Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta Charles University, Faculty of Science
Doktorský studijní program: Mikrobiologie Ph.D. study programme: Microbiology
Autoreferát dizertační práce Summary of the Ph.D. Thesis
Vliv mikrobioty na obranné mechanismy žížal Effects of microbiota on defense system of earthworms
Mgr. Jiří Dvořák
Školitel/Supervisor: RNDr. Martin Bilej, DrSc.
Prague, 2017
Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova a Akademie věd České republiky
Program: Mikrobiologie
Předseda oborové rady: doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc.
Školicí pracoviště: Laboratoř buněčné a molekulární imunologie,
Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky, v. v. i.
Autor: Mgr. Jiří Dvořák
Školitel: RNDr. Martin Bilej, DrSc.
S dizertací je možno se seznámit v příslušných knihovnách Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy.
Doctoral Studies in Biomedicine
Charles University and Czech Academy of Sciences Programme: Microbiology
Chairman of
the Supervisory Committee: doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc.
Training workplace: Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, Institute of Microbiology of the CAS, v. v. i.
Author: Mgr. Jiří Dvořák
Supervisor: RNDr. Martin Bilej, DrSc.
The Ph.D. thesis is available at the library of Faculty of Sciences, Charles University in Prague.
Obsah/Table of contents
Abstrakt 4
1. Úvod 5
1.1. Ekologie žížal 5
1.2. Obranné mechanismy žížal 6 1.3. Homeostáza železa a imunitní procesy 7
2. Cíle 7 3. Materiál a metodika 8 4. Výsledky a diskuze 9 5. Závěr 12
Abstract 13
1. Introduction 14
1.1. Earthworm ecology 14
1.2. Defense system of earthworms 15
1.3. Iron homeostasis and immune processes 16
2. Aims 16
3. Material and Methods 17
4. Results and discussion 18
5. Conclusion 21
Seznam použité literatury/References 22
Curriculum vitae 25
Seznam publikací/List of publications 26
Abbreviations 27
4
Abstrakt
Žížaly patří mezi významné půdní bezobratlé živočichy. Přispívají ke koloběhu živin v půdních ekosystémech a podílí se na tvorbě půd ovlivňováním jak fyzikálně chemických tak mikrobiálních procesů. Půdy jsou nejvíce mikrobiálně různorodým prostředím na Zemi. Půdní bezobratlí proto musí mít dobře vyvinutý imunitní systém. Žížaly se používají jako modelový organismus pro studium imunitních procesů několik desítek let. Mají jednoduchou stavbu těla.
Její základní schéma je založeno na trávicí trubici, která leží uvnitř dutiny coelomu. Obě dutiny jsou otevřené vůči vnějšímu prostředí, a z toho důvodu obsahují mikroorganismy.
V naší laboratoři používáme mnoho let jako imunologický model druh žížaly Eisenia andrei.
Přirozeným prostředím těchto žížal je kompost obsahující velké množství mikroorganismů, a proto mají dobře vyvinutý imunitní systém. Objasnění nových obranných mechanismů tohoto druhu je předmětem této práce. Popsali jsme dva nové receptory rozpoznávající vzory u žížal, a sice Toll-like receptor (TLR) a protein rozpoznávající lipopolysacharid (LBP/BPI). Obě tyto molekuly jsou produkovány coelomocyty a jejich exprese se zvyšuje po mikrobiální stimulaci. Tyto receptory se také exprimují v trávicím traktu. Střevo žížal obsahuje mnohem více bakterií v porovnání s coelomem. Slizniční imunitní systém střev vytváří složité interakce se střevními mikroorganismy. Na těchto interakcích se podílejí také trávicí procesy, které mohou štěpením bakterií podpořit proces rozpoznávání bakteriálních komponent proteiny rozpoznávající vzory. Předpokládáme, že vysoká mikrobiální zátěž v trávicím traktu může podnítit uvolňování coelomocytů z výstelky coelomu a jejich následnou diferenciaci.
Aktivita imunitního systému byla sledována u dvou epigeických druhů, E. andrei a E. fetida.
Imunitní systém E. andrei je v některých ohledech efektivnější, konkrétně v produkci antimikrobiálních proteinů. Navíc bylo prokázáno, že dioxiny významně poškozují tkáně trávicího traktu. Žížaly reagují na tyto polutanty produkcí antioxidačních molekul.
5
1. Úvod
Žížaly patří mezi bezobratlé živočichy s pravým coelomem a dvoustrannou tělní symetrií. Řadí se do kmenu kroužkovci (Annelida). Mají segmentované tělo přizpůsobené k suchozemskému způsobu života. Základní schéma jejich tělní organizace je založeno na trávicí trubici, která prochází celou délkou těla a je uložena v coelomové dutině plnící funkci hydrostatického skeletu. Coelomová dutina má epiteliální výstelku mesodermálního původu [1]. Z této výstelky se do coelomu uvolňují buňky zvané coelomocyty, které následně plní rozličné funkce včetně funkce imunitní [2]. Trávicí systém žížal je tvořen jednoduchou trubicí a dělí se na ústní dutinu, hltan, jícen, žláznatý žaludek, svalnatý žaludek a střevo.
Žížaly patří mezi významné půdní organismy a lze je nalézt téměř ve všech typech půd. Půdy představují prostředí s velmi komplexními mikrobiálními společenstvy. Coelom i trávicí trakt jsou dutiny v přímém kontaktu s vnějším prostředím, a proto jsou v neustálém kontaktu s půdními mikroorganismy. Žížaly musí mít účinný imunitní systém, aby mohli v tomto mikrobiálně bohatém prostředí přežít. Žížaly, stejně jako ostatní bezobratlí, mají pouze nespecifickou vrozenou imunitu. Tyto imunitní mechanismy působí rozdílně v coelomu a trávicím traktu. Množení mikroorganismů v coelomu je nežádoucí. Coelomocyty, výkonné buňky imunitního systému, zabíjejí bakterie pomocí fagocytózy, enkapsulace a produkcí širokého spektra antimikrobiálních molekul do prostoru coelomu. Naproti tomu trávicí trakt obsahuje obrovské množství mikroorganismů, které se do něj dostávají v pozřené půdě. Toto se odráží i v komplikovanějších vztazích mezi imunitním systémem střeva a mikroorganismy.
1.1. Ekologie žížal
Žížaly hrají významnou roli v půdních transformačních procesech. Přispívají k dekompozici organických zbytků, tvorbě humusu, koloběhu živin a podílí se na strukturní přeměně půd [3, 4]. Na základě jejich vrozeného chování je můžeme rozdělit do tří ekologických skupin: žížaly epigeické, endogeické a anektické [5, 6]. Epigeické žížaly žijí v blízkosti půdního povrchu a jsou odpovědné za asimilaci rostlinného opadu do vrchních vrstev půd. Mezi epigeické žížaly řadíme druhy Dendrobaena octaedra, Lumbricus rubellus, Eisenia fetida a Eisenia andrei. Endogeické žížaly lze nalézt v hlubších organo-minerálních vrstvách půd a řadíme mezi ně například druhy Allolobophora chlorotica, Apporectodea caliginosa, Apporectodea rosea. Anektické žížaly vytvářejí trvalejší chodbičky, které vertikálně procházejí skrz půdní horizonty. Mezi anektické žížaly patří například druhy Lumbricus terrestris a Apporectodea longa. Množství a rozmanitost mikroorganismů se mění v průběhu půdních horizontů a snižuje se vzrůstající hloubkou [7, 8]. Žížaly z odlišných ekologických skupin jsou proto v kontaktu s rozdílnými mikrobiálními společenstvy.
