a následně sýrů připravených z mléka dojnic krmených těmito silážemi 62 těkavých látek (z toho 12 aldehydů a ketonů, 16 alkoholů, 17 esterů, 2 uhlovodíky a 4 sirné sloučeniny). Zjistili, že vliv složení těkavých látek v krmivech na zastoupení těkavých látek v sýrech je menší než vliv mikrobiálních a chemických přeměn během pro- cesu zrání sýrů.
Technikou analýzy látek v prostorách nad siláží v uzavřené vialce (tzv. dynamické headspace) a GC-MS analýzy bylo identifikováno 41 těkavých sloučenin, které přešly do mléka ze tří druhů ověřovaných krmiv: lučního sena, sena kombinovaného s kukuřičnou siláží a sena s kukuřičnou a travní siláží2.
Stanovení těkavých látek v silážích není v literatuře příliš popisováno. Ojedinělé práce byly publikovány v 80.
letech v Japonsku. Travní siláž byla destilována s vodní parou, destilát byl extrahován diethyletherem a extrakt byl analyzován metodou GC-MS. V silážích převládal 2-fenyl- ethan-1-ol, 4-ethyl-2-methoxyfenol a 4-ethylfenol (cit.5).
Jiní autoři6 extrahovali těkavé látky ze siláží kapalinou, směsí pentanu a diethyletheru (1:1). Extrakt zkoncentrova- li na Vigreauxově destilační koloně, přitom se však zřejmě ztratily těkavé látky, protože jako dominantní látku zjistili kyselinu máselnou. Stejný postup extrakce byl použit u kukuřičné siláže, kde převládajícími látkami byly kyseli- ny octová, máselná a 3-methylbutanová. Z ostatních látek byly nalezeny různé C5 alkoholy, dále (Z)-hex-3-en-1-ol a 2-fenylethan-1-ol.
Cílem naší práce bylo stanovit dominantní těkavé látky v travní a kukuřičné siláži metodami mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a plynové chromatografie s hmotnostně-spektrometrickou detekcí (GC-MS) a dále zjistit, jak se mění jejich složení vlivem použití inokulantů (očkovacích či startérových látek) různých mléčných bak- terií při silážování píce.
Materiál a metody
Použité přístroje a chemikálie
Pro stanovení těkavých látek metodou SPME bylo použito poly(dimethylsiloxan)ové vlákno (PDMS) s tlou- šťkou vrstvy 100 µm s navázanou stacionární fází na zá- kladě polydimethylsiloxanu (Sigma-Aldrich, ČR). K ana- lýzám byl použit plynový chromatograf Finnigan GCQ v kombinaci s hmotnostním detektorem typu iontové pasti.
Byla použita kapilární kolona Zebron ZB 5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm). Použité standardy (4-ethylfenol, 2-methoxy-4-vinylfenol, α-pinen, β-humulen a α-cyklo- citral) byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich, ČR.
Příprava siláží v laboratorním měřítku a stanovení jejich jakosti
V průběhu roku 2005 byly založeny čtyři modelové laboratorní pokusy přípravy siláží (dvě travní siláže a dvě
STANOVENÍ TĚKAVÝCH LÁTEK V TRAVNÍCH A KUKUŘIČNÝCH SILÁŽÍCH MIKROEXTRAKCÍ NA PEVNÉ FÁZI A PLYNOVOU
CHROMATOGRAFIÍ S HMOTNOSTNĚ- SPEKTROMETRICKOU DETEKCÍ Š
TĚPÁNKAC
HMELOVÁa, J
ANT
ŘÍSKAb, K
AMILAR
ŮŽIČKOVÁba P
AVELK
ALAČca Katedra biologie, Pedagogická fakulta, Jihočeská univer- zita v Českých Budějovicích, Jeronýmova 10, 371 15 Čes- ké Budějovice, b Ústav systémové biologie a ekologie Aka- demie věd ČR, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice,
c Katedra aplikované chemie a učitelství chemie, Zeměděl- ská fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice
chmel@pf.jcu.cz, triska@usbe.cas.cz, ruzickova@usbe.cas.cz, kalac@zf.jcu.cz
Došlo 30.4.07, přepracováno 11.2.08, přijato 31.3.08.
