SPORULACE BACILLUS SUBTILIS

SPORULACE BACILLUS SUBTILIS

1.Buňka ⇒ 1 nebo více buněk odlišných DĚLENÍ

EXTERNÍ SIGNÁLY (pokles zdrojů výživy,

hustota populace) INTERNÍ SIGNÁLY (stádium buněčného

cyklu)

SPORULACE Signální transdukce

HLADOVĚNÍ - pokles intracelulární hladiny GTP (inhibice GTP biosynthesy = sporulace i v prostředí bohatém živinami

HUSTOTA - sporulace pouze při vysoké hustotě buněk

feromon-like faktor (peptidy) - akumulace v husté kultuře B.CYKLUS - ?

NESPORULUJÍCÍ MUTANTY ⇒ geny Spo0 (A,B,E,F,H,J,K …)

- Exprimují se při normálním růstu buněk ⇒ role v detekci signálů a regulaci přechodu vegetativní růst ⇒ sporulace

- Spo0A = transkripční faktor

“Terminální buňka”

⇒ LYSE

“Zárodečná buňka”

⇒ DALŠÍ VÝVOJ

- >500 genů (1/10 genů) = časová a místní regulace genové exprese - 5 sigma (σ) faktorů RNA polymeras + 4 DNA vazebné proteiny - cot geny = kódují polypeptidy komponent obalu spory - synt MB - ssp geny = malé proteiny uvnitř spóry (SASP) - synt PRE-SPORA

⇒ některé vazba na genom = resistence k UV - Oddělené kompartmenty

- Kompletní genomy - Rozdílná exprese

(koordinace)

Mateřská buňka (MB)

Forespore

(FS, “pre-spora”)

0 - I

II

III.

V - VI IV VII

SPORULACE BACILLUS

SUBTILIS

IV 6-8 hod Tvorba

axiálního filamenta

Tvorba

septa σ

σ

σ

σ

????

⇒ ROZHODOVÁNÍ B.CYKLUS SPORULACE

⇒ KOMUNIKACE OBOU KOMPARTMENTU BĚHEM VÝVOJE

⇒ JAK ASYMETRICKÉ DĚLENÍ OVLIVNÍ OSUD OBOU KOMPARTMENTU = MB x FS

⇒ ASYMETRICKÉ BUNĚČNÉ DĚLENÍ

⇒ ŘÍZENÍ GENOVÉ EXPRESE V ZÁVISLOSTI NA MORFOGENESI = “TIMING”

Richard Losick (Harvard University)

REGULACE úroveň transkripce

úroveň post-translační

2 KOMPONENTOVÝ REGULAČNÍ SYSTÉM

⇒ signální transdukce ⇒ regulace genové exprese a chování buněk jako odpověď na změny externích podmínek

A) SENSOR

membránový

N C

Přenos signálu Registrace

signálu

vnitrobuněčný

N C

Často transkripční faktor Konservativní doména na C-konci

200 - 250 AK

B) REGULÁTOR

N C Detekce

signálu

Funkce

Konservativní doména na N-konci 120 AK

Přenos fosfátu

Často histidine protein kinasa - autofosforylace na His

PŔÍKLADY:

- Sporulace - Chemotaxe

- Exprese porinů etc.

SPORULACE X DALŚÍ SYSTÉMY Kaskáda fosforylací

mezi PK a transkripčním faktorem

Regulátor - přímá fosforylace protein kinasou

SPORULACE BACILLUS SUBTILIS

kinA mutanta - redukce sporulace na 10 %

⇒ další protein kinasa - KinB kinA,kinB mutanta - nesporuluje

⇒ možná substituce protein kinas

A) SENSOR = KinA B) REGULATOR = Spo0A

KinA + ATP ⇔ KinA~ P + ADP KinA~ P + Spo0F ⇔ KinA + Spo0F~ P Spo0F~ P + Spo0B ⇔ Spo0F + Spo0B~ P Spo0B~ P + Spo0A ⇔ Spo0B + Spo0A~ P

Geny Spo0F, Spo0B, Spo0A - Není amplifikace signálu - V každém kroku lze ovlivnit

