Zobrazit Dangerous Pathogen Enterobacter sakazakii and Its Detection

M

B

, L

F

a P

R

Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha, Technic- ká 5, 166 28 Praha 6

Došlo 3.8.09, přijato 15.10.09.

Klíčová slova: Enterobacter sakazakii, dětská výživa, po- lymerázová řetězová reakce, chromogenní a fluorogenní média, Cronobacter spp.

Obsah 1. Úvod 2. Legislativa

3. Metody detekce Enterobacter sakazakii 3.1. Kultivační metody

3.2. Chromogenní a fluorogenní média 3.3. Biochemické soupravy

3.4. Molekulární metody 3.5. Porovnání metod detekce 4. Závěr

1. Úvod

„Žlutě pigmentovaný Enterobacter cloacae“ byl v roce 1980 rozpoznán jako nový druh mikroorganismu¹ a přejmenován na Enterobacter sakazakii. Od té doby se tento patogen stal předmětem mnoha studií. Pojem Entero- bacter sakazakii zahrnuje skupinu bakterií, gramnega- tivních, mobilních, tyčinkového tvaru, které jsou velice přizpůsobivým patogenem. Enterobacter sakazakii způso- buje infekční onemocnění zvláště u předčasně narozených dětí a dětí v prvních týdnech života, která velmi často kon- čí úmrtím. Mikrobiologický přehled této problematiky přehledně zpracovaly Demnerová a Pazlarová². V roce 2007 bylo zjištěno, že Enterobacter sakazakii se skládá z více druhů s rozlišným genotypem a fenotypem³. Zmatek v taxonomii se stal výzvou pro velký kolektiv autorů, který hlubokou analýzou izolovaných 210 kmenů E. sakazakii s využitím molekulárně-biologických technik (např. analý- zy genu pro malou ribosomální podjednotku 16S rRNA a DNA-DNA hybridizace) navrhl reklasifikaci tohoto or- ganismu do nového rodu Cronobacter, jenž podle autorů⁴ obsahuje nejméně šest různých druhů a řadí se mezi Ente- robacteriaceae. Rod Cronobacter zahrnuje, podle této

práce, Cronobacter sakazakii, Cronobacter malonaticus, Cronobacter muytjensi, Cronobacter turicensis, Crono- bacter dublinensis (C. dublinensis subsp. dublinensis, C. dublinensis subsp. lausannensis, C. dublinensis subsp.

lactardi) a Cronobacter genomospecies 1.

Současná platná potravinářská legislativa vycházející z nařízení Evropské komise však dosud používá název Enterobacter sakazakii, místo Cronobacter spp.

V literatuře se však zatím používají nejednotně oba názvy, Enterobacter sakazakii a Cronobacter spp., jako synony- ma, mimo jiné proto, že zatím nejsou propracovány meto- dy detekce Cronobacter spp. a rovněž není prozkoumána patogenicita jednotlivých druhů tohoto nového rodu. Poda- řilo se však izolovat několik virulentních faktorů⁵. Jedná se o látky podobné enterotoxinům, které byly také purifiko- vány⁶. Kromě toho byl izolován protein⁷, který byl identi- fikován jako metaloproteasa obsahující Zn²⁺. Podařilo se rovněž získat proteiny z povrchu⁸ Enterobacter sakaza- kii. Některé z nich byly identifikovány^911. Jsou to: en- zym -glukosidasa, proteiny, které mohou vázat aminoky- seliny a sacharidy a proteiny vnější membrány (OmpA, OmpC, Protein A). Tyto poznatky slouží také jako základ pro vývoj nových metod detekce Enterobacter sakazakii.

Vzhledem k nebezpečnosti Enterobacter sakazakii je nezbytné mít k dispozici vhodné metody jeho detekce.

Vedle klasických kultivačních technik se postupně prosa- zují rychlé metody založené na biochemických a moleku- lárně-biologických principech. V tomto přehledu je podán jejich výčet a stručná charakteristika.

2. Legislativa

Bezpečností potravin se v rámci EU zabývá Evropský úřad pro bezpečnost potravin (European Food Safety Authority, EFSA), vlastními biologickými riziky pak vě- decká skupina pro sledování biologického rizika (BIOHAZ Panel). Do mikrobiologického rizika dětské výživy byl v roce 2004 zahrnut také Enterobacter sakaza- kii. Bylo konstatováno, že možný výskyt tohoto patogenu v dětské výživě představuje pro konzumenty velké zdra- votní riziko. Rod Enterobacteriaceae, který se všeobecně vyskytuje v potravinách, může sloužit jako indikátor rizi- ka. Proto EFSA doporučila sledování přítomnosti patogen- ních mikroorganismů jak při výrobě potravin, tak v potravinářských výrobcích¹².

