M
ARCELAD
VOŘÁKOVÁa T
OMÁŠV
ANĚK Laboratoř rostlinných biotechnologií, Ústav experimentál- ní botaniky, AV ČR, v.v.i., Rozvojová 263, 165 02 Praha 6 vanek@ueb.cas.czDošlo 21.1.15, přijato 26.3.15.
Klíčová slova: strigolaktony, fytohormony, arbuskulární mykorhizní houby, parazitické rostliny, mechanismus
Obsah 1. Úvod
2. Funkce strigolaktonů v rostlinách 2.1. Parazitické rostliny
2.2. AM houby 2.3. Fytohormony 3. Chemie strigolaktonů
3.1. Biosyntéza strigolaktonů
3.2. Přírodní strigolaktony – chemická struktura 3.3. Syntetické deriváty strigolaktonů
3.4. Vliv struktury na aktivitu strigolaktonů 3.4.1. Klíčení parazitických rostlin 3.4.2. Symbióza s AM houbami 3.4.3. Vývoj rostliny
3.5. Mechanismus účinku strigolaktonů 4. Závěr
1. Úvod
Strigolaktony, seskviterpenoidní laktony biogeneticky příbuzné karotenoidům, jsou nejmladší identifikovanou skupinou fytohormonů regulující růst a větvení výhonků a kořenů, klíčení semen či fotomorfogenezi1,2. Strigolak- tony byly známé již dříve, ale pouze jako signální moleku- ly rostlin hrající zásadní roli v symbióze rostlin a parazitických plevelů nebo arbuskulárních mykorhizních hub (AM hub)3.
Strigolaktony jsou produkovány ve velmi nízkých koncentracích především v kořenech rostlin a následně jsou částečně uvolňovány do rhizosféry. Strigolaktony byly dosud nalezeny u všech zkoumaných suchozemských rostlin, a to i u těch, které netvoří symbiózu s AM houba- mi či parazitickými rostlinami3.
2. Funkce strigolaktonů v rostlinách 2.1. Parazitické rostliny
Prvotně byly strigolaktony identifikovány jako látky hostitelské rostliny ovlivňující klíčení semen parazitických rostlin rodů Orobanche či Striga4. Tyto parazitické rostli- ny napadají celou řadu zemědělských plodin, jako jsou kukuřice, rýže, čirok, proso, rajče, slunečnice, tabák či luštěniny, a to zejména v oblastech subsaharské Afriky a ve východní a jižní Evropě5. Parazitické rostliny dokáží vyprodukovat až 100 000 semen za jedno vegetační obdo- bí a tato semena jsou navíc schopna přežít v půdě v dor- manci až několik let6. I proto tyto parazitické rostliny způso- bují masivní ztráty v produkci zemědělských plodin odhad- nuté jen pro rod Striga přes 7 miliard dolarů ročně3. Z tohoto důvodu je velmi důležitá možnost ovlivnění klíčení semen parazitických rostlin k regulaci jejich výskytu a růstu.
Regulace růstu a vývoje parazitických rostlin je ex- trémně složitá kvůli jejich složitému životnímu cyklu, vaskulárnímu propojení s hostitelem, produkci spousty dlouhožijících semínek a schopnosti zničit hostitele ještě pod zemí6. Semena parazitických rostlin klíčí pouze na základě přijetí signálu vyvolaného stimulátory klíčení, například právě strigolaktony, přítomnými v půdě5. Vyklí- čená semena jsou pak schopná navázat se na kořeny hosti- telské rostliny, přičemž vzniká speciální orgán, haustori- um, který vytvoří propojení s vaskulárním systémem rost- liny5. Parazitická rostlina pak odebírá hostitelské rostlině vodu, živiny i hormony, což snižuje produkci této hostitel- ské rostliny.
Napojení vyklíčených semen na hostitelskou rostlinu musí proběhnout v řádu několika dnů, jinak vyklíčené semeno zahyne. Tuto kritickou fázi ve vývoji parazitické rostliny by bylo možné využít pro regulaci jejich výskytu tzv. „sebevražedným klíčením“, kdy se pomocí stimuláto- ru klíčení nechají semena v půdě vyklíčit bez přítomnosti hostitelské rostliny. Vyklíčená semena se tak nemohou dále vyvíjet a zahynou a teprve poté se do takto ošetřené půdy vysadí průmyslové plodiny5,7. Jinou možností využití strigolaktonů pro regulaci klíčení semen parazitických rostlin je jejich aplikace ve formě disperze s pomocí vhod- ného emulzifikátoru, jež se využívá u jiných herbicidů8,9. 2.2. AM houby
V roce 2005 bylo poprvé publikováno, že strigolakto- ny v rhizosféře ovlivňují také interakci hostitelské rostliny a AM hub. Strigolaktony slouží jako signál k rozeznání hostitele a vyvolávají u hub vývoj výtrusnic a hyf důleži- tých pro kolonizaci kořenů. Na základě signálu se na hyfě vytvoří apresorium schopné pronikat kořeny rostlin, kde se hyfy diferencují na hustě větvené struktury zvané arbusku-
STRIGOLAKTONY – STRUKTURA A FUNKCE V ROSTLINÁCH
ly zajišťující výměnu živin10.
