Studium komplexních molekulárních systémů

Katedra fyzikální a makromolekulární Chemie Studentská konference

Studium komplexních molekulárních systémů

16.5.2008

Posluchárna CH2

Chemický ústav PřF UK, Hlavova 8, Praha 2

Úvodní slovo

Konference STUDIUM KOMPLEXNÍCH MOLEKULÁRNÍCH SYSTÉMŮ má za úkol studentům přiblížit možnosti studia a výzkumu na Katedře fyzikální a makromolekulární chemie a dalších spolupracujících ústavech Akademie věd ČR, jmenovitě Ústav organické chemie a biochemie, Ústav chemických procesů a Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského.

Doufáme že díky této konferenci získají studenti nižších ročníků chemických oborů větší přehled o možnostech dalšího studia fyzikálně-chemických oborů a najdou zde inspiraci pro svoje bakalářské a diplomové práce.

Konferenci organizují a budou zde přednášet studenti Doktorského studia z uvedených pracovišť, kteří jsou zapojeni do řešení grantového projektu 203/05/H001 za podpory výzkumného záměru MSM0021620857. Grantový projekt 203/05/H001 „Experimentální studium a počítačové modelování struktury a funkce komplexních molekulových systémů a bio(makro)molekul“, který sleduje (i) prohloubení a současné urychlení studia pokročilých předmětů z oblasti moderní fyzikální chemie, (ii) zintenzivnění a zkvalitnění vědecké práce v rámci disertační práce, (iii) zlepšení komunikativních a prezentačních schopností studentů a (vi) zapojení studentů do organizace a administrace vědecké činnosti, zvláště pak do organizace konferencí.

V Praze, 29.4. 2008

Karel Procházka (řešitel projektu)

Harmonogram konference

Studium komplexních systémů Chair: P. Košovan

9:00 - 9:05 J. Lokajová Úvod str.

9:05 - 9:25 J. Jirsák Molekulární teorie vody 4

9:25 - 9:45 E. Bouřa 3D struktura proteinů a jejich funkce

– komplex FOXO4 a DNA 6

9:45 - 10:05 R. Chudoba Detekce bodových mutací v DNA metodou

CDCE 7

10:05 - 10:15 J. Lokajová Optimalizace CZE pomocí simulačních programů 9

10:15-10:45 Kávička

Pohledy do nanosvěta

Chair: M. Uchman

10:45-11:05 K. Šišková Mikroskopie pomocí rastrovací sondy

(AFM/STM) 11

11:05-11:25 O. Dammer Polovodivé polymery se zlatými a stříbrnými

nanočásticemi 13

11:25-11:45 M. Sládková SERS 15

11:45-13:00 Oběd

Modelování molekulových systémů Chair: K. Berka

13:00-13:20 J. Heyda Distribuce iontů na površích hydratovaných

aminokyselin 18

13:20-13:30 R. Vácha Kyselost vodních povrchů 20

13:30-13:50 P. Košovan Modelování polyelektrolytů pomocí zhrubených

modelů 21

13:50-14:10 M. Rubeš Ab initio popis slabě vázaných molekulových

krystalů 23

14:10-14:20 J. Řezáč Stabilita dvojšroubovice DNA 24

14:20-14:30 J. Fanfrlík Interakce metallacarboranů s HIV-1 proteázou 25

Seznam posterů Str.

K. Berka Decomposition of the Energy Stabilization Inside of the Hydrophobic

Core of Rubredoxin 28

P. Dobeš Interactions between roscovitine and cyclin-dependent kinase 2 29 J. Chalupský Quantum chemical calculations of spectroscopic parameters

for intermediates in the reaction cycle of multicopper oxidases 30 A. Olżyńska Principles and Recent Applications of Fluorescence Solvent Relaxation

Technique – Drug Delivery Systems 31

M. Srnec Reaction mechanism of Stearoyl-ACP Δ⁹ Desaturase. QM/MM study. 33 M. Uchman Induced micellization by interaction of double hydrophilic block copoly-

mers with metal compound. Micelle and CdS Nanoparticle characteristics 34

Molekulární teorie vody

J. Jirsák a I. Nezbeda

Katedra fyzikální a makromolekulární chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzita Karlova, Albertov 6, 128 43 Praha 2, Česká republika

http://www.natur.cuni.cz/~pmc jirsak@icpf.cas.cz

Termodynamická laboratoř E. Hály, Ústav chemických procesů Akademie věd, Rozvojová 135, 165 02 Praha 6, Česká republika

http://www.icpf.cas.cz/theory

Pozorováním vlastností látek lidé přišli na to, že je hmota tvořena částicemi – atomy a mole- kulami – a odhalili, jak tyto částice vypadají a jak na sebe působí. Logicky nás napadá opačná otázka, zda a jak můžeme ze známých vlastností částic předpovědět chování látky jako celku.

Na konci 19. století byly položeny základy teorie, která umožňuje takové otázky zodpovědět.

Jedná se o statistickou mechaniku [1], která spojuje poznatky klasické a kvantové mechaniky s teorií pravděpodobnosti.

Informace o tom, jak se molekuly chovají, se pro potřeby statistické mechaniky precizuje tzv. Hamiltonovou funkcí – hamiltoniánem, H, který má význam celkové energie mechanického systému. Hamiltonián je funkcí zobecněných hybností, p, a zobecněných souřadnic, q, a má dvě složky, kinetickou energii, K, a potenciální energii, U,

) ( ) , ( ) ,

(p q K p q U q

H = + .

Po zpracování aparátem statistické mechaniky vede první člen na termodynamické funkce ideálního plynu, kdežto druhý na tzv. reziduální funkce, které udávají hodnotu dané veličiny pro reálný systém zmenšenou o příspěvek ideálního plynu. Vzhledem k tomu, že ideální příspěvky k termodynamickým veličinám jsou triviální, zabýváme se v teorii převážně poten- ciální energií, která se často zjednodušuje předpokladem párové aditivity,

∑

=

j i

j i q q u q

U( ) ( , ),

kde u značí párovou interakční energii dvojice částic. Klíčovou veličinou popisující reálné systémy je tzv. konfigurační integrál,

dq kT U

Z ⁼

∫

který přímo souvisí s reziduálními stavovými funkcemi. Konfigurační integrál je důležitý

Velice rozšířenou statisticko-termodynamickou metodou, vhodnou zejména pro tekutiny, je poruchová teorie [2], jejímž výchozím krokem je rozdělení párové interakční energie na referenční část, u₀, a poruchu, u_P. Platí tedy

uP

u

u= ₀ + .

Toto rozdělení se pak promítne do libovolné termodynamické veličiny, která je pak rovněž sumou referenčního, X₀ a poruchových členů. Referenční systém se volí co možná nejjednodušší, protože jeho termodynamické funkce musí být známy. Na druhou stranu, porucha musí být malá a nesmí výrazně měnit strukturu látky.

Poruchová teorie byla velmi úspěšná v případě tzv. jednoduchých tekutin se sfericky symetrickým potenciálem, jako např. Argon, nesferické, lehce polární molekuly lze obecně také popsat dobře. Nicméně aplikace na asociující tekutiny, vyznačující se silnými orientovanými interakcemi krátkého dosahu (nejčastěji vodíkové můstky), jako např. voda, zůstává nedořešena. A zrovna u vody, která vykazuje řadu termodynamických anomálií (nejznámější je maximum hustoty pří 4°C) [3], je molekulárně-teoretický vhled zajímavý.