Klíčová slova: těkavé látky; travní siláže; kukuřičné siláže;
SPME head-space, GC-MS
Úvod
Siláže jsou vedle čerstvé píce a sena široce používa- nými krmivy pro přežvýkavce ve všech vyspělých zemích.
Silážování představuje velmi složitý biologický a mikrobi- ální proces, při kterém jsou za anerobních podmínek čin- ností baktérií mléčného kvašení přeměňovány rostlinné cukry na konzervující kyseliny mléčnou a octovou a na oxid uhličitý, a to za současného poklesu pH konzervova- né hmoty.
Jakost siláží se stanovuje kvalitativními ukazateli1, zejména hodnotou pH, titrační kyselostí vodného výluhu (KVV), obsahem amoniaku a obsahem kyselin vznikají- cích kvasnými procesy − mléčné, octové, propionové a nežádoucí kyseliny máselné.
V silážích jsou přítomny četné těkavé látky, které vytvářejí typickou vůni kvalitních siláží a také ovlivňují chutnost, a tím do určité míry i příjem siláží zvířaty. Ně- které z nich mohou přecházet do mléka (příp. masa) a ovlivnit tak výslednou kvalitu živočišných produktů2−4. Jde hlavně o nižší alkoholy, těkavé mastné kyseliny a je- jich estery, aldehydy, ketony, terpeny a fenolické látky.
Část těchto látek může přecházet do siláže přímo z výchozí píce, některé však mohou vznikat až při fermentačním procesu, příp. během dlouhodobého skladování siláže.
Stefanon a Procida3 identifikovali ve vzorcích siláží
siláže kukuřičné). Travní porosty byly silážovány bez zavadání, jedna z variant byla připravena z píce zavadlé na obsah sušiny přibližně 400 g kg−1. Trávy byly sklízeny po delším suchém období a některé složky porostu již dřev- natěly. Píce rozřezaná na délku 6−8 cm byla udusána do konzervárenských sklenic objemu 720 cm3 s hustotou 450 g dm−3 u trav a 520 g dm−3 u kukuřice. Sklenice byly uzavřeny víčky Omnia. Tato modelová sila umožňují únik plynů vznikajících během kvasného procesu. Poté vzniká podtlak, který umožní hermetické uzavření a vytvoření nezbytných anerobních podmínek. Sklenice byly uloženy ve tmě při teplotě 20−21 °C po dobu 120 dnů. Metodika této části práce je podrobně popsána v předchozích publi- kacích7,8.
Charakteristiku výchozí píce uvádí tabulka I.
Pro modelové pokusy silážování byly použity násle- dující varianty (každá varianta po čtyřech sklenicích, cel- kem 16 pokusných sil pro jeden pokus):
− pro travní siláže: a) kontrolní (bez přídavku aditiva či konzervantu, tzv. negativní kontrola), b) s mravenčí kyselinou (0,3 hm.%), c) s přídavkem homofermenta- tivní mléčné bakterie Lactobacillus plantarum, d) zavadlá píce;
− pro kukuřičné siláže: a) kontrolní (bez přídavku aditi- va či konzervantu), b) se směsným preparátem mléč- ných bakterií Microsil, c) s přídavkem heterofermen- tativní mléčné bakterie Lactobacillus buchneri a d) s inokulantem L. plantarum.
Dávky všech mléčných bakterií byly 1⋅105 jednotek tvořících kolonie (KTJ) na gram píce. Použité inokulanty poskytla firma Medipharm CZ, Hustopeče u Brna.
Stanovení běžných kvalitativních ukazatelů provedla akreditovaná laboratoř Agrola Jindřichův Hradec podle jednotných pracovních postupů ÚKZÚZ Brno1. Vzorek byl odebrán z každého pokusného sila (sklenice). Průměr- né zjištěné hodnoty jsou uvedeny v tabulkách II a III.
