Text práce (2.270Mb)

Fulltext

(1)Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta. BAKALÁŘSKÁ PRÁCE. Petra Vahalová Vliv kyslíku na dobu života tripletních stavů karotenoidů ve fotosyntetických komplexech Katedra chemické fyziky a optiky. Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D. Studijní program: Fyzika Studijní obor: Obecná fyzika. Praha 2013.

(2) Ráda bych poděkovala vedoucímu mé bakalářské práce doc. RNDr. Jakubu Pšenčíkovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady, ochotu a trpělivost. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Petro Khoroshyy za pomoc se zprovozněním optického senzoru k měření koncentrace kyslíku ve vzorcích a Prof. RNDr. Tomáši Polívkovi, Ph.D. za poskytnutí světlosběrné antény..

(3) Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů, literatury a dalších odborných zdrojů. Beru na vědomí, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona v platném znění, zejména skutečnost, že Univerzita Karlova v Praze má právo na uzavření licenční smlouvy o užití této práce jako školního díla podle §60 odst. 1 autorského zákona.. V . . . . . . . . dne . . . . . . . . . . . .. Podpis autora.

(4) Název práce: Vliv kyslíku na dobu života tripletních stavů karotenoidů ve fotosyntetických komplexech Autor: Petra Vahalová Katedra: Katedra chemické fyziky a optiky Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D., Katedra chemické fyziky a optiky Abstrakt: Cílem této práce bylo nalézt vhodnou metodu k přípravě anaerobních podmínek za účelem studia vlastních dob života tripletních stavů karotenoidů ve fotosyntetických světlosběrných komplexech. Porovnávali jsme tři metody: (1) foukání inertního plynu (dusíku) nad hladinu vzorku, (2) odstranění kyslíku pomocí chemických reakcí katalyzovaných glukózoxidázou a katalázou a (3) pomocí dithioničitanu sodného. Jednotlivé metody jsme nejprve otestovali na snadno dostupném vzorku meso-tetra(4-sulfofenyl)porfyrinu a následně aplikovali na hlavní světlosběrnou anténu obrněnky Amphidinium carterae. Doby života tripletních stavů karotenoidů ve světlosběrné anténě byly určovány buď z přímo měřených kinetik pomocí fotonásobiče, nebo z transientních absorpčních spekter naměřených v různých zpožděních od excitačního pulsu získaných pomocí zesilované CCD kamery. Vliv použitých látek na stabilitu vzorku jsme vyhodnocovali na základě měření stacionárních absorpčních spekter a měření pH indikátorovými papírky. Vyfoukávání vzorku dusíkem bylo časově náročné a méně účinné v dosažení anaerobních podmínek než zbylé dvě metody. Při aplikaci dithioničitanu sodného se nám podařilo poměrně efektivně připravit anaerobní podmínky, avšak docházelo k okyselování vzorku spojenému s negativními vlivy na stabilitu vzorku. Jako nejvhodnější ze studovaných metod se tedy jeví použití enzymů, pomocí nichž jsme během několika minut dosáhli anaerobních podmínek a zároveň nezpůsobili degradaci vzorku. Klíčová slova: Karotenoidy, doba života, zhášení kyslíkem. Title: The effect of oxygen on the triplet state lifetime of carotenoids in photosynthetic complexes Author: Petra Vahalová Department: Department of Chemical Physics and Optics Supervisor: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D., Department of Chemical Physics and Optics Abstract: The aim of this study was to find a suitable method of preparation of anaerobic conditions in order to determine intrinsic lifetimes of carotenoid triplet states in photosynthetic light-harvesting complexes. We have compared the following three methods: (1) blowing an inert gas (nitrogen) above the surface of a liquid sample, (2) removing oxygen by means of chemical reactions catalyzed by glucose oxidase and catalase and (3) use of sodium dithionite. Each method was first tested on meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine and then applied on the main light-harvesting complex of Amphidinium carterae. The lifetimes of the triplet states of carotenoids in the light-harvesting complex were determined from kinetics measured directly by a photomultiplier tube and from transient absorption spectra measured at different delays after the excitation pulse by an intensified CCD camera. The effects of the used substances on the sample stability were evaluated by measuring steady-state absorption spectra and pH. Blowing the sample with nitrogen was time-consuming and less efficient in attaining anaerobic conditions compared to the other two methods. In contrast, anaerobic conditions were obtained in a relatively short time after the application of sodium dithionite; however, it caused acidification of the sample ralated to negative effects on sample stability. The use of enzymes was evaluated as the most suitable method since anaerobic conditions were achieved within few minutes and it did not cause any degradation of the sample. Keywords: Carotenoids, lifetime, quenching by molecular oxygen.

(5) Obsah Předmluva. 3. 1 Teoretický úvod. 4. 1.1. Fotosyntéza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4. 1.2. Světlosběrné antény . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. 1.3. Pigmenty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. 1.4. Singletní a tripletní stav molekuly . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 9. 1.5. Absorpční spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 10. 1.6. Kinetiky a doba života . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 12. 2 Použitý materiál a metody 2.1. 2.2. 2.3. 15. Materiál . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15. 2.1.1. Vzorky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15. 2.1.2. Pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15. Metody přípravy anaerobního prostředí . . . . . . . . . . . . . . .. 16. 2.2.1. Bublání/foukání dusíkem . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 16. 2.2.2. Enzymy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 17. 2.2.3. Dithioničitan sodný . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 17. Měřicí přístroje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 18. 2.3.1. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 19. 2.3.2. Kalibrace sondy FOXY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20. 3 Výsledky a diskuze 3.1. 3.2. 3.3. 22. TPPS4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22. 3.1.1. Bublání/ foukání dusíkem . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22. 3.1.2. Enzymy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22. 3.1.3. DT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 23. LHCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 24. 3.2.1. Foukání dusíkem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 25. 3.2.2. Enzymy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 25. 3.2.3. DT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 27. Porovnání jednotlivých metod přípravy anaerobního prostředí ve vzorku s LHCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Závěr. 28 31. 1.

(6) Seznam použité literatury. 33. Seznam tabulek. 37. Seznam použitých zkratek. 38. 2.

(7) Předmluva Spolu s buněčným dýcháním patří fotosyntéza mezi nejdůležitější biologické procesy probíhající na Zemi. Při fotosyntéze dochází k přeměně energie slunečního záření na energii chemickou, která může být uskladněna a následně užita k uskutečnění dalších reakcí a procesů odehrávajících se v organismu. Při oxygenní fotosyntéze provozované většinou fotosyntetických organismů se jako vedlejší produkt uvolňuje kyslík, prvek nezbytný pro existenci většiny živých organismů. Jedná se o velice komplikovaný proces, avšak porozuměním jednotlivým reakcím a mechanismům se můžeme naučit mnoho nového nejen o fotosyntéze samé, ale také o dílčích procesech, které se odehrávají v přírodě i v rámci jiných dějů než jen v průběhu fotosyntézy. Z fyzikálního hlediska jsou zajímavé především primární procesy fotosyntézy, při nichž můžeme studovat různé mechanismy přenosu excitonu a elektronu, či projevy mezimolekulárních interakcí [1]. Nabyté znalosti lze využít při vývoji nových technologií založených na principech fotosyntézy, např. nových typů solárních článků. Nepostradatelnou součástí každého fotosyntetického aparátu jsou fotosyntetické pigmenty, které plní hned několik důležitých funkcí. Primární roli hrají chlorofyly, které dokáží využít z fotonů získanou excitační energii k separaci nábojů, tedy k přeměně na chemickou oxidačně-redukční energii. Nejvýznamnější úlohou dalších fotosyntetických pigmentů, karotenoidů, je ochrana fotosyntetického aparátu před vznikem reaktivního singletního kyslíku, ke kterému může dojít při populaci tripletních stavů chlorofylů. Kyslík také ovlivňuje dobu života excitovaných stavů přítomných molekul. Za aerobních podmínek dochází v důsledku srážek s molekulami kyslíku k rychlejší depopulaci tripletních stavů karotenoidů, a tudíž i ke zkrácení příslušné doby života. Cílem této práce bylo určit nejvhodnější metodu k přípravě anaerobního prostředí za účelem určování vlastních dob života karotenoidů, tedy dob, za které karotenoidy samovolně přejdou z excitovaného stavu do základního, nikoli v důsledku srážek s molekulami kyslíku.. 3.