V naší laboratoři se statisticko-termodynamickým popisem asociujících látek, včetně vody, zabýváme již tradičně. Provedené simulační studie [4] vedly k poznatku, že na strukturu vody mají vliv pouze krátkodosahové síly. Jako referenční model byl proto zvolen tzv.

krátkodosahový referenční potenciál, který je nulový pro velké vzdálenosti částic. Vlastnosti referenčního systému jsou aproximovány pomocí tzv. primitivních modelů (PM) [5], což jsou jednoduché interakční potenciály se známými termodynamickými funkcemi [6]. Přes svoji jednoduchost dávají poměrně přesný obraz struktury svých realistických protějšků. Ukazuje se [7], že vhodně zvolený referenční primitivní model umožňuje kvalitativně popsat řadu anomálií, aniž by bylo třeba výsledek korigovat poruchovými členy. Vzhledem k tomu, že v PM je zahrnut efekt asociace, je tento poznatek v souladu s obecně přijímanou skutečností, že největší podíl na podivném chování vody mají vodíkové vazby.

[1] J. Kvasnica, Statistická fyzika, Academia, Praha, 1998.

[2] T. Boublík, Statistická termodynamika, Academia, Praha, 1996.

[3] D.Eisenberg, W. Kauzmann, The structure and properties of water, Clarendon Press, Oxford, 1969 [4] I. Nezbeda, J. Kolafa, Mol. Phys. 97, 1105 (1999).

[5] L. Vlček, I. Nezbeda, Mol. Phys. 102, 385 (2004).

[6] L. Vlček, I. Nezbeda, Mol. Phys. 102, 771 (2004).

[7] J. Jirsák, I. Nezbeda, J. Chem. Phys. 127, 124508 (2007).

Struktura proteinů a jejich funkce - komplex FOXO4 a DNA

E. Bouřa and T. Obšil

Department of Physical and Macromolecular Chemistry, Faculty of Science, Charles University, 128 43 Prague

http://web.natur.cuni.cz/~kfmch/kompmolsys/studenti/evzen-boura/

http://www.natur.cuni.cz/~obsil/

eugenee@seznam.cz

Struktura a funkce proteinů a jejich komplexů spolu úzce souvisí. Naše laboratoř se proto snaží určovat 3D strukturu proteinů a tím na molekulární úrovni popsat jejich funkce. Znalost 3D struktury umožňuje např. “inteligentní design” drog jako jsou inhibitory enzymů. Mezi nejpoužívanější metody určování 3D struktury patří krystalografie, NMR a různé spektrosko- pické metody. Zatímco NMR i krystalografie nám umožňují získat informaci o poloze každého atomu, spektroskopické metody poskytují daleko méně informací (třeba jen procentuální obsah sekundární struktury), ale jejich výhodou je relativní jednoduchost experimentů.

V naší laboratoři jsme úspěšně použili metodu proteinové krysta- lografie k vyřešení 3D struktury komplexu transkripčního faktoru FOXO4 s DNA (Obr. 1). FOXO4 je důležitý transkripční faktor, který reguluje buněčný cyklus a hraje roli při vzniku rakoviny.

Ve své přednášce vás seznámím s experimentálními základy prote- inové krystalografie, tedy co vše je potřeba udělat, aby krystal

“vyrostl” a také na příkladu kom- plexu FOXO4/DNA ukážu, co všechno nám 3D struktura umí říci.

Obr. 1: Struktura transkripčního faktoru FOXO4 v komplexu s DNA

Detekce bodových mutací v DNA metodou CDCE

R. Chudoba a B. Gaš

Skupina elektromigračních separačních procesů

Katedra fyzikální a makromolekulární chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze, Albertov 6, 128 43, Praha 2, Česká republika

http://www.natur.cuni.cz/gas

Sekvenace lidského genomu na konci minulého desetiletí otevřela cestu diagnostice dědičných chorob a včasné diagnostice karcinomu pomocí testování DNA na přítomnost mutací. Metodami molekulární biologie pak byla prokázána přímá souvislost mezi konkrétními bodovými mutacemi a rozvojem určitého onemocnění.

Značná část metod pro testování bodových mutací v DNA je založena na elektroforetické separaci fragmentů DNA. Molekula DNA má v bazickém pufru záporný náboj disociovaných fosfátových skupin, takže je tažena elektrickým polem k anodě. Pohyblivosti fragmentů DNA jsou ovšem ve volném roztoku takřka shodné, proto se separace DNA provádí v síťujícím prostředím polymerního gelu, což způsobí, že se fragmenty DNA separují podle své délky, míry denaturace (rozpletení dvojšroubovice) nebo podle své sekundární struktury.

(Elektroforetickou separaci různě dlouhé DNA lze však provést i ve volném roztoku po předchozím navázáním frikční značky na DNA – metoda ELFSE.)

Za standardní a takřka univerzální postup detekce bodových mutací je považována sekvenace zvoleného úseku DNA podle Sangera. Nejprve je provedena polymerázová reakce ve směsi obsahující nukleotidtrifosfáty a fluorescenčně značené dideoxynukleotidtrifosfáty (každý druh nukleotidu jinou značkou). Jelikož se navázáním dideoxynukleotidu ukončuje další polymerizace vlákna, je výsledkem reakce směs různě dlouhé jednovláknové DNA zakončené fluorescenční značkou. Tato DNA se následně separují gelovou elektroforézou podle délky a z odezvy fluorescenčního detektoru se určí sekvence nukleotidů v DNA. Za rozpracování této metody získal F. Sanger roku 1980 svou druhou Nobelovu cenu.

Sangerova metoda však klade na elektroforetickou separaci velké nároky, neboť separace DNA musí proběhnout s rozlišením jedné báze. Nevýhodou Sangerovy metody je rovněž nízká citlivost. Pokud je zdravá DNA v nadbytku nad mutantní DNA, což je případ biopsií z karcinomů, tak nemusí být mutace detekována. Byly proto vypracovány alternativní metody detekce bodových mutací.

Denaturační gelová elektroforéza (DGE) využívá nepatrného rozdílu v termodynamické stabilitě fragmentů DNA, které se odlišují jednou bází. Přestože má záměna báze jen nepatrný vliv na změnu teploty tání dvoušroubovice, tak pravděpodobnost spárování vláken se změní

při teplotě blízké teplotě tání velmi výrazně, což se projeví i výraznou změnou pohyblivosti při gelové elektroforéze.

Citlivost DGE lze ještě zvýšit za použití techniky heteroduplexní analýzy, kdy se heterozygotní DNA (případně homozygotní DNA po přídavku zdravé DNA) teplotou denaturuje na jednotlivá vlákna a poté se nechá pomalu zchladnout. Vedle dvou správně spárovaných homoduplexních dvoujšroubovic vzniknou i dvě termodynamicky méně stabilní heteroduplexní dvoušroubovice, kde v místě mutace proti sobě stojí nekomplementární báze.

Metoda DGE byla původně vyvinuta jako technika plošné elektroforézy, nyní se klinicky využívá v kombinaci s kapilární elektroforézou a experimenty ukazují, že je vhodná i pro detekci mutací na čipové elektroforéze.

Ve spolupráci se společností Genomac Int. vytváříme teoretický model CDGE (Constant Denaturant Gel Electrophoresis) a současně optimalizujeme metodu pro použití na komerčně dostupných čipových instrumentech. Naším cílem je plně využít potenciálu této metody a současně umožnit optimalizaci denaturačních podmínek in silico.