Žížaly lze využít jako vhodné modelové organismy pro studium znečištění půd. Jejich epiteliální povrchy jsou v neustálém kontaktu s půdními částicemi a polutanty přítomné v půdách tak mohou tyto epitely přímo ovlivňovat [9, 10]. Existuje velké množství protokolů, které jsou zaměřeny na studium dopadu odpadních látek na různé biologické parametry žížal.
Mezi ně patří například testy sledující vliv polutantů na aktivitu enzymů zapojených v detoxifikačních nebo opravných procesech buněk. Lze sem zařadit protokoly stanovující aktivity enzymů cytochromu P450 [11], superoxid dismutázy, katalázy a peroxidázy [12], metalothioneinů [13] a proteinů teplotního šoku [14]. Pro tyto testy se používají rozličné druhy žížal, nejčastěji však druhy E. andrei a E. fetida.
6 1.2. Obranné mechanismy žížal
Kůže představuje primární ochranu žížal před vnějším prostředím půd. Je tvořena jednovrstevným epitelem, který je pokrytý tenkou vrstvou kutikuly. Kůže není absolutně nepropustnou bariérou a jsou v ní dorzální póry a nefridiopóry, které vytváří přímé spojení mezi coelomem a vnějším prostředím. Z toho důvodu obsahuje coelomová tekutina žížal půdní mikroorganismy [15]. Epiteliální výstelka coelomu je zdrojem coelomocytů [16, 17].
Jejich množství hraje důležitou roli při snižování počtu mikroorganismů v coelomu.
V důsledku jejich několikanásobné převahy mohou být mikroorganismy efektivně odstraněny pomocí fagocytózy [18].
Kromě fagocytózy zabíjejí coelomocyty bakterie produkcí různých molekul, které jsou zodpovědné za rozpoznávání mikroorganismů a jejich následné zničení pomocí nebuněčných procesů. Jedna z těchto molekul byla popsána jako coelomový cytolytický faktor (CCF).
Jedná se o receptor rozpoznávající vzory (angl. pattern recognition receptor; zkr. PRR) s vazebnou afinitou k ß-1,3 glukanu a lipopolysacharidu (LPS) [19]. Shluky bakterií nebo parazité představují příliš velké částice a nemohou být proto pozřeny jedinou buňkou. Mohou být ale eliminovány pomocí procesu enkapsulace. Během tohoto procesu dochází k tvorbě melaninu a volných kyslíkových radikálů, které ničí cizorodé mikroorganismy. Tvorba melaninu se spouští aktivací fenoloxidázové kaskády, která představuje základní obranný mechanismu mnohých bezobratlých živočichů [20]. PRR molekuly hrají významnou úlohu v této aktivaci a bylo prokázáno, že CCF spouští tuto kaskádu u žížal [19].
Coelomová tekutina žížal druhu E. fetida vykazuje hemolytickou aktivitu. Většina identifikovaných proteinů s hemolytickou aktivitou má také baktericidní a bakteriostatické účinky proti půdním bakteriím [21, 22]. Některé z těchto molekul byly popsány a označeny jako Eisenia fetida andrei faktory (EFAF) [23]. EFAF byly charakterizovány na molekulární úrovni a pojmenovány fetidiny [24, 25]. Nezávisle na tom byl popsán podobný protein způsobující kontrakce hladké svaloviny u potkanů a byl pojmenován lysenin [26, 27]. Spolu s ním byly popsány i dva lyseninu podobné proteiny o velikosti 42 kDa, které způsobují pouze slabou kontrakci hladkého svalstva potkanů. Později byl popsán nový člen této rodiny a pojmenován lysenin-related protein 3 [28]. Sekvenční analýza těchto proteinů odhalila jejich vysokou podobnost. Bylo prokázáno, že fetidin a lysenin jsou kódovány nezávislými geny a exprese těchto genů vykazuje odlišnosti při porovnávání jednotlivců [29].
V coelomové tekutině druhu E. fetida byla také popsána lysozymová aktivita [30].
Částečná charakterizace molekuly lysozymu žížal poukázala na jeho homologii s ostatními molekulami lysozymů bezobratlých živočichů [31]. Detailní charakterizace této molekuly vedla k získání cDNA sekvence a následně k přípravě rekombinantního proteinu [32]. Bylo prokázáno, že exprese lysozymu se zvyšuje po mikrobiální stimulaci.
Buněčná výstelka vnitřních orgánů včetně střeva se nazývá sliznice. Sliznice kryjí vnitřní povrchy těla a tvoří významnou část imunitního systému, který se označuje jako slizniční imunita. Mikrobiota představuje společenství mikroorganismů interagujících se slizničním imunitním systémem na bázi molekulárního rozpoznávání, zvláště pak prostřednictvím receptorů rozpoznávající vzory (PRRs) [33]. Komplexní interakce mezi komenzálními bakteriemi střev a imunitním systémem jsou podmínkou pro normální vývoj a zachování imunologické integrity slizničních povrchů [34].
7 1.3. Homeostáza železa a imunitní procesy
Imunologické procesy jsou závislé na přítomnosti určitých esenciálních prvků. Železo je prvek, který se jako kofaktor účastní důležitých biochemických procesů. Jeho nedostatek i přebytek má negativní dopad na důležité životní funkce. Hlavní zásobárnou molekul železa jsou proteiny zvané feritiny [35]. Tyto proteiny hrají klíčovou úlohu při udržování stabilní hladiny železa v organismech [36]. Jejich exprese je regulována na posttranskripční úrovni interakcí mezi proteinem regulujícím železo (angl. iron regulatory protein; zkr. IRP) a specifickými sekvencemi v 5' nepřekládané oblasti mRNA molekuly feritinu. Tyto sekvence se nazývají iron-responsive elements (IRE) [37]. Při nízké koncentraci železa se IRP protein váže na IRE sekvenci, čímž blokuje translaci mRNA feritinu v důsledku nemožnosti vazby ribozomů do 5' nepřekládané oblasti mRNA [38]. Vysoká koncentrace železa má za následek vytvoření 4Fe-4S klastru v molekule IRP, což změní její konformaci a ztratí tak možnost vazby na IRE sekvenci. Místo toho pak tento protein funguje jako akonitáza. IRE sekvence tvoří sekundární strukturu v podobě vlásenky, která obsahuje motiv CAGUN ve smyčce vlásenky a volný zbytek cytosinu pět nukleotidů před tímto motivem. Toto uspořádání se zdá být důležité pro správnou funkci IRE sekvence [39]. Role feritinu v imunitních procesech bezobratlých živočichů byla potvrzena u ostnokožců [40] a korýšů [41].
2. Cíle
Cílem této práce je přispět k objasnění vztahů mezi mikroorganismy a imunitním systémem žížal v coelomu a ve střevech. Konkrétně:
Identifikace imunitních mechanismů žížaly druhu E. andrei, které umožňují přežití v jejím přirozeném prostředí obsahující velké množství mikroorganismů.
Identifikace nových receptorů rozpoznávajících vzory, které se mohou podílet na úspěšné obranné strategii tohoto druhu žížal proti bakteriální infekci.
Popis vztahů mezi imunitním systémem střeva a mikrobioty.
Popis mechanismů, které se podílejí na udržování homeostázi železa, ve vztahu k obranným mechanizmům žížal.
Posouzení vlivu toxicity dioxinů na imunitní systém střeva a coelomu.
8
3. Materiál a metodika
Materiál a metodiky byly detailně popsány v jednotlivých publikacích.