Zkoncentrování těkavých látek metodou SPME Po otevření byl ze střední části každé sklenice ode- brán vzorek siláže o hmotnosti 2 g do vialky o objemu 7 ml. Vialka byla naplněna do dvou třetin objemu silážní hmotou a ihned uzavřena víčkem. Pro zkoncentrování těkavých látek v silážích metodou SPME headspace bylo použito PDMS vlákno s držákem pro ruční vzorkování.
Doba sorpce činila 20 min při teplotě 22 °C. Po této době byly těkavé látky desorbovány v nástřikovém bloku plyno- vého chromatografu při teplotě 250 °C. Vlákno bylo každý den před použitím zahříváno hodinu při teplotě 250 °C.
Stejným způsobem byly v den zahajování modelových laboratorních pokusů zkoncentrovány i těkavé látky z výchozí píce.
GC-MS analýzy
Počáteční teplota kolony 60 °C, dále teplotní program 15 °C/min. do konečné teploty 275 °C (na této teplotě prodleva 15,25 min), teplota nástřiku 250 °C, nosný plyn helium, lineární rychlost 35 cm s−1. Teplota iontového zdroje 200 °C, teplota spojovací trubice mezi termostatem a iontovým zdrojem 275 °C, skenování molekulových hmotností v rozsahu 50−600 Da.
Identifikace těkavých látek
Identifikace těkavých látek v silážích probíhala srov- náním hmotnostních spekter zjištěných látek se spektry knihovny spekter Xcalibur NIST 98/EPA/NIH. Pro účely naší studie byly uvažovány pouze látky vykazující vyso- kou pravděpodobnost shody spekter. Vybrané těkavé látky pak byly stanoveny srovnáním s vnějšími standardy
− 4-ethylfenolem a 2-methoxy-4-vinylfenolem, α-pinenem, β-humulenem a α-cyklocitralem. Relativní směrodatná odchylka pro stanovení 4-ethylfenolu byla 12,1 % Tabulka I
Charakteristika píce použité pro laboratorní přípravu siláží
Číslo pokusu Datum Botanické složení, odrůda Pořadí seče Zralost Sušina [g kg−1] Tráva I 7.6.05 66 % trávy (psárka luční, kostřava
červená, lipnice luční, psineček tenký) ostatní byliny 34 % (svízel bílý, mochna pětilístek, rozrazil rezekvítek)
druhá,
nehnojený porost metání 302
Tráva II 7.6.05 67 % trávy (ovsík vyvýšený, psárka luční, kostřava červená)
33 % ostatní byliny (svízel bílý, rozrazil rezekvítek, řebříček obecný, svízel přítula)
druhá, stejný porost hnojený N, P a K
metání 330
Kukuřice I 26.9.05 Markíza (FAO 280) - mléčně-
vosková
313 Kukuřice II
(jiný porost)
14.10.05 Markíza (FAO 280) - mléčná zralost 354
a 2-methoxy-4-vinylfenolu 13,4 %. Terpeny α-pinen, β-humu- len a α-cyklocitral byly sice dokázány srovnáním s vnějším standardem, ale jejich obsah nebyl stanoven.
Výsledky a diskuse
V tabulkách II a III jsou uvedeny běžné kvalitativní údaje připravených a analyzovaných siláží. Všechny hod- noty byly vyrovnané a odpovídají parametrům siláží dob- ré jakosti. Pouze u obou travních siláží ze zavadlé píce (varianty d) byly vyšší hodnoty titrační kyselosti vodného výluhu.
Popsaným postupem bylo nalezeno celkem 21 těkavých látek. Byly to převážně estery nižších mast- ných kyselin, terpenové a fenolické látky. Bohatší spekt- rum látek bylo nalezeno v travních silážích. To lze přičítat druhové rozmanitosti travních porostů, ze kterých byla
siláž připravena. Přehled nalezených látek v obou typech siláží je uveden v tabulkách IV a V.