- Exprimují se při normálním růstu buněk KinA = ? Integrace signálu množství živin a

signálu buněčného cyklu

= 3 PAS domény - ? Sensing energie buňky a redox stavu

- inhibice jako odpověď na DNA poškození nebo blok DNA replikace

SIGNÁL

TRANSKRIPČNÍ FAKTOR V nesporulujících buňkách, basální hladina exprese

Fosforylace ⇒ transkripce > 500 genů

KinA~ P

KinB~ P

Spo0F

Spo0F~ P

Spo0B

Spo0B~ P

Spo0A

Spo0A~ P KinA

KinB

Signály

Spo0E

Spo0E = Inhibitor iniciace sporulace (specifická fosfatasa, defosforylace Spo0A~ P) - mutace ⇒ zvýšená sporulace

- overexprese ⇒ inhibice sporulace

- některé nonsense mutace ⇒ inhibice sporulace ⇒ C-konec - detekce signálu N-konec - inhibice ⇒ krátké fragmenty mohou inhibovat

Rap1 = fosfatasa ⇒ defosforylace Spo0F~ P

Cell density signály (sekretované peptidy – processing – import jako pentapeptidy zpět do buněk ⇒ inhibice fosfatas)

Rap1

HLADOVĚNÍ

? Pokles GTP ⇒ ? Aktivace protein kinasy nebo vliv na Obg

⇒ GTP váže CodY protein (represor sporulace), snížení GTP vede k ztrátě represorové aktivity

Obg gen = GTP-binding protein (esenciální, GTP vazebná doména homologní s RAS)

⇒ ? Detekce hladiny GTP nebo signálů buněčného cyklu

⇒ regulace aktivity Spo0B

Obg

Signály - ? GTP + další kinásy KinC,D,E

branched chain fatty acid

branched chain keto acid

xanthosine monophosphate inosine

monophosphate

Limitace aminokyselin

Vazba nenabitých tRNA na ribosom

ribosome-bound enzyme aktivace

GTP-binding protein, represor Bacillus subtilis dipeptide (dppABCDE) operonu Snížení množství GTP

Sporulace IMP dehydrogenase

Represor CodY = má 2 ko-represory (GTP, Ile),

= snížení každého z nich – částečná dereprese

stimulace CodY vazby na DNA - Tvoří 90 %

membránových mastných kyselin

KinA~ P

KinB~ P

Spo0F

Spo0F~ P

Spo0B

Spo0B~ P

Spo0A

Spo0A~ P KinA

KinB Signály

Signály

Spo0K operon = transportní systém = receptor CSF signálního polypeptidu - podobný permease polypeptidů u Salmonella),

- substrate binding protein (povrch buňky) - 2 membránové proteiny (přenos substrátu) - 2 ATPasy (ATP hydrolysa, energie)

- nadprodukce KinA ⇒ částečná substituce Spo0K systému ⇒ ? Aktivace protein kinasy po detekci nebo transportu oligopeptidu

Spo0K Oligopeptid

signál

Signály

Spo0E

Obg

Signály - ? GTP

AKTIVACE/REPRESE TRANSKRIPCE

Spo0A transkripční faktor

- Spo0A~ P akumulace ⇒ aktivace alespoň 500 genů ⇒ přepnutí ze symetrického na polární dělení (SpoIIE, SpoIIA, SpoIIG)

- nutné udržení určité hladiny i po iniciaci sporulace - autoaktivace exprese

+ další kinásy KinC,D,E

Cell density signály (sekretované peptidy – processing – import jako pentapeptidy zpět do buněk ⇒ inhibice fosfatas)

Rap1

sigH

– σ

Spo0A~ P – nepřímý regulátor sigH (represe represoru AbrB)

- Řídí transkripci spoIIAA-spoIIAB-sigF operonu – kóduje

σ

Funguje ve vegetativních buňkách

0 - I SYMETRICKÉ DĚLENÍ POLÁRNÍ DĚLENÍ

- vegetativní buňky - FtsZ (tvorba septa v

místě FtsZ assembly) - Min systém

- sporulace

⇒ nukleoidy spojené axiálním filamentem (stadium I)

⇒ FtsZ ring - změna posice z centra do oblasti obou pólů - pod kontrolou Spo0A~P (? jaké geny)

⇒ septum v jednom z polárních “rings” FtsZ - kontrola sporulačním

σ

⇒ oba póly jsou místem, kde může septum vzniknout - mutanty v

σ

⇒ nukleoid - translokace do pre-spory (přes septum) SpoIIIE = podobný proteinu pro přenos konjugativních

plasmidů Streptomycet

spoIIIE mutanty - 30 % nukleoidu z oblasti ori -

“chyceno” v prespoře (? CEN-like oblast) Spo0J = ? Vazba ori k pólu (spo0J / spoIIIE mutanta

není “chycena”