(8) 1. Teoretický úvod 1.1. Fotosyntéza. Při fotosyntéze dochází k přeměně energie slunečního záření na energii chemickou. U eukaryotických organismů se celý proces odehrává v chloroplastech (obr. 1.1), buněčných organelách s dvojitou membránou a vlastní DNA. Vnitřní membrána vymezuje tzv. stroma, cytoplazmě podobnou tekutinu obsahující velké množství rozpuštěných enzymů, vlastní chloroplastovou DNA, RNA a ribozomy [3]. Uvnitř chloroplastu, ve stromatu, se také nachází další membránové struktury - thylakoidy, jež jsou u vyšších rostlin formovány do shluků nazývaných grana, navzájem propojených tzv. intergranálními (stromálními) thylakoidy. Dutinu obklopenou thylakoidní membránou označujeme jako lumen. V thylakoidní membráně se nachází pigment-proteinové komplexy (fotosystém I a II), cytochromové komplexy, pohyblivé přenašeče elektronů a ATP syntáza [4]. Funkční a strukturní jednotkou fotosyntetického aparátu je fotosystém (obr. 1.2) – komplex reakčního centra a systému světlosběrných antén.. Obrázek 1.1: Struktura chloroplastu [2]. Celý akt přeměny energie je rozdělen do čtyř fází: (1) absorpce fotonů a přenos excitační energie pomocí světlosběrných komplexů, (2) separace nábojů (primární přenos elektronu) v reakčním centru, (3) stabilizace rozdělených nábojů pomocí sekundárních reakcí a (4) syntéza a export stabilních produktů z chloroplastu [5]. První tři fáze se odehrávají v thylakoidních membránách. Pigment světlosběrné antény absorbuje foton, čímž dojde k jeho excitaci. Excitační energie je po4.

(9) Obrázek 1.2: Fotosystém tvořený svělosběrnou anténou (zelené molekuly) a reakčním centrem (hnědá a modré molekuly) [1]. stupně přenesena do reakčního centra, kde se využije k separaci nábojů. Energie excitovaných elektronů se tak převede na chemickou oxidačně-redukční energii. Systém se nyní nachází v nestabilním stavu, kdy může snadno dojít k rekombinaci iontů a ztrátě získané energie přeměnou na teplo. Proto je primární reakce fotosyntézy (rozdělení nábojů) následovaná sérií velmi rychlých sekundárních reakcí ústících v rozseparování oxidované a redukované formy na opačné strany thylakoidní membrány. Následně mohou proběhnout pomalejší procesy vedoucí k přeměně energie na stabilnější a snáze využitelné formy energie. Během přenosu elektronů získaných excitací chlorofylu v reakčním centru dochází k fotolýze vody 2H2 O → O2 + 4H+ + 2e− . Zatímco vzniklé protony (H+ ) a elektrony jsou dále zpracovány, molekulární kyslík se bez dalšího využití uvolňuje do atmosféry. Elektrony jsou transportovány membránou a použity k redukci NADP+ (nikotinamidadenindinukleotidfosfát) na NADPH1 . Vzniklé protony pak spolu s dalšími protony přenesenými ze stromatu do lumenu zapříčiňují vznik elektrochemického pH gradientu, který je následně využit k tvorbě makroergní sloučeniny2 adenosintrifosfátu (ATP). Finální fáze fotosyntézy se odehrává již mimo thylakoidy, ve stromatu. Využívá produkty vzniklé v předchozí fázi, NADPH a ATP, k zabudování oxidu uhličitého do organické sloučeniny sacharidového typu [5]. 1. V případě neoxygenní fotosyntézy dochází k redukci nikotinamidadenindinukleotidu bez fosfátové skupiny, tj. NAD+ na NADH. 2. Makroergní sloučeniny obsahují vazby, při jejichž hydrolytickém štěpení se uvolňuje velké množství energie [6].. 5.

(10) 1.2. Světlosběrné antény. Reakční centra fotosystémů většiny fotosyntetických organismů jsou obklopena pigment-proteinovými komplexy, jejichž úkolem je zvýšit množství zachycených fotonů, a tím i efektivitu reakce. Bez světlosběrných antén by při průměrných ozářenostech přenašeče elektronů v thylakoidní membráně po většinu času zahálely. Nepoměr mezi přísunem a využitím energie je kompenzován systémem většího počtu molekul absorbujících na různých vlnových délkách, který koncentruje excitaci do jednoho místa, reakčního centra [7]. Na okraji světlosběrných komplexů se vyskytují pigmenty absorbující na kratších vlnových délkách, zatímco s klesající vzdáleností od reakčního centra dochází k prodlužování absorbovaných vlnových délek. Dochází tak ke vzniku energetického gradientu, pomocí něhož je excitační energie z libovolného místa na anténě přenášena směrem k reakčnímu centru [5]. Dobu, během níž přejde molekula z excitovaného stavu do základního, chrakterizujeme veličinou zvanou doba života příslušného stavu. U pigmentů světlosběrných antén dochází k přechodu mezi energetickými hladinami nejčastěji v důsledku přenosu excitační energie z jedné molekuly barviva na druhou. Pokud se přenos energie neuskuteční, dochází k populaci tripletních stavů mezisystémovým přechodem, k vyzáření přebytečné energie při fluorescenci nebo jejímu rozptýlení ve formě tepelných vibrací [7].. 1.3. Pigmenty. Pigment (barvivo) je označení pro chemickou látku způsobující změnu barvy odraženého nebo prošlého světla založenou na selektivní absorpci světla [8]. Jedná se o molekuly se systémem konjugovaných dvojných vazeb3 , který umožňuje volný pohyb π-elektronů. Delokalizace π-elektronů má za následek snížení energie molekuly a tím i její stabilizaci. Dochází nejen ke snížení energie základního stavu, ale i hladin excitovaných stavů, což molekule umožňuje absorbovat při delších vlnových délkách. Často tak dochází k posuvu absorpce do viditelné části spektra [9]. Pigmenty mají ve fotosyntetických ústrojích tři základní role: 1. Světlosběrné komplexy tvořené soustavou molekul barviv se starají o ab3. V systému konjugovaných dvojných vazeb se pravidelně střídají jedna jednoduchá a jedna dvojná vazba.. 6.

