CH CH

1

Cht la bych na tomto míst pod kovat svému školiteli, Doc. RNDr. Ji in Škorpíkové, CSc., za pomoc a rady, které mi poskytovala v pr b hu psaní této práce a v pr b hu postgraduálního studia. Dále d kuji paní Svatav Modrové za neocenitelnou pomoc p i realizaci odborných m ení, MUDR. Theodoru Horváthovi, CSc. za poskytnutí odborné literatury, prof. RNDr. Vojt chu Mornsteinovi, CSc., za pomoc p i publika ní innosti a prof. MUDR. Romanu Janischovi, CSc., za poskytnutí odborných p ipomínek k práci.

V neposlední ad d kuji také svým rodi m a manželovi za jejich velkou podporu a porozum ní.

Práce byla podpo ena granty . 301/03/H005 a . 304/04/1386 Grantové agentury eské republiky.

2

Prohlašuji, že tato dizerta ní práce je mým p vodním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatn . Všechny zdroje, prameny a literaturu, které jsem p i vypracování používala nebo z nich erpala, v práci ádn cituji s uvedením úplného odkazu na p íslušný zdroj.

V Brn , dne ………

3

Abstrakt

Název práce: Studium potenciálního fotosensibilizátoru indocyaninové zelen in vitro Autor: Mgr. Kate ina Sk ivanová, katerina@jeremy.cz

Katedra: Léka ské biofyziky, LF MU Brno

Vedoucí diserta ní práce: Doc. RNDr. Ji ina Škorpíková, CSc., jskorpik@med.muni.cz

Tato diserta ní práce shrnuje výsledky studia potenciálního fotosensibilizátoru indocyaninové zelen (ICG) v testech cytotoxicity a fototoxicity na bun ných kulturách HeLa bun k a fibroblastech ínského k e ka V79 in vitro. Pro d kladnou fotochemickou charakterizaci bylo ICG podrobeno spektrofotometrickým m ením pro stanovení absorp ního maxima za r zných experimentálních podmínek. ICG se prokazateln akumulovala v HeLa bu kách. Po realizaci test cytotoxicity ICG jsme vybrali rozmezí nejvyšších netoxických koncentrací ICG pro následné testy fototoxicity in vitro.

Z výsledk experiment vyplývá, že v testovaném koncentra ním rozmezí 24 – 194 µM ICG fototoxický efekt roste s koncentrací ICG, hustotou ozá ení laserem a s délkou expozice ozá ených HeLa bun k ICG. Pro zesílení fototoxického efektu jsme provedli experimenty s peroxidem vodíku coby oxida ním inidlem v kombinaci s ICG, který 48 hodin po ozá ení laserem vyvolal žádaný potencia ní efekt. Naše experimenty potvrzují, že ICG by mohla být perspektivním agens pro použití ve fotodynamické terapii a že její fototoxický efekt m že být zesílen p ídavkem oxida ního inidla.

Klí ová slova: Indocyaninová zele , Fotosensibilizátor, HeLa bu ky, fibroblasty ínského k e ka V79, peroxid vodíku

4

Abstract

Title of dissertation: The study of a potential photosensitiser indocyanine green in vitro.

Author: Mgr. Kate ina Sk ivanová, katerina@jeremy.cz

Workplace: Department of Biophysics, Medical Fakulty, Masaryk University, Brno Supervisit of dissertation: Doc. RNDr. Ji ina Škorpíková, CSc.

This disertation summarizes the results of the research on indocyanine green (ICG) as a potential photosensitiser in tests of cytotoxicity and phototoxicity on HeLa cells and V79 keratinocytes in vitro. For the determination of the ICG absorption maximum at different experimental conditions we analysed this substance by spectrophotometric method.

Moreover, we proved that ICG accumulated in HeLa cells. After the cytotoxic tests of ICG, we choose the range of the highest non-toxic concentrations of ICG for further phototoxic tests in vitro. From our experiments, it reveals that in the tested concentration range of 24 – 194 µM ICG the phototoxic effect increases with the ICG concentration, the exposure duration and applied irradiation dose. For the stimulation of ICG phototoxicity, we added H2O2 to the ICG solution, as a strong oxidation agent, which lead to a potentiation of the phototoxic effect of ICG48 hours after laser irradiation. Our results confirm that ICG could be a perspective agent in photodynamic therapy and that its phototoxic effect can be potentiated by addition of an oxidising agent.

Key words: Indocyanine green, Photosensitiser, HeLa cells, V79 Chinese hamster fibroblasts, Hydrogen peroxide

5

Seznam zkratek

ICG indocyaninová zele PDT fotodynamická terapie F fotosensibilizátor

M molekula

kvantový výt žek produkce ¹O2

–Q kvantový výt žek fotooxidace zháše e Q

f kvantový výt žek fluorescence k rychlostní konstanta

A absorbance molekuly p i excita ní vlnové délce frakce absorbované energie uvoln né jako rychlé teplo Ea celková absorbovaná energie

Ef energie nesená fluorescen ními kvanty E energie nesená O2(1 g)

E0 energie dopadajícího pulsu R polom r excitujícího pulsu

a tranzitní as

doba životaO2(1 g)

a rychlost zvuku v rozpoušt dle H amplituda akustického signálu PBS fosfátový pufr

DMEM Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium EDTA ethylendiamintetraoctvá kyselina

DMSO dimethylsulfoxid ROS reaktivní formy kyslíku

6

Obsah

1. Prolog ... 8

2. Úvod ... 10

2.1 PDT: Možnosti a omezení ... 10

2.2 Fotosensibilizátory v PDT ... 14

2.3 Fotochemické vlastnosti fotosensibilizátor ... 14

2.3.1 Fotofyzikální vlastnosti fotosensibilizátor ... 20

2.3.2 Vlastnosti fotosensibilizátor pot ebné pro aplikaci v PDT... 24

2.4 Testování toxicity fotosensibilizátor ... 24

2.4.1 Testy toxicity in vitro... 24

2.5 Zdroje sv tla v PDT ... 25

2.5.1 Laserové zdroje... 26

2.5.2 Lampy používané v PDT ... 28

3. Materiál a metody... 29

3.1 Použité bun né kultury... 29

3.2 Fotochemické vlastnosti indocyaninové zelen ... 30

3.2.1 M ení absorp ních spekter ... 30

3.3 Akumulace ICG v bu kách odvozených z nádoru ... 30

3.4 Testy toxicity ICG na bun ných kulturách in vitro... 31

3.4.1 Testy cytotoxicity ICG... 31

3.4.2 Testy fototoxicity ICG ... 32

7

3.4.3 Testy fototoxicity ICG s p ídavkem oxida ního inidla... 33

3.4.4 Analýza dat a statistika ... 34

4. Výsledky... 35

4.1 Fotochemické vlastnosti indocyaninové zelen ... 35

4.2 Akumulace ICG v bu kách odvozených z nádoru ... 37

4.3 Testy toxicity ICG na bun ných kulturách in vitro... 38

4.3.1 Testy cytotoxicity ICG na HeLa bu ky in vitro ... 38

4.3.2 Testy cytotoxicity ICG na V79 k e í fibroblasty in vitro ... 40

4.3.3 Testy fototoxicity ICG na HeLa bu ky ... 41

4.3.4 Potenciace fototoxicity oxida ním inidlem... 52

5. Diskuze... 56

5.1 Fotochemické vlastnosti ICG... 56

5.2 Akumulace ICG v bu kách odvozených z nádoru ... 59

5.3 Testy cytoxicity ICG in vitro ... 60

5.4 Testy fototoxicity ICG in vitro ... 61

5.5 Vlastní mechanismus PDT... 62

5.6 Potenciace fotochemické reakce ICG ... 64

6. Záv r ... 65

7. Summary... 68

8. Reference ... 71

9. Publika ní aktivita autora... 82

8

1. Prolog

Tém sto let je známo, že expozice fotosensitivních slou enin sv tlu vyús uje ve fotochemickou reakci (1). V bec první vyšet ení zam ené na fotodynamickou reakci bylo provedeno v roce 1903 Tappeinerem a Jesionekem u pacienta s rakovinou k že, p i emž bylo použito eozinu aktivovaného slune ním sv tlem (2). Fotodynamická terapie ve srovnání s radioteraoií a chemoterapií p edstavuje malé mutagenní nebezpe í a krom fototoxicity k že zanedbatelné vedlejší ú inky (3). Mechanismus fotodynamické reakce spo ívá v absorbci kvanta sv telné energie fotosensibilizátorem, který vstupuje do vysokoenergetického stavu. Ten p i návratu do svého základního stavu vytvá í p enosem energie na molekulární kyslík vysoce cytotoxický singletový kyslík a další volné radikály. Jejich ú inkem dochází k alteraci celulárních membránových systém cestou lipidové peroxidace a poškozením protein , což vyús í v cytolýzu a tumorózní destrukci.