AM houby jsou závislé na uhlíku, který přijímají od hostitele ve formě cukrů, jehož kořeny kolonizují a výmě- nou mu zajišťují lepší příjem živin (P, N, minerálů). Sym- bióza rostlin s AM houbami je stará více než 400 milionů let a tvoří ji přes 80 % suchozemských rostlin, AM houby tak hrály zásadní roli v kolonizaci Země rostlinami3. Lepší příjem živin zvyšuje schopnost rostlin růst a vyvíjet se jako i odolávat stresu a patogenům10.
2.3. Fytohormony
Teprve nedávno bylo zjištěno, že strigolaktony působí také jako fytohormony1,2. Tato jejich funkce byla objevena v souvislosti s potvrzením jejich role v ovlivnění větvení výhonků1,2. Následně bylo zjištěno, že ovlivňují vývoj kořenů a dalších částí rostliny.
Strigolaktony interagují také s dalšími rostlinnými hormony jako jsou auxiny, gibereliny nebo kyselina absci- sová3. Vypadá to, že funkce strigolaktonů jako fytohormo- nů souvisí s jejich schopností modulovat transport auxinů, dělení buněk, či rozdělení živin. Bylo například zjištěno, že strigolaktony inhibují dělení buněk kořenů, a tím inhi- bují jejich náhodný růst; podporují prodlužování kořeno- vých vlásečnic; podporují růst stonku; ovlivňují vývoj hlízek; inhibují vývoj nových výhonků; podporují růst kambia; a také zachovávají fosforovou a dusíkovou rovno- váhu v rostlinných buňkách1–3,8,11. V podstatě lze říci, že rostlina reaguje na změny v prostředí změnou v produkci strigolaktonů a zajišťuje si tak optimální růst za daných podmínek3,11.
Produkce strigolaktonů je v rostlinách výrazně stimu- lována (může vzrůst až 100 000×) za nedostatku fosforu v půdě, což může znamenat, že strigolaktony jsou klíčo- vým endogenním signálem, pomocí kterého je ovlivňová- na dostupnost živin a růst a vývoj rostliny11. To souvisí také se schopností rostlin adaptovat růst kořenů a výhonků na chudé nutriční podmínky. Při nedostatku fosforu je inhibován růst primárních kořenů, ale zpočátku rostou vedlejší kořeny, jejichž růst se po čase zastaví a stimulováno je pouze zvětšování jejich hustoty11. Někte- ré rostlinné druhy zvyšují produkci strigolaktonů za úče- lem zvýšení přijímání fosforu z prostředí vlivem lepší spo- lupráce s AM houbami11.
3. Chemie strigolaktonů 3.1. Biosyntéza strigolaktonů
Hlavním místem biosyntézy strigolaktonů v rostlinách jsou kořeny, odkud jsou strigolaktony transportovány do nadzemních částí rostliny a uvolňovány do rhizosféry10.
Biosyntéza strigolaktonů vychází z karotenoidů ve- doucí ke karlaktonu jako výchozí látce pro následnou syn- tézu strigolaktonů. Jedná se o oxidativní štěpení C40 karo- tenoidů vzniklých nemevalonátovou (methylerytritol fos- fátovou) cestou v plastidech buněk10. Způsob biosyntézy
strigolaktonů byl zjištěn na základě použití fluoridonu, inhibitoru biosyntézy karotenoidů12.
Mezi enzymy podílející se na biosyntéze strigolakto- nů patří karotenoidy štěpící deoxygenasy (carotenoid clea- vage deoxygenase) CCD7 a CCD8 a karotenoid-isomerasa DWARF27 (D27)12. Pomocí těchto enzymů vzniká z trans--karotenů jediný stereoisomer karlaktonu, 11R-karlakton (Schéma 1). Enzymy následně metabolizu- jící 11R-karlakton na strigolaktony zůstávaly donedávna neznámé12. Prvním enzymem u něhož byla potvrzena jeho schopnost metabolizovat 11R-karlakton na strigolakton, a to na (–)-(3aR,4R,8bR,2´R)-5-deoxystrigol, byl člen CYP711, CYP711A1, podskupiny enzymů cytochromu P450 kódovaný MAX1 (more axillary growth 1) protei- nem13. Jiný člen této podskupiny je pak schopen oxidace 11R-karlaktonu na (–)-(3aR,4R,8bR,2´R)-orobanchol.