Metody použité během experimentů:
stanovení aktivity akonitázy
analýza mikrobiálních společenstev počítačové modelování biomolekul kultivace mikroorganismů
stanovení cytolytické, hemolytické a proteázové aktivity gelová zpomalovací analýza
stanovení enzymových aktivit ve střevě žížal exprese rekombinantních proteinů
histologické barvící metody in situ hybridizace
in vitro transkripce
izolace nukleových kyselin
stanovení lysozymové aktivity (Lysoplate assay) hmotnostní spektrometrie
PCR
fylogenetická analýza
elektroforéza v polyakrylamidovém gelu kvantitativní PCR
amplifikace konců cDNA molekul reverzní transkripce
sekvenování
9
4. Výsledky a diskuze
Různé druhy žížal byly během let používány jako modelové organismy pro studium imunitních procesů. Druh Eisenia andrei mezi nimi hraje významnou úlohu. Nicméně název tohoto druhu se často měnil a kromě toho byl v literatuře často chybně označován jako Eisenia fetida. Oba tyto druhy patří mezi epigeické žížaly, ale žijí v odlišných prostředích.
Druh E. andrei se vyskytuje v kompostu a hnoji, kde je vystaven velkému množství potenciálních patogenů. Žížaly druhu E. fetida žijí v lesní půdě a jsou vystaveny mnohem nižší mikrobiální zátěži [42]. Z tohoto důvodu bylo zajímavé zjistit, jak tato dvě odlišná mikrobiální prostředí mohou ovlivňovat imunitní mechanismy těchto dvou blízce příbuzných druhů. Porovnáním vybraných biologických vlastností coelomových tekutin těchto druhů (cytolytické, hemolytické, proteolytické a lysozymové), jsme odhalili významné rozdíly v případě hemolytické aktivity. Coelomová tekutina žížal E. andrei vykazuje mnohem vyšší hemolytickou aktivitu ve srovnání se žížalami E. fetida. Pro detekci všech známých variant genů fetidinů a lyseninů jsme navrhli univerzální primery a stanovili jejich množství pomocí kvantitativní PCR reakce. Ukázalo se, že žížaly druhu E. andrei mají větší množství těchto hemolytických molekul jak na úrovni genomové DNA, tak i na úrovni mRNA [43]. V dalším kroku jsme provedli experiment, při kterém jsme izolovali a kultivovali bakterie z kompostu a lesní půdy. Následně jsme sledovali adaptaci E. andrei a E fetida na cizí mikrobiální prostředí. Zatímco exprese fetidinů a lyseninů byla významně zvýšena u druhu E. andrei, výměna mikrobioty neměla vliv na expresi těchto molekul u druhu E. fetida. Heterogenita mikroorganismů v kompostu může vytvářet tlak na imunitní systém žížaly E. andrei, což se odráží ve vyšší expresi antimikrobiálních proteinů.
Rozpoznávání mikroorganismů je zprostředkováno pomocí receptorů rozpoznávající vzory (PRRs). V této práci jsou popsány dvě nové PRR molekuly u žížaly E. andrei a sice Toll-like receptor (EaTLR) a lipopolysacharid vázající protein LBP/BPI. Aminokyselinová sekvence EaTLR vykazuje standartní uspořádání proteinových domén Toll-like receptoru.
Skládá se z extracelulární domény se sedmi úseky s vysokým výskytem aminokyseliny leucinu. Za ní se nachází transmembránová doména následovaná intracelulární signalizační TIR doménou (angl. Toll/interleukin-1 receptor, zkr. TIR) [44]. Detailní srovnání většího množství sekvencí EaTLR odhalilo jejich značnou variabilitu, což naznačuje, že existuje větší množství kopií genu tohoto receptoru v genomu žížal. Experimenty s mikrobiální stimulací žížal potvrdili imunitní funkci této molekuly. Její exprese se zvyšuje po stimulaci s grampozitivními bakteriemi. Podobné výsledky byly získány při studiu aktivace signalizační dráhy Tollu u Drosophily pomocí grampozitivního typu peptidoglykanu [45].
Druhý zde popsaný receptor rozpoznávající vzory patří do proteinové rodiny LBP/BPI/CETP. Analýza aminokyselinové sekvence této molekuly odhalila přítomnost dvou BPI domén (N- a C- koncovou), které jsou spojeny centrální částí obsahující velké množství aminokyseliny prolinu [46]. Stejné uspořádání domén bylo popsáno i u jiných LBP/BPI molekul bezobratlých živočichů [47-49]. Nejvyšší genová exprese LBP/BPI byla detekována v coelomocytech a v seminálních váčcích. Vysoká exprese LBP/BPI molekul v reprodukčních orgánech byla popsána i u jiných živočichů. Masivní výskyt tohoto proteinu byl například prokázán ve vajíčkách sladkovodního šneka druhu B. glabrata [47]. Tato zjištění naznačují, že LBP/BPI protein může hrát důležitou roli při ochraně pohlavních buněk proti patogenům.
Injekce bakteriální suspenze do coelomové dutiny vedla ke zvýšení exprese LBP/BPI v coelomocytech, což může naznačovat jeho potencionální antimikrobiální funkci.
V coelomové dutině i trávicím traktu žížal se vyskytují mikroorganismy. Imunitní strategie těchto dvou prostředí ale musí být odlišná. Množení mikroorganismů v coelomu není žádoucí a musí být striktně pod kontrolou. Naproti tomu imunitní systém střev musí být regulován, aby se předešlo nadměrné zánětlivé odpovědi proti střevním bakteriím. Dalším
10
cílem práce bylo popsat, jak imunitní systém coelomu a střev reaguje na mikrobiální stimulaci. Nejdříve jsme porovnali množství kultivovatelných bakterií (colony forming units CFU) ve střevech a coelomové tekutině u nestimulovaných žížal a zjistili jsme, že ve střevech se vyskytuje přibližně šestkrát více bakterií než v coelomu [50]. Žížaly byly následně stimulovány velkým množství gramnegativních bakterií E. coli, grampozitivních bakterií B.
subtilis a kvasinek S. cerevisiae. Tyto stimulace vedly ke zvýšení počtu mikroorganismů v obou tělních dutinách, nicméně mikrobiální zátěž zvyšuje množství bakterií ve střevě v menší míře než v coelomu. Určitá část populace mikroorganismů trávicího traktu může být pevně vázána na střevní epitel [51]. V mikroprostředí střeva žížal existují ideální podmínky pro růst určitých skupin bakterií, jako jsou Clostridiaceae a Enterobacteriaceae [52]. Tato zjištění naznačují, že ve střevech žížal mohou existovat příhodné podmínky pro udržování stabilních populací mikroorganismů. Žížaly reagují na zvýšené množství mikroorganismů v coelomu a střevech zvýšenou imunitní odpovědí. Coelomocyty vykazují vyšší expresi CCF molekuly po mikrobiální stimulaci, než buňky střevní tkáně. Produkce CCF ve střevech je méně ovlivněna mikrobiální stimulací patrně proto, že stálý kontakt střevního epitelu s půdními bakteriemi [53-55] vede k udržování vyšší bazální hladiny exprese této molekuly.
Pomocí in situ hybridizace jsme potvrdili, že se CCF exprimuje v epiteliálních buňkách přední a střední části střeva žížal [50]. Další dvě výše popsané PRR molekuly se také exprimují v trávicím traktu žížal. EaTLR vykazuje nejvyšší expresi ve středním regionu střeva [44]. Naproti tomu LBP lze detekovat především v přední části trávicího traktu, v hltanu a jícnu [46]. Stálá produkce PRR molekul ve střevě je důležitá pro zachování normálních interakcí s mikroorganismy. Bylo prokázáno, že ztráta TLR signalizace ve střevě vede ke zvýšení prozánětlivé odpovědi a poškození střevního epitelu [56].
