UNIVERZITA KARLOVA
FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOLOGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD
B A K A L Á Ř S K Á P R Á C E
PATOGENNÍ ESCHERICHIA COLI
DOMINIKA BÍLKOVÁ
Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D.
HRADEC KRÁLOVÉ, 2022
2
Poděkování
Ráda bych poděkovala paní Mgr. Marcele Vejsové, Ph.D. za odborné vedení mé bakalářské práce, cenné rady a připomínky.
3
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorských dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu.“
V Hradci Králové, 2022 Dominika Bílková
4
ABSTRAKT
Univerzita Karlova v Praze
Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Studijní obor: Zdravotnická bioanalytika Autor: Dominika Bílková
Školitel: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D.
Název bakalářské práce: Patogenní Escherichia coli
Cíl práce: Cílem této práce je shromáždit základní poznatky týkající se bakterie Escherichia coli. Práce se zaměřuje především na patogenní sérotypy E. coli, jejich faktory virulence a projevy onemocnění. Dále se práce zabývá možnostmi laboratorní diagnostiky E. coli a možnostmi terapie a prevence onemocnění způsobených E. coli.
Hlavní poznatky: Escherichia coli je gramnegativní, fakultativně anaerobní bakterie, která náleží do čeledi Enterobacterales. Je běžnou součástí střevní mikroflóry člověka, kde se podílí na tvorbě vitamínu K a zabraňuje růstu a množení patogenních bakterií.
Některé kmeny E. coli jsou však patogenní a podle onemocnění, která způsobují, se dělí na intestinální a extraintestinální patogeny. Intestinální patogenní kmeny způsobují střevní infekce projevující se průjmy a patří k nim E. coli enteropatogenní (EPEC), enterotoxigenní (ETEC), enterohemoragická (EHEC), enteroinvazivní (EIEC), enteroagregativní (EAEC) a difúzně adherentní (DAEC). Extraintestinální patogenní kmeny způsobují onemocnění mimo trávicí trakt, zejména infekce močových cest, novorozenecké meningitidy a sepse.
Závěry: Escherichia coli je důležitou součástí střevní mikroflóry člověka. Některé její kmeny jsou však patogenní a jsou původci různých onemocnění. Tyto kmeny mohou být pro člověka velmi nebezpečné.
Klíčová slova: Escherichia coli, patogenní sérotypy, toxiny, laboratorní diagnostika
5
ABSTRACT
Charles University in Prague
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové
Department of Biological and Medical Sciences Subject of study: Healthcare bioanalytics Author: Dominika Bílková
Supervisor: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D.
Title: Pathogenic Escherichia coli
Background: The aim of this work is to gather basic knowledge about bacteria Escherichia coli. The work is mainly focused on pathogenic serotypes of E. coli, their virulence factors and symptoms of diseases. The work also deals with laboratory diagnosis options for E. coli and treatment and prevention options.
Main findings: Escherichia coli is a Gram-negative, facultative anaerobic bacterium and a member of the family Enterobacterales. It is common part of the human intestinal microflora, where it produces vitamin K and inhibits the growth of pathogenic bacteria. Some serotypes of E. coli are pathogenic and they have the ability to cause intestinal or extraintestinal diseases. Intestinal pathogens cause intestinal infections with diarrhea and they are divided into enteropathogenic (EPEC), enterotoxigenic (ETEC), enterohemorrhagic (EHEC), enteroaggregative (EAEC) and diffusely adherent (DAEC) E. coli. Extraintestinal pathogens cause mainly urinary tract infections, neonatal meningitis and sepsis.
Conclusions: Escherichia coli is important part of the human intestinal microflora.
However, some serotypes of E. coli are pathogenic and have the ability to cause various disease. These pathogens can be for humans very dangerous.
Key words: Escherichia coli, pathogenic serotypes, toxins, laboratory diagnostics
6
OBSAH
1. ÚVOD ... 8
2. ZADÁNÍ – CÍL PRÁCE ... 9
3. OBECNÁ CHARAKTERISTIKA E. COLI ... 10
3.1 Využití E. coli ... 10
3.2 Antigenní struktura E. coli ... 11
3.2.1 O-antigeny ... 11
3.2.2 H-antigeny ... 11
3.2.3 K-antigeny ... 11
4. INTESTINÁLNÍ PATOGENNÍ E. COLI ... 12
4.1 Enteropatogenní E. coli (EPEC) ... 12
4.2 Enterotoxigenní E. coli (ETEC) ... 14
4.2.1 Tepelně stabilní enterotoxin (ST) ... 14
4.2.2 Tepelně labilní enterotoxin (LT) ... 15
4.3 Enterohemoragická E. coli (EHEC) ... 16
4.3.1 Shiga toxin ... 17
4.3.2 Další faktory virulence ... 18
4.4 Enteroinvazivní E. coli (EIEC) ... 19
4.5 Enteroagregativní E. coli (EAEC, EAggEC) ... 21
4.6 Difúzně adherentní E. coli (DAEC) ... 22
5. EXTRAINTESTINÁLNÍ PATOGENNÍ E. COLI ... 23
5.1 Uropatogenní E. coli (UPEC) ... 23
5.1.1 Faktory virulence ... 23
5.2 E. coli způsobující novorozeneckou meningitidu (NMEC) ... 25
5.3 E. coli způsobující sepse (SEPEC) ... 26
6. MOŽNOSTI LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY ... 27
6.1 Mikroskopický průkaz ... 27
6.2 Kultivace ... 27
6.3 Biochemický průkaz ... 29
6.4 Sérotypizace ... 30
6.5 Metody molekulární biologie ... 30
6.5.1 DNA-sondy ... 30
7
6.5.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) ... 31
6.6 MALDI-TOF ... 31
7. TERAPIE A PREVENCE ... 34
7.1 Intestinální infekce ... 34
7.2 Extraintestinální infekce ... 35
7.2.1 Infekce močových cest ... 35
7.2.2 Novorozenecké meningitidy ... 36
7.2.3 Sepse ... 36
8. KAZUISTIKA ... 37
9. DISKUSE A ZÁVĚR ... 38
10. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ... 40
11. SEZNAM TABULEK ... 42
12. SEZNAM OBRÁZKŮ ... 43
13. POUŽITÁ LITERATURA... 44
8
1. ÚVOD
Escherichia coli je gramnegativní, fakultativně anaerobní bakterie ve tvaru tyčinky, která náleží do čeledi Enterobacterales. Je důležitou součástí střevní mikroflóry, kde se podílí na tvorbě vitamínu K a zabraňuje růstu a množení patogenních bakterií. Více k obecné charakteristice této bakterie a jejímu významu je uvedeno v první kapitole.
V další části práce jsou popsány patogenní kmeny E. coli. Tyto kmeny jsou vybaveny specifickými faktory virulence a podle onemocnění, která způsobují, se dělí na intestinální a extraintestinální patogeny. Intestinální patogenní kmeny způsobují střevní infekce a průjmy a patří k nim enteropatogenní (EPEC), enterotoxigenní (ETEC), enterohemoragická (EHEC), enteroinvazivní (EIEC), enteroagregativní (EAEC) a difúzně adherentní (DAEC) E. coli. K extraintestinálním patogenním kmenům, které způsobují onemocnění mimo trávicí trakt, patří uropatogenní E. coli (UPEC) způsobující infekce močových cest, dále E. coli způsobující novorozenecké meningitidy (NMEC) a E. coli způsobující sepse (SEPEC).
Další část práce se zabývá možnostmi laboratorní diagnostiky E. coli a možnostmi terapie a prevence onemocnění způsobených intestinálními nebo extraintestinálními kmeny E. coli. Pro účel laboratorní diagnostiky E. coli se využívá mikroskopický průkaz, kultivace na selektivně-diagnostických půdách, biochemický průkaz, sérotypizace, metody molekulární biologie (DNA-sondy a PCR) a hmotnostní spektrometrie MALDI- TOF.
9
2. ZADÁNÍ – CÍL PRÁCE
Cílem této práce je shrnutí základních poznatků týkajících se patogenních sérotypů Escherichia coli, a to zejména jejich faktorů virulence, onemocnění, která způsobují, a možností laboratorní diagnostiky.
10
3. OBECNÁ CHARAKTERISTIKA E. COLI
Escherichia coli (E. coli), původním názvem Bacterium coli, náleží do čeledi Enterobacterales a rodu Escherichia. Je pojmenována podle rakouského lékaře a bakteriologa Theodora von Eschericha, který ji v roce 1885 izoloval (Votava, 2003).