(11) sorpci fotonů a následný přenos excitační energie do reakčního centra. Podle zastoupení jednotlivých pigmentů rozlišujeme antény převážně (bakterio)chlorofylové, převážně xantofylové a výhradně fykobilinové [7]. 2. V reakčním centru je excitační energie elektronů přenesena na speciální pigmentový dimer (chlorofyl a, bakteriochlorofyly a a b). Ten se po excitaci stává silným redukčním činidlem, rychle ztrácí elektron, který je následně přijat blízkým akceptorem elektronů. Dochází tak k separaci nábojů a výsledné přeměně energie slunečního záření na energii chemickou. 3. S malou, avšak nezanedbatelnou pravděpodobností může dojít k tripletní excitaci chlorofylu, kdy elektron při přechodu mezi hladinami změní svůj spin. Tripletní excitace má oproti standardní singletní excitaci chlorofylu poměrně dlouhou dobu života (řádově 10−3 s oproti 10−9 s příslušejícím singletní excitaci), během níž může dojít ke srážce s molekulou kyslíku. V základním stavu se kyslík vyskytuje jako dvouatomová molekula s tripletní konfigurací elektronů. Přenosem energie z tripletních stavů chlorofylu se však dostává do velmi reaktivního singletního stavu a oxiduje bílkoviny i pigmenty fotosyntetického aparátu. V blízkosti téměř každého chlorofylu se proto vyskytuje nějaký karoten (reakční centrum) či xantofyl (světlosběrné antény), který přejímá tripletní excitaci chlorofylů a přeměňuje ji na teplo [7]. Ochranná role karotenoidů však nespočívá pouze v ochraně fotosyntetického aparátu před nežádoucí tripletní excitací chlorofylů, ale i v ochraně před nadměrnou excitací při vysokých ozářenostech, či v přímém zhášení singletního kyslíku. Nejdůležitějšími fotosyntetickými pigmenty jsou chlorofyly. Chemicky se řadí mezi porfyriny obsahující hořčíkový iont (obr. 1.3). Jsou známy chlorofyly a až f a příbuzné bakteriochlorofyly (vyskytující se v bakteriích mimo sinic) a až g [10, 11]. Vyznačují se dvěma hlavními absorpčními pásy, ve fialové (modré) a červené části spektra. V závislosti na typu chlorofylu a použitého rozpouštědla dochází k mírnému posunu hlavních absorpčních píků ve vymezených oblastech. Absorpce na vlnových délkách odpovídajících zelené části spektra je prakticky nulová, proto se chlorofyly jeví zelené. V kyselém prostředí dochází k uvolnění hořčíkového iontu, a tak k přeměně na feofytin. Dalšími významnými pigmenty jsou karotenoidy. Chemicky se jedná o tetraterpenoidy s velkou variabilitou ve struktuře molekul i spektrálních vlastnostech, 7.

(12) Obrázek 1.3: Strukturní vzorec chlorofylu a, b, d [10]. např. na obrázku 1.4 je vyobrazen strukturní vzorec peridininu. V dnešní době je známo více než 500 různých karotenoidů [7] rozčleněných do dvou skupin dle svého chemického složení. Uhlovodíkové formy se nazývají karoteny, jejich kyslíkaté deriváty pak xantofyly. Na rozdíl od chlorofylů není výskyt karotenoidů omezen pouze na fotosystém, např. β-karoten se vyskytuje v mnoha různých druzích ovoce a zeleniny. Absorpční vlnové délky karotenoidů se pohybují přibližně v rozmezí 400–550 nm. Jejich absorpční spektra bývají poměrně jednoduchá, nejčastěji se třemi maximy [13]. Při fotosyntéze plní hned několik funkcí. Podílejí se na zachycování fotonů i jejich následném přenosu do reakčního centra. Neoxantin a lutein udržují strukturální integritu a pevnost vnějších a vnitřních světlosběrných antén [13]. Nejvýznamnější rolí karotenoidů ve fotosyntéze je však jejich ochranná funkce – zhášejí tripletní stavy chlorofylů a vysoce reaktivní singletní kyslík a v rámci xantofylového cyklu regulují množství energie přicházející do reakčního centra při nadměrném ozáření.. Obrázek 1.4: Strukturní vzorec peridininu [12].. 8.

(13) 1.4. Singletní a tripletní stav molekuly. Dle Pauliho vylučovacího principu se žádné dva nerozlišitelné fermiony4 nemohou vyskytovat ve stejném kvantovém stavu, tj. nemohou mít shodná všechna čtyři kvantová čísla. V základním stavu S0 tedy mohou být pouze elektrony s opačným spinem ( √12 (↑↓ − ↓↑)). Jejich působení se navzájem kompenzuje, a tudíž celkové spinové kvantové číslo molekuly S je rovno 0. Takový stav molekuly označujeme jako singletní. Nedojde-li během excitace ke změně S, označujeme vzniklé excitované singletní stavy S1 , S2 , atd. Po excitaci již nejsou elektrony spárované, může tedy dojít k převrácení spinu a změně S na 1. V takovém případě existují tři možné projekce spinu do osy z, kterých lze docílit kombinacemi ↑↑, ↓↓ a. √1 2. (↑↓ + ↓↑). Daný stav molekuly pak nazýváme tripletním. Těchto stavů. může být opět celá řada, stav s nejnižší energií je označován jako T1 [14]. Tripletní stavy mají ve srovnání s příslušnými singletními stavy nižší energii, a to v důsledku energeticky výhodnější korelace pohybu záporných nábojů obou nespárovaných elektronů [9]. V důsledku vibračních pohybů molekuly můžeme u jednotlivých elektronových stavů pozorovat sérii vibračních hladin. Za standardních podmínek a tepelné rovnováhy se většina molekul nachází ve stavu S0 s elektrony na základní vibrační hladině. Po absorpci fotonu dojde k excitaci molekuly, která se snaží co nejrychleji dostat zpět do základního stavu, tj. stavu s nejnižší energií. Získanou energii předává svému okolí během tzv. nezářivých přechodů (vnitřní konverze, mezisystémový přechod) následovaných vibrační relaxací. Až přechod ze základní vibrační hladiny prvního excitovaného stavu S1 nebo nejnižšího tripletního stavu T1 do základního stavu S0 bývá pomalejší a může být spojen s vyzářením (emisí) fotonu [14]. Při stejné multiplicitě obou stavů nazýváme zářivý přechod fluorescencí, při rozdílné multiplicitě fosforescencí. Mezisystémový přechod z T1 do S0 je sice spinovými výběrovými pravidly zakázán, avšak docházet k němu může v důsledku spin-spinových a spin-orbitálních interakcí. Kvantový výtěžek (typicky 10−5 ) je však o tři řády nižší než u fluorescence (10−2 ) a charakteristická doba života delší (10−6 –10−3 s) ve srovnání s typickými časy pro fluorescenci (10−9 –10−8 s) [9]. I přechody mezi stavy o stejné multiplicitě mohou být zakázané, a to např. v důsledku orbitálních výběrových pravidel [9]. Například u karotenoidů můžeme pozorovat jen velice slabou fluorescenci v důsledku zakázanosti S1 stavu a jeho 4. Částice s poločíselným spinem, např. elektrony, protony, neutrony.. 9.