V d sledku preferentního zachycování fotosensibilizátoru nádorovými bu kami je docíleno specifické destrukce nádoru, zatímco okolní tká z stává neporušena (4).

Klí ovým faktorem p i použití PDT je zvolení vhodného fotosensibilizátoru, nej ast ji porfyrinu i analogických slou enin (5). Již delší dobu je známo, že porfyriny a jejich analogy jsou schopny selektivn se akumulovat v nádorové tkáni a setrvat zde po ur itou dobu (6). Tato vlastnost a dob e popsané fotofyzikální a fotochemické vlastnosti p edur ují porfyriny pro aplikaci v PDT. Ve fázi klinického ov ování pro ú ely PDT je nap . Npe6 (mono- L asparatylchlorin 6) (7). In vitro jsou také testovány syntetické porfyriny – ftalocyaniny (8). Intenzivn jsou však zkoumány další fotocitlivé slou eniny:

perylenchinony jako jsou hypericin a hypokrelin (9) a mnohé další. Perspektivní skupinou pro ú ely PDT se zdají být indocyaninová barviva.

Diserta ní práce popisuje výsledky experimentálního výzkumu potenciálního fotosensibilizátoru Indocyaninové zelen (ICG) ze skupiny cyaninových barviv. Cílen

9

byly zkoumány fotochemické a fotofyzikální vlastnosti ICG, akumulace ICG v nádorových bu kách, fototerapeutický potenciál ICG na nádorových a normálních bun ných kulturách in vitro, optimální koncentrace ICG a intenzity ozá ení sv tlem v infra ervené oblasti pro docílení maximální fototoxicity p i nízké cytotoxicit a možnost významného zvýšení fototoxicity ICG prost ednictvím p ídavku oxida ního

inidla.

Obr. . 1: Chemická struktura indocyaninové zelen

Indocyaninová zele je trikarbonový typ barviva s infra erveným typem absorp ního spektra s maximem absorpce okolo 800 nm, což umožnuje maximální penetraci sv tla do tkání (10) a tedy efektivn jší postup aplikaci PDT. Ve viditelné oblasti absorbuje málo nebo v bec. ICG (chemickou strukturu slou eniny ukazuje Obr. .1) se používá od roku 1956 v léka ské diagnostice pro stanovení výdeje srdce, objemu krevní plasmy, v diagnostice funkce jater, kapilární mikroskopii a pro lokalizaci objekt ve tkáních. In vivo bývá ICG využívána p i barvivem zvýšené fotokoagulaci a ablaci tkání (11). Slibn se jeví aplikace ICG také ve fotochemoterapii, ta je nyní považována za efektivní paliativní terapeutickou modalitu p i lé b Kaposiho sarkomu (12). Hlavním mechanismem fototoxického efektu ICG na nádorové bu ky se zdá být mechanismus fotooxidace (13).

N

CH CH

N

CH

CH

H

C

H

C

(CH

)

(CH

)

SO

(CH CH)

CH

NaO

S

10

2. Úvod

2.1 PDT: Možnosti a omezení

Rakovina je velkým celosv tovým medicínským problémem. Jako p í ina úmrtí se adí na druhé místo za kardiovaskulární choroby. V roce 1985 byla rakovina diagnostikována u 7.6 milionu osob a asi 5 milion lidí na ni zem elo. Je obtížné toto onemocn ní v as diagnostikovat, lé ba je drahá a asov náro ná. Rakovina se zhruba d lí do dvou v tví:

rakovina vyskytující se ast ji ve vysp lých zemích (rakovina st eva a rekta, plic, melanomy k že, rakovina prsu, corpus uteri, vaje níku, prostaty, m chý e, ledvin, lymfy a leukemie), a rakovina vyskytující se asto v chudých zemích (rakovina ústní dutiny, nosofaryngu, esofagu, žaludku, jater a ípku). Nap ., nasofaryngeální karcinom (NPC) je maligní onemocn ní oblasti hlavy a krku, které je velmi asté v jihovýchodní Asii a severní Africe. Vyskytuje se predominantn u mladé populace (14). Etnické a regionální faktory významn ovliv ují riziko onemocn ní (15). Virus Epstain – Barrové, pravd podobná p í ina onemocn ní, je p ítomen ve všech bu kách nediferencovaného NPC (16).

V minulosti se lé ba omezovala na chirurgii a radioterapii. V sou asné dob je jedinou možnou lé bou ionizující zá ení, ale v intervalu 5 let p ežije pouze 65 % pacient . Proto klinikové a v dci pátrají po nové možnosti, jak lé it NPC i další typy karcinom . Jednou ze slibných metod lé by je práv PDT, u které byl zaznamenán p íznivý efekt. Na po átku byly fotoaktivní slou eniny používány hlavn jako antiseptické a antibakteriální agens, v poslední dekád se ale používání rozší ilo pro lé bu mnoha chorob v etn n kolika typ rakoviny. PDT je t í - komponentová terapie

11

zahrnující p sobení fotosensibilizátoru, sv tla absorbovaného fotosensibilizátorem a molekulárního kyslík. Všechny t i komponenty jsou tedy pro odpov nezbytné, ale jejich role jsou závislé na fotosensibilizátoru, jeho subcellulární a tká ové distribuci, typu tumoru a jeho mikrovaskularizaci a typu a délce vyvolané zán tlivé a imunitní odpov di (17, 18, 19). Fotosensibilizátor je administrován systémov , selektivn se hromadí v nádorové tkáni a p echodn ji ozna í. Pom r mezi koncentrací v nádorové versus normální tkáni byl stanoven mezi 2 a 30, v závislosti na individuálním orgánu (20, 21).

Použití PDT v terapii nádorových onemocn ní má adu výhod. Není pot eba anestézie, nedochází ke ztrátám krve, poopera ní bolestivost ozá eného místa není velká.

Karcinogenní ú inky PDT nebyly zaznamenány, což je považováno za hlavní p ednost lé by oproti klasickým postup m. Nevýhodou PDT je fotosensibilizace k že, takže pacient nem že být vystaven dennímu sv tlu po dobu 4 týdn .

V po átcích PDT byl syntetizován derivát hematoporfyrinu Protofrin I (22), u kterého byla pozorována zvýšená akumulace v nádorové tkáni. Tato látka byla používána pro diagnostiku nádor . Ve sv t je dnes nejpoužívan jším fotosensibilizátorem derivát hematoporfyrinu Protofrin II, který byl oficiáln schválen k lé b nádor mo ového m chý e, plic a jícnu v Kanad , Holandsku a Japonsku. Fotosensibilizátory první generace mají ale p i systémovém použití adu omezení, p edevším práv dlouhodob p etrvávající kožní radiosensitivitu, navíc k excitaci je nutné použít krátkovlnné sv tlo, které špatn proniká do tkání. Reziduální množství fotosensibilizátoru jsou detekována ješt za 75 dní (23). Intenzivn probíhá výzkum fotosensibilizátor druhé generace, mezi n ž adíme porfyceny, ftalocyaniny, naftalocyaniny, chloriny a další. Jejich absorp ní maxima se nachází v rozmezí vlnových délek 650 – 800 nm, které jsou charakterizovány hlubší penetrací tkán mi. Navíc se vyzna ují vysokou chemickou istotou a jsou selektivn jší (24).