Zvýšená mikrobiální zátěž ve střevě ovlivňuje také trávicí procesy, protože bakterie tvoří podstatnou část potravy žížal. Prokázali jsme, že mikrobiální stimulace vede ke zvýšení enzymových aktivit laminarinázy, glukosaminidázy a proteázy ve střevě žížal [57]. Trávicí procesy přispívají k uvolňování konzervovaných strukturních motivů z mikroorganismů a tyto struktury jsou následně rozpoznávány receptory rozpoznávající vzory. Již dříve bylo prokázáno, že CCF vyžaduje spolupůsobení lysozymu pro účinné rozpoznávání peptidoglykanových zbytků [58].
Na základě našeho výzkumu předpokládáme, že zvýšené množství bakterií ve střevě žížal vede k uvolnění coelomocytů z výstelky coelomu. Volné coelomocyty pak v coelomu plní své funkce buď jako výživové buňky - eleocyty nebo jako buňky imunitní - amébocyty [59]. Volné coelomocyty mají nízkou proliferační aktivitu a proto je jejich hlavním zdrojem uvolňování z mezenchymální výstelky coelomu. Mechanismus uvolnění coelomocytů jsme zachytili na histologických řezech [50]. Již dříve bylo prokázáno, že prekurzorové buňky výstelky coelomu proliferují okamžitě po antigenní stimulaci [60].
Železo je prvek, který má nezastupitelnou úlohu v klíčových procesech centrálního metabolismu [61]. Regulace dostupnosti tohoto prvku v organismu může přispívat k obranným strategiím živočichů proti infekci [62]. Z tohoto důvodu jsme se zaměřili na studium mechanismů, které přispívají k udržování homeostázi železa u žížal. Popsali jsme molekulu feritinu a mechanismus posttranskripční regulace jeho exprese. Analýza získané cDNA sekvence vedla k identifikaci proteinu o předpokládané velikosti 19.7 kDa s izoelektrickým bodem 5.19 [63]. Na 5' nepřekládaném konci mRNA molekuly se nachází IRE vazebné místo s konzervovaným motivem CAGUN ve smyčce vlásenky a cytosinovým zbytkem pět nukleotidů před tímto motivem, který se zdá být důležitý pro funkci IRE sekvence. Počítačovým modelováním IRE sekvence jsme odhalili nestandartní konformaci vlásenky oproti IRE vlásenkám obratlovců. Podobné nestandartní uspořádání IRE sekvencí bylo popsáno u mRNA feritinů dalších bezobratlých živočichů [64-66]. Zdá se, že tyto alternativní konformace neovlivňují vazbu IRP proteinu do IRE místa [67]. Gramnegativní a
11
grampozitivní bakterie byly použity pro stimulaci žížal za účelem objasnění role feritinu v imunitních procesech. Změny v genové expresi feritinu byly sledovány v coelomocytech pomocí kvantitativní PCR. Dále byl zjišťován vliv železa v podobě FeCl3 na expresi feritinu.
Bakteriální stimulace vedla ke zvýšení exprese feritinu v coelomocytech, což naznačuje jeho funkci v imunitní odpovědi. Překvapivým výsledkem bylo, že stimulace pomocí vysoké koncentrace železa nemá vliv na syntézu mRNA feritinu. Změna koncentrace železa v prostředí může ovlivňovat syntézu feritinu na posttranskripční úrovni pomocí proteinu regulujícího železo (IRP). Navíc přidání FeCl3 do prostředí žížalvede ke zvýšení akonitázové aktivity v coelomové tekutině. V dalším kroku jsme proto charakterizovali protein regulující železo u E. andrei (EaIRP). Osekvenovali jsme jeho gen a následně klonovali do expresního vektoru. U získaného rekombinantního proteinu (rEAIRP) jsme prokázali jeho vazebnou schopnost k IRE sekvenci v mRNA feritinu pomocí gelové zpomalovací analýzy (REMSA).
Zvýšená koncentrace železa má za následek konformační změnu IRP proteinu. Dochází k tvorbě [4Fe-4S] klastru uvnitř molekuly, což vede ke změně jeho funkce na akonitázu.
Cytosolická i mitochondriální buněčná frakce vykazuje akonitázovu aktivitu, stejně jako rekombinantní protein rEaIRP. Akonitázová aktivita obou frakcí a rEaIRP se snižuje po inkubaci s H2O2, při které dochází k destrukci Fe-S klastru v IRP molekule [68].
Integritu slizničních povrchů může narušit řada toxických látek. Některé z nich se mohou dlouhodobě usazovat v půdách. Příkladem takových látek jsou dioxiny [69]. Sledovali jsme, jaký vliv mají kontaminované půdy obsahující dibenzo-p-dioxin a dibenzofuran (PCDD/Fs) na trávicí trakt žížal a jak tyto kontaminanty ovlivňují produkci imunitních a antioxidačních molekul v coelomocytech [70]. Vliv kontaminantů na střevo a přilehlou chloragogenní vrstvu byl zkoumán pomocí histologických technik. Dioxiny jsou zodpovědné za signifikantní úbytek epiteliálních buněk ve střevě a poškozují také chloragogenní tkáň.
Kontaminace dioxiny vede ke změnám v množství a složení půdních bakterií, což se odráží i ve vyšší expresi CCF v coelomocytech u žížal udržovaných v kontaminovaných půdách.
Kromě toho jsme také detekovali zvýšené hladiny mRNA kalretikulinu a proteinu teplotního šoku Hsp70. Kalretikulin je protein, který pomáhá buňky chránit proti oxidativnímu stresu [71, 72]. Protein Hsp70 přispívá k ochraně a opravě buněk poškozených různými mechanismy [73-75].
12
5. Závěr
Tato práce je věnována studiu interakcí mezi mikroorganismy a imunitním systémem coelomu a střeva u žížaly druhu E. andrei. Tento druh žije v kompostu obsahujícím výrazně větší množství mikroorganismů, než jiné typy půd. Proto se u tohoto druhu žížal musel vyvinout účinný imunitní systém, který umožňuje přežití v tak mikrobiálně bohatém prostředí.
Coelomová tekutina žížal E. andrei má vyšší hemolytickou aktivitu ve srovnání s jí blízce příbuzným epigeickým druhem E. fetida. Mikrobiální stimulace žížal E. andrei vede ke zvýšení hladiny mRNA hemolytických molekul s antibakteriálními vlastnostmi v coelomocytech, což patrně přispívá k účinnějším obranným reakcím tohoto druhu.
Základními složkami imunitního systému, které zprostředkovávají interakce s mikroorganismy, jsou receptory rozpoznávající vzory (PRRs). V této práci jsou popsány dva nové receptory žížaly E. andrei. Jedná se o Toll-like receptor (TLR) a lipopolysacharid vázající protein (LBP/BPI). Obě tyto molekuly jsou produkovány coelomocyty a jejich genová exprese se zvyšuje po mikrobiální stimulaci. Každý z těchto receptorů se exprimuje v jiné části trávicího traktu. LBP/BPI lze detekovat hlavně v přední části trávicí trubice, zatímco TLR se exprimuje nejvíce ve střevě.
Experimentální mikrobiální stimulace také zvyšuje aktivitu trávicích enzymů ve střevě žížal. Proces trávení mikrobiálních komponent může přispívat ke snadnějšímu rozpoznávání bakteriálních struktur pomocí receptorů rozpoznávající vzory. Obzvláště CCF vykazuje silnou expresi v epiteliálních buňkách střeva a může tak přispívat k vyvážené interakci mezi mikroorganismy a imunitním systémem. Předpokládáme, že zvýšení počtu bakterií ve střevě vede k uvolňování a diferenciace buněk ve výstelce coelomu. Uvolněné coelomocyty s imunitní funkcí pak působí buď jako fagocyty, nebo produkují antimikrobiální proteiny do prostředí coelomu a snižují v něm tak množství mikroorganismů.