(14) krátké doby života (∼ 10 ps pro β-karoten), jež je způsobena účinnou vnitřní relaxací. Krátká doba života S1 má také za následek, že tripletní stav karotenoidů nelze populovat přímo pomocí mezisystémového přechodu, nýbrž energie musí být přenesena z nějakého sensitizéru (např. chlorofyl) pomocí triplet-triplentího přechodu. Zářivé přechody se většinou odehrávají až z nejnižších vibračních hladin nejnižších excitovaných stavů, u některých karotenoidů však byla zaznamenána slabá fluorescence i z velmi krátce žijícího stavu S2 [15].. 1.5. Absorpční spektroskopie. Absorpcí fotonu dojde v molekule k elektronovým a vibračním přechodům mezi energetickými hladinami. Míra excitace molekuly závisí na dané molekule a na vlnové délce (energii) absorbovaného světla. Absorpční spektrum, tedy množství absorbovaného světla v závislosti na vlnové délce, je charakteristické pro jednotlivé pigmenty a pigment-proteinové komplexy [16]. Bezrozměrná veličina udávající množství světla určité vlnové délky prošlého měřeným vzorkem se označuje jako transmitance T (λ) a je definována jako podíl intenzity světla, které prošlo vzorkem, a intenzity světla, které do vzorku vstoupilo: T =. I(λ) . I0 (λ). V praxi se však. místo intenzity dopadajícího záření měří intenzita světla prošlého referenčním vzorkem, tj. roztokem obsahujícím všechny složky vyjma stanovované barevné látky. Nemusíme se pak zabývat nespecifickými ztrátami intenzity světla způsobenými např. absorpcí a odrazem světla na stěnách kyvety a v optice fotometru [17]. Množství světla pohlceného měřeným vzorkem popisuje veličina nazývaná absorbance A(λ). Je definována jako záporně vzatá hodnota dekadického logaritmu transmitance, lze ji však také zapsat pomocí Lambert-Beerova zákona: I(λ) A(λ) = −logT (λ) = −log = ε(λ) · c · d , I0 (λ). (1.1). kde c označuje koncentraci látky, d tloušťku absorbující vrstvy (optickou délku kyvety) a ε(λ) nazýváme molárním absorpčním (extinkčním) koeficientem. Jeho hodnota závisí na vlnové délce absorbovaného světla a na typu pigmentu [16]. Absorbance je aditivní veličina, tj. množství pohlceného světla jednotlivými pigmenty ve směsi se sčítá. Absorbance látky při dané vlnové délce λ na jednotku vzdálenosti je označována jako optická hustota, značí se OD (optical density) [18]. Aλ 1 ODλ = = − log l l 10. . I I0. .

(15) Stacionární absorpční spektra se měří pomocí spektrometrů a lze z nich určit energii (z polohy pásů na x-ové ose) a pravděpodobnost (z intenzity absorpčních pásů) přechodu. Chceme-li sledovat vývoj spektra v čase, musíme užít sofistikovanější metody i aparaturu. Výsledný trojrozměrný graf lze získat proměřováním transientních absorpčních spekter v různých časech, nebo měřením závislosti změn intenzity absorbovaného světla na čase při daných vlnových délkách. Měření kinetik na dané vlnové délce představuje poměrně rychlou metodu umožňující přímo získat křivku dohasínání. Avšak v uspořádání používaném v této práci dává data s horším poměrem signálu k šumu než aparatura na měření transientních spekter, která je založena na metodě excitace a sondování. Studovaný systém je nejprve vyveden z rovnováhy krátkým silným pulsem (nejčastěji laserem), načež pomocí jiného, slabšího světelného zdroje zjišťujeme (sondujeme) intenzitu světla prošlého vzorkem v daných zpožděních po excitačním pulsu. Měřicí světlo se používá slabší než světlo excitační, aby změny jím vyvolané byly zanedbatelné vůči excitaci způsobené počátečním excitačním pulsem. Pro každé zpoždění se provede N (např. N = 1000) měření, přičemž jen každé druhé je s excitačním pulsem. Porovnáním spektra bez excitace A0 (λ) a v určitém čase t po excitačním pulsu At (λ) získáme tzv. transientní (rozdílové) spektrum ∆At (λ) = At (λ)−A0 (λ). Zprůměrováním jednotlivých měření se pak zlepší poměr signálu vůči šumu pozadí. Také měřicí světlo podléhá jistým výkyvům. Jejich vliv lze redukovat, budeme-li měřit v tzv. dvoupaprskovém uspořádání, kdy signál IS z měřeného vzorku porovnáváme s referencí IR (např. destilovaná voda). ∆At (λ) = At (λ)–A0 (λ) = −log(Tt (λ)) + log(T0 (λ)) = IS0 (λ) ISt (λ) = log − log IR0 (λ) IRt (λ) Ve výsledném transientním spektru můžeme pozorovat kladné i záporné příspěvky. Změny absorpce jsou způsobeny rozdílnou obsazeností základního a excitovaných stavů vzorku před a po excitaci. Například porfyriny mají významnou absorpci ve fialové části spektra, v transientním spektru se úbytek elektronů v základním stavu po excitaci projeví záporným signálem v dané oblasti vlnových délek. Dochází k tzv. vybělování (photobleaching). Naopak vyšší populovanost excitovaných stavů má za následek nárůst absorpce na jiných vlnových délkách (u porfyrinů v modré části spektra), což se v transientním spektru projeví kladným signálem. Nejvýznamnější kladný příspěvek pochází z triplet-tripletní absorpce relativně dlouho žijících tripletních stavů. V časech blízkých excitačnímu pulsu můžeme ve spektru pozorovat ještě silný signál patřící fluorescenci. Emitované fotony zvyšují intenzitu prošlého světla. Nárůst transmise odpovídá 11.

(16) poklesu absorpce a tedy zápornému signálu v transientním absorpčním spektru. Časové rozlišení aparatury je dáno kombinací délky excitačního pulsu (čím kratší puls, tím větší rozlišení) a buď délkou měřícího pulsu, nebo rychlostí detekce (délka detekčního okna). První možnost se využívá ke studiu procesů v řádech fs–ps, druhá pak pro rozlišení na škále ns–ms. Metoda využívající uspořádání s rychlým (ns–µs) detektorem bývá označována jako triplet-mínus-singletní spektroskopie.. 1.6. Kinetiky a doba života. Spontánní relaxace molekuly z excitovaného stavu do základního a mnoho dalších kinetických procesů ve fotosyntetických systémech odpovídá kinetice prvního řádu d[B] = k1 [B] , dt kde v značí reakční rychlost, [B] koncentraci výchozí látky B a k1 rychlostní v=−. konstantu prvního řádu pro danou reakci [5]. Integrací rovnice dostaneme průběh změny koncentrace látky B v čase [B]t = [B]0 e−k1 t , kde [B]0 značí počáteční koncentraci látky B. Jelikož z Lambert-Beerova zákona (1.1) víme, že absorbance je přímo úměrná koncentraci látky, můžeme psát t. Aλ (t) = Aλ (0) · e− τ , kde převrácená hodnota rychlostní konstanty k1 odpovídá době života τ příslušného stavu. Pro transientní absorpci dochází k posunu nulové hodnoty na y-ové ose t. ∆Aλ (t) = Aλ (0) · e− τ − Aλ (0) . Vybereme-li tedy z naměřeného souboru transientních absorpčních spekter pro různá zpoždění data pro jednu vlnovou délku, můžeme jejich fitováním získat dobu života příslušného stavu. Máme-li k dispozici pouze časový průběh intenzity světla prošlého vzorkem I(t), nemusíme kvůli určení doby života naměřené hodnoty přepočítávat na absorbanci. Lze ukázat, že za předpokladu malé změny intenzity signálu ∆I při průchodu vzorkem bychom přímým fitováním naměřených hodnot a hodnot přepočtených na absorbanci dostali stejný výsledek.. 12.