Na přenosu signálů strigolaktonů se podílejí například enzymy D14, resp. DAD2, /-fold hydrolasa a na leucin bohatý F-box protein MAX2/D3/RMS414. D14 hydrolyzu- je strigolaktony na neaktivní produkty14 (Schéma 1).
Schéma 1. Biosyntéza strigolaktonů
3.2. Přírodní strigolaktony – chemická struktura Jednotlivé rostlinné druhy jsou schopné produkce celé řady různých strigolaktonů v různém poměru. Je pravdě- podobné, že rostliny dokáží syntetizovat až stovky stereoi- somerů strigolaktonů, ale my jsme schopni izolovat jen ty, které jsou produkovány v největším množství15.
Identifikaci a charakterizaci strigolaktonů ztěžuje zejména jejich velmi nízká koncentrace v rostlinách – tyto látky jsou aktivní za koncentrací tak nízkých, jako je 10–13 M (AM houby), 10–12M (parazitické rostliny), 10–8 M (hormonální funkce) – a jejich přítomnost v kořenových exudátech, která je na úrovni pikogramů16. Kořenové
exudáty hostitelských rostlin obsahují zpravidla směsi strigolaktonů, a to často v různém poměru5.
Izolace strigolaktonů z kořenových exudátů je prová- děna s pomocí hydroponických kultur rostlin, jako je např.
rýže, kdy jsou kořenové exudáty uvolněné do média adsor- bovány na aktivním uhlí, z něhož se pak extrahují. Násled- ným rozdělením extraktu na silikagelu pomocí řádově několika gradientových elucí lze separovat jednotlivé stri- golaktony. K získání strigolaktonů v množství potřebném k jejich identifikaci jsou třeba stovky rostlin v závislosti na koncentraci strigolaktonů v příslušných kořenových exudátech17.
O O
O O OH O
O O
O O O
O O
O O O
O O
O O OH O
O O
O O O
O OH O O
O O O
HO
O O
O O OH O
O
O O
O O OH O
O
O
O
O O O
(-)-(3aR,4R,8bR,2´R)-orobanchol
5-Deoxystrigol Sorgolakton
Solanakol Fabakol
Sorgomol
7-Oxoorobanchol*
ent-2´-epi-orobanchol Strigon
O O
O O OH O
O O
O O OH O
Didehydro-orobanchol (je více isomerù)
Medicaol - isomer didehydro-orobancholu
O O
O O OH O
HO
7-Hydroxyorobanchol*
Isolované deriváty s nejasnou stereochemií:
S -orientací C kruhu:
S -orientací C kruhu:
O
OH
O
O O O
A B C
D
(+)-(3aR,5S,8bS,2´R)-strigol 1´
2´
3´ 4´
5´
7´
2 3 3a 8a8b 8
4a 4 5 6 7
10 1 9
Obr. 1. Identifikované přírodní strigolaktony
Analýza a identifikace látek izolovaných z přírodních materiálů je vždy velmi náročná a přesné určení struktury včetně stereochemie je možné až na základě porovnání retenčních časů a spektroskopických dat autentických a syntetických látek změřených na GC-MS nebo LC-MS/
MS. Při analýze směsí je často nezbytná zdlouhavá opti- malizace podmínek kapalinové chromatografie, tak aby byla možná identifikace všech látek. Nezbytné je také pou- žití chirální LC-MS/MS pro správné určení stereoisomerů.
Pro správné určení stereochemie je kromě chirální LC-MS/
MS důležité také měření CD spekter. U izolovaných jed- notlivých zástupců strigolaktonů je pak pro plnou charak- terizaci nezbytné také měření NMR spekter. Totální synté- za navržených struktur přírodních látek je v takovém pří- padě pro identifikaci jednotlivých látek velmi důležitá a značně ji usnadňuje.
Strukturním základem strigolaktonů je různě substitu- ovaný tricyklický lakton (kruhy A,B,C), který je enol ethe- rovou vazbou spojen s ,-nenasyceným furanonem (kruh D; obr. 1). Prvním izolovaným strigolaktonem byl (+)-(3aR,5S,8bS,2´R)-strigol izolovaný v roce 1966 z koře- nových exudátů bavlny (obr. 1)4.
Dalšími izolovanými strigolaktony byly v roce 1992 sorgolakton a alektrol, následované v roce 1998 oroban- cholem8. Navržené struktury a stereochemie těchto izolo- vaných látek byly odhadnuty na základě spektroskopické analýzy v porovnání s (+)-strigolem8. Pozdějším porovná- ním spektroskopických dat autentických a syntetických látek se podařilo určit přesné struktury i stereoisomerii orobancholu a alektrolu18. Bylo zjištěno, že izolovaný oro- banchol je ve skutečnosti (–)-(3aR,4R,8bR,2´R)-orobanchol a ne původně navržený (3aS,4S,8bS,2´R)-orobanchol (obr. 1). Struktura alektrolu byla určena jako (3aR,4R,8bR,2´R)-orobanchyl acetát18.