Další molekulou produkovanou coelomocyty je feritin, který slouží jako hlavní zásobárna železa a může tak ovlivnit jeho dostupnost pro bakterie. Prokázali jsme, že hladina mRNA feritinu se zvyšuje po mikrobiální stimulaci. Dále pak byla popsána regulace exprese feritinu na posttranskripční úrovni.
Půdní kontaminace dioxiny vede k patologickým změnám střevní a přilehlé chloragogenní tkáně. Takovéto poškození vede k aktivaci opravných mechanismů. Kromě toho vede kontaminace dioxiny ke změnám v mikrobiálním složení půdy, což se odráží ve zvýšené expresi CCF molekuly v coelomocytech.
V této práci předkládám nové poznatky a hypotézy o imunitním systému žížaly druhu E. andrei. Tyto výsledky ozřejmují obranné mechanizmy tohoto druhu, které jsou nezbytné pro jeho přežití v mikrobiálně náročném prostředí. Přirozená imunita představuje evolučně starou a konzervovanou strategii obrany proti patogenům. Z toho důvodu tyto výsledky mohou přispět k objasnění imunitních mechanismů nejen bezobratlých, ale i obratlovců.
13
Abstract
Earthworms are important soil invertebrate organisms that participate in nutrient cycling in terrestrial ecosystems and in the formation of the soil profile from the physical, chemical and also microbial point of view. Soils are considered the most microbially diverse environments on earth. All invertebrates living in soil therefore need to possess a complex immune system. Earthworms are used as a model organism in immunology for decades. Their simple body plan consists of two main body cavities: true coelom and digestive tube. Both coelomic cavity and digestive tract represent open systems with permanent contact with soil microorganisms. Eisenia andrei species is used as a standard immunological model in our laboratory for many years. E andrei earthworms live in compost, microbially abundant environment, which is reflected in their well-developed immune system. Some new mechanisms of E. andrei defense system are described in this work. Two novel pattern recognition receptors (PRRs), Toll-like receptor (TLR) and lipopolysaccharide binding protein/bactericidal permeability-increasing protein (LBP/BPI) were characterized in earthworms. These molecules are expressed in coelomocytes and their production is upregulated after microbial challenge. Moreover, both receptors were detected in digestive tract of earthworms. Intestine of earthworms contains significantly higher amount of microorganisms in comparison with coelom. Interactions between microorganisms and mucosal immune system of the gut are more complex and they also include digestive enzymes which can promote molecular recognition of bacterial components by immune system. We hypothesize that high microbial load of bacteria in the gut can trigger release of coelomocytes from the coelomic lining and the differentiation of free coelomocytes in coelom. Comparison of two epigeic earthworms, E. andrei and E. fetida revealed stronger immune response in coelom of E. andrei in some aspects, especially in the production of antimicrobial proteins.
Moreover, adverse effects of dioxin pollution on earthworm gut were documented and the response to these toxins is reflected in higher expression of antioxidant molecules.
14
1. Introduction
Earthworms are triploblastic coelomate invertebrates with bilateral body symmetry belonging to the phylum Annelida. They are segmented worms adapted to the life in the terrestrial environment. The tube-within-tube body plan of earthworms consists of digestive tract that runs through the entire length of the body. It is located in a cavity filled with fluid that functions as a hydrostatic skeleton. This body cavity is a true coelom which is lined by the coelomic epithelium derived from mesoderm [1]. This epithelium is a source of cells called coelomocytes which possess various functions contributing to the maintaining of stable inner environment including defense functions [2]. Digestive system of earthworms is a straight tube which is differentiated into a buccal cavity, pharynx, esophagus, crop, gizzard and intestine.
Earthworms are important edaphic macroorganisms. They can be found in almost all types of soil habitats. Soils represent habitats accommodating probably the most complicated microbial communities of the world. Both coelomic cavity and digestive tract represent open systems. They are therefore in permanent direct contact with soil microorganisms. For that reason, earthworms needed to evolve efficient defense system which allowed them to survive in this microbially hostile environment. Earthworms as well as the other invertebrates must rely only on innate immune system mechanisms. Defense strategies of coelom and digestive tract are different. Multiplication of microorganisms in coelom is not desirable. Coelomocytes represent an effector part of coelomic immune system. They kill the bacteria by the mechanisms of phagocytosis and encapsulation and produce a broad spectrum of antimicrobial molecules into the coelom. In contrast, digestive tract of earthworms is in permanent contact with huge amount of ingested microorganisms from soil. This must be reflected in more complicated relationships between immune system of the gut and intestinal microbial communities.
1.1. Earthworm ecology
Earthworms play an important role in many processes of soil transformation. Their feeding and burrowing activities promote decomposition of organic debris, humus formation, cycling of nutrients and soil structural development [3, 4]. Earthworms can be grouped according to their behavioral adaptation into three ecological groups: epigeic, endogeic and anecic [5, 6]. Epigeic earthworms are active close to the surface of the soil. These earthworms are responsible for converting surface debris to topsoil, an important process for the continual renewal of soil ecosystems. Epigeic earthworm species include Dendrobaena octaedra, Lumbricus rubellus, Eisenia fetida, Eisenia andrei. Endogeic earthworms inhabit organo- mineral, deeper soil profile. The representatives of endogeic earthworms include Allolobophora chlorotica, Apporectodea caliginosa, Apporectodea rosea. Anecic earthworm species create more permanent vertical burrows across the soil horizons. Anecic earthworms include for example Lumbricus terrestris, Apporectodea longa. Number and diversity of microorganisms is not homogeneous across the soil profiles. Abundance and composition of microbial communities is significantly decreased with soil depth [7, 8]. Therefore, earthworms belonging to different ecotypes are in contact with different populations of microorganisms.
Earthworms, as an important part of soil ecosystems, can be used as a tool for monitoring of pollution. Epithelial surfaces of earthworms are in close contact with soil particles, therefore various chemicals reaching the soil system can affect the epithelia [9, 10].
Accordingly, various protocols based on the measurement of different aspects of earthworm’s life were developed. These include for example measurement of activity of different enzymes
15
involved in various repair/detoxification mechanisms or oxidative stress response:
cytochrome P450 enzymes [11], superoxide dismutase, catalase and peroxidase [12], metallothioneins [13] and heat shock proteins [14]. Different earthworm species were used in these tests. Two species E. fetida and E. andrei have been used for many years in monitoring ecotoxicity.
1.2. Defense system of earthworms
The skin of earthworms represents the first protective barrier against outer environment of soil. It consists of single layer of epidermis covered by thin cuticle. The skin is not absolutely impermeable, but it contains dorsal pores and nephridiopores that represent a connection between outer environment and coelomic cavity. As a consequence, coelomic fluid of earthworms naturally contains a number of microorganisms [15]. The coelom is lined with mesenchymal layer which is considered to be a source of free coelomocytes [16, 17].
Number of coelomocytes play critical role in controlling numbers of microorganisms in coelomic cavity. Their quantity exceeds more than ten times number of naturally occurring bacteria in the coelom [18] and microorganisms can be thus effectively eliminated by phagocytosis.