Metodou SPME s použitím PDMS vlákna byly nale- zeny některé estery těkavých mastných kyselin a nižších alkoholů (tabulky IV, V). Těkavé mastné kyseliny a alko- holy vznikají v silážích během fermentačních pochodů.
Byla nalezena řada látek terpenové povahy. Terpeny jsou významné vonné látky, v rostlinách poměrně hojné.
Dá se proto předpokládat, že do siláží je vnáší již silážova- ná píce. Epi-bicykloseskvifelandren je odvozen od mono- cyklického seskviterpenu seskvifelandrenu. Další naleze- nou látkou této skupiny byl α-cyklocitral, odvozený od citralu. Citral je nenasycený terpenový aldehyd vznikající oxidací geraniolu. Citral je vonnou složkou mnoha směs- ných silic. Výskyt α-cyklocitralu v silážích byl ověřen srovnáním s vnějším standardem a potvrzen pouze u kuku- řičných siláží. U travních siláží nebyla nalezena shoda spekter. Seskviterpen kadina-3,9-dien byl nalezen metodou
Pozn.: varianty: a) kontrolní siláž, b) Microsil, c) L. buchneri, d) L. plantarum
Parametr Pokus I Pokus II
varianty
a b c d a b c d
pH 3,85 3,90 3,99 3,93 3,92 3,88 3,90 3,90
KVV, mg KOH/100 g 1485 1555 1558 1485 1127 1269 1225 1196
NH3, % 0,03 0,04 0,03 0,03 0,02 0,01 0,02 0,02
Mléčná kyselina, % 1,90 1,93 1,64 1,69 1,30 1,44 1,42 1,39
Octová kyselina, % 0,58 0,63 0,79 0,68 0,45 0,53 0,56 0,53
Propionová kyselina, % 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
Máselná kyselina, % 0,02 0,01 0,02 0,02 0,01 0,01 0,02 0,02
varianty Tabulka III
Parametry ukazující kvalitu kukuřičných siláží. Hodnoty jsou průměrem stanovení ze čtyř pokusných sil Tabulka II
Parametry ukazující kvalitu travních siláží. Hodnoty jsou průměrem stanovení ze čtyř pokusných sil
Parametr Pokus I Pokus II
varianty
a b c d a b c d
pH 4,05 4,00 3,90 4,68 4,05 3,95 3,80 4,35
KVV, mg KOH/100 g 535 672 962 1023 860 698 946 1023
NH3, % 0,03 0,02 0,02 0,03 0,04 0,03 0,03 0,07
Mléčná kyselina, % 1,45 0,77 1,35 1,28 1,30 0,95 1,48 1,49
Octová kyselina, % 0,35 0,23 0,30 0,42 0,20 0,22 0,28 0,45
Propionová kyselina, % 0,01 0,10 0,01 0,35 0,01 0,13 0,01 0,01
Máselná kyselina, % 0,17 0,07 0,05 0,05 0,01 0,20 0,01 0,10
varianty
Pozn.: KVV − kyselost vodného výluhu, varianty: a) kontrolní siláž, b) kyselina mravenčí, c) L. plantarum, d) siláž ze za- vadlé píce
SPME jako vonná látka u květů petúnií9. α-Pinen patří i mezi složky vůně mléka2 a sýrů3. α-Pinen byl identifiko- ván italskými autory2 ve vzorcích mléka při krmení sko- tu lučním senem, kukuřičnou a travní siláží. 3-Thujen (spolu s α-pinenem, β-seskvifelandrenem, α-humulenem a dalšími terpeny) byl nalezen v přirozených travních po- rostech ve Francii10. Velmi zajímavý je výskyt safranalu u vzorků kukuřičných siláží. Safranal zde může vznikat z pikrokrocinu jako produktu rozkladu karotenoidu zea- xanthinu, který se vyskytuje v zrnech kukuřice. Silážní hmota v našich pokusech obsahovala rozdrcená zrna kuku- řice.
Varianty u travních siláží se liší převážně v zastoupení terpenových látek.