Obr. 1 - Elektroferogramy separací DNA nedetekující (vlevo) a detekující (vpravo) mutaci v genu EGFR (Epidermal Grow Factor Receptor) exonu 21 na čipovém přístroji Agilent Bioanalyzer 2100;

* primery, HM mutantní homoduplex, WT zdravý homoduplex, HT 1 a HT 2 heteroduplexy

Optimalizace separace v systému kapilární elektroforézy pomocí simulačních programů

J. Lokajová

Group of electromigration separation processes

Department of Physical and Macromolecular Chemistry, Charles University in Prague, Faculty of Science, Albertov 6, 128 43, Praha 2, Czech Republic

http://www.natur.cuni.cz/~pmc lokajova@seznam.cz

Kapilární elektromigrační metody představují vysokoúčinné a vysoce citlivé separační techniky, které jsou stále cennějším nástrojem v analytických laboratořích. Prvopočátky elektroforézy sahají do konce devatenáctého století. V roce 1948 byla švédskému chemikovi A. Tiseliusovi udělena Nobelova cena za aparaturu separující proteiny krevního séra na základě jejich elektroforetických mobilit. Největší rozvoj zaznamenaly elektromigrační metody v osmdesátých a počátkem devadesátých let 20. století a dodnes jsou úspěšně používány v široké řadě aplikací (rutinně pro klinické aplikace, chirální analýzy, analýzy fragmentů DNA i anorganických iontů, aj.).

Kapilární elektromigrační metody využívají pohyb nabitých částic, ať už malých iontů či makromolekul (proteinů, fragmentů DNA) v elektrickém poli (Obr.1). Nosným médiem může být volný roztok, elektrolyt s přídavkem různých aditiv, např. micel, nebo také gel. Podle povahy nosného média dochází k upřednostnění, či naopak utlumení různých typů interakcí nosného média s analytem, což vyústí v odlišné separaci jednotlivých látek ve vzorku. Pokud je elektrolytem nebo médiem naplněna kapilára, metoda se označuje jako kapilární elektroforéza. Podle způsobu separace se dělí na kapilární zónovou elektroforézu, kapilární izotachoforézu a další.

Obr. 1 – Elektromigrační dělení

Na základě matematického modelu elektromigrace byly v naší laboratoři vypracovány počítačové programy Simul a Peakmaster (Obr.2), umožňující simulace dynamických elektromigračních separačních procesů i jejich „ustálených“ stavů [1,2]. Simulační programy jsou volně dostupné jako freeware na stránkách http://www.natur.cuni.cz/gas. Oba simulační programy slouží především pro optimalizaci separace, která spočívá v nalezení separačního systému, ve kterém jednotlivé složky vykazují dobré rozlišení, dostatečný signál detektoru a který umožňuje separaci v co nejkratším čase. Součástí optimalizace je odstranění rušivých jevů doprovázejících elektroforetické separace. Takovými jevy jsou především systémové píky, které mohou zasahovat do oblasti analytů nebo vysoká elektromigrační disperze daná nelineární povahou elektroforézy. Parametry separace, tedy elektroforetické chování analytu i systémových píků v daném základním elektrolytu, lze teoreticky předpovědět na základě řešení modelů elektromigrace. Počítačové simulace proto nabízejí oproti tradičnímu experimentálnímu postupu optimalizace metodou „pokus – omyl“ výraznou časovou i materiální úsporu.

Obr. 2 – Náhled programu PeakMaster

[1] V. Hruska, M. Jaros, B. Gas, Electrophoresis 27, 984 (2006).

[2] B. Gas, M. Jaros, V. Hruska, I. Zuskova, M. Stedry, LC GC EUROPE 18, 282 (2005)

Mikroskopie pomocí rastrovací sondy (AFM/STM)

K. Šišková

Odd. polymerních materiálů, Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Heyrovského nám. 2, 16206 Praha 6

http://www.imc.cas.cz/onlyimc/

ksiskova@seznam.cz M. Uchman

Katedra fyzikální a makromolekulární chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze, Hlavova 8/2030, 128 40 Praha 2

http://www.natur.cuni.cz/~pmc qqryk@o2.pl

Rastrovací sondové mikroskopie neboli mikroskopie pomocí rastrovací sondy (SPM z anglického Scanning Probe Microscopy) zahrnují dvě základní techniky: AFM a STM. Tyto magické zkratky pocházejí z anglických názvů Atomic Force Microscopy (mikroskopie atomových sil) a Scanning Tunneling Microscopy (rastrovací tunelová mikroskopie) popisující jevy, na nichž je měření založeno.

V obou dvou případech (AFM i STM) je povrch vzorku skenován/rastrován prostřednictvím sondy, jež různým způsobem interaguje s povrchem vzorku. Sonda se pohybuje v těsné blízkosti povrchu, obvykle několika málo nanometrů (pro připomenutí:

1 nm = 1 miliontina milimetru).

Obr. 1 – SPM mikroskop na PřF UK a schématické znázornění jeho funkce.

Pojem zvětšení nemá v sondové mikroskopii smysl. Obraz je totiž vytvářen na základě elektromechanické interakce sondy se vzorkem. Zatímco AFM využívá interakce mezi atomy sondy a atomy povrchu vzorku; STM vychází z tunelového jevu mezi dvěma vodivými materiály, kovovou sondou a vodivým povrchem vzorku. Z tohoto faktu vyplývá jisté omezení STM. Na druhé straně, základní předností STM je rozlišení až na atomární úrovni, neboli zobrazování jednotlivých atomů. Právě toto se podařilo prokázat tvůrcům mikroskopu, pánům Gerdu Binningovi a Heinrichu Rohrerovi, kteří byli velmi záhy po svém objevu (do 5-ti let) odměněni Nobelovou cenou (r. 1986). Za další přednost STM lze považovat cílenou manipulaci s jednotlivými atomy. Na rozdíl od STM je AFM technika uplatnitelná pro měření téměř všech, tj. i nevodivých materiálů. To vše navíc v různých prostředích - na vzduchu, ve vakuu, ve speciální atmosféře, v kapalinách; za nízkých i vysokých teplot (stovky stupňů Celsia chladu i tepla).

Předměty zkoumání jsou velmi různorodé. Sahají od kovů a polovodičů přes molekuly, DNA, nanočástice a polymery až po živé buňky. Z tohoto důvodu jsou mikroskopie pomocí rastrovací sondy atraktivní jak pro chemiky, fyziky, tak i biology, nemluvě o umělcích, pro něž odhalování krás přírody a bohatosti tvarů v submikronovém měřítku nemůže být než inspirativní.

Obr. 2 – Výškový profil polymerních micel na slídovém povrchu, získaný pomocí SPM

1.0µm

Polovodivé polymery se zlatými a stříbrnými nanočásticemi

O. Dammer a B. Vlčková

Katedra fyzikální a makromolekulární chemie, Karlova Univerzita v Praze, Přírodovědecká fakulta, Albertov 6, 128 43, Praha 2, Česká republika

http://www.natur.cuni.cz/~pmc odam@seznam.cz O. Dammer a J. Pfleger

Ústav makromolekulární chemie AVČR, v.v.i., Heyrovského nám. 2,162 06, Praha 6, Česká republika

http://www.imc.cas.cz/czwinl2/imc/electr/

Kompozity kovových nanočástic (Au, Ag) a π-konjugovaných polymerů (organické polovodiče) představují nový typ hybridních materiálů se zajímavými elektrickými, optickými a fotochemickými vlastnostmi [1]. Kovové nanočástice vykazují výjimečné optické vlastnosti ve srovnání s objemovým kovem. Odlišnost nanočástic od objemového kovu spočívá v prostorové omezenosti oscilací volných elektronů.