V listopadu 2005 přijala Evropská komise regulační opatření č. 2073/2005, kterým se stanovují mikrobiologic- ká kritéria pro potraviny. Cílem tohoto nařízení bylo snížit množství určitých mikroorganismů a zavést pravidla, která musí výrobci potravin dodržovat. Toto regulační opatření Evropské komise vyžaduje nepřítomnost Enterobacter sakazakii v 10 g vzorku sušené počáteční kojenecké výži-

NEBEZPEČNÝ PATOGEN Enterobacter sakazakii A JEHO DETEKCE

vy a v sušených dietních potravinách pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsíců věku. Zmíněné nařízení bylo upraveno novým regulačním opatřením č. 1441/2007 vydaným v prosinci 2007, avšak limity pro Enterobacter sakazakii zůstaly stejné. Jako referenční analytická metoda¹³ se používá klasická kultivační mikro- biologická metoda ISO/TS 22964 (2006).

3. Metody detekce Enterobacter sakazakii V posledních letech byla věnována intenzivní vý- zkumná činnost vývoji metod detekce Enterobacter saka- zakii. Hlavní obtíž při detekci Enterobacter sakazakii, a také jiných patogenů, je potřeba splnit legislativní nároky (viz kap. 2) a prokázat jednu mikrobiální buňku v několikagramovém vzorku potraviny, resp. naopak doká- zat, že se v tomto vzorku žádný patogen nevyskytuje. Pro- to se osvědčují zvláště klasické kultivační techniky, které umožní po několikadenní kultivaci namnožit a izolovat mikrobiální patogen, jehož identita je následně určena na základě morfologických a biochemických vlastností. Ta- kový postup trvá obvykle 5 až 7 dní. Z hlediska hygienic- kých opatření (HACCP) je však potřebné vědět co nej- rychleji, zda je potravina kontaminována, nikoliv až v horizontu více dnů.

Proto jsou vyvíjeny tzv. rychlé metody, využívající různé principy detekce. Cílem je získat výsledek detekce patogenních mikroorganismů¹⁴ co nejdříve, nejpozději za 24 až 48 h. Tyto metody by navíc měly být i uživatelsky snadno a lehce použitelné (friendly use).

Avšak ani použitím rychlých metod se nevyhneme kultivačnímu kroku, který musí umožnit pomnožení třeba jediné buňky mikroorganismu v analyzovaném vzorku o několik řádů. Mnohdy je třeba ještě mikrobiální buňky revitalizovat kultivací ve vhodném kultivačním médiu^15,16. Obvykle takové kultivace trvají 24 h. Po tomto kroku často následují izolační postupy, které vedou k dalšímu zvýšení množství mikroorganismů v analyzovaném vzorku. Využí- vá se např. imunomagnetické separace nebo adsorbce mik- roorganismů na vhodný nosič, např. hydroxidy zirkonia¹⁷. Takto se získají vzorky, ve kterých lze dále uvedenými me- todami již prokázat Enterobacter sakazakii v 10 g vzorku.

3.1. Kultivační metody

Mikrobiologické kultivační metody používané pro detekci Enterobacter sakazakii jsou založeny na selektivní kultivaci mikroorganismu po jeho kultivačním nabohacení.

Jako standardní ISO metoda akceptovaná také Mezi- národní mlékařskou federací (IDF) byl nedávno přijat po- stup (ISO/TS 22964:2006) definující metodu detekce E. sakazakii v mléce a mléčných výrobcích. Podstatou zkoušky je pomnožení nejprve v neselektivní (pufrovaná peptonová voda) a posléze v selektivní (tryptózová půda s laurylsulfátem) půdě. Následuje izolace na chromogen- ním agaru pro Enterobacter sakazakii (Enterobacter saka- zakii isolation agar, ESIA) a na sojovém agaru (Trypton

soya agar, TSA). Podezřelé kolonie (žluté kolonie na TSA, modré kolonie na ESIA) z obou agarů jsou identifikovány biochemickými testy.