Jedná se o gramnegativní, fakultativně anaerobní, pohyblivou tyčinku dlouhou 2 až 3 μm a tlustou 0,5 až 0,8 μm (Votava, 2003). Některé kmeny, především ty, které způsobují infekce močového ústrojí, mají polysacharidové pouzdro (Greenwood a kol., 1999).
E. coli je běžnou součástí střevní mikroflóry člověka. Je komenzálem a symbiontem.
Podílí se na tvorbě vitamínu K a tvorbou kolicinů (bílkovin ze skupiny bakteriocinů schopných ničit bakterie jiných druhů) zabraňuje růstu a přemnožení patogenních bakterií ve střevě (Julák, 2006; Votava, 2003). Se stolicí se dostává do vody, kde může přežít ještě několik týdnů. Je využívána jako nejběžnější indikátor fekálního znečištění pitné vody (Bednář, 1996).
3.1 Využití E. coli
Escherichia coli je jednou z nejlépe prostudovaných bakterií a je využívána jako důležitý modelový organismus (Julák, 2006). Byl na ní studován mechanismus bakteriální konjugace a replikace DNA. Je využívána v genovém inženýrství, například k tvorbě lidského inzulinu nebo interferonu, kdy je do buňky bakterie přenesen gen pro danou látku a takto geneticky modifikovaná bakterie následně tuto látku produkuje (Votava, 2003).
E. coli je využívána také jako probiotikum. Probiotika jsou živé mikroorganismy, které příznivě ovlivňují zdraví člověka. K tomuto účelu se pod obchodním názvem Mutaflor využívá lyofilizovaná biomasa kmene E. coli Nissle 1917. Tento kmen, který v roce 1917 objevil profesor Alfred Nissle, nevykazuje patogenní vlastnosti a má inhibiční vliv na růst jiných bakterií (Lukáš, 2015).
11
3.2 Antigenní struktura E. coli
Na povrchu bakterií E. coli se nachází řada antigenů. Jedná se o somatické O-antigeny, bičíkové H-antigeny a kapsulární K-antigeny (Julák, 2006). Na základě kombinace těchto antigenů se E. coli dělí na sérotypy (Bednář, 1996). O-antigen určuje séroskupinu a kombinace O-antigenu s H-antigenem konkrétní sérotyp (Kaper a kol., 2004).
3.2.1 O-antigeny
O-antigen neboli tělový (somatický) antigen je lipopolysacharid nacházející se na povrchu plazmatické membrány bakterií. Je složen z lipidu A, vnitřního polysacharidu a koncového polysacharidu (vlastního O-antigenu). Lipid A upevňuje antigen v membráně bakterie a vlastní O-antigen, který je tvořen oligosacharidovými jednotkami a jeho složení určuje antigenní strukturu antigenu, směřuje ven z buňky. Je termostabilní – antigenní vlastnosti si zachovává i při vysokých teplotách (Julák, 2006;
Votava, 2005). V současné době je popsáno více než 180 typů O-antigenů (Robins- Browne a Hartland, 2002).
3.2.2 H-antigeny
H-antigeny neboli bičíkové antigeny jsou tvořeny polymerizovanou bílkovinou flagelinem a jsou termolabilní (Julák, 2006). Je popsáno více než 60 H-antigenů (Robins-Browne a Hartland, 2002).
3.2.3 K-antigeny
K-antigeny neboli kapsulární (pouzderné) antigeny jsou většinou tvořeny polysacharidy bakteriálního pouzdra a jsou termostabilní. Jsou významnými virulenčními faktory - chrání bakterii před fagocytózou a před bakteriolytickým účinkem komplementu (Julák, 2006; Votava, 2005).
12
4. INTESTINÁLNÍ PATOGENNÍ E. COLI
Intestinální patogenní sérotypy E. coli způsobují střevní infekce projevující se průjmy.
To jim umožňují specifické faktory virulence, kterými jsou vybaveny. Mezi hlavní intestinální patogeny patří E. coli enteropatogenní (EPEC), enterotoxigenní (ETEC), enterohemoragická (EHEC), enteroinvazivní (EIEC), enteroagregativní (EAEC) a difúzně adherentní (DAEC) (Votava, 2003).
4.1 Enteropatogenní E. coli (EPEC)
Enteropatogenní E. coli (EPEC) je původcem průjmů zejména u dětí mladších 2 let.
Většinou se jedná o průjmy akutní, ale mohou se objevit i průjmy perzistentní trvající déle než 2 týdny. Průjmy bývají doprovázeny horečkou, zvracením a dehydratací a v případě perzistentních průjmů také malnutricí (Mare a kol., 2021). Ve vážných případech mohou vést až k úmrtí (Julák, 2006).
EPEC se vyskytuje především v rozvojových zemích, ve kterých je hlavní příčinou novorozeneckých průjmů. K přenosu dochází fekálně-orální cestou, zejména špinavýma rukama, kontaminovanou kojeneckou výživou a kontaminovanými předměty. Rezervoárem infekce jsou nemocné děti a děti a dospělí s asymptomatickým průběhem infekce (Nataro a Kaper, 1998).
Patogenní účinek EPEC je dán tvorbou tzv. A/E (attaching and effacing) lézí na střevní sliznici. Bakterie při tvorbě A/E lézí těsně adherují prostřednictvím intiminu na povrch epitelu tenkého střeva (attaching), narušují povrch epitelu a způsobují ztrátu mikroklků (effacing) (Ochoa a Contreras, 2011).
Patogeneze EPEC se skládá ze 3 fází. Nejprve dochází k počáteční adhezi bakterií na epitelové buňky prostřednictvím BFP (bundle-forming pili). Ve 2. fázi jsou z bakterií sekrečním systémem III. typu transportovány do hostitelských buněk efektorové proteiny. Ve 3. fázi dochází k tvorbě podstavců a bakterie se prostřednictvím intiminu těsně vážou k epitelu (Hu a Torres, 2015; Nataro a Kaper, 1998).
Hlavními efektorovými proteiny transportovanými do hostitelských buněk jsou Tir, Map a EspF. Tir (translocated intimin receptor) je začleněn do membrány hostitelské
13
buňky, kde slouží jako receptor pro intimin a umožňuje tak bakteriím těsnou adhezi k epitelu prostřednictvím intiminu (Kaper a kol., 2004). Map (mitochondrial-associated protein) ovlivňuje funkci mitochondrií a stejně jako EspF (E. coli-secreted protein F) způsobuje narušení tight junctions (těsných spojů) mezi epitelovými buňkami a zvýšení střevní propustnosti (Ochoa a Contreras, 2011; Hu a Torres, 2015).
Bakterie adherované na epitel způsobují v epitelových buňkách změny v cytoskeletu, včetně akumulace polymerizovaného aktinu. V důsledku toho se membrána epitelových buněk pod bakteriemi zvedá a tvoří charakteristické podstavce. Dochází k destrukci klků a absorpčního povrchu střeva (Chen a Frankel, 2005; Nataro a Kaper, 1998).
Obrázek 1: Střevní sliznice infikovaná EPEC
Snímek z elektronového mikroskopu (zvětšení 45 000x) zobrazující vznik charakteristických A/E lézí (E = EPEC, MV = mikroklky, P = podstavec).
Zdroj: Chen a Frankel, 2005 (převzato a upraveno)
Ke vzniku průjmu dochází v důsledku několika mechanismů, mezi které patří malabsorpce způsobená ztrátou mikroklků, zvýšená střevní propustnost, aktivní sekrece iontů a zánět střevní sliznice (Kaper a kol., 2004).
14
4.2 Enterotoxigenní E. coli (ETEC)
Enterotoxigenní E. coli (ETEC) se vyskytuje především v rozvojových zemích, kde je častým původcem dětských průjmů. Kromě toho je také hlavní příčinou cestovatelských průjmů u turistů cestujících z vyspělých do rozvojových zemí (Kaper a kol., 2004).
Průjmy způsobené ETEC bývají vodnaté, bez krve a hlenu a u některých pacientů se může objevit i horečka a zvracení. Průjmy mohou být mírné s krátkým trváním až těžké připomínající choleru. K přenosu dochází pozřením fekálně kontaminovaných potravin nebo vody (Nataro a Kaper, 1998).
Patogeneze ETEC spočívá v adhezi bakterií k povrchu tenkého střeva a následné produkci enterotoxinů. Adhezi bakterií zprostředkovávají kolonizační faktory CFA (colonization factor antigens). U ETEC napadajících člověka se nejčastěji nachází typy CFA/I, CFA/II nebo CFA/IV. Pro ETEC je charakteristická produkce tepelně stabilního (ST) a tepelně labilního (LT) enterotoxinu. Může produkovat buď jen ST, nebo jen LT, nebo oba typy (Kaper a kol., 2004).