Vzhledem k tomu, že v molekulách strigolaktonů se nachází několik center chirality, je kromě klasického IUPAC názvosloví používáno i názvosloví, které pomocí předpon ent a epi vyjadřuje vztah dané struktury určitého strigolaktonu vůči struktuře referenčního strigolaktonu.
V případě, že je předponou ent, je daná struktura enantio- merem referenční molekuly, je-li předponou epi, má opač- nou konfiguraci na uvedeném atomu. Zmatení ale může způsobit výběr referenční molekuly, kdy jedni8,18 používají jako referenční molekulu (+)-(3aR,5S,8bS,2´R)-strigol, ale jiní11 zase (–)-(3aR,4R,8bR,2´R)-orobanchol15.
Zwanenburg a Pospíšil8 navrhli nazývat správnou strukturu orobancholu „přírodní stereoisomer orobancho- lu“, aby nedocházelo k záměně se strukturou původně navrhovanou pro orobanchol. Zavádějící ale v tomto přípa- dě může být to, že nedávno Xie a spol.17 identifikovali tento původně navržený stereoisomer orobancholu (ent-2'- -epi-orobanchol, neboli (3aS,5S,8bS,2´R)-orobanchol, obr. 1) v kořenových exudátech tabáku a pokud je jeho strukturní identita správná, pak je tento stereoisomer také přírodním stereoisomerem.
Dle absolutní konfigurace BCD strukturní části mole- kuly se přírodní strigolaktony dělí na dvě skupiny, ty které mají orientaci C kruhu stejnou s (+)-strigolem (C kruh má
-orientaci): strigyl acetát, sorgomol, sorgolakton, strigon, 5-deoxystrigol, ent-2'-epi-orobanchol, a ty s konfigurací stejnou jako má (–)-orobanchol (C kruh má -orientaci):
orobanchyl acetát, fabacyl acetát, solanakol, solanacyl acetát15.
Do dnešní doby bylo identifikováno a charakterizová- no přibližně 18 strigolaktonů z kořenových exudátů. Jejich základní struktury jsou uvedeny na obr. 1 (cit.17–20). Od všech hydroxylovaných strigolaktonů byly charakterizová- ny i příslušné acetáty. Dostupná spektroskopická data jed- notlivých derivátů byla shrnuta v práci Cavara a spol.15.
V případě 7-oxoorobancholu a 7-hydroxyorobancholu jsou na obr. 1 uvedeny jejich stereoisomery tak, jak jsou dostupné v literatuře19, tedy s -orientací C kruhu, a označeny hvězdičkou, neboť je pravděpodobné, že ve skutečnosti budou mít tyto deriváty -orientaci C kruhu odpovídající (–)-orobancholu17. Revize jejich CD spekter je nutná pro potvrzení této teorie.
3.3. Syntetické deriváty strigolaktonů
Přírodní strigolaktony jsou velmi složité molekuly a jejich syntéza je tudíž obtížná a drahá. Vývoj nových derivátů strigolaktonů s potenciálně vyšší aktivitou a stabi- litou je proto velmi žádoucí. V případě syntetických deri- vátů je důležité připravit strigolaktony stabilnější vůči hydrolýze, které by byly schopny setrvat v půdě déle a bylo tak možné je využít např. k regulaci klíčení parazi- tických rostlin při tzv. „sebevražedném klíčení“ (viz kapi- tola 2.1.)5.
Syntetické deriváty strigolaktonů lze rozdělit na syn- tetická analoga, u nichž je zachována enol etherová vazba a syntetická mimika, která tuto enol etherovou vazbu po- strádají.
Do dnešní doby byla připravena řada syntetických derivátů strigolaktonů, z nichž derivát GR24 (obr. 2A) se používá jako referenční molekula při testech aktivity no- vých derivátů21. Od testování GR (germination releaser) derivátů k regulaci výskytu parazitických rostlin bylo upuštěno, pravděpodobně kvůli nízké stabilitě derivátů v bazické půdě a komerční dostupnosti6. Také bylo zjiště- no, že GR24 neindukuje klíčení u S. gesneriodes, nejrozší- řenější parazitické rostliny ohrožující produkci luštěnin rodu Vigna v subsaharských oblastech Afriky6.