12

Pomocí PDT byla nejprve lé ena pokro ilá stadia onemocn ní, kde již selhávala dostupná terapie a dále byla aplikována na malé primární nebo recidivující tumory v k ži a podkoží. Nejlepší výsledky byly dosaženy v po áte ním stadiu onemocn ní, kdy nádor byl menší než 1 cm. V t chto p ípadech nedocházelo k recidiv onemocn ní. Doposud byla PDT použita na lé ení následujících druh nádor : V dermatologii pro lé bu maligního melanomu, spinocelulárního karcinomu, kožních metastáz karcinomu prsu.

V oblasti orofaciální na karcinomy dutiny ústní, nasofaryngu, orofaryngu, o ni tumory.

Dále byla použita v kombinaci s chirurgickým zákrokem pro lé bu endobronchiálních tumor , karcinomy mo ového m chý e, kolorektální tumory, nádory d ložního hrdla (25).

13

Obr. . 2 – P íklady fotosenzibilizátor : meta-tetra hydroxymethyl chlorin (m-THPC);

mono-L asparatyl chlorin (MACE)

14

2.2 Fotosensibilizátory v PDT

Vzhledem k principu fungování PDT považuji za nezbytné d kladn rozebrat fotochemické a fotofyzikální vlastnosti fotosensibilizátor . V diserta ní práci jsou v kapitole výsledky také dokumentovány experimenty, jejichž cílem je zvýšit destruktivní sílu potenciálního fotosensibilizátoru ICG na nádorové bu ky prost ednictvím p ídavku silného oxida ního inidla, akcelerujícího fotochemické pochody v nádorové bu ce s akumulovaným fotosensibilitátorem.

2.3 Fotochemické vlastnosti fotosensibilizátor

Molekuly organických fotosensibilizátor se zpravidla nacházejí v základním singletním stavu (¹F⁰)stavu. Po absorpci sv telné ástice fotosensibilizátor p echází do excitovaného stavu (¹F^*), který se vyzna uje krátkou dobou života (1 – 100 ns). P i tomto p echodu nedochází ke zm n spinové konfigurace. Ze stavu ¹F^*, m že dojít k p ímé deexcitaci na stav ¹F⁰ nebo nebo k intersystémovému p echodu na excitivovaný tripletní stav ³F*.

Tento stav se vyzna uje dlouhou dobou života (> 500 ns) a díky ní dochází k mezimolekulárním interakcím.

Reak ním mechanismem I. dochází prost ednictvím elektronového nebo protonového transportu. Interakce ³F* se základním singletním stavem okolních akceptorových molekul (¹M) vede ke generování ady radikál (nap . ²M -). V tšina t chto radikál reaguje s molekulárním kyslíkem za vzniku reaktivních forem kyslíku (ROS), mezi které pat í radikály OH^•, HO^•2, ^•O2- a H2O2. Tyto intermediáty jsou velmi reaktivní a mohou poškozovat d ležité biomolekuly oxidací.

15

Reak ním mechanismem II. vzniká singletový kyslík ¹O2 reakcí ³F* s kyslíkem vyskytujícím se v základním tripletním stavu ³O2 (26). Singletní kyslík ¹O2 se dále podílí na tvorb radikál . Ve v tšin literatury pojednávající o ¹O2 v roztoku v kontextu s fotodynamickým efektem je termínem singletový kyslík ozna ována stabiln jší forma singletového kyslíku O2(¹ g). V posledních letech nastal zájem o generování a reakce energeticky bohatší, ale mén stabilní formy O2(¹ g) v roztoku i v plynné fázi. P isp l k tomu biologický význam fotosensitizovaných reakcí kyslíku a pot eba porozum t jejich detailnímu mechanismu. Energie singletových stav O2(¹ g) a O2(¹ g) je 94.1 a 156.9 kJ/mol. Zhášení tripletových stav v n kterých organických rozpoušt dlech produkuje v primárním kroku p enosu energie jak O2(¹ g) tak i O2(¹ g). Pom r mezi produkcí obou forem singletového kyslíku závisí na povaze fotosensibilizátoru i rozpoušt dla (27).

Singletový kyslík v roztoku zaniká t emi cestami: fosforescencí, srážkami s molekulami rozpoušt dla nebo zhášením. Zhášení znamená interakci s okolními molekulami a nemusí vždy vést k chemické zm n . M že nastávat p enosem energie na molekulu zháše e, která ji následn rozptyluje do okolního rozpoušt dla. Tento mechanismus se ozna uje jako fyzikální zhášení. Zhášení m že pobíhat také chemickou reakcí - oxidací reaktantu (chemické zhášení). Vzhledem k vysoké reaktivit ¹O2 existuje množství jeho oxida ních reakcí, které však mají jisté selektivní rysy. Typickou reakcí je adice na dvojné vazby C=C, izolované nebo konjugované, jako jsou oxidace olefín , 1,3- dien , aromatických slou enin a heterocykl . Meziprodukty, p ípadn produkty, jsou dioxetany, endoperoxidy a peroxoslou eniny. Reakce nenasycených lipid jsou typicky n-reakce. Výsledná rychlostní konstanta zhášení je dána sou tem rychlostních konstant fyzikálního a chemického procesu. Design, syntéza a studium vlastností fotosensibilizátor produkujících ¹O2 se v posledních letech rozvinuly v souvislosti s aplikacemi ve fotomedicín , zejména p i PDT (27).

16

K fotosensibilizátor m produkujícím ¹O2 pat í velký po et barviv, aromatických a heterocyklických organických slou enin a barevných kovových komplex . Zhášení tripletových stav kyslíkem m že probíhat p enosem elektronu za vzniku O^2- nebo p enosem energie vedoucí ke vzniku ¹O2. Obecn platí, že fotosensibilizátory ozna ené jako (n, *), kde excitovaný elektron pochází z nevazebného orbitalu, poskytují p evážn O^2-. Typickým p íkladem je antrachinon a jeho deriváty. Fotosensibilizátory typu ( , *), kde excitovaný elektron pochází z orbitalu, poskytují ¹O2. K tomuto typu náležejí barviva jako eozin, akridin, bengálská erve , methylenová mod , anthracen, triarylmethanová barviva, dále porfyriny, ftalocyaniny, expandované porfyriny a jejich metalokomplexy. Vznikající ¹O2 atakuje bezprost ední okolí fotosensibilizátoru.

Interakce s biopolymery a hostitelskými molekulami závisí na velikosti, znaménku, a distribuci náboje na periferii fotosensibilizátoru a na hydrofilnosti nebo hydrofobnosti interagujících partner (27).

Z aniontových fotosensibilizátor byly nejpodrobn ji prozkoumány sulfonované a karboxylované tetrafenylporfyriny a ftalocyaniny. Nap . studie (28) se zabývá subcelulární lokalizací aniontového fotosensibilizátoru disulfonovaného aluminium ftalocyaninu (AlPcS2) a 5,10,15,20-meta-tetra-hydroxyfenylchlorinu (m-THPC nebo-li Foscan) pomocí fluorescen ní mikroskopie. Tetra- a trisubstituované fotosensibilizátory jsou hydrofilní, mono- a di substituované se chovají jako amfifilní. Aniontové fotosensibilizátory interagují s kladn nabitými protonovanými aminoskupinami protein a jsou tedy klí em k degradaci protein vlivem ¹O2. Aniontové fotosensibilizátory AlPcS4

a ZnPcS4 a kationtový (N-ethylpyridinium–4-yl)porfyrin tetratosylát (TN-Et-Pyp) byly s úsp chem testovány pro ú ely destrukce Gram-positivních a Gram-negativních baktérií fotochemickou cestou (29).