(17) Uvažujme poměr změny intenzity signálu ∆I = I(t) − I(0) vůči intezitě I(0) v čase t = 0. Přenásobíme-li čitatel i jmenovatel převrácenou hodnotou intenzity světla prošlého referencí IR , dostaneme transmitanci. Dosadíme z definice absorbance (1.1) a výraz upravíme. Pro malé změny absorbance ∆A lze použít Taylorův rozvoj a zanedbat členy vyššího než prvního stupně. Dostáváme, že změna absorbance ∆A je přímo úměrná změně intenzity signálu ∆I. Za předpokladu malých změn intenzity signálu tedy lze naměřené závislosti I(t) fitovat přímo, bez nutnosti přepočtu na absorbanci. ∆I I(t) − I(0) = = I(0) I(0). I(t) IR. −. I(0) IR. I(0) IR. =. T (t) − T (0) e−A(t) − e−A(0) = = e−∆A − 1 = T (0) e−A(0). = (1 − ∆A) − 1 = −∆A Dochází-li k rozpadu látky A na n (n > 1) produktů, můžeme proces popsat n kinetikami prvního řádu. Finální výtěžek jednotlivých produktů Xi můžeme určit jako poměr výsledné koncetrace produktu [Bi ]∞ po ustanovení rovnováhy (t → ∞) a koncentrace výchozí látky [A]0 na počátku reakce (t = 0). Časový průběh koncetrace látek získáme integrací jednotlivých kinetik a po provedení příslušných limit dostáváme výsledek. 0 limt→∞ ki [A] 1 − e−kt ki [Bi ]∞ k = , Xi = = −kt [A]0 limt→0 [A]0 e k kde k =. Pn. i=1. ki .. Je-li úbytek látky A ovlivněn dalším reaktantem Q, danou reakci pak popisujeme kinetikou druhého řádu: d[Bi ]Q = kiQ [A][Q] , dt kde kiQ představuje rychlostní konstantu druhého řádu [5]. Výtěžek produktu Xi v přítomnosti látky Q pak odpovídá XiQ =. [Bi ]Q ki ∞ = . [A]0 k + kiQ [Q]. Porovnáním výtěžků produktu při nulové a nenulové koncentraci látky Q dostáváme Stern-Volmerovu rovnici: Xi0 Xi = Q = Q Xi Xi kde KSV =. kiQ k. ki k ki k+kiQ [Q]. =. k + kiQ [Q] kQ = 1 + i [Q] = 1 + KSV [Q] , k k. označuje tzv. Stern-Volmerovou konstantu [5].. 13. (1.2).

(18) Stern-Volmerova rovnice (1.2) se nejčastěji užívá pro popis dynamického (kolizního) zhášení fluorescence, tedy v případě deaktivace fluoroforu v excitovaném stavu prostřednictvím srážek s molekulami zhášedla a následném nezářivém přechodu fluoroforu do základního stavu [19]. Poměr na levé straně rovnice pak odpovídá poměru intenzit fluorescence v nepřítomnosti F0 , resp. přítomnosti F zhášedla o koncentraci [Q]. Nemusí se však nutně jednat o zhášení fluorescence. Pro libovolné dynamické zhášení excitovaných stavů představuje k rychlostní konstantu, s níž ubývá výchozí látka A (klesá intenzita fluorescence) při nulové koncentraci zhášeče. Stern-Volmerovu konstantu KSV = kq τ0 pak můžeme psát jako součin bimolekulární zhášecí konstanty kq = kiQ a střední doby života τ0 =. 1 k. látky A (fluoroforu) při absenci zhášedla [20]. Pomocí dob života můžeme přepsat i poměr výtěžků (intenzit fluorescence) na levé straně: Xi0 XiQ. F0 k + kiQ [Q] τ0 = = = . F k τ. (1.3). Porovnáme-li pak rovnice (1.2) a (1.3), zjistíme, že doba života τ výchozí látky (fluoroforu) je maximální při nulové koncentraci zhášedla Q a s rostoucí koncentrací zhášedla [Q] se zkracuje. Stern-Volmerova rovnice platí i pro statické zhášení fluorescence (či jiného podobného jevu), kdy dochází k tvorbě nefluorescenčního komplexu zhášeče s fluoroforem [19]. Stern-Volmerova konstanta má však zcela jiný význam: KSV =. [F − Q] , [F ][Q]. kde [F − Q] značí koncentraci vzniklého nefluorescenčního komplexu a [F ], [Q] koncentrace volného fluoroforu, resp. zhášedla. Také nedochází k poklesu doby života, jelikož intenzita fluorescence je přímo úměrná koncentraci chemicky nevázaného fluoroforu [F ], viz. [20].. 14.

(19) 2. Použitý materiál a metody 2.1 2.1.1. Materiál Vzorky. Metody přípravy anaerobního prostředí jsme si nejprve vyzkoušeli na ve vodě rozpustném meso-tetra(4-sulfofenyl)porfyrinu [H2 TTPS4 ]4− (TPPS4), který se však častěji (za běžných hodnot pH) vyskytuje v protonované formě [H4 TTPS4 ]2− (obr. 2.1). Následně jsme metody aplikovali na vzorek, jehož dobu života jsme chtěli zjistit. Konkrétně se jednalo o hlavní světlosběrnou anténu (LHCP) izolovanou z obrněnky Amphidinium carterae 1 , tvořenou 7 molekulami chlorofylu a, 4 molekulami chlorofylu c2, 10-12 (přesné číslo není známo) molekulami peridininu a 2 molekulami diadinoxanthinu (xantofyl) [23]. V obou případech jsme vzorek rozpustili v příslušném pufru v takovém poměru, aby se maximální OD pohybovala kolem jedné. Výsledný objem roztoku obvykle činil 3 ml. TPPS4 jsme měřili ve fluorescenčních křemenných kyvetách (111-QS), u nichž je udávaná propustnost (tj. transmitance větší než 80 %) pro vlnové délky od 200 nm. LHCP by však mohl být UV zářením poškozen, proto jsme použili fluorescenční kyvety z optického skla (111-OS) s propustností od 320 nm [24]. TPPS4 jsme excitovali světelnými pulsy o vlnové délce 420 nm a pomocí fotonásobiče měřili kinetiku dohasínání tripletních stavů na 460 nm (maximum triplet-tripletní absorpce). Excitační vlnová délka pro LHCP činila 670 nm, detekční pak 507 nm. Na této vlnové délce bylo pozorováno maximum triplet-tripletní absorpce karotenoidů. Energie jednoho pulsu (3 ns) se pohybovala mezi 0,25 a 0,30 mJ. Abychom předešli přílišné fotodegradaci části vzorku v místě excitace a sondování, míchali jsme vzorek v průběhu měření pomocí magnetické částice rotující po dně kyvety.. 2.1.2. Pufry. Při práci s TPPS4 jsme použili snadno dostupný pufr PBS (phosphate buffered saline), který udržuje pH na hodnotě 7,4 a svým složením připomíná fyziologický roztok (154 mM roztok chloridu sodného [25]). Z jedné tablety rozpuštěné v 200 ml destilované vody vznikne 10 mM fosfátový pufr s 2,7 mM chloridem draselným 1. Nadkmen Alveolata, říše Chromalveolata, doména Eukaryota [22].. 15.