Dalšími připravenými deriváty (obr. 2) jsou deriváty s modifikovaným nebo chybějícím A kruhem (obr. 2B), B kruhem (obr. 2C) i C kruhem (obr. 2D)22–24 nebo se změněnou enol etherovou vazbou (obr. 2E)25,26. Připraveny byly také karbaderiváty GR analogů strigolaktonů (obr. 2A), jako potenciální inhibitory produkce strigolakto- nů, ale tato inhibice u nich nebyla prokázána5. Naopak, jednoduché deriváty strigolaktonů se zachovaným D kru- hem, ale se scházející enol etherovou vazbou byly aktivní při stimulaci klíčení semen u rodu Orobanche22,25,26. Jiné takové deriváty zase výrazně inhibovaly růst výhonků27. Nedávno byly připraveny také fluorescenční deriváty stri- golaktonů, které mohou být užitečné k detekci receptorů in vivo28–30.
3.4. Vliv struktury na aktivitu strigolaktonů
Všechny dosud známé přírodní strigolaktony mají stejnou strukturu CD kruhů s methylem v pozici C4´, což naznačuje důležitost tohoto motivu pro bioaktivitu strigol- aktonů5,16. Aktivita strigolaktonů v půdě závisí na celé řadě faktorů, jako je bazicita či vlhkost půdy, čož je dáno zejména přítomností enol etherové vazby v molekule stri- golaktonů, jež je velmi nestabilní vůči hydrolýze ve vod- ném prostředí6,31. Z tohoto důvodu je přítomnost strigolak- tonů v půdě jen krátkodobá.
3.4.1. Klíčení parazitických rostlin
Struktura kruhů C a D a jejich spojení enol etherovou vazbou výrazně ovlivňuje aktivitu strigolaktonů vůči jejich schopnosti stimulovat klíčení semen parazitických rostlin.
Předpokládá se, že k interakci molekuly v aktivním místě receptoru dochází pomocí adičně-eliminačního mechanis- mu iniciovaného Michaelovou adicí nukleofilu na enol etherovou vazbu a následného odštěpení D kruhu (viz ka- pitola 3.5.)20. Přítomnost kruhů A a B není v tomto případě nezbytná, ale pravděpodobně zajišťuje lepší vazbu strigol- aktonu na receptor. Substituce na A kruhu, otevření B kru- hu či modifikace nebo otevření C kruhu nemá výraznější efekt na aktivitu strigolaktonů22,23. Naopak, stereochemie substituentů na strigolaktonovém skeletu má vliv na jejich biologickou aktivitu. Bylo zjištěno, že nejaktivnější jsou látky se stereochemií analogickou přírodnímu strigolu, 3aR,5S,8bS, 2´R (cit.5).
Tyto strukturní charakteristiky jsou důležité pro bio- aktivitu všech strigolaktonů, ale jednotlivé deriváty strigol- aktonů jsou často aktivní pouze vůči určitému druhu nebo
Obr. 2. Syntetické deriváty strigolaktonů: A) GR deriváty a karba-GR-deriváty, B) deriváty s modifikovaným nebo chybějícím A kru- hem, C) deriváty s modifikovaným nebo chybějícím B kruhem, D) deriváty s modifikovaným nebo chybějícím C kruhem, E) deriváty se změněnou enol etherovou vazbou
rodu parazitické rostliny, což poukazuje na rozdílnost ak- tivních míst receptorů strigolaktonů. Například deriváty strigolu stimulující klíčení semen parazitických rostlin rodu Striga jsou výrazně méně aktivní při stimulaci klíčení semen u rodu Orobanche32.
K testování vlivu strigolaktonů na klíčení semen para- zitických rostlin v laboratorních podmínkách se standartně používá metoda popsaná Mangnusem a spol.21. Nedávno publikovali Pouvreau a spol.33 novou jednoduchou metodu založenou na spektroskopickém měření redukce MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu.
Některé deriváty strigolaktonů byly testovány i v pol- ních podmínkách k vyvolání tzv. sebevražedného klíčení semen parazitických rostlin (viz kap. 2.1.). Takový způsob regulace výskytu parazitických rostlin byl vyzkoušen po- prvé již v roce 1976, kdy byl testován na S. asiatica a O. ramosa derivát GR7 za koncentrace 10 mg l–1 se slib- nými výsledky7. Takto testován byl také derivát GR24 (cit.8). Od 80. let ale již žádné další pokusy ani s jinými deriváty strigolaktonů nebyly publikovány8. Pouze Kgosi a spol.6 zkoumali in vitro vliv některých nových derivátů na klíčení semen rodu Striga.
Jiný způsob regulace výskytu parazitických rostlin byl použit například u derivátu Nijmegen-1, jež byl apliko- ván na tabáková pole napadená O. ramosa L. ve formě emulze (viz kap. 2.1.). Po čtyřech cyklech aplikace se po- dařilo snížit napadení tabáku až o 95 % (cit.9).
3.4.2. Symbióza s AM houbami
V případě symbiózy rostlin s AM houbami je pro aktivitu strigolaktonů důležitá nejen přítomnost CD skele- tu, ale také přítomnost kruhů A i B a jejich substituenty.