Coelomocytes acts simultaneously as phagocytes and producers of various molecules involved in bacterial recognition and killing via non-cellular processes. One of these molecules involved in process of recognition is named coelomic cytolytic factor (CCF). This protein acts as pattern recognition receptor (PRR) with binding affinity to ß-1,3-glucan and lipopolysaccharide (LPS) [19]. Large foreign particles which cannot be engulfed by a single phagocyte, such as agglutinated bacteria or parasites, are eliminated in the process of encapsulation. Encapsulated foreign bodies are subsequently destroyed in the process of melanization and generation of free radical byproducts. The process of melanization starts with the activation of prophenoloxidase cascade, which is a basic defense mechanism in many invertebrate species [20]. Pattern recognition receptors play crucial role in this activation and it was shown, that CCF triggers the prophenoloxidase cascade in earthworms [19].
The coelomic fluid of E. fetida earthworms exhibits numerous biological activities including hemolytic activity. The majority of the proteins with hemolytic activity identified so far show bactericidal and/or bacteriostatic activities against pathogenic soil bacteria [21, 22].
Some of these molecules were characterized and named Eisenia fetida andrei factors (EFAF) [23]. EFAF were characterized on molecular level. They were sequenced and named fetidins [24, 25]. Independently, a similar protein secreted by coelomocytes that causes contraction of rat vascular smooth muscles was purified from coelomic fluid and named lysenin [26, 27].
Simultaneously, two 42 - kDa lysenin-related proteins with weak contraction activity were identified. More recently, new member of this gene family was identified and named lysenin- related protein 3 [28]. Analysis of all these proteins showed that they share high sequence homology. It was proved that fetidin and lysenin are encoded by two distinct genes and their expression differs in individual earthworms [29].
Lysozyme activity, a potent antimicrobial defense of both plants and animals, was documented in coelomic fluid of E. fetida [30]. Partial protein sequence of earthworm lysozyme was later obtained and showed the high homology with other known invertebrate lysozymes [31]. Finally cDNA sequence of earthworm lysozyme was characterized and recombinant protein was prepared [32]. Moreover it was shown that lysozyme expression can be up-regulated after a microbial challenge.
Internal organs including intestine are surrounded with one or more layers of epithelial cells referred to as mucous membranes. Mucous membranes represent a physical barrier and participate in a key part of the immune system which is called mucosal immunity. Microbiota
16
and host mucosal immune system are connected with each other by exchanging of components based on molecular recognition. Key components of mucosal immunity that mediate interaction between host and microbiota are pattern recognition receptors [33].
Complex interactions of commensal communities of microbiota residing on epithelial surfaces of host’s organisms are crucial for normal development and maintenance of immunological integrity [34].
1.3. Iron homeostasis and immune processes
Immunological processes can be influenced by the concentration of some essential elements. Iron is important element for all living organisms that acts as a cofactor in fundamental biochemical processes in cells. Both iron deficiency and iron excess can have adverse effects on basic life functions. Ferritins are major iron-storage proteins [35]. They play a key role in iron homeostasis of all organisms [36]. The expression of ferritin is regulated at the posttranscriptional level by the interactions between the iron regulatory protein (IRP) and the iron-responsive element (IRE) in the 5'-untranslated region (UTR) of ferritin mRNA [37]. At low iron concentration, IRP binds to the IRE and thus blocks the translation of ferritin due to impossibility of ribosomes to bind 5' UTR region of ferritin mRNA [38]. High concentration of iron leads to assembling of 4Fe-4S cluster in IRP and this provokes the change of this protein into aconitase form which does not possess a function of mRNA binding protein. IRE is a short stem-loop containing typical CAGUN motif in the loop and unpaired C residue five nucleotide upstream from this motif. This arrangement appears to be critical for the function of IREs [39]. The role of ferritin in immune reactions of invertebrates was documented in echinoderms [40] and crustaceans [41].
2. Aims
This thesis focuses on elucidation of relationships between microorganisms and immune system of earthworms both in coelom and in gut. Following aims of this thesis were settled:
Identification of selective immune mechanisms of the earthworm E. andrei that allow its survival in compost, environment containing enormous number of bacteria.
Characterization of new pattern recognition receptors of this species that can contribute to its ability to effectively resist bacterial infections.
Description of relations between gut immune system and microbiota.
Description of mechanisms that participate in the maintenance of iron homeostasis in earthworms taking into account its relations to immune system.
Assessment of dioxin toxicity to immune system of the gut and coelom.
17
3. Material and Methods
Material and methods are described in detail in the particular publications.
Methods used during the experiments:
Aconitase assay
Analysis of microbial communities Computational molecular modeling Cultivation of microorganisms
Cytolytic, hemolytic and protease assay Electromobility shift assay
Enzyme activity assessment
Expression of recombinant proteins Histological staining techniques In situ hybridization
In vitro transcription Isolation of nuclei acids Lysoplate assay
Mass spectrometry PCR
Phylogenetic analyses
Polyacrylamide gel electrophoresis Quantitative real-time PCR
Rapid amplification of cDNA ends Reverse transcription reaction Sequencing
18
4. Results and discussion
Various earthworm species were used as a model of immunological research during years. Among them, Eisenia andrei plays a major role. Unfortunately, name of this earthworm was often changed during the time and moreover this species was often erroneously listed as Eisenia fetida. E. andrei and E. fetida are both epigeic earthworms, but their natural environment substantially varies. Whereas E. andrei lives in compost and manure rich in potential pathogens, non-synanthropic indigenous populations of E. fetida earthworm can be found in the litter layer of moist forests that are considerably less abundant in a number of microorganisms [42]. Therefore, it was of interest to inquire how the natural environment and its microbiota affect various defense mechanisms of these two earthworm species. Natural biological activities of coelomic fluids were compared between these two earthworms.
Specifically, cytolytic, hemolytic, proteolytic and lysozyme activities were determined.
Significant differences were observed in the case of hemolytic activities. Coelomic fluid of E.
andrei manifested much higher hemolytic activity compared to that of E. fetida. We designed a universal primer pair for the detection of all known fetidin- and lysenins-related molecules with the hemolytic activity. Quantitative real-time PCR confirmed that hemolytic molecules are more abundant in E. andrei on the level of genomic DNA as well as mRNA [43]. In order to monitor the possible adaptation of earthworms to foreign microbiota, the cross-colonization experiments were performed. We isolated and cultured bacterial strains from both compost and forest soil. The obtained mixtures were used for the earthworm stimulation in the cross- colonization experiments. While the expression of fetidin/lysenins was significantly upregulated in E. andrei, biologically nonsignificant changes were found in E. fetida challenged with compost bacteria. It can be hypothesized that E. andrei colonizing compost (habitat rich in the complexity of microbiota) acquired an evolutionary selection advantage resulting in higher expression of antimicrobial proteins.
The recognition of microorganisms is based on the presence of pattern recognition receptors in earthworms. In our study, we described two of these PRRs - Toll-like receptor (EaTLR) and LBP/BPI of E. andrei. The deduced amino acid sequence of EaTLR revealed standard organization of protein domains. It consists of extracellular domain with seven leucine rich repeats followed by transmembrane domain and cytoplasmic TIR domain [44].
Detailed analysis demonstrated a high intraspecific variability in amino acid sequences of this molecule suggesting that high number of TLRs is encoded within the genome. In our experiments with microbial stimulation, the increased levels of EaTLR mRNA after stimulation with Gram-positive bacteria confirmed its role in defense reactions. Similar results were previously described in Drosophila, where the recognition of Gram-positive Lys- type of peptidoglycan results in activation of Toll-pathway [45].
Another earthworm PRR, which is originally documented in this work, belongs to the LBP/BPI/CETP protein family. Predicted amino acid sequence of this molecule revealed two BPI domain (N- and C-terminal) interconnected by a proline-rich central domain [46].