(20) Obrázek 2.1: Struktura molekuly neprotonované (a) a protonované (b) formy TPPS4 [21]. a 137 mM chloridem sodným. U antén LHCP jsme pak využili pufr udržující pH 7,5, který obsahoval 20 mM tricin (stabilizace pH), 20 mM chlorid draselný (imitace fyziologického roztoku) a 0,16% dodecyl maltosid. Poslední zmíněná látka slouží jako detergent, který zajišťuje, aby se komplexy izolované z tylakoidních membrán nevysrážely.. 2.2 2.2.1. Metody přípravy anaerobního prostředí Bublání/foukání dusíkem. Poměrně jednoduchou metodou odstranění kyslíku ze vzorku je jeho probublání inertním plynem. Do této skupiny patří i dvouatomová molekula dusíku N2 , jejíž inertnost je přisuzována velmi silné trojné kovalentní vazbě. Tento postup však nelze použít u antén rozpuštěných v pufru s detergentem (kvůli nadměrné tvorbě bublin a unikání vzorku z kyvety). Proto jsme provedli pouze jeden experiment s bubláním do vzorku s TPPS4 a u všech následujících experimentů jsme již pouze foukali dusík do prostoru nad vzorkem. V obou případech jsme užili k utěsnění kyvety silikonovou zátku propíchnutou dvěma jehlami, jednu pro přívod a druhou pro odvod plynů. Později k jehlám přibyla ještě sonda k měření koncentrace kyslíku ve vzorku. K usnadnění výměny plynů v objemu kyvety jsme užili míchadlo (magnetickou částici pohybující se po dně kyvety).. 16.

(21) 2.2.2. Enzymy. Další používanou metodou k přípravě anaerobního prostření je využití enzymů glukózoxidázy a katalázy. Glukózoxidáza je oxidoreduktáza2 katalyzující oxidaci glukózy na peroxid vodíku a D-glukono-1,5-lacton, který je následně hydrolyzován na kyselinu glukonovou [27]. Kataláza pak zprostředkovává rozklad peroxidu vodíku na vodu a kyslík [28]. glukózoxidáza. 1. β-D-glukóza + O2 −−−−−−−→ D-glucono-1,5-lacton + H2 O2 kataláza. 2. H2 O2 + H2 O2 −−−−→ 2 H2 O + O2 Vlivem rozkladu D-glukono-1,5-laktonu na kyselinu glukonovou dochází k okyselování vzorku. Negativnímu vlivu poklesu pH na vzorek lze částečně zamezit použitím pufru. Okyselení se pak v závislosti na zkoumaném vzorku, použitých koncentracích enzymů a síle pufru může [29], ale také nemusí (3.2.2) projevit. Tato metoda se dnes běžně používá, avšak v různých literaturách nalezneme odlišná množství a poměry jednotlivých složek. Například Swoboda a kol. [29] využili 7,5 u/ml 3 glukózoxidázy, 1000 u/ml katalázy a 50 mM glukózu, zatímco Mozzo a kol. [31] pracovali s 20 µg/ml glukózoxidázy, 40 µg/ml katalázy a s 0,02 mM/ml glukózou, bohužel však neuvádí, jakou enzymovou aktivitu vykazovaly použité látky. Námi použité koncetrace jsou určitým kompromisem mezi hodnotami nalezenými v literatuře [29, 31, 32, 33, 34]. Při prvním experimentu s enzymy na TPPS4 jsme pracovali s 11,5 u/ml glukózoxidázy (G6125, SigmaAldrich), 850 u/ml katalázy (C30, Sigma-Aldrich) a 100 mM glukózou (G7528, Sigma-Aldrich). V dalších experimentech (TPPS4 i LHCP) jsme množství glukózoxidázy ztrojnásobili (na 34,5 u/ml) a snížili molaritu glukózy na 20 mM.. 2.2.3. Dithioničitan sodný. Při práci s chlorosomy4 se k přípravě anaerobního prostředí používá dithioničitan sodný (DT) (Na2 S2 O4 ; 157953 Sigma-Aldrich) [35]. Ve vodném roztoku je DT kyselý a rozkládá se na thiosíran sodný (Na2 S2 O3 ) a hydrogensiřičitan sodný (NaHSO3 ). Reakční rychlost roste spolu s rostoucí teplotou a větší kyselostí 2. Enzym katalyzující přenos elektronu z donoru elektronů (reduktantu) na akceptor (oxidant) [26]. 3. Enzymová jednotka u odpovídá množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 µmol substrátu za jednu minutu za standardních podmínek (obvykle při 25 ◦ C a hodnotách pH a koncentraci substrátu, které vedou k maximální rychlosti přeměny substrátu) [30]. 4. Fotosyntetické anténní komplexy zelených fotosyntetických bakterií.. 17.

(22) roztoku. V přítomnosti kyslíku se rozkládá na hydrogensíran sodný (NaHSO4 ) a hydrogensiřičitan sodný, látky snižující pH a tím i urychlující reakci [36]. Na2 S2 O4 + O2 + H2 O → NaHSO4 + NaHSO3. 2.3. Měřicí přístroje. K měření stacionárních absorpčních spekter byl použit spektrometr Specord 250 (Analytik Jena). Spektra jednotlivých vzorků byla měřena vůči referenci tvořené příslušným pufrem ve stejném typu kyvety. Při měření spekter s časovým rozlišením (v řádu ns–µs) byly vzorky excitovány optickým parametrickým oscilátorem (OPO) PG 122 (EKSPLA) čerpaným nanosekundovým Nd:YAG laserem5 NL303 (EKSPLA) s délkou pulsu 3 ns. V případě měření transientních spekter posloužila k sondování a měření reference (destilovaná voda ve stejném typu kyvety jako měřený vzorek) xenonová výbojka LS-11301 FlashPac (PerkinElmer). Signály ze vzorku a z reference byly v zobrazovacím spektrometru iHR 320 (Horiba Jobin Yvon) rozlišeny podle vlnových délek a poté detekovány zesilovanou CCD kamerou PI-MAX 512RB (Princeton Instuments). Použitá (a zároveň minimální) šířka měřicího okna (gate) činila 2 ns. Zaznamenaná data dále putovala do počítače (PC), kde z nich byla spočtena transientní spektra. Součástí aparatury byl ještě generátor zpoždění DG 535 (Stanford Research), který zajišťoval požadovaná zpoždění mezi excitačním pulsem, měřicím světlem a detekčním oknem CCD kamery [23]. Schéma aparatury je zobrazeno na obrázku 2.2. Přímé měření kinetik probíhalo v jednokanálovém zapojení, tedy bez měření signálu procházejícího referencí. K zjišťování intenzity světla prošlého vzorkem jsme použili kontinuální wolframovou lampu AvaLight-Hal-S (Avantes). Signál byl veden do zobrazovacího spektrometru iHR a následně zesílen fotonásobičem R298 (Hamamatsu). V rychlém převodníku proudu na napětí byla potlačena stejnosměrná složka a výsledný signál byl pomocí fotodiody synchronizován s laserovými pulsy a akumulován v USB osciloskopu U2701A 100 MHz (Agilent) napojeném na počítač [9]. Koncentraci kyslíku ve vzorku jsme stanovovali pomocí optického sensoru NeoFox (Ocean Optics) monitorujícího parciální tlak kyslíku v plynech a vodných roztocích. Konkrétně jsme použili typ sondy FOXY (Ocean Optics) pokrytý vrstvou 5. Pevnolátkový laser, jehož aktivním materiálem je izotropní krystal Yttrium Aluminium Granátu (Y3 Al5 O12 ) dopovaný ionty neodymu (Nd3+ ) [37].. 18.