4.2.1 Tepelně stabilní enterotoxin (ST)
Tepelně stabilní enterotoxin (ST) má malou molekulovou hmotnost a je pouze slabě imunogenní (Greenwood a kol., 1999). Rozlišujeme 2 třídy tohoto enterotoxinu.
Označují se jako STa a STb a liší se strukturou a mechanismem účinku (Nataro a Kaper, 1998).
STa je peptid tvořený 18-19 aminokyselinami a jeho molekulová hmotnost je 2 kDa.
Rozlišujeme 2 varianty: STp a STh. STp (povine neboli prasečí) byl poprvé objeven u ETEC izolovaného z prasete a STh (human neboli lidský) u ETEC izolovaného
ze člověka. Obě tyto varianty se mohou vyskytovat u ETEC napadajících člověka (Nataro
a Kaper, 1998).
Hlavním receptorem pro STa je guanylátcykláza C, která je lokalizována na apikální membráně enterocytů v tenkém a tlustém střevě. Vazba STa na guanylátcyklázu C způsobí její aktivaci a tím zvýšení hladiny cGMP (cyklického guanosinmonofosfátu).
15
Zvýšená hladina cGMP vede k aktivaci cGMP-dependentní proteinkinázy II a ta způsobí fosforylaci a otevření chloridového kanálu CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). V důsledku toho dochází ke zvýšené sekreci chloridových iontů do střevního lumen, což vede ke vzniku osmotických průjmů (Clements a kol., 2012;
Kaper a kol., 2004).
STb je peptid tvořený 48 aminokyselinami s molekulovou hmotností 5,1 kDa. Vyskytuje se především u ETEC napadajících zvířata. Způsobuje poškození střevního epitelu a atrofii klků (Kaper a kol., 2004; Nataro a Kaper, 1998).
4.2.2 Tepelně labilní enterotoxin (LT)
Tepelně labilní enterotoxin (LT) má oproti tepelně stabilnímu větší molekulovou hmotnost a je imunogenní. Svou strukturou i funkcí je podobný enterotoxinu produkovanému Vibrio cholerae. Skládá se z 1 podjednotky A a 5 podjednotek B. Dělí se na 2 třídy: LT-I a LT-II (Greenwood a kol., 1999).
LT-I se prostřednictvím podjednotek B váže na plazmatickou membránu enterocytu, konkrétně na gangliosid GM1 a endocytózou se dostává do enterocytu. A podjednotka toxinu způsobí aktivaci adenylátcyklázy lokalizované na bazolaterální membráně enterocytu. Aktivace adenylátcyklázy vede ke zvýšení intracelulární produkce cAMP (cyklického adenosinmonofosfátu). V důsledku toho dochází k aktivaci cAMP- dependentní proteinkinázy, která způsobí fosforylaci a aktivaci chloridových kanálů, zejména CFTR. Výsledkem je zvýšená sekrece chloridových iontů do lumen střeva a snížená absorpce chloridu sodného z lumen střeva do enterocytů. Zvýšená koncentrace iontů v lumen střeva vede k hypersekreci vody a vzniku osmotických průjmů (Kaper a kol., 2004; Nataro a Kaper, 1998). Vyskytuje se u kmenů ETEC napadajících lidi i zvířata (Nataro a Kaper, 1998).
LT-II má podobný mechanismus působení jako LT-I. Je typický pro kmeny napadající zvířata, u lidských ETEC se vyskytuje pouze vzácně (Nataro a Kaper, 1998).
16
4.3 Enterohemoragická E. coli (EHEC)
Enterohemoragická E. coli (EHEC) je pojmenovaná podle její schopnosti vyvolávat krvácivé průjmy. Je podskupinou shigatoxigenní E. coli (STEC) nazývané též jako verotoxigenní (VTEC). Označení shigatoxigenní souvisí s produkcí toxinů s podobnou strukturou jako mají toxiny produkované bakterií Shigella dysenteriae a označení verotoxigenní s cytotoxickým působením na Vero buňky (Votava, 2003; Ambrožová a Marejková, 2012).
Enterohemoragická E. coli je vysoce nakažlivá a k vyvolání infekce stačí velmi nízká infekční dávka (Bell, 2002). Způsobuje závažná akutní onemocnění, která mohou v některých případech vést k dlouhotrvajícím nebo až fatálním následkům. Mezi tato onemocnění patří hemoragická kolitida, hemolyticko-uremický syndrom a ve vzácných případech trombotická trombocytopenická purpura (Bell, 2002; Ambrožová a Marejková, 2012).
Hemoragická kolitida se projevuje krvácivým průjmem, křečovitými bolestmi břicha a probíhá obvykle bez horečky (Ambrožová a Marejková, 2012).
U některých nemocných může dojít k rozvoji hemolyticko-uremického syndromu (HUS). Nejčastěji k tomu dochází u malých dětí a starších osob. Toto onemocnění je charakterizované hemolytickou anémií, trombocytopenií a akutním selháním ledvin.
Mezi typické klinické příznaky patří bledá až subiketricky zabarvená kůže, krvácivé projevy do kůže a oligurie až anurie (Ambrožová a Marejková, 2012).
Trombotická trombocytopenická purpura vzniká při infekci EHEC pouze vzácně a vyskytuje se zejména u dospělých osob. Je charakterizována stejně jako HUS hemolytickou anémií, trombocytopenií a akutním selháním ledvin. Navíc se mohou objevovat horečky a poruchy centrálního nervového systému. (Ambrožová a Marejková, 2012).
Rezervoárem EHEC je především hovězí dobytek, který bez jakýkoliv příznaků vylučuje bakterie stolicí. K přenosu na člověka dochází fekálně-orální cestou, nejčastěji pozřením infikovaného a nedostatečně tepelně upraveného hovězího masa (hamburgery, tatarský biftek, kebab). Dalším zdrojem nákazy může být
17
nepasterizované kravské a kozí mléko a mléčné výrobky, kontaminovaná syrová zelenina a ovoce, kontaminovaná voda nebo přímý kontakt s hospodářskými zvířaty (Ambrožová a Marejková, 2012).
Nejčastěji izolovaným sérotypem EHEC v České republice je sérotyp O26:H11 a po něm následuje sérotyp O157:H7 (Marejková a kol., 2019).
4.3.1 Shiga toxin
Hlavním faktorem virulence EHEC je Shiga toxin (Stx), který bývá označován též jako verotoxin (VT). Skládá se z 1 aktivní podjednotky A a 5 vazebných podjednotek B (Kaper a kol., 2004).
Podjednotka A se skládá z peptidu A1 a peptidu A2, které jsou spolu spojeny disulfidickým můstkem. Peptid A1 má enzymatickou aktivitu a peptid A2 zprostředkovává spojení podjednotky A s pentamerem podjednotek B. Podjednotky B zprostředkovávají vazbu toxinu na glykolipid Gb3 (globotriaosylceramid) lokalizovaný na buněčné membráně některých eukaryotických buněk (Nataro a Kaper, 1998).
Obrázek 2: Struktura Shiga toxinu
zdroj: Sandvig a kol., 2010 (převzato)
Toxin je po navázání na Gb3 transportován endocytózou do buňky a A podjednotka je translokována do cytoplazmy. A1 peptid následně způsobí odstranění adeninu z 60S podjednotky ribozomu, čímž dojde k inhibici syntézy proteinů v buňce. V důsledku
18
inhibice proteosyntézy dochází k apoptóze buňky (Nataro a Kaper, 1998; Nguyen a Sperandio, 2012).
Shiga toxin je uvolňován bakterií v tlustém střevě, kde se váže na glykolipidy Gb3 na endotelových buňkách střeva. Dostává se dovnitř buněk, odkud se následně vstřebává do krevního oběhu. Krví je transportován k cílovým orgánům. Hlavním cílovým orgánem jsou ledviny, kde se toxin váže na endotelové buňky v glomerulech (Ambrožová a Marejková, 2012).
Rozlišujeme 2 typy Shiga toxinu (Stx), a to Stx-1 a Stx-2. Jednotlivé kmeny EHEC mohou produkovat buď jen Stx-1, nebo jen Stx-2, nebo oba typy (Nataro a Kaper, 1998).