Elektromagnetické záření vhodné vlnové délky indukuje v kovové nanočástici kolektivní oscilaci elektronů, která se projevuje absorpcí ve viditelné oblasti a která může být ovlivňována například tvarem a velikostí nanočástic [2]. V blízkosti Au a Ag nanočástic dochází při rezonanci k zesílení elektromagnetického pole, které se projevuje např. vysokým lokálním zesílením Ramanova rozptylu (SERS) nebo jiných fotofyzikálních procesů (jako je přenos elektronu, energie) [3]. Důležitou podmínkou pro pozorování těchto procesů je interakce mezi polymerem a kovovými nanočásticemi nebo alespoň malá vzdálenost mezi nanočásticí a polymerním řetězcem, při které fotofyzikální procesy mohou být zesíleny.

Přímou interakci mezi polymerem a kovovými nanočásticemi lze dosáhnout modifikací polymeru vhodnou funkční skupinou, která vykazuje afinitu k nanočásticím. V tomto případě působí polymer jako ligand stabilizující nanočástice. Příprava a studium vlastností těchto kompozitů je v současnosti intenzivně zkoumána.

Jako příklad bude diskutován kompozit poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4- phenylenevinylene] (MEH-PPV, Obr.1) a zlatých nanočástic. Tento kompozit byl připraven dvěmi různými způsoby: (i) ligandovou výměnou a (ii) in-situ redukcí zlatité soli v přítomnosti polymeru. Bylo zjištěno, že morfologie zlatých nanočástic v kompozitech připravených oběma způsoby závisí na koncentraci polymeru (např. pro kompozit připravený ligandovou výměnou je distribuce velikostí částic vlivem jejich přerůstání širší a velikost částic větší při nízké koncentraci polymeru ve srovnání s koncentrací větší (Obr.2).

Obr. 1 - MEH-PPV.

Působení silného oxidačního činidla (kys. tetrachlorozlatité) na dvojné vazby πkonjugovaného polymeru komplikuje přípravu kompozitu in situ redukcí vedoucí ke snižování molekulové hmotnosti a konjugační délky polymeru.

Obr. 2 - Morfologie zlatých nanočástic v kompozitech připravených ligandovou výměnou obsahujících různou koncentraci polymeru.

[1] B. C. Sih, M. O. Wolf, Chem. Commun. 3375 (2005).

[2] S. Link, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B 103, 8410 (1999).

[3] P. V. Kamat, J. Phys. Chem. C 111, 2834 (2007).

50 nm 50 nm

zvyšující se koncentrace

polymeru

12.5 wt % 50 wt %

Povrchem zesílený Ramanův rozptyl - detekce jediné molekuly

M. Sládková and B. Vlčková

Department of Physical and Macromolecular Chemistry, Charles University in Prague, Fa- culty of Science, Albertov 6, 128 43, Praha 2, Czech Republic

http://www.natur.cuni.cz/~pmc

Spektroskopie povrchem zesíleného Ramanova rozptylu se řadí mezi metody vibrační spektroskopie. Ramanův rozptyl je založen na nepružném rozptylu viditelného, ultrafialového nebo blízkého infračerveného záření molekulami a umožňuje studovat přechody mezi vibračními stavy molekul v základním elektronovém stavu. Velkým kladem Ramanovy spektroskopie je nedestruktivnost, hlavním přínosem potom možnost získání poměrně detailní strukturní informace, která je často jinými metodami obtížně zjistitelná. Ramanovu spektroskopii lze použít na vzorky plynné, kapalné i pevné; mohou to být roztoky, suspenze, gely, tenké vrstvy, vlákna a monokrystalické, práškové či amorfní vzorky. Informace získané ze vzorku v jednom morfologickém stavu jsou přenositelné na stejný vzorek v jiném morfologickém stavu. Klasická Ramanova spektroskopie má však jistou nevýhodu a to nízký průřez účinnosti Ramanova rozptylu, tj. že ze svazku fotonů je rozptýlen přibližně jeden z 10⁷ fotonů a k získání spektra je tedy nutný velký soubor molekul [1].

Intenzita I Ramanova rozptylu je pak dána vztahem P2

I ≈ .

Ve studované molekule je zářením indukován dipólový moment P E0

P =α⋅

kde α je polarizovatelnost molekuly a E₀je intenzita elektrického pole záření dopadajícího na molekulu.

Pro malé soubory molekul, např. velmi zředěné roztoky biologicky významných molekul, však klasická Ramanova spektroskopie nestačí. Je nutné zvýšit intenzitu Ramanova rozptylu, a to dvěma možnými způsoby:

1. zvýšením polarizovatelnosti molekuly α pomocí vhodného výběru vlnové délky excitujícího záření λ_exc. Je možné použít takovou λ_exc, která odpovídá excitaci elektronového přechodu v molekule. V tomto případě dochází k rezonančnímu Ramanovu rozptylu, při němž je intenzita Ramanova rozptylu zvýšena faktorem zesílení 10²-10⁴ [1].

2. zvýšením intenzity elektrického pole záření dopadajícího na molekulu E₀pomocí

„zesilovačů“, např. Au nebo Ag nanočástic. Pozorujeme tak jev nazvaný povrchem zesílený Ramanův rozptyl. Faktor zesílení Ramanova rozptylu při tomto procesu dosahuje hodnot 10³-10¹⁴ [2-5].

V případě povrchem zesíleného (resonančního) Ramanova rozptylu /SE(R)RS/ mohou k celkovému zesílení přispívat dva mechanismy (obr.1)

Obr. 1. Povrchem zesílený (resonanční) Ramanův rozptyl

1. Elektromagnetický mechanismus - dopadající záření i záření Ramansky rozptýlené je zesíleno prostřednictvím excitace bipolárního povrchového plasmonu a emise záření vzniklým oscilujícím dipólem nanočástice, tj. prostřednictvím resonančního Mieova rozptylu záření nanočásticí tzv. plasmonického kovu. Tento mechanismus působí na všechny typy molekul a faktor zesílení se pohybuje mezi 10³-10¹¹.

2. Mechanismus molekulární resonance – pro jeho působení musí být splněna podmínka, že vlnová délka záření λ_exc je vhodná zároveň pro excitaci povrchového plasmonu (λ_res) a pro excitaci elektronového přechodu v molekule nebo v povrchovém komplexu vzniklém navázáním molekuly na povrch částice (λ_MR). Tento mechanismus je tedy závislý na struktuře sledované molekuly.

Současným působením obou mechanismů lze v některých případech dosáhnout celkového faktoru zesílení až 10¹⁴ [3-5].

Nejúčinnějšími zesilovači záření pak jsou soubory interagujících Ag nebo Au nanočástic s definovanou morfologií.

V těchto souborech jsou plasmonové excitace lokalizovány do tzv. „hot spots“ (Obr. 2 a 3), což jsou místa nejvyššího zesílení elektromagnetického mechanismem [3-5].

V průběhu našeho výzkumu se nám podařilo najít způsob, jak umístit biologicky významné molekuly do blízkosti zesilujících nanočástic, aniž by došlo k porušení jejich nativní struktury v důsledku interakce

s povrchem. Použili jsme tzv. molekulární spacer, tj.

povrch nanočástic jsme pokryli jednomolekulární vrstvou jiných molekul a na ně posléze navázali danou biomolekulu [6]. Dále jsme se zabývali uspořádáváním Au a Ag nanočástic pomocí molekul jako spojek [7]. Výsledků tohoto

výzkumu jsme dále

využili k realizaci nejjednoduššího a zároveň nejúčinnějšího zesilovače záření, tj. dimeru Ag nanočástic spojených zkoumanou molekulou (Obr. 4). Podařilo se nám získat signál Ramanova rozptylu této jediné molekuly, a to díky zesílení Ramanova rozptylu faktorem 10¹⁴. Pozorované změny signálu v čase, konkrétně periodické objevování a ztráty signálu (Obr.5) nám naznačují, že pravděpodobně dochází k rozpojování a opětnému spojování částic molekulární spojkou (Obr. 6) [8]. Objasnění molekulárního mechanismu fungování tohoto „spínače“ signálu je jednou z velkých výzev pro náš další výzkum.