Akiyama a spol.10 testovali 44 strigolaktonů lišících se jak strukturně, tak pouze absolutní konfigurací. Tím bylo zjiš- těno, že redukcí enol etherové vazby nebo její záměnou za iminovou vazbu se aktivita strigolaktonů na vývoj hyf AM hub výrazně nesnižuje, a naopak, že odstraněním A kruhu nebo AB části molekuly se aktivita výrazně snižuje. Přes- tože určité modifikace AB skeletu strigolaktonů jsou mož- né, substituce těchto dvou kruhů má výrazný efekt na akti- vitu, zejména v případě polární substituce A kruhu nebo jeho nahrazení aromatickým kruhem, které vedou k výraz- nému snížení aktivity10.
3.4.3. Vývoj rostliny
Vliv struktury strigolaktonů na jejich fytohormonální aktivitu není tak dobře prozkoumán jako vliv na klíčení semen parazitických rostlin.
Fytohormonální aktivitu strigolaktonů zkoumal Boyer a spol.16, který sledoval vliv 42 derivátů strigolaktonů na růst pupenů u hrachu, pro určení vztahu struktury strigol- aktonů a jejich fytohormonální aktivity. Z výsledků vyplý- vá, že stereochemie na C2´ jakož i přítomnost kruhů A a B není pro tuto aktivitu nezbytná. Naopak, struktura kruhů C a D zásadně ovlivňuje aktivitu, přičemž extra methylová skupina na uhlíku C3´ velmi výrazně aktivitu zvyšuje16.
Fukui a spol.27 připravili řadu fenoxyfuranonových derivátů postrádajících enol etherovou vazbu a tyto derivá-
ty testovali na jejich schopnost inhibovat větvení výhonků.
Většina připravených derivátů větvení inhibovala, a to i lépe než GR24. Z toho vyplývá, že přítomnost enol ethero- vé vazby není nezbytná pro fytohormonální aktivitu strigo- laktonů.
3.5. Mechanismus účinku strigolaktonů
Mechanismus účinku strigolaktonů není zcela jasný – v současné době existují tři teorie mechnismu účinku (Schéma 2). První, odvozená na základě reaktivity synte- tického derivátu GR24 vůči nukleofilům, předpokládá Michaelovu adici nukleofilu na enol etherovou vazbu (Schéma 2A)31. Tuto teorii podporuje neaktivita karba a dihydroderivátů GR24.
Druhá teorie předpokládá adici nukleofilu na furanon v pozici C3´ a následnou eliminaci skupiny na C2´ po pro- tonovém přesmyku (Schéma 2B)22. Pomocí tohoto druhé- ho mechanismus lze vysvětlit, proč i syntetické strigolak- tony postrádající enol etherovou vazbu jsou aktivní při působení na klíčení semen. Skupina eliminující se z C2´
musí být v tomto případě dobrou odstupující skupinou.
Například alkoxy skupina není dobrou odstupující skupi- nou, a proto byly takové deriváty neaktivní vůči klíčení semen rodu Striga22. Aktivita ale byla zjištěna pro některé
Schéma 2. Mechanismus účinku strigolaktonů: A) založený na adici na enol etherovou vazbu, B) založený na adici na furanon v pozici C3´, C) založený na adici na furanon v pozici C5´
aryloxy deriváty27. Pro potvrzení tohoto mechanismu byly syntetizovány benzyloxy deriváty s methylovou skupinou v pozici C3´, u nichž není možný přenos vodíku a tudíž by takové deriváty měly být neaktivní, což se také potvrdilo8. V ostrém kontrastu s těmito výsledky je ale aktivita derivá- tů s methylovou skupinou v pozici C3´ jako fytohormonů.
Boyer a spol.16 zjistili, že extra methylová skupina na uhlí- ku C3´ velmi výrazně zvyšuje aktivitu derivátů strigolakto- nů, tudíž mechanismus působení zde musí být jiný.
Třetí teorie předpokládá adici nukleofilu na furanon v pozici C5´ (Schéma 2C)34. Pomocí tohoto mechanismu lze vysvětlit aktivitu jak enol etherových derivátů, tak i derivátů tuto vazbu postrádajících, u těch ale musí být stále splněna podmínka přítomnosti dobré odstupující na C2´. Zároveň tak lze vysvětlit i fytohormonální aktivitu derivátů s methylovou skupinou v pozici C3´.
Zwanenburg a Pospíšil8 ale tvrdí, že tento mechanismus neodpovídá obecně akceptovanému adičně-eliminačnímu mechanismu hydrolýzy esterů přes sp3 meziprodukt.