V travní siláži z pokusu I je u všech tří variant, je- jichž cílem bylo zlepšit průběh konzervačního procesu, zaznamenán větší výskyt terpenových látek než u varianty kontrolní. Bohatá na terpenové látky byla zejména siláž připravená ze zavadlé píce. Lze předpokládat, že tyto látky vznikají, resp. se uvolňují, již během zavadání trav (vůně sena při sušení). U varianty kontrolní se v obou pokusech vyskytují estery, v dalších variantách pokusu I však estery nebyly zjištěny. Tady musíme zůstat na úrovni hypotéz. Je
známo, že větší množství nižších alkoholů se vytváří v silážích s horším výsledkem konzervačního procesu16, což bývají siláže bez přídavku látek potlačujících nežádou- cí skupiny bakterií – v těchto pokusech kontrolní varianta.
Zajímavý je rovněž četnější výskyt těkavých sloučenin u siláží připravených z nehnojeného travního porostu.
Hnojením se zvyšuje obsah bílkovin i dalších dusíkatých látek na úkor obsahu sacharidů. Nabízí se otázka, zda také neklesá zastoupení těkavých látek, resp. jejich prekurzorů.
Literární údaje o této problematice však zatím chybějí.
Z dalších nalezených látek byly ověřeny s použitím standardů 4-ethylfenol a 2-methoxy-4-vinylfenol. Kami a spol.11 identifikovali 4-ethylfenol v kukuřičných silážích v množství 0,22 mg kg−1. V travní siláži nalezli 4-ethyl- fenol Kibe aj.5 a v siláži kukuřičné Kami aj.12. K analýzám však použili destilát s vodní parou, k detekci rovněž kombinaci GC-MS. Obě tyto látky pocházejí z píce, ovlivňují převážně vůni siláží. Červenému vínu dávají ethylfenoly a vinylfenoly kouřovou a kořeněnou vůni13, silážím pravděpodobně štiplavě květinové až nasládlé aroma. V našich travních silážích byl stanoven 4-ethylfenol v rozmezí 23−33 mg kg−1, s průměrem 30 mg kg−1 . V silážích kukuřičných byl zjištěn v rozmezí Tabulka IV
Těkavé látky v travních silážích
Sloučenina Výchozí píce Pokus I
I II a b c d a b c d
Estery
Pentyl-isobutyrát − − + − − − + − − +
Propyl-kapronát − − − − − − − − + −
Butyl-kapronát − − + − − − + − + −
Fenoly
4-Ethylfenol* − − + − − − − − − −
2-Methoxy-4-vinylfenol* + + − + − − + − + +
Terpeny
α-Cyklocitral − − − + + − − + − −
Epi-bicykloseskvifelandren + − + + + + − − − +
β-Humulen* + − − − + + − − − −
β- Neokloven − − + + − − − − − −
γ- Muurolen − − − + + + − + − −
Kadina-3,9-dien − + + + + + − + + −
α-Pinen* − − − − − + − − − +
3-Thujen + − − − + + − − − −
Cyklosativen − − − − − + − + − −
Isoleden − − − + − + − − − −
Pokus II
Pozn.: − nedetegovatelné; + nalezené a identifikované srovnáním s knihovnou spekter; * látky identifikované s použitím standardu
Tabulka V
Těkavé látky v kukuřičných silážích
Sloučenina Výchozí píce Pokus I Pokus II
I II a b c d a b c d
Estery
Propyl-butyrát − − − − − − + − + +
Propyl-kapronát − − + − + − − − + +
Butyl-kapronát − − − − − − − − + +
Methyl-salicylát − − − + + + − − − −
Kyseliny
Skořicová kyselina − − − − − − − + − −
Fenoly
4-Ethylfenol* − − + + + + + + − −
2-Methoxy-4-vinylfenol* + − + + + + + + + +