Vyhledávání vhodných kultivačních médií však stále pokračuje. Cílem je získat vyšší obohacení kultivovaných vzorků, lepší specifitu detekce a snížit počet používaných kultivačních médií. Nedávno byly popsány postupy využí- vající pouze jedno kultivační médium^18,19. Dokonce byl popsán postup umožňující rozlišení živých buněk Entero- bacter sakazakii od mrtvých²⁰.

3.2. Chromogenní a fluorescenční média

Tato média jsou používána zvláště po kultivačním obohacení vzorku jako první kritérium výskytu Enterobac- ter sakazakii. Jedním z nejvýznamnějších znaků Entero- bacter sakazakii je přítomnost enzymu -glukosidasy.

Tento enzym ostatní zástupci enterobakterů nemají²¹. Pří- tomnost -glukosidasy byla využita pro vývoj selektivních chromogenních/fluorogenních substrátů pro detekci Ente- robacter sakazakii. Mezi chromogenní substráty patří např.

5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glukopyranosid, který je přeměňován -glukosidasou na pigment, který obarví ko- lonie Enterobacter sakazakii na charakteristické modro- zelené zabarvení²². Substrát není selektivní a poskytuje falešně pozitivní výsledky také s Escherichia vulneris, Pantoea sp. a Citrobacter koseri. Jiným chromogenním substrátem, který může být použit pro detekci Enterobac- ter sakazakii, je využití trypsinových štěpů sojového agaru a -D-glukopyranosidu. Působením přítomné -gluko- sidasy vznikají přeměnou přidaného substrátu žluté zóny p-nitrofenylového hydrolyzátu²³.

Nejspolehlivější výsledky, ověřené v rozsáhlé studii²⁰, byly získány při použití selektivních chromogenních médií podle Druggan-Forsythe-Iversen (DFI) agaru²⁴ a Chromo- cult® E. sakazakii (CES) agaru fy Merck. Případné falešně pozitivní výsledky poskytují vzorky obsahující mikroorga- nismy, které mají -glukosidasu. Hledání nových médií pro skríningové metody pokračuje²⁵.

Nejznámnějším fluorogenním substrátem pro detekci Enterobacter sakazakii je methylumbelliferyl--D-gluko- sid²⁶. Přítomná -glukosidasa přeměňuje substrát za vzniku třpytivých fluoreskujících kolonií Enterobacter sakazakii.

Fluorescenčně značené vybrané sekvence genů pro ribosomální RNA Enterobacter sakazakii lze detegovat soupravou VIT-E.sakazakii, fy Vermicon Identification Technology. Fluoreskující buňky Enterobacter sakazakii jsou viditelné pod fluorescenčním mikroskopem. Velkou výhodou tohoto postupu je, že jsou viditelné pouze vitální buňky s vysokým obsahem ribosomů a že celá detekce trvá méně než tři hodiny. Detekční limit je 10³ kolonie tvoří- cích jednotek²⁷ (KTJ)/ml. Fluorescenční techniky však zatím nedosáhly většího rozšíření.

3.3. Biochemické soupravy

Mikroorganismy, které mají být identifikovány, se musí napřed izolovat ve vhodném kultivačním médiu

podle standardních mikrobiologických technik. K detekci Enterobacter sakazakii jsou používány biochemické sou- pravy, založené na průkazu přítomnosti určitých enzymů, charakteristických pro tento mikroorganismus. Příkladem takové soupravy je API 20 E panel²⁸. Prokázalo se však, že tato souprava poskytuje jak falešně pozitivní, tak i falešně negativní výsledky, a proto byl test modifikován²⁹ a počet identifikačních reakcí rozšířen na 32. Souprava je komerč- ně dostupná pod názvem API Rapid ID 32 E, výrobce firma bioMérieux SA. Tento test je standardizovaný iden- tifikační systém pro Enterobacteriaceae a další gramnega- tivní tyčinky, který využívá 32 miniaturizovaných bioche- mických testů a specifickou databázi. Úplný přehled mik- roorganismů, které je možné pomocí tohoto systému iden- tifikovat, je uveden v identifikační tabulce přiložené k testu. Proužek ID 32 E sestává z 32 jamek, které obsahu- jí dehydratované testovací substráty. Po 24 hodinách inku- bace se reakce v jednotlivých jamkách vyhodnocují buď pomocí přístrojů ATB Expression, nebo mini API. Výsled- ky je možné získat i vizuálně. Jednou z nejvýraznějších biochemických charakteristik Enterobacter sakazakii je

přítomnost -glukosidasy. Jako substrát se používají syn- tetické sloučeniny D-glukosy s p-nitrofenylovými deriváty.