[1] Infrared and Raman Spectroscopy, B. Schrader, Ed., VCH Weinheim, 1995.

[2] M. Moskovits, Rev. Mod. Phys. 57, 783 (1985).

[3] B. Vlčková, I.Pavel, M. Sládková, K. Šišková, M. Šlouf, M. J. Mol. Struct. 42, 843 (2007).

[4] H. Xu, J. Aizpurua, M. Kall, P. Apell, Phys. Rev. E 62, 4318 (2000).

[5] M. Moskovits, L.L. Tay, J. Yang, T. Haslett, Topics in Applied Physics 82, 215 (2002).

[6] P. Matějka, B. Vlčková, J. Vohlídal, P. Pančoška, V. Baumruk, J. Phys. Chem. 96, 1361 (1992).

[7] I. Šloufová-Srnová, B. Vlčková, Nano Letters 2, 121 (2002).

[8] B. Vlčková, M. Moskovits, I. Pavel, K. Šišková, M. Sládková, M. Šlouf,Chem.Phys.Lett. 455, 131 (2008).

Obr. 4. Dimer Ag nanočástic

Obr. 5. Fluktuace SERS signálu v čase

Obr. 6. Pravděpodobný mechanismus fluktuace SERS signálu

Distribuce iontů na površích hydradovaných aminokyselin

Jan Heyda a Pavel Jungwirth

Ústav organické chemie a biochemie AV ČR a Centrum biomolekul a komplexních molekulárních systémů, Flemingovo nám. 2, 160 00, Praha 6, Česká republika

www.molecular.cz

Definujeme-li objekt studia (např. Slunce a planety) a známe-li, jakými silami na sebe jednotlivé části působí (např. gravitace, dostředivá síla), můžeme použitím metod numerické matematiky sledovat vývoj systému v čase (pohyb planet a Slunce). Na atomární úrovni mikrosvěta je vhodnou numerickou metodou molekulární dynamika ve spojení se statistickou fyzikou a termodynamikou. Společně poskytují cenné informace o chování chemických systémů na atomární úrovni stejně jako určují hodnoty makroskopických měřitelných veličin.

V přednášce si povíme, co to je fyzikálně měřitelná veličina, co to znamená nabývat určité hodnoty i jaký má tato hodnota vztah k realizaci systému na atomární úrovni. Nakonec si ukážeme některé styčné body s experimentem a možnosti ověřování nových chemických a fyzikálních teorií.

Ve vlastní práci jsme pomocí molekulární dynamiky systematicky studovali chování kladně nabitých aminokyselin - argininu, lysinu a histidinu ve slaných roztocích. Sůl byla vždy tvořena draselným kationem a aniontem ze skupiny halogenidů. Byly studovány jak jednoduché soli, tak i jejich binární směsi. V první řadě jsme určili relativní míru interakce aniontů a aminokyselin, dále jsme definovali interakční centra a jejich podíl na souhrnné interakci. Míra interakce byla kvantifikována pomocí hustotních map (Obr. 1), množství kontaktů a kumulativních sum aniontů vzhledem k jednotlivým částem aminokyseliny.

Všechny výpočty byly provedeny jak bez polarizovatelnosti atomů, tak i s jejím zahrnutím.

Ve všech případech byl pozorován významný rozdíl v chování fluoridového aniontu proti ostatním halogenidům. Fluorid interagoval se silnou preferencí s kladně nabitou částí aminokyselin, zatímco interakce ostatních halogenidů byla rozprostřena přes celý povrch aminokyseliny. Toto specifické chování aniontů může být použito pro bližší porozumění jejich interakce s proteiny, které je nezbytné pro vysvětlení vysolování a denaturace bílkovin stejně jako vlivu soli na enzymatickou aktivitu.

Obr. 1 – Rozložení pravděpodobnosti výskytu aniontu (F^–, Cl^–, Br^–, I^–) v blízkosti kladně nabité skupiny na argininu.

Kyselost vodních povrchů

R. Vácha and P. Jungwirth

Ústav organické chemie a biochemie AV ČR a Centrum biomolekul a komplexních molekulárních systémů, Flemingovo nám. 2, 160 00, Praha 6, Česká republika

http://www.molecular.cz/~vacha robert.vacha@marge.uochb.cas.cz

Na první pohled by se mohlo zdát, že povrch čisté vody se nebude lišit od jejího zbytku, a tedy koncentrace auto-disociačních produktů vody (H⁺ i OH^-) bude 10^-7M. Na druhou stranu již na počátku minulého století bylo ukázáno, že povrch vody by měl být zcela bez iontů. Tato teorie je založena na čistě elektrostatickém přístupu, kdy ion jako bodový náboj je odpuzován od rozhraní dvou dielektrik. Nicméně v poslední době bylo pomoci počítačových simulaci a povrchově citlivých spektroskopických experimentu ukázáno, že toto zjednoušení je pro některé ionty zavádějící a tyto ionty se mohou na vodním povrchu nejen vyskytovat, ale jejich koncentrace může být na povrchu dokonce větší než v kapané fázi (díky polarizovatelnosti a/nebo velikosti iontu) [1]. Tím se nabízí otázka, zda se také H⁺ a/nebo OH^- ionty na povrchu nevyskytují ve zvýšené míře, což by mohlo ovliňovat řadu chemických reakcí v atmosféře, korozní procesy a podobně. Ukázali jsme, že zatímco H⁺ se vyskytuje na vodním povrchu ve zvýšené míře, OH^- ion preferuje kapalnou fázi [2,3] (Obr. 1). Tyto výsledky jsou podpořeny nedávnými povrchově citlivými experimenty, ale jeví se v rozporu s interpretací makroskopických měření pohyblivosti olejových kapek.

Obr. 1 – Rozhraní vody a vzduchu v simulaci

[1] Jungwirth, P.; Tobias, D. J.: Specific ion effects at the air/water interface (Review) & Introduction to the

Modelování polyelektrolytů pomocí zhrubených modelů

P. Košovan a K. Procházka

Katedra fyzikální a makromolekulární chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze, Albertov 6, 128 43, Praha 2, Česká republika

http://www.natur.cuni.cz/~pmc http://lynette.natur.cuni.cz kosovan@vivien.natur.cuni.cz

Skupina asociujících polymerů pod vedením prof. Procházky se zabývá modelováním a experimentálním studiem makromolekul, které za vhodných podmínek vytvářejí různé nadmolekulární struktury, např. micely. Makroskopické chování roztoků těchto molekul je dáno jejich konformací na mikroskopické škále. Zatímco z experimentu máme pouze nepřímé informace o konformaci, v simulaci se můžeme na konformaci “podívat”. Počítačové modelování nám umožnuje lépe pochopit, jak závisí konformace makromolekuly na vnějších podmínkách. Na základě těchto informací pak můžeme cíleně měnit vnější podmínky tak, aby jsme dosáhli požadovaných vlastností, nebo naopak, simulace mohou posloužit jako vodítko pro syntézu makromolekul, které budou mít za daných podmínek požadované vlastnosti.

Velké molekuly nelze modelovat přesnými atomistickými modely, které jsou používány v molekulové dynamice malých molekul, protože obsahují příliš mnoho atomů a výpočet by trval příliš dlouho – třeba několik let či déle. Lze však použít tzv. zhrubené modely (anglicky Coarse-grained models), které sice nedokážou popsat detailní chemickou strukturu, ale pomocí efektivních interakcí zjednodušeně popíšou ty vlastnosti stavebních jednotek, které jsou rozhodující pro chování makromolekuly jako celku. Výměnou za ztrátu některých méně důležitých detailů je to, že simulaci lze provést v kratším čase, například několik dní. Většinu objemu reálného roztoku tvoří molekuly rozpouštědla, kterých chování nás příliš nezajímá.