Stx-1 je sekvencí aminokyselin téměř shodný se Shiga toxinem, který produkuje Shigella dysenteriae Stx-2 je sekvencí aminokyselin shodný s Stx-1 pouze z 55 % (Pacheco a Sperandio, 2012). Kmeny produkující Stx-2 jsou častěji příčinou vzniku HUS než kmeny produkující pouze Stx-1 (Ambrožová a Marejková, 2012).
4.3.2 Další faktory virulence
Mezi další faktory virulence patří intimin umožňující adhezi bakterií na střevní sliznici a enterohemolyzin. Enterohemolyzin je produkován téměř všemi EHEC sérotypu O157:H7 a i u jiných sérotypů je široce rozšířen (Nataro a Kaper, 1998). Patří mezi RTX toxiny (Repeats in ToXin) a způsobuje tvorbu pórů v buněčné membráně buněk (Bielaszewska a kol., 2014). U lidí způsobuje lýzu erytrocytů (hemolýzu) a u hovězího dobytku lýzu erytrocytů i leukocytů. V důsledku lýzy erytrocytů dochází k uvolnění hemoglobinu, který může být bakteriemi využit jako zdroj železa pro jejich růst (Nataro a Kaper, 1998).
19
4.4 Enteroinvazivní E. coli (EIEC)
Enteroinvazivní E. coli (EIEC) je velmi blízká bakteriím rodu Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii a S. sonnei). Má podobný mechanismus patogenity (proniká do buněk, v nichž se množí) a stejně jako shigely způsobuje bacilární dyzenterii (Bednář, 1996; Ud-Din a Wahid, 2015).
U většiny pacientů se infekce EIEC projevuje vodnatými průjmy. Pouze u menší části pacientů dochází k rozvoji bacilární dyzenterie neboli shigelózy. Ta se vyznačuje vodnatou stolicí s příměsí krve a hlenu, křečovitými bolestmi břicha, horečkou a tenesmy (Nataro a Kaper, 1998; Kaper a kol. 2004). Dyzenterie způsobené EIEC bývají méně závažné než dyzenterie vyvolané shigelami (Ud-Din a Wahid, 2015).
K přenosu dochází fekálně-orální cestou, nejčastěji pozřením kontaminované potravy nebo vody. Možný je také přímý přenos z člověka na člověka (Nataro a Kaper, 1998).
Na rozdíl od ostatních enteropatogenních E. coli je EIEC intracelulárním patogenem - je schopná pronikat do buněk a množit se v nich (Kaper a kol., 2004). Z lumen střeva se dostává transcytózou přes M-buňky do Peyerových plaků, kde je fagocytována makrofágem. Uvnitř makrofágu způsobuje lýzi endocytární vakuoly a dostává se do cytoplazmy. V cytoplazmě makrofágu se množí a způsobuje jeho apoptózu.
V důsledku apoptózy makrofágu dochází k uvolnění prozánětlivých cytokinů (např. interleukinu-1) a vyvolání zánětlivé reakce. Uvolněné cytokiny nalákají polymorfonukleární leukocyty (PMN) do místa zánětu a ty způsobí destabilizaci tight-junctions (těsných spojů) mezi epitelovými buňkami. Tím se bakteriím umožní přestup z lumen střeva přímo do enterocytu přes bazolaterální membránu (Nataro a Kaper, 1998; Robins-Browne a Hartland, 2002; Ud-Din a Wahid, 2015).
Z mrtvého makrofágu se uvolňují EIEC, které se skrz bazolaterální membránu dostávají endocytózou do sousedních enterocytů. Uvnitř enterocytu lyzují membránu vakuoly, dostávají se do cytoplazmy a množí se. Na jedné straně svého povrchu si tvoří polymerizací aktinu aktinový ocas, který jim umožní pohybovat se cytoplazmou uvnitř buňky a šířit se dál do okolních enterocytů. Invaze enterocytů vede k silné zánětlivé
20
reakci, ulceraci sliznice a destrukci tkáně (Nataro a Kaper, 1998; Robins-Browne a Hartland, 2002; Ud-Din a Wahid, 2015).
Mezi hlavní faktory virulence patří Ipa (invasion plasmid antigen) proteiny, pomocí nichž bakterie proniká do buněk. Protein IpaB je zodpovědný za schopnost bakterie rozpustit endocytární vakuolu. Tvorbu aktinového ocasu umožňuje protein VirG (Nataro a Kaper, 1998).
Obrázek 3: Schéma patogeneze EIEC
Schéma zobrazující mechanismus patogeneze EIEC:
přestup bakterií přes M-buňky z lumen střeva do Peyerových plaků (1), destabilizace tight-junctions PMN, přestup bakterií z lumen střeva do enterocytů (2),
apoptóza makrofágu a přestup bakterií do enterocytu (3), tvorba aktinového ocasu (4), šíření bakterií do okolních enterocytů (5).
Zdroj: Robins-Browne a Hartland, 2002 (převzato a upraveno)
21
4.5 Enteroagregativní E. coli (EAEC, EAggEC)
Enteroagregativní E. coli (EAEC, EAggEC) způsobuje průjmová onemocnění u dětí v rozvojových i vyspělých zemí, perzistující průjmy u HIV pozitivních pacientů a po ETEC je druhou nejčastější příčinou cestovatelských průjmů (Harrington a kol., 2006; Huang a DuPont, 2004). Hlavním zdrojem infekce je kontaminovaná potrava (Okhuysen a DuPont, 2010).
Infekce EAEC se kromě vodnatých průjmů projevuje také bolestmi břicha, nevolností, zvracením a mírně zvýšenou teplotou. Průjmy mohou být akutní i chronické (přetrvávající více jak 14 dní) (Kaur a kol., 2010).
Pro EAEC je charakteristická agregativní adherence na buňky tkáňových kultur (HEp-2- buňky). Patogeneze EAEC probíhá ve 3 fázích. V první fázi dochází pomocí AAF (adherentně-agregativních fimbrií) k adhezi bakterií ke střevní sliznici a agregaci bakterií mezi sebou. Bakterie tímto způsobem vytváří na povrchu sliznice typickou konfiguraci „skládaných cihel“ (stacked-brick configuration). Ve druhé fázi způsobují bakterie vyšší produkci hlenu a na povrchu sliznice tak vzniká biofilm, který je tvořen hlenem a v něm zachycenými bakteriemi. Ve třetí fázi bakterie produkují toxiny poškozující střevní epitel (klky a enterocyty) a dochází ke vzniku průjmů (Nataro a Kaper, 1998; Kaur a kol., 2010).
Mezi toxiny produkované EAEC patří tepelně stabilní enterotoxin EAST 1, Shigella enterotoxin 1 a cytotoxin Pet (plasmid encoded toxin) (Kaur a kol., 2010).
22
4.6 Difúzně adherentní E. coli (DAEC)
Difúzně adherentní E. coli (DAEC) může způsobovat průjmy u dětí ve věku od 18 měsíců do 5 let, infekce močových cest a těhotenské komplikace. U dětí i u dospělých se může vyskytovat i asymptomatický průběh nákazy (Servin, 2014).
DAEC je charakterizována difúzní adherencí na buňky tkáňových kultur (HEp-2-buňky).
Většina kmenů DAEC produkuje adhezin F1845 patřící do skupiny Dr adhezinů.
Receptorem těchto adhezinů je protein DAF (Decay-Accelerating Factor, faktor urychlující rozpad) vyskytující se na povrchu hostitelských buněk. Po adhezi bakterií k enterocytům dochází k prodlužování enterocytů do prstovitých útvarů, které obepínají adherované bakterie (Kaper a kol., 2004).
Obrázek 4: Schéma patogeneze DAEC
Schéma zobrazující mechanismus patogeneze DAEC:
adheze DAEC prostřednictvím adhezinu na receptor DAF a tvorba prstovitých útvarů obepínajících bakterie.
Zdroj: Kaper a kol., 2004 (převzato)
23
5. EXTRAINTESTINÁLNÍ PATOGENNÍ E. COLI
Extraintestinální E. coli (ExPEC) způsobuje onemocnění mimo trávicí trakt. Jedná se především o infekce močových cest, novorozenecké meningitidy, sepse, pneumonie a infekce ran (Johnson a Russo, 2002; Votava, 2003).
5.1 Uropatogenní E. coli (UPEC)
Escherichia coli je nejčastějším původcem infekcí močových cest (IMC) a způsobuje 80-85 % jejich případů (Kaper a kol, 2004; Svobodová a Turjap, 2018). Infekce močových cest zahrnují asymptomatickou bakteriurii, zánět močové trubice (uretritidu), zánět močového měchýře (cystitidu) a zánět ledvin (pyelonefritidu) (Lyerová a Gregorová, 2011). Bakterie se do močových cest dostávají nejčastěji ascendentní cestou z tlustého střeva (Greenwood a kol., 1999).