Produkce žlutého p-nitrofenylu odlišuje Enterobacter sakazakii od dalších druhů rodu Enterobacter.

Pro aplikaci biochemických testů je základním poža- davkem mít k dispozici čistou bakteriální kulturu a zručné- ho a zkušeného pracovníka vyšetřujícího daný vzorek.

3.4. Molekulární metody

Velké naděje jsou v posledních letech vkládány do tzv. molekulárních metod, tedy postupů, které v našem případě využívají molekulárně-genetických technik, které jsou rychlejší, spolehlivější a hlavně specifičtější než kla- sické metody kultivační³⁰.

První (a zatím jediný) sekvenovaný genom Entero- bacter sakazakii byl zveřejněn v druhé polovině roku 2007. Jednalo se o sbírkový kmen Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894, který pocházel z infikované kojenecké výživy. Jeho genom je tvořen cirkulární DNA délky 4,4 Mbp, kódující 4277 proteinů a dvěma plazmidy².

Tabulka I

Seznam primerů používaných k detekci Enterobacter sakazakii

a RT-PCR (real time PCR), ** data nejsou publikována Název

primeru Sekvence primeru

5‘-sekvence-3‘ Cílový úsek Velikost

produktu Metoda ^a Lit.

Esakf GCTYTGCTGACGAGTGGCGG 16S rDNA 929 pb PCR 31

Esakr ATCTCTGCAGGATTCTCTGG

Esak2 CCCGCATCTCTGCAGGATTCTC 16S rDNA 900 pb PCR 54

Esak3 CTAATACCGCATAACGTCTACG

Saka1 ACAGGGAGCAGCTTGCTGC 16S rDNA 952 pb PCR 32

Saka2b TCCCGCATCTCTGCAGGA

EsAgf TGAAAGCAATCGACAAGAAG gen zodpovědný

za -glukosidasovou aktivitu 1680 pb PCR 27

EsAgr ACTCATTACCCCTCCTGATG

SG-F GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA úsek mezi 16S a 23S rDNA 282 pb PCR 55

SG-R GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG

SI-F CAGGAGTTGAAGAGGTTTAACT úsek mezi 16S a 23S rDNA 251 pb PCR 55

SI-R GTGCTGCGAGTTTGAGAGACTC

Es-ProF GAAAGCGTATAAGCGCGATTC gen zodpovědný za

Zn²⁺ metaloproteasu 350 pb PCR 7

Es-ProR GTTCCAGAAGGCGTTCTGGT

E1 CCCAGACGAAACTCGCCGAG ** 634 pb PCR 42

E2 GGGATAAGCAGATAATGCGATAAA

SF1 TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTG 16S rDNA 426 pb PCR,

RT-PCR 36

SR3 CGGGTAACGTCAATTGCTGCGGT

** ** úsek mezi rpsU (gen kódující

ribosomálníprotein S21) a dnaG (gen kódující primasu)

RT-PCR 56

Většina nových detekčních postupů využívá k průkazu Enterobacter sakazakii polymerázové řetězové reakce (PCR). Vhodný výběr primerů na základě známého genu -glukosidasy (glu A) umožnil specifickou detekci²⁷ Enterobacter sakazakii. Obvykle se však používají prime- ry z oblasti 16S rRNA (viz tab. I). Vyvinutá PCR 16S rRNA umožňuje velmi citlivou detekci³¹ Enterobacter sakazakii (10 pg čistého DNA templátu). Zatímco někteří autoři³² popisují 100% úspěšnost detekce Enterobacter sakazakii, jiní uvádějí nižší procento správné detekce³³. S využitím inhibitorů se podařilo sestavit detekční PCR rozlišující živé a mrtvé buňky³⁴ Enterobacter sakazakii.

Během psaní tohoto přehledu se objevil první úspěšný pokus³⁵ o rozlišení jednotlivých druhů rodu Cronobacter pomocí PCR.