(23) Obrázek 2.2: Schéma aparatury k měření transientních spekter [1]. Nd:YAG nanosekundový laser, OPO - optický parametrický oscilátor, S - vzorek, R - reference, Xe lamp - xenonová výbojka, iCCD - signál zesilující CCD kamera, OS osciloskop, PC - počítač, DG - generátor zpoždění, PTG - ovládací jednotka iCCD kamery. hydrofobního sol-gelu6 chránícího rutheniový komplex. Ten po excitaci modrým LED světlem na 470 nm přechází zpět do základního stavu zářivým přechodem. Dojde-li před vyzářením přebytečné energie ke srážce s molekulou kyslíku, pozorujeme zkrácení doby života fluorescence (dynamické zhášení fluorescence), jež je vypočtena na základě měření fázového posunu mezi excitačním světlem (modré LED) a emisí (fluorescence rutheniového komplexu). Koncentrace kyslíku je ze zkrácení doby života určena na základě Stern-Volmerovy rovnice (1.2). Změny pH jsme zjišťovali pomocí indikátorových pH papírků (Whatman) se čtyřmi barevnými poli a stupnicí od 0 do 14 po jednotkách.. 2.3.1. Software. Při přímém měření kinetik pomocí fotonásobiče byl signál z osciloskopu zobrazen a zaznamenán pomocí programu Agilent Measurement Manager. Získaná data 6. Koloidní suspenze křemíku, ethanolu a vody následně přeměněná na gel. Změnou poměru jednotlivých složek lze kontrolovat velikost pórů, a tak předejít úniku chemicky citlivého barviva [38].. 19.

(24) jsem následně fitovala v programu Gnuplot, který používá metodu nejmenších čtverců a výsledné hodnoty nafitovaných parametrů uvádí spolu s jejich směrodatnými odchylkami. Většinou bylo pro určitý vzorek za daných podmínek změřeno několik (n) kinetik. V takovém případě jsem pak jednotlivé hodnoty dob života xi určených z fitů zprůměrovala (x̄) a výslednou odchylku ∆x̄ stanovila spojením výběrové směrodatné odchylky s a odchylky spočtené na základě kvadratického zákona o přenosu chyb σ ∆x̄ =. √. s2 + σ 2 .. Výběrová směrodatná odchylka s byla počítána dle vzorce v u k u 1 X t s= (xi − x̄)2 n − 1 i=1 a odchylka σ jako v v u n u n uX ∂ x̄ 2 uX 1 2 σ=t (∆xi ) = t (∆xi )2 , ∂x n i i=1 i=1 kde ∆xi značí chyby fitem určených dob života xi . Naměřená transientní spektra byla zpracována tzv. globální analýzou v rámci programu od Mgr. Jana Alstera, Ph.D. [39], jejímž výsledkem byla sada 2–3 komponent, kterými lze nafitovat všechny získané kinetiky. Přiřadíme-li správně děje probíhající ve vzorku po excitaci k jednotlivým komponentám, můžeme určit rychlostní konstanty k =. 1 τ. příslušných procesů.. Změny intenzity fluorescence rutheniového komplexu na sondě FOXY byly na základě úměrnosti parciálnímu tlaku kyslíku (1.2) vyhodnoceny programem NeoFox Viewer.. 2.3.2. Kalibrace sondy FOXY. Před měřením koncentrace kyslíku ve vzorcích jsme nejprve potřebovali nakalibrovat sondu pro měření ve vodných roztocích. Užili jsme dvoubodovou lineární kalibraci. Koncentraci kyslíku v destilované vodě při pokojové teplotě7 , respektive příslušnou dobu života fluorescence rutheniového komplexu τ (2,41 µs), jsme zvolili za 100 %. Následně jsme vzorek začali probublávat dusíkem až do doby, kdy nám za stálého probublávání dusíkem koncentrace kyslíku ve vzorku začala stoupat, pravděpodobně v důsledku netěsnosti systému způsobené přetlakem 7. Za standartního tlaku (1 atm) při 20 ◦ C je koncentrace kyslíku v destilované vodě 284 µM. [40]. 20.

(25) v kyvetě. Největší naměřená hodnota τ činila 3,23 µs. Přidali jsme tedy do kyvety s vodou přibližně 220 µl 750 mM DT a maximální dosaženou hodnotu τ (3,25 µs) označili jako nulovou koncentraci kyslíku ve vzorku. Rozpustnost kyslíku v roztoku je však silně ovlivněna teplotou a koncentrací dalších látek přítomných ve vzorku. Tento fakt jsme si sami ověřili při dalším experimentu s destilovanou vodou a z ledničky (4 ◦ C) vyndaným pufrem, užívaným při práci s LHCP. Ke stanovení koncentrace kyslíku ve vzorku jsme užili dříve provedenou kalibraci. Pro destilovanou vodu jsme za pokojové teploty dostali 94 % (τ = 2,45 µs), což dle výpočtů programu NeoFox odpovídá koncentraci 1905µM. Vyjdeme-li z linearity kalibrace, dostáváme pro koncentraci 284 µM procentuální podíl 14 %. Maximální koncentrace kyslíku v pufru po vyndání z ledničky byla 116 % (τ = 2,31 µs), při pokojové teplotě jsme naměřili 99 % (τ = 2,42 µs). Po přidání 200 µl 750 mM DT vzrostlo τ obou vzorků na 3,26 µs, což na základě použité kalibrace odpovídalo nulové koncentraci kyslíku. Z měření tedy můžeme vyvodit, že s rostoucí teplotou klesá množství kyslíku rozpuštěného ve vzorku, a tím se prodlužuje doba života fluorescence rutheniového komplexu τ . Celkový vzrůst dob života τ v destilované vodě za pokojové teploty při druhém experimentu by tedy mohl být způsoben o trochu vyšší teplotou v laboratoři než při provádění kalibrace. Mohlo by se zdát, že látky rozpuštěné v použitém pufru rozpustnost kyslíku ve vzorku zvyšují. Jelikož však neznáme patřičnou Henryho konstantu, pomocí níž lze v daném roztoku přepočítat změny v intenzitě fluorescence na koncentraci kyslíku ve vzorku, nemůžeme objektivně rozhodnout, zda je při stejné (např. pokojové) teplotě rozpuštěno více kyslíku ve vodě nebo v pufru. Pomocí sondy FOXY tedy nelze určit absolutní hodnoty koncentrací kyslíku v měřených vzorcích, můžeme však alespoň sledovat relativní úbytek kyslíku v průběhu jednotlivých metod přípravy anaerobního prostředí.. 21.