Chromosome SpoIIIE

oriC DivIVA PLR

Spo0J

Vegetativní buňky - FtsZ v centru

Iniciace sporulace ⇒ FtsZ zmizí z centra a objeví se v krajových posicích ⇒ vyžaduje Spo0A~P

⇒ FtsZ tvoří spiralovitou strukturu - posun k pólum, stejná struktura FtsA-GFP a EzrA- GFP (proteiny vážící FtsZ)

centrální ring polární ring

FtsZ -GFP

⇒ “Reverse”sporulace přidáním živin ⇒ opět spirály - posun směrem k centru

⇒ Tvorba spirály závislá na FtsA a na

σ

FtsZ chromatin

DivIVA RacA

Soj

SpoIIIE SpoIIIE

Relokalizace z pólu na pól

exprese

FtsZ - degradace

Stádium II ⇒ asymetrické kompartmenty

Mateřská buňka (MB)

Forespore

(FS, “pre-spora”)

σ

TRANSKRIPČNÍ FAKTOR σ

⇒ PRE-SPORA

⇒ σ

σ

:

- přítomen před sporulací (imunofluorescence)

- po septaci v obou kompartmentech (i v mateřské buňce - imunofluorescence) ⇒ jeho produkce začíná PŘED septací

- v některých mutantách je aktivní před septací a v mutantě s 2 pólovými kompartmenty je aktivní v obou Regulace AKTIVITY

σ

Proteiny: SpoIIE SpoIIAB SpoIIAA

Syntetisovány před septací

SpoIIAB: anti-

σ

σ

σ

PK - fosforylace Ser

SpoIIAA: anti- anti-

σ

σ

σ

- fosforylace prostřednictvím SpoIIAB ⇒ ruší schopnost SpoIIAA vázat SpoIIAB

SpoIIAB: vazebné místo pro adenosinové nukleotidy ⇒ ovlivnění relativní afinity SpoIIAB pro alternativní vazebné partnery (

σ

ATP ⇒ stimulace tvorby komplexu SpoIIAB -

σ

ADP ⇒ stimulace tvorby komplexu SpoIIAB - SpoIIAA

SpoIIE: specifická Ser fosfatasa, defosforyluje (aktivuje) SpoIIAA

SpoIIAA

SpoIIAA ~ P

SpoIIE SpoIIAB

SpoIIAB -

σ

σ

SpoIIAB - SpoIIAA

σ

fosforylace defosforylace

“inaktivní”

“aktivní”

(ATP)

(ADP)

“inaktivní” “inaktivní”

“aktivní”

“aktivní”

? Důležitým regulačním faktorem je pokles hladiny ATP : ADP v malém kompartmentu prespory

⇒ Preferenční vazba SpoIIAB - SpoIIAA (ADP)

SpoIIE: integrální membránový protein, C-doména má fosfatasovou aktivitu Lokalisace:

⇒ před septací - v obou místech potenciálního polárního dělení (závislá na FtsZ)

⇒ po tvorbě polárního septa - zmizí z druhého pólu, zůstává v septu

⇒ aktivace

σ

⇒ v době septace - v místě mezi oběma kompartmenty

Prespóra = 5 - 7 x menší než mateřská buňka ⇒ koncentrace nefosforylovaného SpoIIAA vyšší v PRESPOŘE

⇒ SpoIIAA - uvolní

σ

σ

Nadprodukce SpoIIE ⇒ zvýšená defosforylace SpoIIAA ~ P ⇒ předčasná aktivace

σ

+ Další role SpoIIE - mutanty - aberantní septum, tenčí vrstva peptidoglykanu - zpoždění septace

- Jak je určena subcelulární lokalisace SpoIIE

- Role ADP:ATP etc...

??

σ ^F

IIAB-IIAA IIAB - σ

IIAA ~ P

ATP

ADP

?

MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA

IIE

TRANSKRIPČNÍ FAKTOR σ

⇒ MATEŘSKÁ BUŇKA

⇒

σ

σ

⇒

σ

⇒

σ

⇒

⇒

σ

⇒ Regulace “processingu” časová (po septaci) i místní (mateřská buňka) Úprava pro-

σ

⇒ σ

σ

⇒

σ

σ

SpoIIR

⇒

⇒

⇒

⇒

⇒

spoIIR spoIIR SpoIIGA

pro-

σ

σ

⇒ ? další mechanismy (? Blok aktivity

σ

σ

Hlavní funkce SpoIIR:

⇒ koordinace vývoje mateřské buňky a prespory

??