Poslední dobou nacházejí stále častěji uplatnění modi- fikované metody PCR. Real-time PCR, která umožňuje rychlou a specifickou detekci a kvantifikaci specifického úseku nukleové kyseliny, se stala oblíbenou detekční me- todou mikroorganismů. Hned několik autorů popisuje více než 90% úspěšnost detekce Enterobacter sakazakii touto technikou^3638. PCR, která využívá primery založené na repetitivně-extragenně-palidromních (Rep-PCR) sekven- cích, umožnila získat lepší výsledky^3941 v porovnání s 16S rRNA. Osvědčila se také podobná metoda využívající en- terobakteriálně-repetitivně-integrálně-souhlasných (Eric- PCR) sekvencí⁴².

Druhově specifickou DNA je možné detegovat meto- dou LAMP (loop-mediated isothermal amplification). Je to jednoduchá, rychlá, specifická a nenákladná metoda, zahr- nující obohacovací kultivační krok. Je založená na isoter- mální amplifikaci, při které se využívá 4 primerů specific- ky navržených tak, aby rozpoznaly 6 odlišných oblastí cílového genu. Autoři uvádějí citlivost detekce 1,2 KTJ (kolonie tvořící jednotky) ve 100 g kojenecké výživy⁴³.

Úspešně byla použita rovněž technika založená na selektivním pomnožení restrikčních fragmentů³ (AFLP, amplified fragment lenght polymorfism) z celé molekuly DNA pomocí PCR.

Jinou možností je použití metody detekce fluo- rescenční hybridizace in situ (FISH, fluorescence in situ hybridization). Tato metoda umožňuje detekci specific- kých míst na DNA nebo mRNA. Použitím nové sondy (PNA) byla detegována, po kultivačním pomnožení, 1 KTJ Enterobacter sakazakii v 10 g kojenecké výživy⁴⁴.

Stále jsou vyvíjeny další vysoce sofistikované metody umožňující studovat genetickou příbuznost jednotlivých kmenů⁴⁵. Používají se zejména pro identifikační studie Enterobacter sakazakii, resp. Cronobacter spp., v laboratořích a pro svoji náročnost na přístrojové vybave- ní již méně v běžné diagnostice. Významnou roli hraje pulsní gelová elektroforéza (PFGE, pulsed field gel electro- phoresis), která umožňuje analýzu velkého množství DNA fragmentů z celého bakteriálního genomu. PFGE analýza je poněkud zdlouhavá, trvá 23 dny, ale je považována za vysoký standard v subtypizaci bakterií^4650.

Podobný význam má multilokusová sekvenční typiza- ce (MLSA, multilocus sequence analysis). Genetické roz-

díly bakteriálních kmenů jsou studovány na základě sekve- nování nukleotidů chromosomálních genů pro enzymy nebo některé proteiny. Touto metodou autoři⁵¹ dokázali rozlišit jednotlivé druhy Cronobacter spp.

Pro detekci Enterobacter sakazakii byla rovněž po- psána technika využívající oligonukleotidových čipů⁵² (oligonucleotide array).

Intenzivní práce řady laboratoří vyústila ve výrobu a komerční dostupnost souprav sloužících k detekci Ente- robacter sakazakii. Jsou to např.: BAX® System PCR Assay for Screening Enterobacter sakazakii, výrobce Du- Pont; TaqMan® Enterobacter sakazakii Detection Kit, výrobce Applied Biosystems a Real Time PCR Assays fy Merck KGaA. Vlastní použití těchto souprav je však v každém případě podmíněno dostatečně dlouhou kultiva- cí, která musí obsahovat jak revitalizaci mikroorganismu, tak i jeho dostatečné pomnožení před detekčním krokem.

3.5. Porovnání metod detekce

Výsledky detekce Enterobacter sakazakii získané různými metodami jsou velmi často nejednoznačné. Např.

spolehlivost a přesnost metod založených na PCR je vázá- na na výběr primerů a zvolený teplotní cyklus analytické- ho postupu. Může se proto stát, že některé postupy PCR jsou nedostatečně specifické³¹.