Mezi hlavní příznaky IMC patří bolest při močení, opakované nucení na močení s malou porcí moči (polakisurie), krev v moči (hematurie) a v případě pyelonefritidy také horečka (Ryšánková, 2020).
Močové infekce postihují častěji ženy než muže, neboť kratší a širší ženská močová trubice umožňuje snadnější průnik bakterií. Dalšími rizikovými faktory jsou pohlavní styk, těhotenství, diabetes mellitus, katetrizace močového měchýře a zvětšená prostata u mužů (Greenwood a kol., 1999; Svobodová a Turjap, 2018).
5.1.1 Faktory virulence
Hlavními virulenčními faktory uropatogenní E. coli jsou adheziny, které umožňují bakteriím vazbu k epitelu močových cest. Jedná se především o fimbrie typu 1, P-fimbrie, ale i další typy fimbrií. Fimbrie typu 1 se vážou na receptor uroplakin na epitelu dolních močových cest a jsou nezbytné pro jejich kolonizaci. P-fimbrie se vážou na epitelové buňky ledvin a jsou jimi vybaveny kmeny způsobující pyelonefritidu (Kaper a kol., 2004; Lüthje a Brauner, 2014).
UPEC produkuje řadu toxinů, které ji slouží k šíření do hlubších vrstev epitelu, k získávání živin z hostitelských buněk a k ničení imunitních buněk organismu. Jedná se
24
především o hemolyzin, cytotoxický nekrotizující faktor 1 a toxin Sat (secreted autotransporter toxin) (Kaper a kol., 2004; Lüthje a Brauner, 2014).
Mezi další virulenční faktory patří mechanismy získávání železa. Močové cesty jsou velmi chudé na volné železo, které je pro bakterie životně důležité. Mechanismy získávání železa, jako jsou hemolyzin a siderofory, umožňují bakteriím v tomto prostředí přežít (Lüthje a Brauner, 2014).
Hemolyzin umožňuje lýzou erytrocytů a uvolněním hemoglobinu využití železa z hemu.
Hem se váže na hemové receptory ChuA a Hma na vnější membráně bakterií a je následně transportován do jejich cytoplazmy (Lüthje a Brauner, 2014).
Siderofory jsou molekuly chelatující železo z okolního prostředí. E. coli může syntetizovat 4 druhy sideroforů, a to aerobactin, enterobactin, salmochelin a yersiniabactin (Lüthje a Brauner, 2014).
Hlavním receptorem pro UPEC je glykoprotein uroplakin nacházející se na povrchu deštníčkových buněk (umbrella cells) přechodného epitelu močových cest. Hlavní složkou uroplakinu je D-manóza, na kterou UPEC adherují pomocí fimbrií typu 1.
Adherované bakterie prostupují do cytoplazmy buněk, kde se množí a vytváří tzv. intracelulární bakteriální komunity. Následně dochází k apoptóze hostitelských buněk a uvolnění bakterií do moči. Některé bakterie jsou schopné proniknout až do bazální vrstvy přechodného epitelu, kde jsou chráněny před léčbou antibiotiky, a vytvořit zde tzv. spící ložiska, která mohou být příčinou reinfekcí (Lüthje a Brauner, 2014; Rutar, 2019).
25
5.2 E. coli způsobující novorozeneckou meningitidu (NMEC)
E. coli je po streptokoku skupiny B (Streptococcus agalactiae) druhou nejčastější příčinou novorozenecké meningitidy (Bonacorsi a Bingen, 2005). Novorozenecká meningitida se vyznačuje vysokou mortalitou a u dětí, které přežijí, je spojena s vysokým rizikem vzniku neurologického postižení, jako je například ztráta sluchu, opoždění psychomotorického vývoje nebo porucha kognitivních funkcí (Zhao a kol., 2018).
Příznaky novorozenecké meningitidy jsou obvykle nespecifické – líné sání, poruchy termoregulace a svalového tonu, dráždivost nebo letargie, pláč charakteru bolestivého kočičího křiku, bledá kůže, zvracení, křeče a vyklenutá velká fontanela (Blechová, 2006).
E. coli způsobující novorozeneckou meningitidu se vyznačují schopností přežít v krvi, překonat hematoencefalitickou bariéru novorozenců a způsobit tak zánět mozkových blan (Wijetunge a kol., 2015). Ke vzniku meningitidy dochází v několika krocích.
Nejprve E. coli získané od matky nebo z okolního prostředí kolonizují střevní trakt novorozence. Následně bakterie přestupují ze střevního traktu do krevního oběhu, kde se množí a způsobují bakteremii. Nakonec dochází k přestupu bakterií z krve přes hematoencefalitickou bariéru do centrálního nervového systému (Bonacorsi a Bingen, 2005).
Hlavními faktory virulence NMEC jsou S fimbrie, pomocí kterých bakterie adherují k buňkám choroidního plexu a mozkových komor, a kapsulární antigen K1, který bakterie chrání před fagocytózou (Bingen a kol., 1997).
26
5.3 E. coli způsobující sepse (SEPEC)
E. coli se řadí mezi nejčastější bakteriální původce sepsí (Kolář, 2016). Sepse je systémová zánětlivá odpověď organismu na přítomnost infekce, která může vést až k selhání orgánů a smrti. Příznaky sepse jsou nespecifické, patří k nim například vysoké horečky, zčervenání pokožky, zvýšení srdeční frekvence, dýchání se zvýšenou frekvencí, hypotenze, otoky a další (Streitová a Zoubková, 2015). Sepse způsobené E. coli vznikají většinou jako komplikace infekcí močových cest nebo pneumonií (Mokady a kol., 2005).
Hlavními virulenčními faktory SEPEC jsou mechanizmy získávání železa (zejména siderofor aerobaktin), rezistence na baktericidní účinek séra a různé typy adhezinů (Mokady a kol., 2005).
27
6. MOŽNOSTI LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY
6.1 Mikroskopický průkaz
Pro mikroskopický průkaz se využívá barvení dle Grama. Bakterie E. coli můžeme pod mikroskopem pozorovat jako gramnegativní tyčinky. Mají stejný vzhled jako ostatní bakterie z čeledi Enterobacterales a není možné je od nich rozlišit (Votava, 2010).
Mikroskopie má význam pouze při diagnostice biologického materiálu, ve kterém se E. coli a další enterobakterie normálně nevyskytují (moč, likvor, krev, punktáty apod.).
V případě vyšetření stolice se mikroskopický průkaz neprovádí (Votava, 2000).
6.2 Kultivace
E. coli je poměrně snadno kultivovatelná a je možné ji kultivovat na široké škále půd (Votava, 2003). Kultivace probíhá za aerobních podmínek při teplotě 37 °C a trvá 24 hodin (Nataro a Kaper, 1998 Votava, 2010).
Pro orientační diagnostiku E. coli se využívá kultivace na selektivně-diagnostických půdách, jako jsou Endův a McConkeyho agar. Tyto půdy jsou selektivní, neboť jsou na nich schopné růst jen odolné gramnegativní tyčinky, a zároveň i diagnostické, neboť obsahují laktózu a umožňují rozlišení laktóza-pozitivních a laktóza-negativních bakterií (Votava, 2010).
E. coli je laktóza-pozitivní bakterií – je schopná štěpit laktózu. Na Endově agaru vytváří červené kolonie s typickým kovovým leskem. Na McConkeyho agaru jsou kolonie E. coli růžové až červené (Votava, 2010).
Pro průkaz EHEC sérotypu O157:H7 je možné využít McConkeyho agar se sorbitolem.
Jedná se o modifikaci McConkeyho agaru, ve kterém je laktóza nahrazena sorbitolem.
EHEC O157:H7, která se vyznačuje tím, že na rozdíl od ostatních sérotypů není schopná štěpit sorbitol, tvoří na této půdě bezbarvé kolonie. Pozitivní výsledek je následně nutné potvrdit sérologicky (Votava, 2003).
28
Obrázek 5: E. coli na Endově agaru
Kolonie E. coli na Endově agaru s typickým kovovým leskem zdroj: fotografie z ÚKM FN HK
29
6.3 Biochemický průkaz
K identifikaci E. coli je možné využít biochemické testy. E. coli je po biochemické stránce průměrně aktivní. Štěpí glukózu a laktózu za tvorby plynu, tvoří indol a neštěpí močovinu (Votava, 2003).