Terpeny
α-Cyklocitral* − − − − − − − + + +
Longifolen − + − − − − − − − −
β-Humulen* − − + − − − − − − −
Safranal − − − − − + − − − +
Pozn.: − nedetegovatelné; + nalezené a identifikované srovnáním s knihovnou spekter; * látky identifikované s použitím standardu
O
O OH O H
O CH3
O
OH O H
O OH
OH CH3CH2
biochanin A genistein
4-ethylfenol Obr. 1. Schéma vzniku 4-ethylfenolu z fytoestrogenů
33−60 mg kg−1, průměrný obsah činil 50 mg kg−1. 2-Methoxy-4-vinylfenol byl nalezen v kukuřičných silážích v rozmezí 25−168 mg kg−1, průměr činil 85 mg kg−1, zatímco u travních siláží byl jeho průměr vyšší, a to 110 mg kg−1 s rozmezím 95−158 mg kg−1. Obsahy těchto dvou látek byly zjištěny srovnáním s vnějším standardem a vypočítány z osmi vzorků siláží kukuřičných a pěti vzor- ků siláží travních. Mez detekce pro tyto dvě látky byla 0,1 mg kg−1 a mez stanovitelnosti byla 1 mg kg−1 rovněž pro obě stanovené látky. Koncentrace námi stanovených látek se nachází vysoko nad mezí detekce a mezí stanovi- telnosti.
Fenoly vznikající činností mikroorganismů jako sekundární vonné látky při degradaci fenolických kyselin nebo ligninu se vyskytují jako vedlejší produkty probíhají- cího mléčného a alkoholového kvašení. Jsou nositeli pře- devším netypických chuťových vlastností. 4-Ethylfenol může vznikat v silážích rozkladem isoflavonoidních fy- toestrogenů. Schéma tohoto rozkladu je uvedeno na obr. 1.
Biochanin A (5,7-dihydroxy-4’-methoxyisoflavon) se roz- kládá na genistein, ten dále na dihydroxygenistein, z něhož vzniká 4-ethylfenol a další jednoduché produkty14.
Isoflavonoidní fytoestrogeny se vyskytují jako přiro- zené složky v řadě rostlin, které jsou součástí travních porostů. Silážováním se estrogenní aktivita zvyšuje o de- sítky až stovky procent. Silně omezený přístup vzduchu zabraňuje odbourávání existujících estrogenů, navíc další
enzymové reakce anerobních mikroorganismů způsobují, že tyto estrogeny se přeměňují na aktivnější formy nebo se dokonce syntetizují nové. Jako důsledek kvasných pro- cesů probíhají v siláži podobné pochody jako v bachoru přežvýkavců: především vzniká genistein z biochaninu A (cit.15) .
V kukuřičných silážích byl obsah 4-ethylfenolu vyšší než v silážích travních, což je v souladu se staršími japon- skými výsledky6,11. Silážní kukuřice se vyznačuje znač- ným obsahem zkvasitelných sacharidů, takže mléčné kva- šení probíhá intenzivně. Proto je možné předpokládat, že oba zjištěné fenoly by mohly vznikat ve značné míře čin- ností mléčných bakterií17, a to dekarboxylací fenolických kyselin ferulové, p-kumarové i dalších, odvozených od kyseliny trans-skořicové. Tímto způsobem by mohl vzni- kat i 2-methoxy-4-vinylfenol (obr. 2).
V kukuřičných silážích se v obou pokusech při pří- davku heterofermentativní mléčné bakterie L. buchneri vyskytoval monoterpenový aldehyd safranal. Kyselina skořicová byla zjištěna pouze jednou. Tato kyselina se přirozeně vyskytuje v rostlinách.