Kationtové fotosensibilizátory mohou pronikat do jádra bu ky a interagovat s DNA, adí se mezi n nap . ZnPPc. Amfifilní asymetricky substituované

17

fotosensibilizátory nesou odd lené nabité hydrofilní nebo nenabité hydrofobní oblasti, které mohou nezávisle interagovat s okolními molekulami. P edstaviteli nenabitých hydrofobních fotosensibilizátor jsou nesubstituované ftalocyaniny a naftalocyaniny, z porfyrin nap . oktaethylporfin. Pro medicínské ú ely je výhodné využít afinitu hydrofobních fotosensibilizátor k lipofilním membránám. Vzhledem k nerozpustnosti hydrofobních fotosensibilizátor v polárním prost edí je nutno je zabudovat do vhodných nosi jako jsou cyklodextriny, micely, liposomy apod (30). Cílem vazby fotosensibilizátoru na vhodný p enaše je efektivn jší pr nik do bu ky, zadržení po delší

asový úsek v nádorové bu ce a tím zvýšení fotodynamické efektivity (31).

Pro detekci, stanovení a spektroskopie singletového kyslíku lze použít metody chemické i fyzikální. Pro detekci a stanovení výt žk ¹O2 v kapalné fázi lze použít metod založených na jeho reakcích s vhodnými látkami tvo ícími charakteristické primární i sekundární produkty fotooxidace. Zatímco v tšina termických oxidací kyslíkem je teplotn závislá, oxidace singletovým kyslíkem na teplot tak ka nezávisejí a asto probíhají stereospecificky. Pro použití dané reakce k detekci je d ležité, aby byla dostate n selektivní pro ¹O2 , tj. aby dovolovala odlišení vlivu od ostatních reaktivních oxo – ástic (nap . ^•O2- , OH^•). To bývá astým problémem t chto metod, který je ale vyvážen jednoduchostí experimentálního provedení. M ení kvantových výt žk fotooxidace –Q zháše e Q za podmínek kontinuálního oza ování slouží k získání jak hodnot kvantového výt žku singletového kyslíku , tak i rychlostních konstant fyzikálního a chemického zhášení. Za p edpokladu ustáleného stavu vzniku a podmínek, kdy koncentrace zháše e Q lze považovat za konstantní (tj., mén než 10 % úbytek b hem experimentu) se získává rovnice (27):

–Q = kr [Q] / kd + kq [Q]

18

kde kr p edstavuje rychlostní konstantu chemického zhášení (reakce), kq je rychlostní konstanta zahrnující všechny zhášecí procesy (tj. chemické i fyzikální) a kd je rychlostní konstanta zahrnující fosforescenci a srážky s molekulami rozpoušt dla. Zhášecí metody se používají b žn k diagnostice p ítomnosti ¹O2 v komplexních reakcích. Inhibice sledované reakce p ídavkem fyzikálních zháše jako azidu sodného i –karotenu sv d í o p ítomnosti ¹O2. Rovn ž se používají chemické zháše e jako histidin který reaguje za vzniku p íslušného endoperoxidu, dále 2,5-dimethylfuran, tryptofan, kyselina mo ová nebo 1,4-dizabilcyklo(2,2,2)oktan (DABCO). asto používaným zp sobem jak diagnostikovat ú ast ¹O2 v reakci je použití D2O místo H2O. Doba života singletového kyslíku je 16 krát vyšší než v H2O a pravd podobnost chemické reakce je proto vyšší.

P ítomnost ¹O2 indikuje zvýšení reak ní rychlosti nebo vyšší výt žek reak ních produkt . Ve studii (32) byly jako ROS sensory použity Dane-Py a HO-1889NH, které oba reagují s ¹O2.

Pro detekci ¹O2 slouží také odbarvovací metody, které jsou založeny na skute nosti, že b hem reakce s ¹O2 se absorp ní pásy reaktantu snižují úm rn množství generovaného ¹O2. Reakci lze sledovat spektrofotometricky nebo fluorescen n , protože kyslík má velkou schopnost na chromofory reaktantu p sobit destruk n . Reaktanty jsou v tšinou tvo eny systémem dvojných vazeb, se kterými reaguje za vzniku endoperoxid i hydroperoxid . Millington a kol. (33) studovali r zná b lící fluorescen ní inidla (kumariny, pyrazoliny), produkující hydroperoxidy a superoxidový radikálový aniont po ozá ení ve vodném roztoku UV sv tlem (366 nm) blízko jejich absorp ních maxim. P i odbarvovacích metodách je nutné pamatovat na ur itá omezení: Fotosensibilizátor i reaktant jsou rozpušt ny ve stejném rozpoušt dle, nesm jí se tedy moc lišit polaritou.

Navíc fotosensibilizátor i reaktant musejí být navzájem zcela indiferentní v základních i excitovaných stavech. Nežádoucí jsou tedy možné donor-akceptorové p enosy elektronu i energie mezi excitovaným fotosensibilizátorem a reaktantem. Absorp ní pásy fotosensibilizátoru a reaktantu by se nem ly p ekrývat z d vodu filtra ního efektu

19

dopadajícího zá ení. Podobnou reakci mohou vyvolat jiné reaktivní formy kyslíku (nap .

•O2-,OH^•) (27).

Pro stanovení ¹O2 v organických rozpoušt dlech se doporu uje použití reakce 1,3 – difenylisobenzonfuranu sledované poklesem absorbance p i 440 nm. Ve vodném prost edí lze použít draselné soli tryptofanu, kyseliny mo ové nebo N,N -dimethyl – 4 - nitrosoanilinu (RNO). Reakce s RNO se používá i pro biologická prost edí. Pokles absorbance pásu RNO p i 440 nm je p ímo úm rný celkovému množství generovaného.

Je nutná p ítomnost imidazolu nebo histitidinu, jejichž p echodný endoperoxid zp sobuje m ené odbarvení. Cholesterol reaguje s ¹O2 za tvorby specifických produkt . Tato specifita iní cholesterol efektivním indikátorem ¹O2 in situ v biologickém prost edí, kde m že být použití jiných technik problematické. Cholesterol reaguje s kyslíkem za vzniku nap . 5-hydroperoxy-5 -cholest-6-n-3 -olu, zatímco reakcí s kyslíkem vznikají jiné hydroperoxidové produkty. Bonnett a kol. (34) stanovili ¹O2 z excitovaného fotosensibilizátoru 5,10,15,20-tetrakis (m-hydroxyfenyl)chlorinu (m-THPC) práv pomocí produkt reakce ¹O2 s cholesterolem. P íkladem vhodných fluorescen ních

inidel jsou slou eniny odvozené od fluoresceinu nap . 6-hydroxy-9-(3-karboxy-9,10- dimethyl-2-anthryl)-3H-xanthen-3-on (DMAX). DMAX reaguje s ¹O2 na odpovídající endoperoxid. Zatímco výchozí DMAX je slab fluoreskující látkou, jeho endoperoxid vykazuje intenzívní fluorescenci (27).

Vhodným komer ním inidlem je 1-((E)-2-methoxyvinyl)pyren, který reakcí se

1O2 tvo í dioxetanový meziprodukt rozkládající se na pyren-1-karbaldehyd spolu s chemiluminiscencí p i 465 nm, která se deteguje. Málo je známo o reakcích ¹O2

s anorganickými látkami. Reakce ¹O2 s I^- vede ke složitým mechanismem ke vzniku I3-

v p ítomnosti katalyzátoru (NH4)2MoO4.Koncentraci vznikajícího I3- lze sledovat v jeho absorp ním pásu p i 365 nm. Nevýhodou této metody je její nízká specifita, výhodou je její jednoduchost a vysoká citlivost (27).