To vedlo přední světové laboratoře, které se zabývají touto problematikou, k uskutečnění rozsáhlých studií, při kterých byly za standardních podmínek porovnávány růz- né metody detekce Enterobacter sakazakii. Byly uskuteč- něny dvě velké studie, porovnávající osm různých párů primerů^20,53. Cílem těchto autorů bylo vyhodnotit a porov- nat primery navržené různými autory pro detekci a identi- fikaci Enterobacter sakazakii při analýze reálných vzorků pocházejících převážně z dětské mléčné výživy a ze život- ního prostředí. Navíc autoři těchto studií porovnávali vý- sledky získané PCR s metodou hybridizace DNA-DNA, s metodou používající selektivní média (DFI agar, CES agar, ESIA agar, DFIA agar a ESPM agar), s detekcí - glukosidasy a biochemickými soupravami (API20E a ID32E v3.0). Takový přístup je nesmírně cenný a bohu- žel v literatuře málo častý. Studie těchto autorů představují zásadní průlom v detekci Enterobacter sakazakii.

Autoři první z těchto studií získali velmi uspokojivé výsledky⁵³. Zjistili, že všechny detegované izoláty Entero- bacter sakazakii měly -glukosidasovou aktivitu, chromo- genní média pozitivně detegovala více než 95 % vzorků a biochemický test ID 32 E v3.0 byl úspěšný v 99,5 %.

Nejúspěšnější byla detekce využívající průkazu genů dnaG a gluA, která 100 % vzorků úspěšně prokázala.

Výsledky druhé, velmi rozsáhlé studie, již tak pozitiv- ní nejsou²⁰. Předně se ukázalo, že nejpřesnější identifikač- ní metodou (98 %) je použití selektivních médií využívají- cích kultivace na DFI nebo CES agaru. U postupů založe- ných na PCR se jen u tří dvojic primerů přesnost detekce blíží předchozí metodě a dosahuje max 92 %. U ostatních testovaných primerů kolísá mezi 2986 %. Obdobné vý- sledky autoři získali hodnocením specifity detekce. Porov-

náním získaných pozitivně a negativně určených vzorků s DNA-DNA hybridizačním standardem má opět nejlepší hodnocení technika selektivních médií a jen dva z testovaných primerů. Autoři tak získali podklady pro tvrzení, že z mnoha publikovaných postupů pouze selek- tivní agarová média (DFI a CES) a z používaných primerů (Esakf/Esakr) umožňují získat výsledky s vyšší než 90%

přesností detekce. Proto navrhují použití agarových médií pro výběr pozitivních vzorků po první obohacovací kulti- vaci analyzovaných vzorků a v následujícím detekčním kroku pak použití vybraných primerů za přesně dodržené- ho protokolu PCR. Takovým postupem je možné docílit až 92% přesnosti detekce Enterobacter sakazakii.

Je tedy zřejmé, že problematika detekce Enterobacter sakazaki, alias Cronobacter spp. ještě není zdaleka uzavře- nou kapitolou, jak by se snad mohlo na první pohled zdát.

V současnosti však probíhá v této oblasti intenzivní vý- zkum.

4. Závěr

Velké zdravotní riziko, které přináší Enterobacter sakazakii, alias Cronobacter spp., zvláště pro kojence a batolata, vyvolalo zvýšený zájem o vhodné metody de- tekce tohoto patogenního mikroorganismu. Zejména v posledních čtyřech letech bylo vyvinuto několik principi- álně odlišných detekčních postupů. Mezi získanými vý- sledky však existuje dosud značný nesoulad.

Klasické metody detekce E. sakazakii, kterými lze prokázat nepřítomnost tohoto patogenu v potravině až za několik dní, nejsou pro výrobce potravin dostatečně rych- lé. Je proto nezbytné vyvíjet rychlejší metody detekce, které by dovolily získat informace o možném výskytu tohoto patogenu zejména v dětské výživě a umožnily kont- rolu výrobní technologie a monitorování hygienických podmínek výroby.

V posledních letech byl učiněn velký pokrok ve vývo- ji rychlých metod detekce patogenů. Významnou roli hrají metody založené na využití molekulárně-biologických technik. Pro detekci E. sakazakii bylo zatím popsáno, vedle klasických kultivačních technik a biochemických testů, několik hybridizačních technik. Tyto molekulárně genetické postupy využívají nejčastěji polymerázovou řetězovou reakci. Z technického hlediska mají publikované detekční postupy řadu variant. Nejvíce se zatím osvědčila kombinace kultivace patogenů na agarových (DFI a CES) půdách s následnou detekcí pomocí PCR (cit^20,53). Vývoj metod detekce Enterobacter sakazakii, alias Cronobacter spp. není však zdaleka ukončen a přinese zájemcům o tuto problematiku, velmi pravděpodobně, ještě řadu nečeka- ných problémů.