Identical arrangements of domains were previously described in other LBP/BPI proteins of invertebrates [47-49]. The highest gene expression of LBP/BPI was detected in coelomocytes and seminal vesicles. High expression of LBP/BPI proteins in reproductive system was described also in other animals. Massive occurrence of LBP/BPI protein was evidenced in the eggs of freshwater snail B. glabrata [47]. This may suggest that LBP/BPI proteins play a role in protection of gametes against pathogens. Earthworms were stimulated by injection of bacterial suspension into coelomic cavity. This resulted in upregulation of gene expression of LBP/BPI in coelomocytes and can imply the potential antimicrobial function.
Both coelomic cavity and alimentary tract of earthworms contain naturally occurring microorganisms, but the immune response of these two body cavities differs. Multiplication
19
of microorganisms in coelomic cavity is not desirable and must be strictly regulated. On the other hand, immune response of the gut must be balanced and excessive inflammatory responses against intestinal microbiota should be avoided. Hence next goal was to describe the differences in immune response of the gut and the coelom after microbial challenge.
Comparison in number of culturable bacteria (colony forming units CFU) in the gut and in coelomic fluid of naïve earthworms revealed approximately six times higher amount of bacteria in the gut than in coelom [50]. In earthworms subjected to high microbial load of Gram-negative bacteria E. coli, Gram-positive bacteria B. subtilis and yeast S. cerevisiae, the increased number of microorganisms was observed in both the coelom and the gut. However, microbial overload affects populations of microorganisms in the gut in lesser extent in comparison with the coelom. Partial populations of microorganisms in the digestive tract can be tightly associated with the intestinal wall of earthworms [51]. Microenvironment of the earthworm gut can provide ideal living conditions for some group of bacteria as are Clostridiaceae and Enterobacteriaceae [52]. These findings imply that there exist favorably conditions for maintaining stable populations of bacteria in the gut of earthworms. Increasing number of bacteria in the body of earthworms is reflected in the higher immune response both in coelom and in the gut. We found that coelomocytes produce a significantly higher mRNA level of CCF compared to gut tissue upon microbial stimulation. The production of CCF in gut tissue is probabily not so affected by microbial challenge, because permanent close contact with the microorganisms present in ingested soil [53-55] can maintain higher basal transcription level of defense molecules in the gut epithelium. Results from in situ experiments confirmed that CCF is expressed in epithelial cells of the foregut and midgut [50]. Two others PRRs described in this work are also expressed in the alimentary tract of earthworms. EaTLR is highly expressed in midgut [44]. Contrary to, expression of LBP gene is localized in anterior part of digestive system (pharynx and esophagus) [46]. Stable production of PRRs in intestinal epithelia is important for maintenance of non-pathological interactions. It was shown that loss of TLR signaling can increase intestinal inflammation in case of damaged intestinal epithelium [56].
The increased number of microorganisms in the gut can also influence digestive processes, since they form a significant part of earthworm diet. It was proved that microbial stimulation has resulted in upregulation of laminarinase, glucosaminidase and protease activities in the intestine of earthworms [57]. Process of digestion results in releasing of pathogen-associated molecular patterns from bacteria and therefore it contributes to the mechanisms of recognition by PRRs. As it was documented previously, CCF requires a lysozyme pre-treatment for an efficient recognition of peptidoglycan constituents [58].
Further, we hypothesize that an increased number of bacteria in the gut triggers signaling pathways that induce cell release and differentiation in the coelomic lining.
Coelomocytes are released to the coelom, where they perform either nutritive (eleocytes) or immune (amoebocytes) functions according to their type [59]. Earthworm coelomocytes have been described to exhibit low proliferation activity. Therefore, the main source of these cells is their release from the mesenchymal coelomic lining. The mechanism of coelomocyte release was captured in histological sections [50]. It was shown that precursor cells in the coelomic lining proliferate immediately after antigenic stimulation [60].
In bacteria, iron plays a crucial role in many physiological processes of central metabolism [61] and host's strategy of iron limitation can act as a potent defense against infection [62]. Therefore, the mechanisms of iron homeostasis in earthworm E. andrei were elucidated. New ferritin molecule of this species was described and the mechanism of its regulation on the posttranscriptional level was illustrated. First, cDNA molecule of ferritin was identified. On the basis of sequence analysis, the molecular mass of predicted protein was estimated to 19.7 kDa with the isoelectric point (pI) of 5.19 [63]. 5'UTR sequence of mRNA
20
contains IRE binding site with typical CAGUN loop and cytosine 5 nucleotides upstream that seems to be important for the function of IREs. On the other hand, computer modeling of the E. andrei ferritin IRE secondary structure revealed nonstandard arrangements of nucleotides in the stem of loop compared to known IRE structures of vertebrates. Similarly, atypical IRE structures were described in mRNA ferritins of other invertebrates [64-66]. It seems that these alternate conformations do not have an impact on binding of IRP to IRE [67]. Earthworms were stimulated by Gram-negative and Gram-positive bacteria to elucidate the role of ferritin in defense system. The gene expression of ferritin in coelomocytes was determined by real- time PCR. Simultaneously the expression of ferritin was also measured after the stimulation of FeCl3. The up-regulation of ferritin upon bacterial challenge suggests its role in the immune response against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Surprisingly, iron overload have no significant effect on the expression of ferritin. The response to the changes of iron content in environment can be regulated on post-transcriptional level due to an iron regulatory protein (IRP). This is supported by the finding that stimulation with FeCl3 results in the increase of the aconitase activity in coelomic fluid. Therefore we focused on the characterization of the iron regulatory protein from Eisenia andrei (EaIRP). cDNA sequence of EaIRP was obtained and the gene was consequently cloned to the expression vector.
Recombinant EaIRP (rEaIRP) was used in the RNA electromobility shift assay (REMSA) to verify the binding capability of rEAIRP with IRE structures. It was shown that labeled RNA corresponding to the IRE within 5' UTR of earthworm ferritin mRNA can be bound by rEaIRP. The increased concentration of iron results in the change of conformation of IRP.
Formation of [4Fe-4S] cluster in the molecule of IRP switches its function to the aconitase enzyme. Both cytosolic and mitochondrial fractions of E. andrei cells as well as rEaIRP exhibit aconitase activity. Aconitase activity of both cellular fractions and rEaIRP were decreased after the effect of H2O2 as a consequence of destruction of Fe-S cluster in the IRP molecule [68].
Integrity of mucosal surfaces can be disrupted by various toxic chemicals. A significant part of them is continuously accumulated in soils. Dioxins represent an example of broad spectrum of contaminants which are accumulated in soils [69]. In our study, we examined the impact of dibenzo-p-dioxins and dibenzofuran (PCDD/Fs)-polluted soils on intestinal tract and the effect on production of immune and antioxidant molecules in coelomocytes [70]. Exposure to dioxins is reflected in significant histological changes of the gut epithelium and adjacent chloragogen tissue. Reduction of intestinal villi and chloragenous layer was observed. Dioxin pollution also significantly alters the abundance and composition of soil bacteria. The variation in abundance and composition of microbial communities of dioxin-polluted soil is reflected in higher expression of CCF in coelomocytes. Apart from that, mRNA levels of calreticulin and Hsp70 genes were upregulated. Calreticulin plays an important role in protection against oxidant toxicity and the increase of its expression represents a part of the cellular response to oxidative stress [71, 72]. Hsp70 belongs to the heat shock protein family which contributes to the protection and repair of cells damaged due to various stressors [73-75].