Další zjednodušení v simulacích makromolekul spočívá v použití tzv. implicitního rozpouštědla, t.j. nahrazení molekul rozpouštědla náhodnými silami. Pouze u zhrubených modelů v implicitním rozpouštědle lze dosáhnout simulačních časů, které odpovídají řádově mikrosekundám reálného času, což je časová škála, na které probíhá dynamika velkých molekul.

V této přednášce ukážeme příklad aplikace molekulové dynamiky a zhrubených modelů na modelování polyelektrolytů. Polyelektrolyt je polymer, u kterého mohou některé monomerní jednotky disociovat v roztoku (např. protože obsahují COOH skupiny). Protože je takových skupin na molekule mnoho, navzájem se odpuzují a způsobují natažení polymerního řetězce. Na druhé straně, u většiny polymerů jsou jejich monomerní jednotky hydrofobní, takže kontakty s rozpouštědlem jsou pro ně méně výhodné než kontakty s monomerními

jednotkami stejného typu. To způsobuje, že nenabitý řetězec polyelektrolytu se sbalí a vytvoří kompaktní hydrofobní doménu. V závislosti na tom, kolik nabitých skupin je na řetězci, t.j. na stupni ionizace, může polyelektrolyt vytvářet různé konformace, od úplně natažené (tyčka), až po úplně sbalenou (kulička). Obr. 1 ilustruje, jak se postupně mění konformace polyelektrolytu s měnícím se stupněm ionizace.

Obr. 1 - Konformace polyelektrolytu v závislosti na stupni ionizace, .

Legenda: červená – nenabité monomerní jednotky, modrá – nabité monomerní jednotky, stříbrná – protionty.

Ab initio popis slabě vázaných molekulových krystalů

M.Rubeš a O.Bludský

Ústav organické chemie a biochemie AV ČR a Centrum biomolekul a komplexních molekulárních systémů, Flemingovo nám. 2, 160 00, Praha 6, Česká republika

http://www.molecular.cz

První část příspěvku je věnována stručnému přehledu současných ab initio metod^[1] (Obr.1) se zvláštním důrazem na metodu DFT^[2] (Density functional theory). Hlavní výhodou DFT jsou malé výpočetní nároky ve srovnání s přesnými post-HF (Hartree-Fock) ab initio metodami.

K největším nevýhodám patří skutečnost, že standardně používané funkcionály hustot (LDA, GGA) mají problémy s popisem slabě vázáných systémů (tj. systémů stabilizovaných disperzí, vodíkovou vazbou apod.). Pro přesný popis těchto systémů byla vyvinuta celá řada empirických korekčních schémat^[3] (DFT-D) opravujících nefyzikální chování funkcionálů hustot při zachování výpočetních nároků standardního DFT.

Druhá část příspěvku je věnována aplikacím DFT-D metod pro pevný acetylen, benzen a grafit. Slabě vázané molekulové krystaly představují ideální testovací systémy, jelikož vyžadují velmi přesný teoretický popis interakcí v daném krystalu a zároveň jsou zde k dispozici velmi spolehlivá experimentální data.^[4]

Obr.1 Schématické zobrazení aproximativních ab initio metod.

[1] P. Nachtigall, Zeolites and Ordered Mesoporous Materials: Progress and Prospects 157, 243 (2005).

[2] P. Hohenberg, W. Kohn, Physical Review B 136, B864 (1964).

[3] O. Bludsky, M. Rubes, P. Soldan, P. Nachtigall, Journal of Chemical Physics 128, (2008).

[4] J. P. M. Lommerse et al., Acta Crystallographica Section B-Structural Science 56, 697 (2000).

Stabilita dvojšroubovice DNA koreluje s interakčními energiemi mezi bázemi

J. Řezáč a P. Hobza

Ústav organické chemie a biochemie AV ČR a Centrum biomolekul a komplexních molekulárních systémů, Flemingovo nám. 2, 160 00, Praha 6, Česká republika

http://www.molecular.cz rezac@uochb.cas.cz

Studovali jsme vztah mezi energií jednotlivých typů interakcí mezi bázemi (kterou lze přesně spočítat metodami kvantové chemie) a celkovou stabilitou dvoušroubovice DNA (která je měřitelná experimentálně). Výpočty byly prováděny metodou DFT-D, vyvinutou v naší laboratoři, která umožňuje efektivní a přesné výpočty na statisticky významném vzorku oli- gomerů DNA. V první fázi [1] jsme použili 140 oktamerů, pro které jsou dostupné experi- mentální data. Jednotlivé příspěvky (vodíkové vazby, patrové disperzní interakce a disperzní síly mezi jednotlivými vlákny) byly jednotlivě váženy ve statistickém modelu, který byl para- metrizován na experimentální data. Ukázalo se, že pro dobrou korelaci je nutné zahrnout i solvatační energii.

Výsledný model je schopen nejen odhadovat stabilitu oligomerů DNA na základě kvantově-chemických výpočtů, ale ukazuje i relativní důležitost jednotlivých typů interakcí.

Výsledky potvrzují důležitou roli patrových interakcí v DNA (Obr. 1).

V další práci [2] jsme model rozšířili na různě dlouhé oligomery. Aplikovali jsme jej i na DNA obsahující nepřírodní bázi inosin, kde ale model selhal, protože se zde projevují i další vlivy, které nebylo nutno zahrnout pro popis přírodní DNA.

Obr. 1 – odhad stability dvoušroubovice DNA

Interakce metallacarboranů s biomolekulami: QM/MM výpočty upřesňují krystalovou strukturu komplexu HIV-1

proteázy s metallacarboranovým inhibitorem

J. Fanfrlík, M. Lepšík,J. Řezáč,J. Brynda a P. Hobza

Ústav organické chemie a biochemie AV ČR a Centrum biomolekul a komplexních molekulárních systémů, Flemingovo nám. 2, 160 00, Praha 6, Česká republika

http://www.molecular.cz jindrich.fanfrlik@marge.uochb.cas.cz

Polyhedralní metallacarborany představují skupinu nových, specifických, stabilních, netoxických a nadějných inhibitorů HIV-1 proteázy (PR). HIV-1 PR je jedním z hlavních cílů vývoje leků proti AIDS [1]. Krystalová struktura HIV-1 PR s metalacarboranovým inhibitorem s rozlišením 2.15 Ǻ ukázala nesymetrické navázání inhibitoru (sloučenina 1, [Co-bis(dicarbollide)]^-) do PR (Obr. 1) [1]. QM/MM metodologie je zde použita k upřesnění krystalové struktury a k popisu interakce mezi inhibitorem a HIV-1 PR (Obr. 2).

–

Obr. 1: sloučenina 1 [Co-bis(dicarbollide)]^-

Obr. 2: Krystalová struktura sloučeniny 1 s HIV-1 proteazou.

[1] P. Cígler, M. Kožíšek, P. Řezáčová, J. Brynda, Z. Otwinowski, J. Pokorná, J. Plešek, B. Grüner, L.

Dolečková-Marešová, M. Máša, J. Sedláček, J. Bodem, H. G. Krausslich, V. Král and J. Konvalinka, Proc. Natl.

Acad. Sci. U S A, 2005, 102, 15394.