V případě prvního mechanismu by Michaelova adice nukleofilu na enol etherovou vazbu strigolaktonů napří- klad v buňkách semen parazitických rostlin vedla ke kova- lentví vazbě ABC-části molekuly na receptor, čímž by vyvolala klíčení těchto semen5. Do současné doby ale není známa ani podoba takového receptoru ani jeho případná lokalizace v rámci semene8.
Snahy o nalezení takového receptoru vedly k syntéze fluorescenčních derivátů strigolaktonů28. Bohužel velmi nízká optimální koncentrace látky znemožnila detekci receptoru pomocí fluorescenční korelační spektroskopie.
Byly proto připraveny jiné deriváty, u nichž byl na mole- kulu strigolaktonu GR24 navázán biotin. V tomto případě lze případný protein izolovat afinitní chromatografií s imo- bilizovaným avidinem nebo streptavidinem. Tímto způso- bem se podařilo separovat jeden potenciální receptor, 60 kDa protein5. Další podrobnosti o tomto proteinu ale publikovány nebyly. Pouze o čtyři roky později Zwanenburg a Pospíšil zmínili ve svém přehledu, že hlav- ním problémem při izolaci tohoto proteinu je jeho extrak- ce8. Přestože byly od té doby připraveny i další fluorescen- ční deriváty29,30, žádné další potenciální receptory dosud identifikovány nebyly.
4. Závěr
Výzkum strigolaktonů, příprava nových derivátů a studium jejich biologické aktivity jsou důležité pro zís- kání detailnějších informací o jejich působení na vývoj rostliny a jejích symbiotických partnerů, které může vést k praktickému využití v regulaci příjmu živin, růstu či vývoje výhonků a kořenů rostliny jakož i vývoje AM hub nebo parazitických rostlin. V současné době se syntéza nových derivátů soustřeďuje zejména do oblasti regulace klíčení semen parazitických rostlin, kdy je možností jak příprava derivátů stimulujících klíčení semen parazitic- kých rostlin, tak i derivátů inhibujících procesy v rostlině vedoucí k produkci strigolaktonů. Dalším směrem, kterým
se syntéza nových derivátů ubírá, je příprava fluorescen- čních derivátů, jež by umožnily izolaci příslušných recep- torů.
Autoři děkují za podporu projektu COST LD14127 od MŠMT, Česká republika.
Seznam symbolů
AM houby arbuskulární mykorhizní houby CCD7, CCD8 karotenoidy štěpící deoxygenasy
(carotenoid cleavage deoxygenase) CD spektra spektra cirkulárního dichroismu CYP711 podskupina enzymů cytochromu
P450
D14 /-fold hydrolasa
D27 karotenoid-isomerasa DWARF27 GR germination releaser = stimulátor
klíčení
MAX1 more axillary growth 1 proteinem MAX2/D3/RMS4 na leucin bohatý F-box protein MTT
NMR nukleární magnetická rezonance LC-MS/MS kapalinová chromatografie s tande-
movým hmotnostním detektorem
LITERATURA
1. Gomez-Roldan V., Fermas S., Brewer P. B., Puech- Pages V., Dun E. A., Pillot J. P., Letisse F., Matusova R., Danoun S., Portais J. C., Bouwmeester H., Be´card G., Beveridge C. A., Rameau C., Rochange S. F.:
Nature 455, 189 (2008).
2. Umehara M., Hanada A., Yoshida S., Akiyama K., Arite T., Takeda-Kamiya N., Magome H., Kamiya Y., Shirasu K., Yoneyama K., Kyozuka J., Yamaguchi S.:
Nature 455, 195 (2008).
3. Foo E., Reid J. B.: J. Plant Growth Regul. 32, 429 (2013).
4. Cook C. E., Whichard L. P., Turner B., Wall M. E., Egley G. H.: Science 154, 1189 (1966).
5. Zwanenburg B., Mwakaboko A. S., Reizelman A., Anilkumar G., Sethumadhavan D.: Pest Manag. Sci.
65, 478 (2009).
6. Kgosi R. L., Zwanenburg B., Mwakaboko A. S., Murdoch A. J.: Weed Res. 52, 197 (2012).
7. Johnson A. W., Roseberry G., Parker C.: Weed Res.
16, 223 (1976).
8. Zwanenburg B., Pospíšil T.: Mol. Plant. 6, 38 (2013).
9. Wigchert S. C. M., Kuiper E., Boelhouwer G. J., Nefkens G. H. L., Verkleij J. A. C., Zwanenburg B.: J.
Agric. Food Chem. 47, 1705 (1999).
10. Akiyama K., Ogasawara S., Ito S., Hayashi H.: Plant Cell Physiol. 51, 1104 (2010).
11. Yoneyama K., Xie X., Kim H. I., Kisugi T., Nomura T., Sekimoto H., Yokota T., Yoneyama K.: Planta 235, 1197 (2012).
12. Seto Y., Sado A., Asami K., Hanada A., Umehara M., Akiyama K., Yamaguchi S.: Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 111, 1640 (2014).