Kooperace mateřské buňky a prespory ⇒ MORFOLOGICKÉ ZMĚNY:

⇒ Konverse post-septačního sporangia

⇒ Vznik struktury “buňka v buňce” = STÁDIUM III

⇒ Degradace peptidoglykanu septa (od centra)

⇒ “vychlípení” kompartmentu přespory do mateřské buňky (vyšší osmolarita prespory)

⇒ “migrace” cytoplasmatické membrány mateřské buňky ⇒ fuse ⇒ uzavření PRESPORY - dvojitá membrána

⇒ kontrola

σ

σ

σ

σ

“ENGULFMENT” (POHLCENÍ) = “Fagocytosa-like proces

III. σ

KONTROLA MATEŘSKOU BUŇKOU

⇒ na úrovni transkripce

⇒ na úrovni aktivace (i když je SpoIIIG pod kontrolou jiného promotoru, není

σ

aktivní bez

σ

σ

sekrečního systému.

SpoIIIAH interaguje s SpoIIQ prespory – pravděpodobně tvoří kanál mezi prespórou a mateřskou buňkou

? Co transportuje (?regulační protein/y, malé metabolity, živiny, důležitý i v pozdějších stádiích)

⇒ KOORDINACE ČASOVÉHO VÝVOJE

GENOVÉ EXPRESE V PRESPOŘE + KONTROLA MATEŘSKOU BUŇKOU

σ

⇒ autoaktivace vlastní exprese ⇒ zvýšení hladiny - Po ukončení “engulfment” ⇒ stádium III

-

σ

⇒ závislá na přítomnosti

σ

⇒ mateřská buňka generuje signál nutný pro expresi SpoIIIG

σ

REGULACE GENOVÉ EXPRESE V MATEŘSKÉ BUŇCE - KASKÁDA

σ

SpoIIID spolu se

σ

σ

buňka) ⇒

σ

σ

σ

GerE spolu se

σ

MATEŘSKÁ BUŇKA: 2 sigma faktory (

σ

σ

MATEŘSKÁ BUŇKA

SpoIVB SpoIVB pro-

σ

σ

SpoIVFB

SpoIVB ⇒ aktivace membránově vázané metaloproteasy

SpoIVFB, aktivita modulovaná

dvěma membránovými proteiny mateřské buňky SpoIVFA a BofA

⇒ SYNCHRONISACE VÝVOJE OBOU KOMPARTMENTU

⇒ exprese

σ

σ

σ

⇒ Syntetisován jako pro-

σ

⇒ Aktivace (processing) blokován mutací v SpoIIIG (

σ

ZPĚTNÁ SIGNALISACE Z PRESPORY DO MATEŘSKÉ BUŇKY

III.

σ

IV

σ

⇒ Aktivace vyžaduje účinek produktu(ů) genu(ů) aktivovaných

σ

⇒ Role produktu genu SpoIVB ⇒ lokalisace na membráně prespory

σ

MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA SpoIVCA

48kbp

SpoIVCA SigK

pro-

σ

“Skin” element (48 kbp) ⇒ obsahuje gen SpoIVCA

⇒ je aktivován SpoIIID -

σ

⇒ kóduje místně specifickou rekombinasu - vyštěpí “skin” element (specifická

sekvence 5 bp)

⇒ spojení SigK genu (pro-

σ

“Skin” element

⇒ homologie s genomem bakteriofága PBSX ⇒ asi kryptický profág

⇒ využit buňkou

X Umělé odstranění “skin” elementu nepoškozuje sporulaci ⇒ další hladiny regulace

Další hladiny regulace

σ

⇒ regulace exprese SigK = kombinovaná akce SpoIIID -

σ

⇒ aktivace odštěpením pro-sekvence

⇒ positivní “feedback” = autoaktivace exprese

Exprese cot genů (obaly spóry)

MATEŘSKÁ BUŇKA PRESPORA

Septum/

obal prespory

σ

σ

Spo0A~ P

POLÁRNÍ DĚLENÍ

SpoIIE σ

σ

pro

σ

σ

σ

pro

σ

SpoIIGA-SpoIIR proteolýza

SpoIIIA kanál

SpoIVFB-SpoIVB proteolýza

cot ssp

?