Autoři děkují za finanční podporu Grantové agentuře ČR projekt 525/09/1075, Národnímu výzkumnému centru 2B06048 a Výzkumnému záměru MSM 6046137305.

LITERATURA

1. Farmer J. J. III, Asbury M. A., Hickman F. W., Bren- ner D. J.: Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 569 (1980).

2. Demnerová K., Pazlarová J.: Chem. Listy 103, 641 (2009).

3. Iversen C., Lehner A., Mullane N., Bidlas E., Cle- enwerck I., Marugg J., Fanning S., Stephan R., Joos- ten H.: BMC Evol. Biol. 7, 64 (2007).

4. Iversen C., Mullane N., McCardell B., Tall B. D., Lehner A., Fanning S., Stephan R., Joosten H.: Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 58, 1442 (2008).

5. Pagotto F. J., Nazarowec-White M., Bidawid S., Far- ber J. M.: J. Food Prot. 66, 370 (2003).

6. Raghav M., Aggarwal P. K. P.: Can. J. Microbiol. 53, 750 (2007).

7. Kothary M. H., McCardell B. A., Frazar C. D., Deer D., Tall B. D.: Appl. Environ. Microb. 73, 4142 (2007).

8. Nilsson I., Utt M., Nilsson H. O., Ljungh A., Wad- strom T.: Electrophoresis 21, 2670 (2000).

9. Riedel K., Lehner A.: Proteomics 7, 1217 (2007).

10. Nair M. K. M., Venkitanarayanan K.: Pediatr. Res. 62, 664 (2007).

11. Singamsetty V. K., Wang Y., Shimada H., Prasadarao N. V.: Microb. Pathog. 45, 181 (2008).

12. Hochel I.: Chem. Listy 103, 814 (2009).

13. ČSN P ISO/TS 22964: Mléko a mléčné výrobky - Průkaz Enterobacter sakazakii (říjen 2006).

14. Blažková M., Karamonová L., Fukal L., Rauch P.:

Chem. Listy 99, 467 (2005).

15. Al-Holy M. A., Lin M., Al-Qadin H. M., Rasco B. A.:

Food Microbiol. 25, 22 (2008).

16. Shaker R. R., Osaili T. M., Abu Al-Hasan A. S., Ay- yash M. M., Forsythe S. J.: J. Food Sci. 73, M354 (2008).

17. Zhou Y., Qingping W., Xiaoke X., Xiaojuan Y., Yin- gwang Y., Zhang J.: Food Microbiol. 25, 648 (2008).

18. Fox E. M., Jordan K. N.: J. Appl. Microbiol. 105, 1091 (2008).

19. O´Brien S., Healy B., Negredo C., Fanning S., Iversen C.: J. Food Prot. 72, 1472 (2009).

20. Cawthorn D.-M., Botha S., Witthuhn R. C.: Int. J.

Food Microbiol. 127, 129 (2008).

21. Muytjens H. L., van der Ros-van de Repe J., van Dru- ten H. A. M.: J. Clin. Microbiol. 20, 684 (1984).

22. Iversen C., Druggan P., Forsythe S.: Int. J. Food Microbiol. 96, 133 (2004).

23. Kandhai M. C., Reij M. W., van Puyvelde K., Guillaume-Gentil O., Beumer R. R., van Schothorst M.: J. Food Prot. 67, 1207 (2004).

24. Iversen C., Waddington M., On S. L., Forsythe S.: J.

Clin. Microbiol. 42, 5368 (2004).

25. Iversen C., Druggan P., Schumacher S., Lehner A., Feer C., Dschwend K., Joosten H., Stephan R.: Appl.

Environ. Microbiol. 74, 2550 (2008).

26. Oh S. W., Kang D. H.: Appl. Environ. Microbiol. 70, 5692 (2004).

27. Lehner A., Nitzsche S., Breeuwer P., Diep B., Thelen K., Stephan R.: BMC Microbiol. 6, 15 (2006).

28. Washington J. A., Yu P. K. W., Jeffery M. W.: Appl.

Microbiol. 22, 267 (1971).

29. Iversen C., Forsythe S.: Food Microbiol. 21, 771 (2004).

30. Blažková M., Koets M., Rauch P., van Amerongen A.: Eur. Food Res. Technol. 229, 867 (2009).

31. Lehner A., Stephan R.: J. Food Prot. 67, 2850 (2004).

32. Hassan A. A., Akineden O., Kress C., Estuningsih S., Schneider E., Usleber E.: Int. J. Food Microbiol. 116, 214 (2007).