20

Pro ú ely stanovení lze použít i instrumentáln náro nou metodu elektronové paramagnetické rezonance (EPR). Metoda se nazývá spinový záchyt a je založena na reakci ¹O2 s neradikálovou slou eninou za vzniku pom rn stabilního radikálového produktu. Na stanovení ¹O2 se používá 2,2,6,6-tetramethylpiperidin a jeho deriváty, nap . 2,2,6,6–tetramethylpiperidin-4-ol, 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidon. Vznikající nitroxidový radikál dává EPR spektrum se t emi liniemi, jejichž intenzita je úm rná koncentraci ¹O2 v roztoku. Mohanty a kol. (35) pomocí metody EPR poukázali na ochranný efekt aminokyseliny prolinu p ed singletním kyslíkem produkovaným ozá eným fotosensibilizátorem toluidinivé mod i.

2.3.1 Fotofyzikální vlastnosti fotosensibilizátor

Fyzikálními metodami rozumíme p ímou detekci luminiscence ¹O2 ve studovaném prost edí ( asov rozlišená nebo za stacionárních podmínek), fototermální techniky (fotoakustická kalorimetrie nazývaná také „laser induced optoacoustic spectroscopy“ – LIOAS, asov rozlišený „thermal lensing“ –TRTL) a asov rozlišenou absorpci ¹O2

v I oblasti. Výhodou spektroskopických metod je, že vznik a reakce ¹O2 jsou detegovány p ímo, a tím odpadá vliv vedlejších reakcí s chemickými inidly. Na druhé stran spektrální metody jsou náro n jší na vybavení a vyžadují použití laserových zdroj a speciáln konstruovaných detektor . Excitovaná molekula uvol uje absorbovanou energii radia ními nebo neradia ními procesy. Pr b h neradia ních proces je spojen se vznikem ástic s vysokým obsahem energie nebo s disipací tepla do okolí. Teplo uvoln né b hem neradia ních proces excitované molekuly do okolního rozpoušt dla zp sobuje zm ny indexu lomu (metoda TRTL) a vznik tlakového rázu (metoda LIOAS).

21

Protože jsou tyto techniky kalorimetrické, je d ležité vzít v úvahu energetickou bilanci fotosensibiliza ního procesu, uvážit asové intervaly, ve kterých probíhají konkrétní procesy disipace absorbované energie, a dát je do souvislostí s asovým rozlišením m ení. Deaktivace F do základního, resp. do tripletového stavu probíhá v asech kratších než 10^-8 s. Rychlost deaktivace T stav závisí na viskozit rozpoušt dla, koncentraci kyslíku a je obvykle v rozmezí 10^-7 až 10^-6 s. Deaktivace ¹O2 probíhá v asech delších než 10^-6 s. Tepelnou disipaci m žeme tedy rozd lit na rychlou probíhající v asech kratších než je integra ní doba m ení uvoln ného tepla a které z stanou nedetekovány.

Z toho pak plyne energetická bilance (27):

Ea = Ea + f Ef + E

kde Ea p edstavuje celkovou absorbovanou energii a je frakce absorbované energie uvoln né jako rychlé teplo. Druhý len rovnice pak p edstavuje energii ve form fluorescence, která je vyjád ena jako sou in kvantového výt žku fluorescence f a energie fluorescen ního stavu Ef. Jde o zjednodušenou bilanci fotosensibiliza ního procesu. Pokud vznikají další produkty i probíhají další procesy (nap . fosforescence), musí být v rovnici také zahrnuty.

P i použití metody LIOAS jsou tlakové vlny p evedeny na elektrický signál piezoelektrickým idlem, které je umíst no na vn jší st n kyvety nej ast ji na ve sm ru kolmém dopadající laserový puls. asové rozlišení je limitováno efektivním akustickým tranzitním asem, které se vypo te z a = 2R / a , kde R je polom r excitujícího pulsu a a

je rychlost zvuku v rozpoušt dle. P i polom ru št rbiny 0,25 mm je asové rozlišení v acetonitrilu ( a = 1300 m/s) tém 400 ns. Amplituda akustického signálu H je úm rná energii uvoln né b hem („rychlé teplo“) podle následujícího vztahu (27):

H = K E0 (1-10^-4)

22

kde E0 je energie dopadajícího pulsu, A absorbance p i excita ní vlnové délce a K je konstanta, která závisí na geometrii experimentu a termoelastickách vlastnostech rozpoušt dla. Konstanta se ur uje pomocí kalorimetrického standardu. Metoda Lioas se používá ke stanovení . Dekonvoluce fotoakustických vln umož uje detekci zm n objemu molekuly po excitaci v asovém rozmezí 5ns až 10 ns.

P i použití metody TRTL se m í zm na indexu lomu indukovaná lokálním uvoln ním tepla v souvislosti se vznikem a reakcemi ¹O2.Všechny procesy prob hlé v ase kratším než je tranzitní as a = 2R/ a zp sobují zm nu indexu lomu charakterizovanou dobou života a a všechny pomalejší procesy zp sobují zm nu danou jejich dobou života. Metodu TRTL lze využít pro stanovení a b hem jednoduchého experimentu bez pot eby externího standardu (27).

M ení luminiscence ¹O2 : P ímé m ení singletového kyslíku jak v prvním O2(¹ g), tak ve druhém O2(¹ g) excitovaném stavu je založeno na monitorování odpovídajících radia ních p echod . Nejpoužívan jší je asov rozlišená detekce fosforescence O2(¹ g) p i 1270 nm. Vzorek je umíst n v b žné fluorescen ní kyvet a je excitován pulsním laserem, který má vlnovou délku pot ebnou k excitaci fotosensibilizátoru. Fosforescence se nej ast ji m í ve sm ru kolmém k dopadajícímu pulsu fotodiodou, která je chrán na p ed celkovou emisí vzorku interferen ním filtrem propoušt jícím pouze zá ení kolem 1270 nm. Kvantový výt žek fosforescence je velmi malý, pohybuje se v rozmezí 10^-4 až 10^-7 v závislosti na rozpoušt dle, a proto jsou kladeny vysoké nároky na citlivost detek ního systému. Metoda je velmi vhodná pro popis fotosensibilizátor v homogenních systémech a je rozvíjena také pro heterogenní i mikroheterogenní systémy jako nap . pro chování fotosensibilitátor in vivo. S využitím optického mikroskopu lze monitorovat i prostorovou distribuci O2(¹ g) s rozlišením až 2.5 m. Za podmínek, kdy je doba života O2(¹ g) relativn dlouhá nebo když je

23

koncentrace O2(¹ g) vysoká, interagují dv molekuly O2(¹ g) za vzniku emisních pás p i 635 nm a 703 nm. Ty mohou v n kterých rozpoušt dlech také sloužit k detekci O2(¹ g) (27).

Dále lze monitorovat fluorescen ní p echod z O2(¹ g) p i 1925 nm a fosforescen ní p echod p i 725 nm. Pro excitaci fotosensibilizátoru se využívá nanosekundový pulsní laser a pro detekci spektrometr FTIR. Podobn jako fluorescenci p echodu O2(¹ g) O2(¹ g) lze také m it opa ný proces, odpovídající absorp nímu pásu O2(¹ g). Poloha maxima pásu významn závisí na rozpoušt dle. Keating a kol (36) vytvo ili detek ní p ístroj pro sledování koncentrace ¹O2 v reálném ase pomocí optického monitorovacího systému emise ¹O2 p i 1270 nm. Schmidt a kol. (37) nam ili oproti (36) kratší hodnoty životnosti ¹O2 v pokusných roztocích, což Schmidt a kol.

vysv tlují použitím odlišného detek ního systému.

Chi Yu a kol. (38) detekovali ¹O2 pomocí luminiscence p i 1270 nm fotosensibilizátoru hexa(sulfo-n-butyl)fulleren (FC4S), který absorbuje vlnovou délku 500-600 nm. Tento fotokatalytický efekt iní FC4S alternativním k fotosensibilizátoru TiO2. Vzhledem k absorbci v 600 nm signál ¹O2 byl detekován ve stejné molární koncentraci jako u hematoporfyrinových derivát Protofrinu, ale nižší než u Al sulfonovaných ftalocyanin AlS4Pc. Kvantový výt žek pro generaci ¹O2 v H2O byl odhadnut asi na 0.36 použitím relativní korelace s C60I -CD. M ením luminiscence a fototermálními metodami byly ve studii (39) zkoumány p írodní i syntetizované fotosensibilizátory: merocyaniny, bakteriochlorofyl c a bakteriofenofytin c.