FM4-64 - membrána

FM4-64 - membrána

FM4-64 - membrána

FM4-64 - membrána

gerE-GFP (σ^G) spoIIQ-GFP (σ^F)

spoIID-GFP (σ^E)

sspA-GFP (σ^K)

Membrána prespóry není dostupná pro lipofilní FM4-64 (engulfment)

LABORATORNÍ KMENY, INDIVIDUÁLNÍ BUŇKY

“DIVOKÉ KMENY” ISOLOVANÉ Z PŘÍRODY

X

Branda et al., (2001), Fruiting body formation by Bacillus subtilis, PNAS 98: 11621–11626

Laboratorní kmen “Divoký” kmen “Divoký” kmen = u okraje kolonie

100 μm

10 μm 10 μm

“Divoký” kmen = SEM

Fuse:

- lacZ genu + sspE (exprese v pozdějších fázích sporulace, prespora) - lacZ genu + spoIID

Podobně u dalších mikroorganismů - Streptomyces, Myxobacteria etc...

“Vzdušné” (aerial) struktury na koloniích ⇒ lokalisace exprese ⇒ lokalisace sporulace

⇒ MÍSTNÍ LOKALISACE DIFERENCIACE UVNITŔ MNOHOBUNĚČNÉ STRUKTURY

50 μm

REGULACE LOKALISACE SPORULACE ? Analysa mutant”

- v genech Spo0A, Spo0H (

σ

σ

- v genech YveQ and YveR = transkripce pod kontrolou Spo0A a

σ

- mutanta sfp = nemá phosphopantetheinyltransferasu, která je důležitá pro produkci surfactinu (surfactants důležité pro tvorbu vzdušných struktur - snížení povrchové

“smáčivosti”)

Spo0A, Spo0H (

σ

0.5 μm

Změny ve vnitrobuněčné koncentraci Spo0A-P regulují odlišnou genovou expresi v různých buňkách

Vysoká hladina Spo0A-P Nižší hladina

Spo0A-P

Transkripční represor, konstitutivní

Studium diferenciace

Diferenciace v kolonii/biofilmu

Okraj kolonie

E.coli P. aeruginosa B. subtilis

DOMESTIKACE = Obecná vlastnost mikroorganismů

?

B. subtilis

Aguilar et al., Curr Opin Microbiol. 10: 638–643, 2007

Veening et. al, .J Bacteriol.188, 3099–3109, 2006

Kanibalismus Bacillus subtilis

Stress – indukce záchranného programu, např. sporulace - spóry přežijí Spo0A – aktivován pouze v cca ½ buněk populace při hladovění (závisí na podmínkách)

– směsná populace buněk (Spo0A-ON) a buněk (Spo0A-OFF) – základem pro „kanibalismus“

Ochrana Spo0A-ON buněk před zabitím – skfA-H nese geny pro proteiny exportující peptidový killing faktor. SdpC proteinový toxin – stimuluje sousední operon SdpRI – SdpI imunitní protein pouze v Spo0A-ON buňkách

Spo0A-ON buňky: zapnutí transkripce operonů skfA-H a sdpABC – produkce a export peptidového faktoru Skf podobného antibiotiku (cyklický 26 AK peptid) + proteinového toxinu SdpC – zabijí

Spo0A-OFF buňky

Spo0A-ON

Spo0A-OFF

Živiny ze zabitých buněk zpomalí

sporulaci, resp. průchod Spo0-ON buněk

stádiem, kdy je nastartován

irreversibilní program - Oddálí se „rozhodnutí“

42 AA peptid Skf

Sporulation killing factor

Sdp

Sporulation delay protein

Kanibalismus Bacillus subtilis v kolonii/biofilmu

- Spo0A-ON buňky, které kanibalizují (produkuji toxiny a jsou resistentní), zároveň produkují ECM - Živiny z lysovaných buněk podporují tvorbu ECM, zároveň oddalují sporulaci dokud se

nevytvoří struktura ve které spóry vznikají, spóry jsou pak lépe chráněny - Analogie programované buněčné smrti

- Koordinace kanibalismu a produkce ECM specifickou buněčnou subpopulací je zprostředkovaná surfactinem který funguje jako quorum sensing molekula.