V praxi se pro biochemickou identifikaci bakterií využívají komerčně vyráběné diagnostické soupravy. K identifikaci E. coli a dalších enterobakterií lze využít například soupravy od firmy Lachema, např. ENTEROtest 16, ENTEROtest 24 a ENTEROtest Rapid (Votava, 2000).
ENTEROtest 16 obsahuje 16 biochemických testů a u ENTEROtestu 24 a ENTEROtestu Rapid jich je 24. Biochemické testy jsou umístěny v jamkách titrační destičky.
Do jednotlivých jamek se přidává bakteriální suspenze. Suspenze se připravuje homogenizací čisté kultury ve fyziologickém roztoku a její zákal musí odpovídat 1. stupni McFarlandovy zákalové stupnice. Do některých jamek se přidává sterilní parafinový olej, který vytváří anaerobní prostředí potřebné pro některé reakce. Poté se destička s naočkovanými jamkami vkládá do inkubačního sáčku a nechává se inkubovat při teplotě 35 – 37 °C po dobu 18 – 24 hodin. V případě ENTEROtestu Rapid, který slouží pro rychlou diagnostiku bakterií, trvá inkubace pouze 4 hodiny. Po uplynutí inkubační doby se do některých jamek ještě přidají předepsaná činidla a na základě zbarvení jamek se odečtou výsledky. Odečtení výsledků je možné provést vizuálně nebo automaticky za použití readeru (čtecího zařízení). Identifikace bakterií se provádí srovnáním výsledku s údaji v diferenciační tabulce nebo pomocí identifikačního program (Erba Lachema, 2018a; Erba Lachema 2018b; Erba Lachema 2018c; Votava, 2000).
30
6.4 Sérotypizace
K určení antigenních sérotypů E. coli se využívá sérotypizace. Jejím principem je interakce antigenu, kterým je v tomto případě povrchová struktura bakterie, s protilátkou vytvořenou proti tomuto antigenu. Pro provedení sérotypizace se využívá především latexová aglutinace, při které jsou dané protilátky navázány na povrchu latexových částic (Votava, 2010).
Postup provedení je následující: na podložní sklíčko, skleněnou destičku či testovací kartičku se kápne testované sérum a vedle něj se přidá kapka bakteriální suspenze připravené homogenizací čisté bakteriální kultury ve fyziologickém roztoku. Poté se kapky pomocí tyčinky smíchají a pozoruje se, zda dochází k aglutinaci. V případě, že je viditelný vznik aglutinátu (vyvločkování), hodnotí se reakce jako pozitivní (Votava, 2010).
Z důvodu snížení počtu prováděných reakcí se bakteriální suspenze testuje nejprve s polyvalentními séry, která obsahují několik různých typů protilátek, a až poté se séry monovalentními obsahujícími pouze 1 typ protilátky (Votava, 2010).
6.5 Metody molekulární biologie
Metody molekulární biologie jsou založeny na průkazu bakteriálních nukleových kyselin. K průkazu DNA E. coli se mohou využít DNA sondy nebo PCR (polymerázová řetězová reakce). Jedná se o nejspolehlivější metody pro rozlišení enteropatogenních kmenů od nepatogenních a pro stanovení enteropatogenních sérotypů E. coli (Nataro a Kaper, 1998).
6.5.1 DNA-sondy
DNA-sonda je fragment jednořetězcové molekuly DNA, který je komplementární k prokazované DNA a na základě komplementarity bází se na ní váže. Při průkazu bakteriální DNA pomocí DNA-sondy se nejprve provede kultivace bakterií na Petriho misce s živným agarem a narostlé kolonie se následně otisknou na nitrocelulózovou membránu. Následuje lýze bakterií, denaturace bakteriální DNA (rozdělení dvoušroubovice DNA na jednotlivá vlákna) a hybridizace DNA se značenou sondou.
31
Poté se promytím odstraní zbytky nenavázané sondy a výsledná hybridizace se vyhodnotí (Nataro a Kaper, 1998; Votava, 2010).
Značení sond může být buď radioaktivní využívající radioaktivních izotopů (např. 32P), nebo neradioaktivní využívající např. značení biotinem. Sonda značená biotinem je detekována pomocí protilátky s navázaným enzymem, který reaguje s přidávaným substrátem a způsobí kolorimetrickou nebo chemiluminiscenční reakci (Beránek, 2016).
6.5.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) je metodou, při které dochází k amplifikaci (zmnožení) hledaného úseku DNA. Principem PCR je opakování cyklů skládajících se ze 3 kroků. Prvním krokem je denaturace, kdy se dvoušroubovice vyšetřované DNA zahřátím rozdělí na jednotlivá vlákna. Druhým krokem je annealing, při kterém dochází k ochlazení a tzv. primery (2 krátké syntetické nukleotidy) se na základě komplementarity připojí ke specifickým místům na vláknech vyšetřované DNA. Posledním krokem je elongace, kdy pomocí enzymu Taq polymerázy a přebytku deoxyribonukleotidtrifosfátů dochází k syntéze nového vlákna DNA. Nově vytvořená DNA se v dalším cyklu stává matricí pro vznik dalších kopií. Přístroj, ve kterém PCR probíhá, se nazývá termocykler. Průkaz amplifikované DNA se provádí elektroforézou s následným obarvením ethidiumbromidem nebo pomocí DNA-sondy (Bursová a kol., 2014; Votava, 2010).
6.6 MALDI-TOF
Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight) slouží k rychlé a velmi přesné identifikaci bakterií na základě vyhodnocení hmotnostních spekter bakteriálních proteinů. Tato metoda patří mezi měkké ionizační techniky – po ozáření bakterií laserem nedochází ke štěpení proteinů bakterií, ale pouze k jejich ionizaci prostřednictvím matrice (Bursová a kol., 2014).
Nevýhodou této metody je neschopnost rozlišit E. coli od bakterií rodu Shigella z důvodu jejich genetické příbuznosti (Khot a Fisher,2013).
32
Při identifikaci bakterií pomocí MALDI-TOF se nejprve provede kultivace bakterií na agarové půdě. Získaná kolonie se přenese na pracovní destičku a nechá se na vzduchu vysušit. Následně se ke vzorku přidá matrice, která z bakterií vyextrahuje jednotlivé proteiny. Destička se poté vloží do hmotnostního spektrometru, ve kterém je směs vzorku s matricí ozářena laserem. Matrice se odpaří a dojde k ionizaci proteinů vzorku. Proteinové ionty jsou elektrostaticky urychleny a vstupují do letové trubice.
Rychlostí, která je úměrná jejich hmotnosti a náboji, letí trubicí k detektoru. Měří se doba letu iontů, lehčí ionty doletí k detektoru dříve než ionty těžší. Výsledkem je hmotnostní spektrum, které se porovná se spektry uloženými v referenční databázi a následně se vyhodnotí (Bursová a kol., 2014; Nyč a Bubeníček, 2015).
33
Obrázek 6: Princip MALDI-TOF
Schéma zobrazující princip MALDI-TOF zdroj: Croxatto a kol., 2012 (převzato a upraveno)
34
7. TERAPIE A PREVENCE
7.1 Intestinální infekce
Základem léčby průjmových onemocnění, způsobených nejen E. coli, je včasná rehydratace. V případě lehkých a středně těžkých průjmů stačí perorální rehydratace, ke které se doporučuje pití černého čaje, nesycených minerálních vod či využití perorálních rehydratačních roztoků. U těžkých průjmů je nutná intravenózní rehydratace (Ambrožová, 2011).
Dále se k léčbě využívá dieta s omezením tuků a podávání nespecifických protiprůjmových léků, jako jsou absorbencia nebo střevní dezinficiencia (antiseptika).
Adsorbencia jsou inertní látky, které na sebe vážou toxiny. Jedná se především o přípravky obsahující aktivní uhlí nebo diosmectic (Smecta). Střevní dezinficiencia mají bakteriostatický účinek a patří k nim např. kloroxin (Endiaron) a nifuroxazid (Ercefuryl) (Ambrožová, 2011).
K antibiotické léčbě se přistupuje pouze výjimečně, nejčastěji u pacientů s těžkým průjmovým onemocnění (Ambrožová, 2011). K léčbě průjmů způsobených E. coli se využívají především fluorochinolony (např. ciprofloxacin) nebo kotrimoxazol (kombinace trimethoprimu a sulfamethoxazolu v poměru 1:5) (Barr a Smith, 2014).
Léčba antibiotiky není doporučena u průjmů vyvolaných EHEC. Antibiotika způsobují uvolnění Shiga toxinu z mrtvých bakterií a zvyšují riziko vzniku HUS (Ambrožová, 2011;
Goldwater a Bettelheim, 2012).