24

2.3.2 Vlastnosti fotosensibilizátor pot ebné pro aplikaci v PDT

- Fotostabilita: Fotosenzibilizátor musí být dostate n stabilní v i p ímé fotodegradaci a oxidaci vznikajícím ¹O2, p ípadn oxidací dalšími reaktivními formami kyslíku. Všechny fotosensibilizátory sice podléhají fotodegradaci, ale se zna n rozdílnou rychlostí

- Chemická istota

- Významná sv telná absorbce takové vlnové délky, která proniká do tkán - Nízká toxicita

- Nádorová selektivita

- Rychlá clearance ze zdravé tkán

2.4 Testování toxicity fotosensibilizátor

Jedním z nejd ležit jších kritérií chemických slou enin pro použití v PDT jako fotosensibilizátor je nízká toxicita, lokální i systémová. Testování toxicity potencionálních fotosensibilizátor se uskute uje na t ech úrovních : in vitro, in vivo a nejvyšším stupn m je klinické testování slou enin. Vzhledem k jednomu z našich výzkumných cíl , stanovit cytotoxicitu a fototoxicitu indocyaninové zelen in vitro, jsou v kapitole 2.4.1 uvedeny n které testy toxicity in vitro využívané v sou asnosti.

2.4.1 Testy toxicity in vitro

- MTT test : rozlišení živých a mrtvých bun k je založeno na schopnosti živých bun k redukovat rozpustnou tetrazoliovou s l MTT (3-[4,5-dimethylazol-2-yl]- difenyltetrazolium bromid pomocí mitochondriálních dehydrogenáz (40) na

25

nerozpustný formazan. Formazan je pak rozpušt n DMSO. Absorbance barevného produktu je m ena fotometricky p i 570 nm.

- XTT, WST-1: založeny podobn jako MTT test na inkubaci bun k s tetrazoliovou solí a následném stanovení metabolické aktivity

- „ Neutral Red Assay “: v testu se p idává k bun ným kulturám testovaná látka spole n s neutrální ervení. P i tomto testu toxicity se obarví pouze živé bu ky, takže zdravé bun né kultury zr žoví, ale bu ky usmrcené testovanou látkou z stanou bledé (41).

- Test toxicity s trypanovou mod í: umož uje p ímé po ítání živých bun k, tyto bu ky vykazují integritu nepoškozené cytoplazmatické bun né membrány

- Po ítaní bun k v Bürkerov kom rce: Jednoduchý a levný test cytotoxicity s nevýhodou nižší reliability oproti p edešlým test m, p eživší bu ky se po ítají v tzv. Bürkerov kom rce (42). Vyžaduje ovšem použití n kterého výše uvedeného rozlišení živých a mrtvých bun k.

- Metoda pr tokové cytometrie

2.5 Zdroje sv tla v PDT

PDT m že být aplikována na nádory, které mohou být osvíceny sv tlem p ímo nebo pomocí optického vlákna. Jako sv telné zdroje jsou pro PDT používány lasery i lampy.

Volba zdroje závisí na konkrétní aplikaci. Speciáln laser m v nuji v úvodu v tší pozornost, nebo jako zdroj excita ního zá ení byl pro náš výzkum fotosensibilizátoru indocyaninové zelen použit terapeutický laser Beautyline BTL –10.

26

2.5.1 Laserové zdroje

Fyzikální základy laseru

Princip funkce laseru vyplývá z plného zn ní zkratky LASER: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation: Mnoho atom má elektrony v excitovaném stavu. Do excitovaného stavu se dostávají p ívodem energie zven í. Pokud se objeví foton, jehož energie odpovídá energií mezi základními a excitovanými stavy elektron , vyvolá tento foton p eskok elektron z vyššího energetického stavu na nižší a p itom vyzá í další foton. Tento sekundární foton má stejnou energii jako p vodní foton a oba jsou dokonale synchronizovány. Nový foton tak m že vyvolat emisi dalšího fotonu a tvorba foton pokra uje. Jeden foton tak vytvo í záplavu foton v základní látce. Foton o stejné energii slouží jako základní mechanismus.

Materiál, ve kterém dochází ke stimulované emisi, je umíst n mezi dv ma rovnob žnými zrcadly, od kterých se fotony mohou odrazit zp t do materiálu. Pouze fotony pohybující se v kolmo k zrcadl m se v laseru udrží. Každý foton pohybující se pod nekolmým úhlem se odrazí n kolikrát, než se rozptýlí do stran. Výsledkem stimulované emise foton je množství p esn sm rovaných koherentních foton , které se pohybují v laserovém zdroji sem a tam. P i každém odrazu ást foton uniká ven polopropustným zrcadlem a vytvá í laserový paprsek (43).

Laser se skládá ze t í aktivních ástí:

1. Aktivní prost edí m že být:

- pevná látka s p ím semi - kapalina

- plyn nebo sm s plyn

27

2. Optický rezonátor jsou:

- Zrcadla

- M ížky a sv tlovody

3. Zdroj budící energie bývá:

- nej ast ji optický - kapalina

- chemická reakce nebo i potencionáln jaderný vojenský výbuch

Laserové sv tlo m že být:

- spojité, nep etržité - emitované v impulsech

- modulované aplitudov (ve smyslu kolísání spojitého signálu), nebo frekven n , jako emise skupin impulz

Laserové sv tlo charakterizuje:

- vlnová délka (nm) - energie E (eV) - frekvence f (hertz) - vlno et (cm ^–1)

V laseroterapii (oblast využití nízkovýkonných laser v léka ství) se navíc používají následující pojmy a veli iny:

- hustota energie (J/cm²)

je definována : st ední výkon (W) . doba aplikace(s) / oza ovaná plocha (cm²) - modula ní frekvence (po et impulz za s)

28

Lasery požívané v PDT

- Argonové a barvivové lasery : argonové lasery se používají nap . pro lé bu karcinomu Barretova esofagu (44), YAG lasery nap . pro destrukci mozkových tumor (45).

- Barvivové lasery erpané laserem využívajícím páry kovu: nap .CO2 laser používaný pro laryngeální aplikace v PDT (46).

- Diodové lasery : používané nap . pro lé bu bazálního bun ného karcinomu (47).

- Pevnolátkové lasery

- Femtosekundové pevnolátkové lasery

2.5.2 Lampy používané v PDT

- Wolframové lampy

- Xenonové lampy : studie (48) dokumentuje srovnatelnou ú innost lamp a laser jako excita ních zdroj pro PDT.

- Fluorescen ní lampy : Juzeniene a kol.(49) srovnává efektivitu halogenové a LED lampy v PDT.

- Sodíkové a rtu ové výbojky

29

3. Materiál a metody

3.1 Použité bun né kultury

HeLa bu ky jsou lidské epiteliální bu ky karcinomu d ložního ípku 31 leté Heleny Laneové. Jedná se o první aneuploidní linii derivovanou z lidské tkán v roce 1951. Tato stabilizovaná bun ná linie roste v kultu e v jedné vrstv . Tyto monolayerové kultury rostoucí na mikroskopickém sklí ku jsou výhodné pro pr b žné mikroskopické pozorování zm n bun né morfologie a postižení bun ných struktur. Bu ky mají dlaždicový tvar (50, 51). Bun ný cyklus HeLa bun k trvá pr m rn 22 hodin, z toho G1-fáze 8 hodin, M-fáze 1 hodinu, G2-fáze 4 hodiny a S-fáze 9 hodin (52).