13. Zhang Y., van Dijk A. D. J., Scaffidi A., Flematti G.
R., Hofmann M., Charnikhova T., Verstappen F., Hepworth J., van der Krol S., Leyser O., Smith S. M., Zwanenburg B., Al-Babili S., Ruyter-Spira C., Bouwmeester H. J.: Nat. Chem. Biol. 10, 1028 (2014).
14. Hamiaux C., Drummond R. S. M., Janssen B. J., Led- ger S. E., Cooney J. M.: Curr. Biol. 22, 2032 (2012).
15. Cavar S., Zwanenburg B., Trkowski P.: Phytochem.
Rev. 2015, in press, doi: 10.1007/s11101-014-9370-4.
16. Boyer F. D., de Saint Germain A., Pillot J. P., Pouvre- au J. B., ChenV. X., Ramos S., Ste´venin A., Simier P., Delavault P., Beau J. M., Rameau C.: Plant Physi- ol. 159, 1524 (2012).
17. Xie X., Yoneyama K., Kisugi T., Uchida K., Ito S., Akiyama K., Hayashin H., Yokota T., Nomura T., Yoneyama K.: Mol. Plant. 6, 153 (2013).
18. Ueno K., Nomura S., Muranaka S., Mizutani M., Ta- kikawa H., Sugimoto Y.: J. Agric. Food Chem. 59, 10485 (2011).
19. Xie X., Yoenyama K., Kurita J.-Y., Harada Y., Yama- da Y., Takeuchi Y., Yoneyama Y.: Biosci. Biotechnol.
Biochem. 73, 1367 (2009).
20. Chen V. X., Boyer F. D., Rameau C., Pillot J.-P., Vors J.-P., Beau J.-M.: Chem.-Eur. J. 19, 4849 (2013).
21. Mangnus E. M., Stommen P. L. A., Zwanenburg B.:
Plant Growth Regul. 11, 91 (1992).
22. Zwanenburg B., Mwakaboko A. S.: Bioorg. Med.
Chem. 19, 7394 (2011).
23. Mangnus E. M., van Vliet L. A., Vandenput D. A. L., Zwanenburg B.: J. Agric. Food Chem. 40, 1222 (1992).
24. Malik H., Rutjes F. P. J. T., Zwanenburg B.: Tetra- hedron 66, 7198 (2010).
25. Kondo Y., Tadokoro E., Matsuura M., Iwasaki K., Sugimoto Y., Miyake H., Takikawa H., Sasaki M.:
Biosci. Biotechnol. Biochem. 71, 2781 (2007).
26. Zwanenburg B., Nayak S. K., Charnikhova T. V., Bouwmeester H. J.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5182 (2013).
27. Fukui K., Ito S., Ueno K., Yamaguchi S., Kyozuka J., Asami T.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 4905 (2011).
28. Reizelman A., Wigchert S. C. M., del-Bianco C., Zwanenburg B.: Org. Biol. Chem. 1, 950 (2003).
29. Prandi C., Rooso H., Lace B., Occhiato E. G., Oppedi- sano A., Tabasso S., Alberto G., Blangetti M.: Mol.
Plant. 6, 113 (2013).
30. Rasmussen A., Heugebaert T., Matthys C., Van Deun R., Boyer F.-D., Goormachtig S., Stevens C., Geelen, D.: Mol. Plant. 6, 99 (2013).
31. Mangnus E. M., Zwanenburg B.: J. Agric. Food Chem. 40, 1066 (1992).
32. Sugimoto Y., Wigchert S. C. M., Thuring J. W. J. F., Zwanenburg B.: J. Org. Chem. 63, 1259 (1998).
33. Pouvreau J.-B., Gaudin Z., Auger B., Lechat M.-M., Gauthier M., Delavault P., Simier P.: Plant Methods 9, 1 (2013).
34. Scaffidi A., Waters M. T., Bond C. S., Dixon K. W., Smith S. M., Ghisalberti E. L., Flematti G. R.: Bioorg.
Med.Chem. Lett. 22, 3743 (2012).
M. Dvořáková and T. Vaněk(Institute of Experi- mental Botany, Academy of Sciences of the Czech Repub- lic, Prague): Strigolactones – Their Structure and Function in Plants
Strigolactones are the most recent class of fytohor- mones, which were originally recognized as stimulators of seed germinators of parasitic weeds Striga and Orobanche spp. They also stimulate symbiosis of plants with arbuscu- lar mycorhizal fungi. Their functions in plants and biosyn- thesis are described. The isolated natural strigolactones and their main synthetic derivatives are listed. Attention is focused on their mechanism of action and structure- activity relationships.