33. Gutierrez-Rojo R., Torres-Chavolla E.: J. Rapid Meth.

Automat. Microbiol. 15, 345 (2007).

34. Cawthorn D.-M., Witthuhn R. C.: J. Appl. Microbiol.

105, 1178 (2008).

35. Stoop B., Lehner A., Iversen C., Fanning S., Stephan R.: Int. J. Food Microbiol., v tisku (2009).

36. Kang S. E., Nam Y. S., Hong K. W.: J. Microbiol.

Biotechnol. 17, 516 (2007).

37. Lehmacher A., Fiegen M., Hansen B.: J. Consumer Protect. Food Safety 2, 218 (2007).

38. Krasccsenicsova K., Trncikova T., Kaclikova E.: Food Anal. Meth. 1, 85 (2008).

39. Choi S. H., Choi J. W., Lee S. B.: Food Sci. Biotech- nol. 17, 1171 (2008).

40. Proudy I., Bougle D., Coton E., Coton M. Leclercq R., Vergnaud M.: J. Appl. Microbiol. 104, 26 (2008).

41. Proudy I., Bougle D., Leclercq R., Vergnaud M.: J.

Appl. Microbiol. 105, 550 (2008).

42. Ye Y. W., Wu P. Q., Zhou Y. H., Dong X. H., Zhang J. M.: J. Microbiol. Meth. 75, 392 (2008).

43. Liu C., Zheng W. J., Zhang W. H., Hou Y. M., Liu Y.:

J. Food Safety 29, 83 (2009).

44. Almeida C., Azevedo N. F., Iversen C., Fanning S., Keevil C. W., Vieira M. J.: Appl. Environ. Microbiol.

75, 2925 (2009).

45. Michalska A., Gospodarek E.: Postepy Mikrobiologii 46, 39 (2007).

46. Mullane N. R., Whyte P., Wall P. G., Quinn T, Fan- ning S.: J. Food Microb. 116, 73 (2007).

47. Healy B., Mullane N., Collin V., Mailler S., Iversen C., Chatellier S., Storrs M., Fanning S.: J. Food Prot.

71, 1372 (2008).

48. Molloy C., Cagney C., O'Brien S., Iversen C., Fanning S., Duffy G.: Int. J. Food Microbiol. doi:10.1016/

j.ijfoodmicro.2009.07.007, v tisku (2009).

49. Baumgartner A., Grand M., Liniger M., Iversen C.:

Int. J. Food Microbiol., v tisku (2009).

50. El-Sharoud W. M., O´Brien S., Negredo C., Iversen C., Fanning S., Healy B.: BMC Microbiol. 9, 24 (2009).

51. Kuhnert P., Korczak B. M., Stephan R., Joosten H., Iversen C.: Int. J. Food Microbiol., v tisku (2009).

52. Liu Y., Gao Q. L., Zhang X., Hou Y. M., Yang J. L., Huang XT.: Molecular Cellular Probes 20, 11 (2006).

53. Iversen C., Lehner A., Mullane N., Marugg J., Fan- ning S., Stephan R., Joosten H.: J. Clin. Microbiol. 45, 3814 (2007).

54. Keyser M., Witthuhn R. C., Ronquest L.-C., Britz T.

J.: Biotechnol. Lett. 25, 1893 (2003).

55. Liu Y., Cai X., Zhang X., Gao Q., Yang X., Zheng Z., Luo M., Huang X.: J. Microbiol. Methods 65, 21 (2006).

56. Seo K. H., Brackett R. E.: J. Food Prot. 68, 59 (2005).

M. Blažková, L. Fukal, and P. Rauch (Department of Biochemistry and Microbiology, Institute of Chemical Technology, Prague): Dangerous Pathogen Enterobacter sakazakii and Its Detection

The aim of the review is to characterize Enterobacter sakazakii alias Cronobacter sp. as one of most dangerous microbial contaminants in foods. The microbe is a patho- gen causing a serious disease in premature and newborn infants, rarely in adults. Despite a low occurrence of the infections, a high mortality (up to 80 %) has been reported.

A survey of methods of its detection is given. Cultivation, chromogenic/fluorogenic media, biochemical kits and molecular genetic methods are promising in Enterobacter sakazakii screening in foods.