Závěr
Tato práce představuje jeden z prvých kroků pro iden- tifikaci těkavých látek v tak významných krmivech, jaký- OH
CH=CHCOOH
CH2CH3
OH
CH=CH2COOH
OH CH3 O
CH=CH2
OH CH3 O -CO2
-CO2 kyselina p-kumarová
4-ethylfenol
kyselina ferulová 2-methoxy-4-vinylfenol kyselina p-kumarová
Obr. 2. Schéma vzniku 4-ethylfenolu a 2-methoxy-4-vinylfenolu v silážích mikrobiální dekarboxylací p-kumarové kyseliny a feru- lové kyseliny
mi jsou siláže. Dá se předpokládat, že těchto látek jsou minimálně desítky a řada z nich nepochybně ovlivňuje chutnost pro zvířata a podílí se tak na příjmu siláží. Někte- ré z nich přecházejí do mléka a následně i mléčných vý- robků, jejichž senzorické vlastnosti mohou zlepšit či zhor- šit. Před zemědělským a potravinářským výzkumem leží prostor, jehož poznání je v samých začátcích.
Práce byla umožněna za podpory grantu GA ČR č. 525/05/P544 a výzkumného záměru ÚSBE AV ČR, v.v.i.
č. AV0Z60870520.
LITERATURA
1. Věstník IV/1.díl. ÚKZÚZ Brno (leden 2005).
2. Toso B., Procida G., Stefanon, B.: J. Dairy Res. 69, 569 (2002).
3. Stefanon B., Procida, G.: J. Dairy Res. 71, 58 (2004).
4. Vasta V., Priolo, A.: Meat Sci. 73, 218 (2006).
5. Kibe K., Kasuya, T.: J. Jpn. Grassl. Sci. 25, 251 (1979).
6. Kami T., Yoshida S., Ohsaki, K.: Jpn. J. Zootech. Sci.
60, 596 (1988).
7. Steidlová Š., Kalač P.: Arch. Anim. Nutr. 57, 359 (2003).
8. Steidlová Š., Kalač P.: Arch. Anim. Nutr. 58, 245 (2004).
9. Verdonk J. C., Vos R., Verhoeven H. A., Haring M.
A., Tunen A. T., Schuurink R.: Phytochemistry 62, 997 (2003).
10. Cornu A., Carnat A. P., Martin B., Coulon J. B., La- maison J. L., Berdagué J. L.: J. Agric. Food Chem.
49, 203 (2001).
11. Kami T., Shiga K., Ohsaki K.: Jpn. J. Zootech. Sci.
58, 859 (1987).
12. Kami T., Yoshida S., Nishium T., Nakasugi T.: Jpn. J.
Zootech. Sci. 61, 1017 (1990).
13. Martorell N., Martí M. P., Mestres M., Busto O., Gu- asch J.: J. Chromatogr., A 975, 349 (2002).
14. Velíšek J.: Chemie potravin. 2. díl. Ossis, Tábor 1999.
15. Kalač P., Míka V.: Přirozené škodlivé látky v rostlinných krmivech. ÚZPI, Praha 1997.
16. Kalač P., Pivničková L.: Živoč. Výr. 32, 641 (1987).
17. Couto J. A., Campos F. M., Figueiredo A. R., Hogg T.
A.: Am. J. Enol. Vitic. 57, 166 (2006).
Š. Chmelováa, J. Třískab, K. Růžičkováb, and P. Kalačc (a Department of Biology, Pedagogical Fac- ulty, University of South Bohemia, České Budějovice,
b Institute of Systemic Biology and Ecology, Academy of Sciences of the Czech Republic, České Budějovice,
c Department of Applied Chemistry, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia, České Budějovice): Deter- mination of Volatile Compounds in Grass and Maize Silages using SPME and GC-MS
Volatile compounds from grass and maize silages were detected using solid-phase microextraction (SPME), headspace SPME, and GC-MS. Two grass silages were tested untreated, preserved with formic acid and inoculated with Lactobacillus plantarum, or with wilted grass up to 400 g kg−1. Two maize silages were tested untreated, inoculated with L. plantarum or L. buchneri or with a mixture of lactic acid bacteria Microsil. The silages were fermented and stored for 4 months. Volatiles were isolated by headspace SPME. Using this method, 21 volatile com- pounds, fatty acid esters, terpenes and phenolics were de- tected. The contents of 4-ethylphenol and 2-methoxy-4- -vinylphenol were determined.