21
5. Conclusion
In my thesis I present new findings about interactions of microorganisms and immune system of earthworm E. andrei in coelom and in gut. E. andrei lives in the microbially abundant environment of compost, where the numbers of microorganisms significantly exceed average amount of microbiota in other types of soils. From that reason, orchestrated immune system enabling survival of this species in such microbially hostile environment had to be evolved.
Coelomic fluid of E. andrei exhibits higher hemolytic activity compared to another epigeic earthworm, E. fetida. The mRNA levels of hemolytic molecules with antibacterial activities produced by coelomocytes of E. andrei are upregulated upon microbial challenge and therefore can contribute to stronger defense reactions of this species.
Fundamental components of innate immune system that mediate the interactions with microorganism are represented by pattern recognition receptors (PRR). Two new PRRs of E.
andrei are described in this thesis, namely TLR and LBP/BPI. Both of these molecules are synthesized by coelomocytes and their gene expression is upregulated upon microbial challenge. Site specific expression of TLR and LBP/BPI molecules was documented in digestive tract of E. andrei. Expression of LBP/BPI is more localized in anterior part of digestive system, whereas TLR exerts highest expression in the intestine.
Experimental microbial overload in gut is also reflected in increased activities of digestive enzymes. Digestions of bacterial components can promote recognition of these structures by PRRs. Especially CCF exerts strong stable expression in epithelium of gut and can therefore contribute to the balanced interactions of intestine microbiota and immune system. We hypothesize that an increased number of bacteria in the gut triggers signaling pathways that induce cell release and differentiation in the coelomic lining. The released coelomocytes with immune function act as phagocytes and/or produce antimicrobial proteins and opsonins that reduce the number of microorganisms in the coelomic cavity.
Coelomocytes are also responsible for synthesis of ferritin, the main iron storage protein, which can influence its availability for bacteria. We showed that synthesis of ferritin mRNA is increased upon microbial challenge. Moreover regulation of ferritin expression on post-transcriptional level was described.
Pathological changes on chloragogen tissue and intestinal epithelium were observed after exposure to dioxins. Such disruption led to the activation of antioxidative and repair mechanisms. Dioxin pollution also alters the composition of bacteria in the soil which is reflected in higher expression level of CCF.
In summary, I submit in this thesis some new conclusions and hypotheses about immune system of E. andrei earthworm. These results can elucidate in detail their abilities to successfully survive in the microbially very rich environment. Innate immunity against pathogen infection is an evolutionarily conserved process among multicellular organisms.
Therefore our results may shed a new light on the native immunity not only of invertebrates, but also of vertebrates.
22
Seznam použité literatury/References
1. Anderson, D.T., Embryology and Phylogeny of Annelids and Arthropods. 1973, Oxford: Pergamon Press.
2. Du Pasquier, L. and P. Duprat, Humoral and cellular aspects of a non-specific natural immunity in the oligochetee Eisenia foetida Sav. (Lumbricinae). Vol. 266. 1968: C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D.
538-41.
3. Lavelle, P., et al., Soil function in a changing world: the role of invertebrate ecosystem engineers.
European Journal of Soil Biology, 1997. 33(4): p. 159-193.
4. Mackay, A.D. and E.J. Kladivko, Earthworms and Rate of Breakdown of Soybean and Maize Residues in Soil. Soil Biology & Biochemistry, 1985. 17(6): p. 851-857.
5. Bouche, M.B., Relations entre les structures spatiales et fonctionelles des ecosystems, illustrees par le role pedobiologique des vers de terre. La Vie dans les Sols, Aspects Nouveaux, Études Experimentales. 1971, Paris: Gauthier-Villars.
6. Bouche, M.B., Strategies lombriciennes. In Soil organisms as components of ecosystems, in Proceedings of the 6th Int. colloquium on soil zoology, U.L.a.T. Persson, Editor. 1977, Swedish Natural Science Research Council Ecological Bulletin: Stockholm. p. 122-133.
7. Ekelund, F., R. Ronn, and S. Christensen, Distribution with depth of protozoa, bacteria and fungi in soil profiles from three Danish forest sites. Soil Biology & Biochemistry, 2001. 33(4-5): p. 475-481.
8. Taylor, J.P., et al., Comparison of microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using various techniques. Soil Biology & Biochemistry, 2002. 34(3): p. 387-401.
9. Jager, T., et al., Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environmental Science & Technology, 2003. 37(15): p. 3399-3404.
10. Morgan, A.J., et al., Differential metallothionein expression in earthworm (Lumbricus rubellus) tissues.
Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004. 57(1): p. 11-19.
11. Achazi, R.K., et al., Cytochrome P450 and dependent activities in unexposed and PAH-exposed terrestrial annelids. Comparative Biochemistry and Physiology C-Pharmacology Toxicology & Endocrinology, 1998. 121(1-3): p. 339-350.
12. Saint-Denis, M., et al., Biochemical responses of the earthworm Eisenia fetida andrei exposed to contaminated artificial soil: effects of benzo(a)pyrene. Soil Biology & Biochemistry, 1999. 31(13): p.
1837-1846.
13. Sturzenbaum, S.R., et al., Metal ion trafficking in earthworms - Identification of a cadmium-specific metallothionein. Journal of Biological Chemistry, 2001. 276(36): p. 34013-34018.
14. Marino, F., C. Winters, and A.J. Morgan, Heat shock protein (hsp60, hsp70, hsp90) expression in earthworms exposed to metal stressors in the field and laboratory. Pedobiologia, 1999. 43(6): p. 615-624.
15. Marks, D.H. and E.L. Cooper, Aeromonas hydrophila in Celomic Cavity of Earthworms Lumbricus terrestris and Eisenia foetida. Journal of Invertebrate Pathology, 1977. 29(3): p. 382-383.
16. Cameron, G.R., Inflammation in earthworms. J Pathol, 1932. 35: p. 933-972.
17. Liebmann, E., The coelomocytes of Lumbricidae. Journal of Morphology, 1942. 71(2): p. 221–249.
18. Dales, R.P. and Y. Kalac, Phagocytic defence by the earthworm Eisenia foetida against certain pathogenic bacteria. Comp Biochem Physiol, 1992. 101A: p. 487-490.
19. Beschin, A., et al., Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J Biol Chem, 1998.
273(38): p. 24948-54.
20. Cerenius, L. and K. Söderhäll, The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immunol Rev, 2004. 198: p. 116-26.
21. Valembois, P., P. Roch, and M. Lassegues, Antibacterial molecules in annelids, in Immunity in Invertebrates, M. Brehelin, Editor. 1986, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York. p. 74-93.
22. Roch, P., M. Lassegues, and P. Valembois, Antibacterial activity of Eisenia fetida andrei coelomic fluid:
III-Relationship within the polymorphic hemolysins. Dev Comp Immunol, 1991. 15(1-2): p. 27-32.
23. Roch, P., et al., Protein analysis of earthworm coelomic fluid. II. Isolation and biochemical characterization of the Eisenia foetida andrei factor (EFAF). Comp Biochem Physiol, 1981. 69B: p. 829- 836.
24. Lassegues, M., et al., Sequence and expression of an Eisenia-fetida-derived cDNA clone that encodes the 40-kDa fetidin antibacterial protein. Eur J Biochem, 1997. 246(3): p. 756-62.
25. Milochau, A., M. Lassegues, and P. Valembois, Purification, characterization and activities of two hemolytic and antibacterial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia fetida andrei. Biochim Biophys Acta, 1997. 1337(1): p. 123-32.
26. Sekizawa, Y., et al., A novel protein, lysenin, that causes contraction of the isolated rat aorta: its purification from the coelomic fluid of the earthworm, Eisenia foetida. Biomed Res, 1996. 17: p. 197- 203.