V79 fibroblasty ínského k e ka jsou vazivové bu ky plicní tkán (93-CCL). Oba použité modely linií nádorových bun k byly b hem experiment ošet eny stejným zp sobem: bun né nádorové linie bun k byly udržovány v Dulbeccov modifikovaném Eaglov médiu (Sigma Aldrich) obohaceném 5 % fetálním sérem (Sigma Aldrich) a 1%

L -glutaminem (Sigma Aldrich) ve zvlh ované atmosfé e obsahující 8% oxidu uhli itého ve 37 ⁰C. Pro uvoln ní od sklí ka bu ky byly promyty fosfátovým roztokem PBS a narušeny po 10 min. 0,1% trypsinem - 0,04 % EDTA v PBS.

30

3.2 Fotochemické vlastnosti indocyaninové zelen

3.2.1 M ení absorp ních spekter

Pro vysv tlení mechanismu ú inku potenciálního fotosensibilizátoru ICG byly rovn ž studovány n které fotochemické vlastnosti této slou eniny.

Prom ovali jsme a srovnávali absorp ní spektrum ICG (M = 775 g/l, Sigma Aldrich) v isté vod a v médiu DMEM (Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium, Sigma Aldrich) ihned po p ipravení roztok , p i emž pom r množství vody a DMEM byl v pom ru 1:1. M ení jsme provedli pomocí absorp ního spektrofotometru Unicam Helios Lambda. Vzhledem k tomu, že ICG samotná je prakticky nerozpustná ve fosfátovém pufru PBS i v médiu DMEM, rozpustili jsme barvivo nejd íve ve vod a poté p idali p ipravený roztok ICG do DMEM. Roztoky ICG nejsou stabilní (53,54). Po n kolika dnech se objeví nový peak s maximem blízko 900 nm, pravd podobn z d vodu degradace a další polymerace. Tento proces je spojený s tvorbou tzv. J-agregátu (55).

Degradace závisí na mnoha faktorech, jako je stupe agregace, osv tlení, typ rozpoušt dla a koncentrace kyslíku (56).

3.3 Akumulace ICG v bu kách odvozených z nádoru

D ležitým parametrem fotosensibilizátoru je jeho schopnost akumulovat se v nádorové tkáni. V experimentu jsme testovali schopnost ICG navázat se na bun né struktury HeLa bun k. Prom ovali jsme absorp ní spektra samotné ICG a samotných HeLa bun k pomocí absorp ního spektrofotometru Unicam Helios Lambda. Poté jsme prom ili absorp ní spektrum HeLa bun k s navázanou ICG do bun ných struktur podle metodiky uvedené ve studii Fickweiler a kol. (57): bu ky byly inkubovány s 50 µM ICG po dobu

31

24 hodin, dvakrát promyty r stovým médiem, trypsinizovány a resuspendovány v 1 ml média DMEM. Suspenze bun k bez ICG byla použita jako kontrola.

3.4 Testy toxicity ICG na bun ných kulturách in vitro

3.4.1 Testy cytotoxicity ICG

Pro pokusy cytotoxicity byly HeLa bu ky nasazeny v koncentraci 10⁴ bun k/ml ve 200 µl kultiva ního média DMEM na jamku do 96 jamkových mikrotitra ních desti ek.

Roztok ICG v objemu 20 l byl p idán ze série p ipravených zásobních roztok tak, aby kone ná koncentrace ICG v jamce zahrnovala žádaný koncentra ní rozsah 2 - 300 M.

ICG byla do bun k p idána jednak ihned po nasazení bun k, jednak 24 hodin od nasazení bun k. Pro testy cytotoxicity in vitro byly rovn ž nasazeny a ošet eny ICG stejným zp sobem i fibroblasty ínského k e ka.

Cytotoxicita byla pak vyhodnocena po 1, 24 a 48 hodinách pomocí metody MTT assay. Tato metoda využívá schopnosti živých bun k redukovat tetrazoliovou s l – MTT (3,4,5–dimethyltiazol–2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid (Sigma) pomocí mitochondriálních degydrogenáz. Množství vznikajícího modrého formazánu je úm rné po tu živých bun k v kultu e. Analýze bylo podrobeno 10 jamek, do kterých bylo p idáno 20 l MTT ze zásobního roztoku o koncentraci 5 g/ml v PBS a bu ky byly inkubovány 4 hodiny p i 37 ⁰C. Po odsátí supernatantu byl formazan rozpušt n v DMSO (Sigma) a absorbance m ena na microplate readeru (Spectra Shell) p i 570 nm.

Absorbance z jednotlivých pokus byly podrobeny statistické analýze.

32

3.4.2 Testy fototoxicity ICG

Pro testy fototoxicity byly HeLa bu ky nasazeny v koncentracích 10⁴ bun k/ml ve 200 l kultiva ního média DMEM na jamku do 96-jamkových mikrotitra ních desti ek.

Roztok ICG v objemu 20 l byl p idán ze série p ipravených zásobních roztok po 24 hodinách od nasazení bun k tak, aby kone ná koncentrace ICG v jamce zahrnovala žádaný koncentra ní rozsah 2 - 200 M. Následovala inkubace 24 hodin za standardních podmínek (37 ⁰C, 8% CO2, 95 % vlhkost vzduchu) a vým na média DMEM.

Následovalo ozá ení HeLa bun k laserem Beautyline BTL-10 (Beutyline, s.r.o, Praha) o vlnové délce 830 nm, hustotou energie 0, 24, 60 a 99 J/cm² p i maximálním výkonu laseru 360 mW. Zp sob a režim oza ování byl následující: Oza ování bylo dosaženo použitím laserové sondy upevn né do mobilného držáku. Každá jamka byla ozá ena individuáln podle asového schematu odpovídajícímu požadované hustot ozá ení. Sonda byla umíst na pod mikrotitra ní desti kou a bu ky byly ozá eny skrz materiál plastu. Bu ky byly po ozá ení op tovn vystaveny standardním podmínkám a byla stanovena viabilita bun k (MTT-assay) po 1, 24, 48 a 72 hodinách od ozá ení laserem.

33

Obr. .3: Oza ovací za ízení: Polovodi ový laser Beautyline BTL –10 a mobilní posuvný držák s upevn nou laserovou sondou a 96-jamkovou mikrotitra ní desti kou

3.4.3 Testy fototoxicity ICG s p ídavkem oxida ního inidla

Pro zesílení fototoxického efektu jsme provedli experimenty s peroxidem vodíku H2O2

(Sigma Aldrich), který je silným oxida ním inidlem. Domníváme se totiž, že mechanismus fototoxicity lze zesílit p ídavkem silného oxida ního inidla do nádorových bun k prost ednictvím roztoku s oxida ním inidlem a fotosensibilizátorem.

Pro zesílení fototoxického efektu ICG bylo p idáno 12.5 µl 0.3 % H2O2 do celkového objemu 5 ml 49 µM ICG roztoku pro dosažení ú inné koncentrace 20 µM H2O2 na jamku. Takto ošet ená ICG byla do jamek p idána 24 hodin od nasazení bun k.

34

Po následné 24 hodinové inkubaci byly HeLa bu ky ozá eny laserem Beautyline BTL- 10 (830 nm, 99 J/cm², 360 mW) popsaným oza ovacím mechanismem a byla stanovena viabilita bun k (MTT-assay) po 1, 24 a 48 hodinách od ozá ení laserem.

3.4.4 Analýza dat a statistika

Každý experiment testování cytotoxicity a fototoxicity (v etn potenciované fototoxicity oxida ním inidlem) byl proveden alespo t ikrát. Hodnocení viability bun k po expozici každé varianty experimentálním podmínkám bylo založeno na tení absorbace z 10 jamek. Data byla statisticky vyhodnocena použitím neparametrického Man-Whitney t- testu a prezentována ve form Box a Whiskers plot s 25 % a 75% kvantily.

35

4. Výsledky

4.1 Fotochemické vlastnosti indocyaninové zelen

Prom ovali jsme a srovnávali absorp ní spektrum ICG ve vod a médiu DMEM (Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium). Zaznamenali jsme posun absorp ního maxima ICG na 792 nm, který vysv tlujeme navázáním ICG na proteinové struktury p ítomné v médiu.