Prevence spočívá zejména v dodržování osobní hygieny, mytí rukou, správném zacházení s potravinami (dostatečná tepelná úprava masa a pasterizace mléka) a úpravě pitné vody. Lidem, kteří cestují do tropických rozvojových zemí s nízkou hygienickou úrovní, je doporučeno konzumovat jen čerstvě tepelně upravená jídla, vlastnoručně oloupané ovoce a balenou vodu (Ambrožová a Marejková, 2012;
Greenwood a kol., 1999).
35
7.2 Extraintestinální infekce 7.2.1 Infekce močových cest
Infekce močových cest se léčí pomocí antibiotik. Hlavním cílem léčby je eliminace bakterií z moči a z tkáně urogenitálního traktu (Matoušková, 2005). U zánětu močového měchýře je lékem první volby nitrofurantoin s doporučenou délkou léčby minimálně 5 dní. V případě zánětu uretry je lékem první volby doxycyklin po dobu minimálně 10 dní. Pro léčbu zánětu horních močových cest se využívá amoxicilin s klavulonovou kyselinou (kombinace betalaktamového antibiotika a inhibitoru betalaktamázy) po dobu 10 až 14 dní (Karen a kol., 2018).
Asymptomatická bakteriurie se léčí pouze u těhotných žen. Bez léčby může dojít k rozvoji akutní pyelonefritidy, která zvyšuje riziko potratu nebo předčasného porodu.
K léčbě se využívají aminopeniciliny s inhibitorem betalaktamáz nebo cefalosporiny (Karen a kol., 2018).
Prevence vzniku IMC je důležitá především u pacientů s rizikovými faktory a u pacientů trpících opakovanými infekcemi. K základním nefarmakologickým preventivním opatřením patří zvýšený příjem tekutin, ochrana před prochladnutím, správná technika očišťování genitálu po stolici, dodržování zásad bezpečného pohlavního styku a vymočení se bezprostředně po pohlavním styku. Nevhodné je předržování močení a nedostatečná nebo naopak nadměrná hygiena. Důležité je také používání vhodného typu antikoncepce, nedoporučuje se kondom, spermicidní krémy a nitroděložní tělísko (Svobodová a Turjap, 2018; Poršová a kol., 2006).
Dále existuje řada léčivých přípravků, které se mohou využívat jak pro prevenci vzniku IMC, tak jako podpůrná léčba. Jedná se o přípravky s obsahem brusinek, probiotika, bakteriální lyzáty, D-manózu a urologické čajové směsi (Svobodová a Turjap, 2018).
36
7.2.2 Novorozenecké meningitidy
Léčba novorozenecké meningitidy spočívá v okamžitém nasazení antibiotik (Blechová, 2006). K cílené antibiotické léčbě meningitid způsobených E. coli se využívají cefalosporiny 3. generace (ceftriaxon nebo cefotaxim) nebo meropenem. Léčba trvá 21 až 28 dní (Džupová a kol., 2017).
7.2.3 Sepse
I v případě sepsí je nutné co nejrychlejší zahájení intravenózní antibiotické léčby.
K úvodní empirické léčbě se využívají širokospektrá antibiotika a po identifikování původce sepse a zjištění jeho citlivosti k antibiotikům se léčba upraví nebo redukuje (Kula a kol., 2007).
37
8. KAZUISTIKA
Jako příklad kazuistiky je zde uveden případ hemolyticko-uremického syndromu u dvouleté dívky z roku 2009, který byl způsoben enterohemoragickou E. coli sérotypu O26:H11.
9. 6. byla dvouletá dívka hospitalizována na jednotce intenzivní péče s podezřením na hemolyticko-uremický syndrom. Dívka měla kašovitou stolici, zvracela a přestala močit. Byla u ní zahájena symptomatická léčba podáváním diuretik.
10. 6. byl pacientce zaveden dialyzační katetr a 11. 6. byla z důvodu zhoršení renální insuficience a anurie provedena hemodialýza. 12. 6. se u dívky objevila porucha vědomí. Bylo provedeno CT mozku, při kterém byl objeven edém mozku. Dívka byla přeložena na anesteziologicko-resuscitační oddělení a byla u ní zahájena umělá plicní ventilace a kontinuální metoda k čištění krve s pomalým průtokem dialyzačního roztoku.
13. 6. byl stav dívky stabilizovaný. 14.6. došlo ke zhoršení stavu a u pacientky se objevila těžká hypertenze pravděpodobně centrálního původu.
16. 6. bylo dívce provedeno CT mozku, při kterém bylo zjištěno zvětšování edému.
Ve večerních hodinách téhož dne pacientka zemřela (Marejková a kol., 2009).
38
9. DISKUSE A ZÁVĚR
Cílem této práce bylo sjednotit základní poznatky o patogenních sérotypech Escherichia coli, a to zejména o jejich faktorech virulence, o onemocněních, která způsobují, a o možnostech laboratorní diagnostiky.
V rámci patogenních sérotypů E. coli se rozlišují intestinální patogeny, které mají za následek průjmová onemocnění, a extraintestinální patogeny, které mohou způsobovat infekce močových cest, meningitidy nebo sepse.
Pro laboratorní diagnostiku E. coli a jejích patogenních sérotypů se využívá mikroskopický průkaz, kultivace na selektivně-diagnostických půdách, biochemický průkaz, sérotypizace, metody molekulární biologie (DNA-sondy a PCR) a hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF.
Patogenní sérotypy E. coli mohou být velmi nebezpečné. Důkazem toho je například nákaza způsobená enterohemoragickou E. coli, která se objevila na konci února tohoto roku ve Francii. Zdrojem této nákazy byla mražená pizza značky Buitoni od firmy Nestlé. Ke dni 13. 4. 2022 bylo zaznamenáno 53 nakažených, z čehož 51 případů bylo způsobeno EHEC O26 a 2 případy EHEC O103. U 88 % nemocných způsobila tato bakterie hemolyticko-uremický syndrom a u zbylých 12 % hemoragickou kolitidu. Dvě děti na nákazu zemřely (Santé publique France, 2022).
V České republice se počet infekcí vyvolaných enterohemoragickou E. coli pohybuje kolem desítek případů ročně. Například v roce 2012 bylo nahlášeno 13 případů, v roce 2013 17 případů, v roce 2014 28 případů, v roce 2015 20 případů, v roce 2016 28 případů, v roce 2017 36 případů, v roce 2018 29 případů, v roce 2019 34 případů, v roce 2020 31 případů a v roce 2021 47 případů (Státní zdravotní ústav, 2022a). V roce 2022 bylo za období od ledna do března nahlášeno 10 případů, z čehož se 4 případy vyskytovaly v Ústeckém kraji, 4 v Jihomoravském kraji, 1 v kraji Praha a 1 v Moravskoslezském kraji (Státní zdravotní ústav, 2022b). Nejčastěji izolovaným sérotypem v České republice je sérotyp O26:H11, po kterém následuje sérotyp O157:H7 (Marejková a kol., 2019).
39
Tabulka 1: Počet infekcí vyvolaných EHEC v České republice v letech 2012 až 2022
rok 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022*
počet
případů 13 17 28 20 28 36 29 34 31 47 10
Zdroj: Státní zdravotní ústav, 2022a (převzato a upraveno)
Přestože je E. coli běžnou a důležitou součástí střevní mikroflóry, může se za určitých okolností stát nebezpečným a obávaným patogenem. Některé její kmeny, které jsou vybaveny specifickými faktory virulence, mohou být příčinou střevních infekcí, infekcí močových cest, meningitid nebo sepsí.