Interactions of Aromatic Residues in Proteins

L. Biedermannová, J. Vondrášek and P. Hobza

Center for Biomolecules and Complex Molecular Systems, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, Flemingovo nám. 2,160 00, Praha 6, Czech Republic

http://www.molecular.cz

Department of Organic and Nuclear Chemistry, Charles University in Prague, Faculty of Science, Albertov 6, 128 43, Praha 2, Czech Republic

http://orgchem.cz/

The aromatic residues play an important role not only in the formation of the core of globular proteins, but also in many molecular recognition processes. In order to describe the interactions of non-polar aromatic and aliphatic moieties precisely, it is necessary to employ high-level methods, e.g. CCSD(T), which are able to describe correctly the correlation part of the interaction. This is because the dispersion forces, which are dominant in the interactions of such systems, originate from the correlation effects. Another possibility is to use a lower level method, such as density functional theory (DFT), augmented with an empirical dispersion parameter (DFT-D), and adjusted to reproduce a set of high-level calculation data.

Proline-tryptophan complexes derived from experimental structures were investigated (Fig. 1 A,B) by quantum chemical procedures known to properly describe the London dispersion energy. [1] Interestingly, the interaction energies in in the proline-trypthophan complex can be very large, especially in the “stacked-like” arrangement where the two residues are in parallel orientation (~7 kcal/mol). The strength of stabilization is rather surprising regarding the fact that only one partner has aromatic character. The interaction energy decomposition using SAPT method demonstrates an important role of dispersion energy in this arrangement.

To elucidate the structural features, responsible for such an unexpectedly large stabilization, we examined the role of the nitrogen heteroatom and the importance of the cyclicity of proline residue. We show that the electrostatic interaction due to the presence of the dipole, caused by nitrogen heteroatom, contributes largely to the strength of the interaction. Nevertheless, the cyclic arrangement of proline, which allows for the largest amount of dispersive contact with the aromatic partner, has also a non-negligible effect.

Geometry optimizations carried out for the “stacked-like” complexes show that the

We conclude that the strength of proline non-covalent interactions, combined with this residue’s rigidity, might be the explanation of its prominent role in protein stabilization as well as recognition processes. This is indeed confirmed by the analysis of two protein-protein interaction interfaces, where the interaction of tryptophan with proline residues plays a prominent role.

A) B)

Fig. 1: Two of the analyzed proline-rich domains mediating the protein-protein recognition via the interaction with tryptophane:

A) Binding motif of Trp23 residue from EVH1 domain in complex with proline-rich sequence from ActA peptide; PDB code 1evh.

B) Binding motif of Trp28 residue from GYF domain in complex with proline-rich CD2 tail segment peptide; PDB code 1l2z.

[1] L. Biedermannova, K. E. Riley, K. Berka, P. Hobza & J. Vondrasek, Phys. Chem. Chem. Phys., submitted (2008).

Decomposition of the Energy Stabilization Inside of the Hydrophobic Core of Rubredoxin.

K. Berka, J. Vondrášek and P. Hobza

Center for Biomolecules and Complex Molecular Systems, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Flemingovo nám. 2,160 00, Praha 6, Czech Republic

http://www.molecular.cz karel.berka@marge.uochb.cas.cz

A hydrophobic core of proteins is believed to be responsible for major stabilization of protein tertiary structure. Prevailing amino acids in the core are of aliphatic or aromatic character and therefore the core is in majority stabilized by non covalent interactions. Here we present a theoretical analysis of the interaction energy of amino acids composing the hydrophobic core of small globular protein rubredoxin (Figure 1). The most striking result is that the dispersion interaction plays the key role in the stabilization of the hydrophobic core of the proteins.

Figure 1 - Rubredoxin (PDB ID 1RB9). Residues of the hydrophobic core are colored by their interaction energy. Red color means the maximal interaction energy and blue color means minimal interaction energy

Interactions between roscovitine and cyclin-dependent kinase 2

Petr Dobeš and Pavel Hobza

Center for Biomolecules and Complex Molecular Systems, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Flemingovo nám. 2,160 00, Praha 6, Czech Republic

http://www.molecular.cz petr.dobes@uochb.cas.cz

The cyclin-dependent kinase 2 (cdk2) controls the progression of the cell cycle. This protein phoshorylates other regulatory proteins of cell cycle and thus it activates them. The purine like inhibitor such as roscovitine binds to the ATP binding pocket. The correlated ab initio study has shown that main role of binding plays dispersion energy and that AMBER force field is sufficient for describing interaction between roscovitine and cdk2. The binding free energy for that complex was estimated using a continuum solvent (MM-PBSA) approach.

Those results, along with structural data from molecular dynamics trajectories, allowed the identification of group of similar placements that serve as a model for natural protein ligand complex structure.

Quantum chemical calculations of spectroscopic parameters for intermediates in the reaction cycle of

multicopper oxidases

J. Chalupský and Lubomír Rulíšek

Institute of Organic Chemistry and Biochemistry Academy of Sciences of the Czech Republic, and Center for Complex Molecular Systems and Biomolecules, Flemingovo nam. 2, 166 10

Praha 6, Czech Republic

Recent spectroscopic studies of multicopper oxidases (MCOs) have provided several alternative structural models for key intermediates in its catalytic cycle, the native (NI) and peroxy intermediate (PI), as well as for the peroxy adduct (PA). On the other hand, extensive quantum mechanical/molecular mechanical (QM/MM) calculations of possible protonation and redox states of intermediates along the complicated reaction pathway of four-electron reduction of dioxygen to water, have yielded a detailed structural and energetic characterization. In order to establish a direct link between theory and experiment, quantum chemical calculations of the spectroscopic parameters for the most plausible structures for each of the intermediates are reported here. Using the model complexes attaining the equilibrium geometry in the protein (i.e., the truncated quantum region from the QM/MM calculations) and multi-reference wave functions as provided by the multi-state CASPT2 and MRDDCI2 methods, spectroscopic results have been reproduced with a near-quantitative accuracy. The low lying doublet state of ~150 cm^-1, and a doublet-quartet gap of ~780 cm^-1 in NI, zero-field splitting of the ground ²E state in a D3 symmetric hydroxy-bridged trinuclear Cu(II) model complex of ~70 cm^-1, the quantitatively correct quartet-doublet splitting of 164 cm^-1 in a CS symmetric μ3–oxo-bridged trinuclear Cu(II) cluster, the analysis of the multi- reference character of the low-spin states in (Cu^I/II)(Cu^II)2 clusters, and the fact that in all cases, low spin states (S = 0 or S = 1/2) have been unambiguously identified as the ground state, belong to the most important findings of this work. These results have allowed us to

Principles and Recent Applications of Fluorescence Solvent Relaxation Technique – Drug Delivery Systems

A. Olżyńska and M.Hof

Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejskova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic

http://www.jh-inst.cas.cz/~fluorescence

Fluorescence is the process of spontaneous emission of light from a singlet excited state. [1]

Before this spontaneous emission, the absorption of the photon by fluorophore (molecule that can absorb and emit the light) must occur. This transition from singlet electronic ground state to excited state takes place in a time (10^-15 s) to short for displacement of nuclei (Franck- Condon rule) creating so-called Franck-Condon state. Following excitation, the solvent dipoles can reorient or relax, which lowers the energy of the excited state; higher solvent polarity effects in bigger Stokes’ shift of the emission spectrum (towards longer wavelengths) (see Fig. 1).

Fig.1. Simplified Jablonski diagram. Polar fluorophores surrounded by polar solvent mole- cules in ground and excited states are shown.