Obr. .4: Absorp ní spektrum ICG rozpušt né ve vod

Absorp ní spektrum

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

550 566 582 598 614 630 646 662 678 694 710 726 742 758 774 790 806 822 838 854

vlnová délka (nm)

absorbance

hodnota

36

Absorp ní spektrum

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

550 600 650 700 750 800 850 900

vlnová délka (nm)

absorbance

hodnota

Obr. .5: Absorp ní spektrum ICG rozpušt né ve sm si: voda a DMEM

37

4.2 Akumulace ICG v bu kách odvozených z nádoru

Prom ovali jsme absorp ní spektra samotné ICG a samotných HeLa bun k pomocí absorp ního spektrofotometru Unicam Helios Lambda. Poté jsme prom ili absorp ní spektrum HeLa bun k s navázanou ICG do bun ných struktur. Výsledkem experimentu je detekce absorp ního maxima suspenze HeLa bun k inkubovaných s ICG na 790 nm, což dokazuje navázání ICG na bun né struktury.

-0,020 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 0,160

650 670 690 710 730 750 770 790 810 830 850 870 890 vlnová délka

absorbance

vzorek referen ní

Obr. .6. Akumulace ICG v HeLa bu kách

38

4.3 Testy toxicity ICG na bun ných kulturách in vitro

4.3.1 Testy cytotoxicity ICG na HeLa bu ky in vitro

V p ípad , že byla ICG k HeLa bu kám p idána až 24 hodin po nasazení bun k, byl pozorován stimula ní efekt ICG na bun ný r st. Všechny rozdíly mezi kontrolou (0 µM ICG) a testovanými koncentracemi ICG byly významné na hladin (P<0.001).

0 206 212 218 224 230 236 242

Cytotoxicita ICG

0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6

A b so rb an ce

Median 25%-75% Min-Max

µM ICG

Obr. .7: Cytotoxicita ICG (µM) na HeLa bu ky (ICG p idána do bun k 24 hodin po nasazení bun k)

39

V p ípad , že ICG byla p idána k HeLa bu kám ihned po nasazení, cytotoxicita byla detekována již u nižších koncentrací ICG, viz Obr. .8. Všechny rozdíly mezi kontrolou (0 µM ICG) a testovanými koncentracemi ICG byly významné na hladin (P<0.001).

Z uvedených experiment jasn vyplývá vliv doby p idání ICG jako experimentální prom nné k bun né linii HeLa bun k na jejich životnost.

Cytotoxicita icg u HeLa bun k

Kontrola

206 218

230 242

255 267

279 Mikromolární koncentrace icg

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3

A bs or ba nc e

Medián 25%-75%

5%-95%

N=80; P<0,001

P<0,001P<0,001

P<0,001P<0,001

P<0,001P<0,001

P<0,001

Obr. . 8 : Cytotoxicita ICG na HeLa bu ky (ICG p idána ihned po nasazení)

40

4.3.2 Testy cytotoxicity ICG na V79 k e í fibroblasty in vitro

Srovnání individuálních variant (absorbance m ené v MTT testu ve vztahu k testovaným koncentracím 24 – 194µM ) s kontrolou (0 µM ICG) poskytuje Obr. . 9. Všechny rozdíly byly významné se stejnou pravd podobností P< 0.001.

Cytotoxický efekt ICG na V79 fibroblasty in vitro pozorujeme už od koncentrace ICG 49 µM, což je mnohem nižší ú inná koncentrace než v p ípad HeLa bun k (206 µM).

Zdá se tedy, že normální V79 k e í fibroblasty reagují na p sobení ICG mnohem citliv ji než HeLa bu ky.

0 24 49 73 94 121 145 194

Varianty

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6

A b so rb ac e

Median 25%-75% Min-Max µM ICG

Obr. .9 Cytotoxicita ICG (µM) na V79 k e í fibroblasty

41

4.3.3 Testy fototoxicity ICG na HeLa bu ky

Pilotní testy fototoxicity ICG na HeLa bu ky

Experimentáln jsme zkoumali prolifera ní k ivky HeLa bun k pod kombinovaným vlivem ozá ení laserem a ICG.

Neozá ené bu ky

Median; Whisker: 5%, 95%

1 24 48

as (hod) 0,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

A bs or ba nc e

Kontrola 49 µΜ icg 94 µΜ icg 194µΜ icg

Obr. . 10 : Prolifera ní k ivky HeLa bun k : Neozá ené bu ky

42

Ozá ené bu ky

Median; Whisker: 5%, 95%

1 24 48

as (hod) 0,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Absorbance

Kontrola

49 µM icg 94 µM icg

194 µM icg

Obr. . 11: Prolifera ní k ivky HeLa bun k : Ozá ené bu ky

Srovnání ozá ených a neozá ených bun k

Median; Whisker: 5%, 95%

Kontrola 400 800 1600

Koncentrace icg ( µµµµg/ml) 0,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Absorbance

Ne 1 hod O 1 hod Ne 24 hod O 24 hod Ne 48 hod O 48 hod

Obr. . 12 : Prolifera ní k ivky HeLa bun k : Srovnání ozá ených a neozá ených bun k

43

Testy fototoxicity: Optimalizace koncentrace a ozá ení

P i následujících experimentech test fototoxicity ICG na HeLa bu kách byly použity následující koncentrace ICG: 24, 49, 94 a 194 µM ICG a následující dávky ozá ení: 24, 60 a 99 J/cm². Jako kontrola ve statistických testech byla v jednotlivých experimentech použita vždy tato varianta: experimentáln testovaná neozá ená ICG aplikovaná na HeLa bu ky.

Životnost bun k se hodnotila pomocí MTT testu 1, 24, 48 a v jednom p ípad i 72 hodin po ozá ení laserem. Za p íslušnými grafy jsou uvedeny tabulky pravd podobností a stru ný komentá ke každému experimentu.

Koncentrace 24 µµµµM ICG

Srovnání individuálních variant (absorbance m ené v MTT testu ve vztahu k testovaným koncentracím ICG) s kontrolou (24 µM neozá ená ICG) poskytuje Obr. . 13. První symbol zna í hustotu ozá ení laserem, druhý koncentraci ICG (tedy nap . varianta 60-24 ozna uje bu ky s aplikovanou 24 µM ICG ozá ené hustotou ozá ení 60 J/cm². Rozdíly mezi variantami nejsou statisticky významné. Ani po 24 hodinách nebyl v tomto experimentu detekován statisticky významný rozdíl mezi experimentálními variantami (Obr. .14). Avšak 48 hodin po ozá ení laserem o hustot 99 J/cm² byl detekován statisticky významný fototoxický efekt s pravd podobností P=0.013 (Obr. .15).

44

K-0 24-0 60-0 99-0

Varianty 0.3

0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Obr. . 13 : Fototoxixita ICG na HeLa bu ky detekovaná 1hodinu po ozá ení laserem

K 24-24 60-24 99-24

Varianty 0.3

0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Absorbance

45

K 24-24 60-24 99-24 Varianty 0.6

0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

Absorbance

K-0 24-0 60-0 99-0

Varianty 0.6

0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

Obr. .14: Fototoxixita 24 µM ICG na HeLa bu ky detekovaná 24hodin po ozá ení

K 24-24 60-24 99-24

Varianty 1,0

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

Absorbance

K-0 24-0 60-0 99-0

Varianty 1,0

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

Obr. .15: Fototoxixita 24 µM ICG na HeLa bu ky detekovaná 48hodin po ozá ení

Koncentrace 94 µµµµM ICG

Srovnání individuálních variant (absorbance m ené v MTT testu) s kontrolou K (absorbance ve vztahu k variant 94 µM neozá ená ICG) poskytuje Obr. . 16. První symbol zna í hustotu ozá ení laserem, druhý koncentraci ICG (tedy nap . varianta 60-94 ozna uje bu ky s aplikovanou 94 µM ICG ozá ené hustotou ozá ení 60 J/cm²). Rozdíly mezi variantami nejsou statisticky významné. Po 24 hodinách byl detekován statisticky