40
10. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
zkratka význam zkratky český význam
A/E Attaching and effacing
AAF Aggregative adherence fimbriae adherentně-agregativní fimbrie
BFP Bundle-forming pili pili tvořící svazky
cAMP Cyclic adenosine monophosphate cyklický adenosinmonofosfát CFA Colonization factor antigens
CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
transmembránový regulátor cystické fibrózy
cGMP Cyclic guanosine monophosphate cyklický guanosinmonofosfát DAEC Diffusely adherent E. coli difúzně adherentní E. coli
DAF Decay-Accelerating Factor faktor urychlující rozpad DNA Deoxyribonucleic acid deoxyribonukleová kyselina EAEC Enteroaggregative E. coli enteroagregativní E. coli EHEC Enterohemorrhagic E. coli enterohemoragická E. coli
EIEC Enteroinvasive E. coli enteroinvazivní E. coli EPEC Enteropathogenic Escherichia coli enteropatogenní Escherichia coli EspF E. coli-secreted protein F
ETEC Enterotoxigenic E. coli enterotoxigenní E. coli ExPEC Extraintestinal pathogenic E. coli extraintestinální E. coli
Gb3 Globotriaosylceramide globotriaosylceramid
HEp-2-buňky Human Epithelial type 2 cells
HUS Hemolytic-uremic syndrome hemolyticko-uremický syndrom
IMC infekce močových cest
LT Heat-labile enterotoxin tepelně labilní enterotoxin MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization – Time of Flight
Matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace - Analyzátor
doby letu Map Mitochondrial-associated protein
NMEC Neonatal meningitis- causing Escherichia coli
E. coli způsobující novorozeneckou meningitidu
PCR Polymerase Chain Reaction polymerázová řetězová reakce Pet Plasmid encoded toxin
41
PMN Polymorphonuclear leukocytes polymorfonukleární leukocyty RTX Repeats in ToXin
Sat Secreted autotransporter toxin
SEPEC Sepsis-associated E. coli E. coli způsobující sepse ST Heat-stable enterotoxin tepelně stabilní enterotoxin STEC Shiga-toxigenic E. coli shigatoxigenní E. coli
Stx Shiga toxin
Tir Translocated intimin receptor
UPEC Uropathogenic E. coli uropatogenní E. coli
VT Verotoxin
VTEC Verotoxogenic E. Coli verotoxigenní E. coli
42
11. SEZNAM TABULEK
Tabulka 1: Počet infekcí vyvolaných EHEC v České republice v letech 2012 až 2022 .... 39
43
12. SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1: Střevní sliznice infikovaná EPEC ... 13
Obrázek 2: Struktura Shiga toxinu ... 17
Obrázek 3: Schéma patogeneze EIEC ... 20
Obrázek 4: Schéma patogeneze DAEC ... 22
Obrázek 5: E. coli na Endově agaru ... 28
Obrázek 6: Princip MALDI-TOF ... 33
44
13. POUŽITÁ LITERATURA
AMBROŽOVÁ, Helena a Monika MAREJKOVÁ. Enterohemoragické kmeny Escherichia coli – nebezpečné novější patogeny. Časopis lékařů českých [online]. 2012, 151(11), 514-518 [cit. 2022-02-12]. ISSN 1805-4420. Dostupné z:
https://www.prolekare.cz/casopisy/casopis-lekaru-ceskych/2012-11- 1/download?hl=cs
AMBROŽOVÁ, Helena. Průjmová onemocnění a jejich léčba. Prakt. lékáren. [online].
2011, 7(3), 116-120 [cit. 2022-04-03]. ISSN 1803-5329. Dostupné z:
https://www.solen.cz/artkey/lek-201103-
0006_Prujmova_onemocneni_a_jejich_lecba.php
BARR, Wendy a Andrew SMITH. Acute Diarrhea in Adults. Am Fam Physician [online].
2014, 89(3), 180-189 [cit. 2022-04-03]. Dostupné z:
https://www.aafp.org/afp/2014/0201/p180.html
BEDNÁŘ, Marek. Lékařská mikrobiologie: bakteriologie, virologie, parazitologie. Praha:
Marvil, 1996, s. 264-265. ISBN 80-238-0297-6.
BELL, C. Approach to the control of entero-haemorrhagic Escherichia coli (EHEC). International Journal of Food Microbiology [online]. 2002, 78(3), 197-216 [cit.
2022-02-12]. ISSN 01681605. Dostupné z: doi:10.1016/S0168-1605(02)00188-5 BERÁNEK, Martin. Molekulární genetika pro bioanalytiky. Praha: Karolinum, 2016, s.
64-65. ISBN 978-80-246-3224-7.
BIELASZEWSKA, Martina, Thomas ALDICK, Andreas BAUWENS a Helge KARCH.
Hemolysin of enterohemorrhagic Escherichia coli: Structure, transport, biological activity and putative role in virulence. International Journal of Medical Microbiology [online]. 2014, 304(5-6), 521-529 [cit. 2022-02-13]. ISSN 14384221.
Dostupné z: doi:10.1016/j.ijmm.2014.05.005
45
BINGEN, E, S BONACORSI, N BRAHIMI, E DENAMUR a J ELION. Virulence patterns of Escherichia coli K1 strains associated with neonatal meningitis. Journal of Clinical Microbiology [online]. 1997, 35(11), 2981-2982 [cit. 2022-03-08]. ISSN 0095-1137.
Dostupné z: doi:10.1128/jcm.35.11.2981-2982.1997
BLECHOVÁ, Zuzana. Hnisavé meningitidy nejmladších věkových skupin. Neurol.
praxi [online]. 2006, 7(3), 131-133 [cit. 2022-03-06]. ISSN 1803-5280. Dostupné z:
http://solen.cz/artkey/neu-200603-
0004_Hnisave_meningitidy_nejmladsich_vekovych_skupin.php
BONACORSI, Stéphane a Edouard BINGEN. Molecular epidemiology of Escherichia coli causing neonatal meningitis. International Journal of Medical Microbiology [online].
2005, 295(6-7), 373-381 [cit. 2022-03-06]. ISSN 14384221. Dostupné z:
doi:10.1016/j.ijmm.2005.07.011
BURSOVÁ, Šárka, Marta DUŠKOVÁ, Lenka NECIDOVÁ, Renáta KARPÍŠKOVÁ a Petra MYŠKOVÁ. Mikrobiologické laboratorní metody. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2014, s. 36-37. ISBN 978-80-7305-676-6.
CLEMENTS, Abigail, Joanna C. YOUNG, Nicholas CONSTANTINOU a Gad FRANKEL.
Infection strategies of enteric pathogenic Escherichia coli. Gut Microbes [online].
2012, 3(2), 71-87 [cit. 2022-02-12]. ISSN 1949-0976. Dostupné z:
doi:10.4161/gmic.19182
CROXATTO, Antony, Guy PROD'HOM a Gilbert GREUB. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews [online].
2012, 36(2), 380-407 [cit. 2022-03-30]. ISSN 1574-6976. Dostupné z:
doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x
46
DŽUPOVÁ, Olga, Miroslav HELCL, Renata KRAČMAROVÁ, Lenka KRBKOVÁ, Radana PAŘÍZKOVÁ a Luděk ROŽNOVSKÝ. Doporučený postup diagnostiky a léčby purulentní meningitidy. Klinická mikrobiologie a infekční lékařství [online]. 2017, 23(2), 76-84 [cit.
2022-04-03]. ISSN 1211-264X. Dostupné z:
https://www.infekce.cz/DoporMenPur17t.htm
ERBA LACHEMA. ENTERO-Rapid 24 [online]. 2018c [cit. 2022-03-24]. Dostupné z:
https://www.erbalachema.com/attachments/ENTERO- Rapid%2024_CZ_SK_EN_RU_PL_L.pdf
ERBA LACHEMA. ENTEROtest 16 [online]. Brno, 2018a [cit. 2022-03-24]. Dostupné z:
https://www.erbalachema.com/attachments/ENTEROtest%2016_CZ_SK_EN_RU_PL_S.
ERBA LACHEMA. ENTEROtest 24 [online]. 2018b [cit. 2022-03-24]. Dostupné z:
https://www.erbalachema.com/attachments/ENTEROtest%2024_CZ_SK_EN_RU_PL_S.
GOLDWATER, Paul N a Karl A BETTELHEIM. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Medicine [online]. 2012, 10(1) [cit. 2022-04-03]. ISSN 1741-7015. Dostupné z:
doi:10.1186/1741-7015-10-12
GREENWOOD, David, Richard C. B. SLACK a John F. PEUTHERER. Lékařská mikrobiologie: přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie. Vyd. 1., čes. Praha: Grada, 1999, s. 279-287. ISBN 80- 7169-365-0.
HARRINGTON, Susan M., Edward G. DUDLEY a James P. NATARO. Pathogenesis of enteroaggregative Escherichia coli infection. FEMS Microbiology Letters [online].
2006, 254(1), 12-18 [cit. 2022-02-13]. ISSN 03781097. Dostupné z: doi:10.1111/j.1574- 6968.2005.00005.x
HU, J. a A.G. TORRES. Enteropathogenic Escherichia coli: foe or innocent bystander?. Clinical Microbiology and Infection [online]. 2015, 21(8), 729-734 [cit.
2022-02-12]. ISSN 1198743X. Dostupné z: doi:10.1016/j.cmi.2015.01.015