F

Frraanncckk--CCoonnddoonn ststaattee

G

Grroouunndd ssttaattee

S

Sttookkeess'' s shhiifftt RReellaaxxeedd ssttaattee

A

Abbssoorrppttiioonn

F

Flluuoorreesscceennccee

As long as the fluorescence lifetime of a particular fluorophore, defined as the average time molecule stays in excited state, is long enough to reach the relaxed state of the system, we can get information on the polarity of the fluorophore surrounding. However, only time-resolved fluorescence measurements enable us to reconstruct the so-called time-resolved emission spectra (TRES) and get the information on the kinetic of the solvent relaxation process.[2]

Fluorescence solvent relaxation technique (SR) is based on collecting fluorescent decays for a number of wavelengths spanning the emission spectrum and analyzing the reconstructed TRES. The method can be used for the measurements of polarity and viscosity of neat solvents but also of biological membranes (see Fig.2, on the right). When the fluorophore is incorporated in the lipid membrane, it provides information on the hydration and dynamics of this structure [2], i.e. the overall Stokes’ shift which correlates with the probe environment polarity, reflects the degree of membrane hydration and the kinetics of the time-resolved Stokes’ shift reports on mobility of the hydrated lipids in the membrane.

Fig.2. On the left: structure of the positively charged lipid molecule (DOTAP). On the right:

liposome as an example of lipid membrane labeled with fluorophore molecules.

SR technique can be applied to characterize positively charged lipid membranes (important for gene therapy). We compare binary lipid mixtures consist of a cationic lipid (DOTAP (Fig.2, left panel) or DMTAP) and a neutral helper lipid (DOPC, DMPC or DOPE).[3,4]

Thanks to the sensitivity of the method we were able to characterize those systems at the molecular level. The obtained results are in agreement with the molecular dynamics simula- tions performed lately.

[1] J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed.; Kluwer-Plenum Press: New York (1999) [2] P.Jurkiewicz, J. Sýkora, A. Olżyńska, J. Humpolíčková, M. Hof, J. Fluorescence 15, 883, (2005).

Reaction mechanism of Stearoyl-ACP Δ9 Desaturase.

QM/MM study

M. Srnec and L. Rulíšek

Center for Biomolecules and Complex Molecular Systems, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Flemingovo nám. 2,160 00, Praha 6, Czech Republic

http://www.molecular.cz srnec@uochb.cas.cz

The soluble Δ⁹-desaturase is NADPH^- and dioxygen-dependent enzyme with binuclear non- heme iron active site catalyzing the insertion of the cis double bond between the 9 and 10 position of stearoyl-ACP. Despite there exist spectroscopic studies of substrate binding describing the geometrical changes of the active site during catalytic cycle,[1,2,3] the detailed structural and energy information regarding the Δ⁹-desaturase reaction mechanism is not sufficiently understood.

We use the combined quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) calculations (Obr. 1) to elucidate the substrate and dioxygen binding mode in active site, and the changes in the electronic structure of the active site during the catalytic cycle.

Obr. 1 – Treating of the system within QM/MM

[1] Solomon et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2770.

[2] Solomon et al., Inorg. Chem. 2001, 40, 3656.

[3] Solomon et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8842.

Induced micellization by interaction of double hydrophilic block copolymers with metal compound. Micelle and CdS

Nanoparticle characteristics

M. Uchman and K. Procházka

Department of Physical and Macromolecular Chemistry, Charles University in Prague, Hlavova 2030, 12843 Prague2 Czech Republic

http://www.natur.cuni.cz/%7Epmc/

qqryk@o2.pl K. Gatsouli and S. Pispas

Theoretical and Physical Chemistry Institute, National Hellenic Research Foundation, 48 Vasileos Konstantinou Ave., 11635 Athens, Greece

http://www.eie.gr/index-en.html

Hybrid micelles of sodium (sulfamate-carboxylate)isoprene/ethylene oxide double hydro- philic diblock copolymer¹ and CdS nanoparticles (SCIEO-2/CdS) were prepared according to the following protocol: the SCIEO-2 was dissolved in water, acidified with a few drops of HCl. A weighted amount of cadmium acetate, Cd(Ac)2, was added to the polymer solution under stirring for 24h. The amount of Cd(Ac)2 was calculated according to the desired proportion of acidic groups (SO3H and COOH), present on the polymer chain, to Cd²⁺ ions ( molar ratios 1:1 and 2:1). The solution was subsequently heated to approximately 80^oC and thioacetamide aqueous solution was slowly added drop wise. During heating, H2S is formed by the thermal decomposition of thioacetamide and serves as a sulfur source (S/Cd molar ratio was kept at 2), Fig. 1. The solution acquired a stable yellowish to orange colour, depending on the CdS content, in less than 2h. Then it was cooled at room temperature.

Cd(Ac)2 Thioacetamide

Micellization

: PEO : Cd /SO , COO clusters²⁺ 3^{- -}

Induced micelles

Hybrid micelles

A number of characterization techniques, including fluorescence correlation spectroscopy (FCS), steady-state fluorescence spectroscopy, UV-vis spectroscopy (UV-vis), dynamic light scattering (DLS), atomic force microscopy (AFM) and transmission electron microscopy (TEM) were employed to characterize the prepared nanoparticles, both CdS and hybrid micelles. Upon addition of cadium ions Cd²⁺ in the solution of the polymer in water, a solvent for both blocks, micelles are formed due to the complexation of Cd²⁺ with SO3- and COO^- from SCI units. The induced micelle core is composed of CSI/Cd²⁺ clusters, and the shell is composed of polyethylene oxide blocks. Therefore the precursor ions are confined in the micelles cores, resulting in a nanoreactor. Concomitantly with the introduction of sulfane, semiconductor CdS nanocrystals are formed. The resulting nanoparticles are stabilized by the interaction between SCI units with the surface of the CdS nanocrystals. UV-vis absorption spectra and TEM images show that larger CdS nanoparticles are produced at SO3-, COO^-/Cd²⁺

molar ratio 2:1.^2,3 Hydrodynamic radii (RH) of hybrid micelles were determined by DLS (90.2nm and 24.6nm) and FCS (57.4nm and 13.7nm) measurement at different SO3-, COO^- /Cd²⁺ molar ratios 1:1 and 2:1, respectively. Some differences in RH were observed as expected, since the z-average and number-average diffusion coefficients were measured. The AFM images show primarily spherical particles with some secondary aggregation, towards worm-like structures, these agree with results achieved from DLS and TEM.

[1] S. Pispas, Journal of Polymer Science: Part A Polymer Chemistry, 44, 606, (2006) [2] H. Zhao, E.P. Douglas, B.S. Harrison, K.S. Schanze, Langmuir, 17, 8428, (2001)

[3] Y. Wang, A. Suna, W. Mahler, R. Kasowski, Journal of Chemical Physics 87, 7315, (1987).

Adresář účastníků konference Berka Karel karel.berka@marge.uochb.cas.cz Biedermannová Lada lada.biedermannova@gmail.com Bouřa Evžen eugenee@seznam.cz

Dammer Ondřej odam@seznam.cz

Dobeš Petr petr.dobes@uochb.cas.cz

Fanrfrlík Jindřich jindrich.fanfrlik@marge.uochb.cas.cz Heyda Jan jan.heyda@uochb.cas.cz

Chalupský Jakub chalupsky@uochb.cas.cz Chudoba Richard chemie@ritchie.cz Jirsák Jan jirsak@icpf.cas.cz

Košovan Peter kosovan@vivien.natur.cuni.cz Lokajová Jana lokajova@seznam.cz

Olzynska Agnieszka agnieszka.olzynska@jh-inst.cas.cz Rubeš Miroslav miroslav.rubes@marge.uochb.cas.cz Řezáč Jan rezac@uochb.cas.cz

Sládková Magda MagdiSla@seznam.cz Srnec Martin srnec@uochb.cas.cz Šišková Karolína ksiskova@seznam.cz Uchman Mariusz qqryk@o2.pl

Vácha Robert robert.vacha@marge.uochb.cas.cz