(26) 3. Výsledky a diskuze 3.1. TPPS4. Doby života TPPS4 byly určovány z kinetik naměřených pomocí fotonásobiče (3.1). Degradaci vzorků jsme pak vyhodnocovali ze stacionárních absorpčních spekter (3.2).. 3.1.1. Bublání/ foukání dusíkem. Nejprve jsme testovali probublávání TPPS4 dusíkem. Za aerobních podmínek (před bubláním) jsme dobu života T určili jako (1,92 ± 0,03) µs. Po 10 minutách bublání se doba života protáhla přibližně třicetkrát (T = (63 ± 1) µs) a po dalších 10 minutách dosáhla hodnoty (306 ± 21) µs. Reakci vzorku na dalších 10 minut bublání se nám již zjistit nepodařilo, jelikož při manipulaci s bublacími jehlami došlo k povytažení zátky, a tudíž zvýšení množství kyslíku ve vzorku. Zkusili jsme tedy vzorek probublat vzduchem a opětovně vytvořit aerobní podmínky (T = (3,09 ± 0,07) µs). Následné probublávání dusíkem pravděpodobně probíhalo za trochu jiných podmínek než v prvním případě, jelikož po 30 minutách probublávání se nám podařilo docílit protažení doby života „pouzeÿ na (240 ± 3) µs. Možnou příčinou mohl být nižší průtok dusíku zkoumaným vzorkem či netěsnost zátky způsobená přetlakem v kyvetě. Jelikož vzorky s LHCP nebylo možné kvůli obsahu detergentu probublávat, zkusili jsme metodu modifikovat a foukat dusík nad hladinu vzorku. K usnadnění výměny plynů přispívalo magnetické míchadlo pohybující se po dně kyvety. Po více než dvou hodinách foukání (2 hod 12 min) se nám podařilo protáhnout dobu života z (3,20 ± 0,06) µs na (626 ± 5) µs.. 3.1.2. Enzymy. Při prvním experimentu s nižší koncentrací glukózoxidázy (11,5 u/ml) a vyšší koncentrací glukózy (100 mM) se doba života TPPS4 protáhla ze (2,2 ± 0,1) µs na (420 ± 5) µs. Po úpravě koncentrací jednotlivých látek (34,5 u/ml glukózoxidázy, 20 mM glukóza) jsme dosáhli velmi podobné hodnoty (416±5) µs. Porovnáním stacionárních absorpčních spekter před přidáním glukózoxidázy a a šest a půl hodiny po jejím přidání do vzorku a měření kinetik jsme zjistili významný nárůst intenzity absorpce v UV části spektra, kde absorbují přidané enzymy. V hlavním absorpčním píku TPPS4 (414 nm) jsme pozorovali pokles intenzity o necelou 22.

(27) Obrázek 3.1: Kinetika dohasínání tripletních stavů TPPS4 naměřená při prvním experimentu s enzymy (11,5 units/ml glukózoxidázy, 850 units/ml katalázy, 100 mM glukóza). Nafitovaná hodnota doby života určená z této kinetiky činila T = (418 ± 7) µs. jednu šestinu (16 %) vůči intenzitě před přidáním glukózoxidázy. Došlo také k mírnému posunu celého spektra směrem k delším vlnovým délkám. Pokles intenzity pozorovaný na 414 nm může být částečně způsoben degradací v důsledku měření, avšak při přímém měření kinetik nedojde k takové poškození jako při časově náročnějším měření transientních spekter (pokles intenzity přibližně o 18 %). Lze tedy usoudit, že i působením enzymů dochází k částečné degradaci TPPS4.. 3.1.3. DT. Ze stacionární absorpčních spekter jsme zjistili, že po přidání DT o výsledné koncentraci 15 mM došlo k téměř okamžité degradaci vzorku, podobně i při desetkrát nižší koncentraci DT. Při snížení koncentrace na 0,15 mM se DT ve spektru naopak vůbec neprojevil. Přidali jsme tedy ještě jednou stejné množství (0,7 µl 750 mM roztoku DT do 3,5 ml vzorku), též bez odezvy ve spektru. Vzhledem k malému množství látky je však možné, že jsme do zkoumaného vzorku přidali méně než 0,7 µl DT, nebo dokonce žádný. Pozorovatelného efektu na studované spektrum jsme dosáhli až po přidání dalšího DT, a to 1 µl. Spektrum změřené 23.

(28) hned po přidání DT vykazovalo přibližně poloviční intenzitu světla absorbovaného TPPS4 na 414 nm a významný nárůst intenzity v oblasti absorpce DT (UV, významný pík kolem 316 nm). Ve spektru změřeném 4 minuty poté jsme pozorovali již jen absorpci od DT (obr. 3.2).. Obrázek 3.2: Absorpční spektra TPPS4 před přidáním DT (plná čára), po přidání 1 µl 750 mM DT (čárkovaná čára) a po 4 minutách od změření předchozího spektra s DT (jemně čárkovaná čára).. 3.2. LHCP. Signál od antén byl výrazně slabší než od TPPS4, proto jsme zpočátku měřili především transientní absorpční spektra v různých zpožděních pomocí CCD kamery. Při pokusu změřit několik kinetik (3.3) pomocí fotonásobiče se ukázalo, že i tato metoda je dostatečně citlivá a lze ji použít k určování dob života tripletních stavů karotenoidů v LHCP. Proto jsme následně většinu experimentů vyhodnocovali touto metodou, která je ve srovnání s měřením pomocí CCD kamery rychlejší a efektivnější. Vzhledem k použitému uspořádání aparatury je však výsledek získaný z přímého měření kinetik zatížen větší chybou než v případě fitování transientních spekter v důsledku horšího poměru signálu vůči šumu pozadí. Vliv přidaných látek na stabilitu antény jsme zjišťovali ze stacionárních 24.

(29) absorpčních spekter (3.4) a měřením pH pomocí indikátorových papírků. Relativní změny množství kyslíku přítomného ve vzorku jsme sledovali na základě prodlužování, popř. zkracování dob života fluorescence rutheniového komplexu naneseného na sondě FOXY. V závorce za dobou života fluorescence je uvedena příslušná koncentrace kyslíku vypočtená programem NeoFox Viewer na základě kalibrace provedené s destilovanou vodou.. 3.2.1. Foukání dusíkem. Z transientních spekter naměřených po hodině a půl foukání dusíku nad hladinu vzorku jsme získali dobu života T = (4,0 ± 0,1) µs. Měřicí program však ještě nebyl zcela odladěný, proto jsme museli spektra naměřená v pěti různých zpožděních od excitačního pulsu zcela vyloučit z globální analýzy. Vzhledem k rozložení vynechaných měření mohla jejich absence nezanedbatelně ovlivnit výsledek fitu. K nepříliš velkému prodloužení doby života mohla však vést také nízká efektivita výměny plynů, tedy příliš krátká doba foukání, či netěsnost zátky zapřičiněná přetlakem v kyvetě. Další měření proběhlo se sondou měřicí koncentraci kyslíku ve vzorku. Doby života tripletů karotenoidů jsme určovali z kinetik naměřených pomocí fotonásobiče. Za aerobních podmínek, kdy doba života pigmentu sondy τ činila 2,28 µs (121 %), se doba života T tripletních stavů karotenoidů rovnala (1,86 ± 0,06) µs. Při τ = 2,41 µs (99,4 %) jsme naměřili T = (2,6 ± 0,4) µs. Po změření kinetik a opětovném připojení měřicí sondy k počítači doba života pigmentu τ vzrostla na 2,46 µs (91,6 %). Při τ = 2,69 µs (60 %) jsme určili T = (3, 5 ± 0,2) µs a poté zaznamenali vzrůst τ na 2,75 µs (51,9 %). Při τ = 2,94 µs (30 %) činilo T (5, 9 ± 0,7) µs, přičemž po naměření kinetik se τ změnilo na 2,97 µs (26,7 %). Nejnižší koncentrace kyslíku, které se nám po několikahodinovém foukání podařilo dosáhnout, byla při τ = 3,15 µs (9 %). Doba života karotenoidů odpovídala (7,8 ± 0,7) µs a τ se po opětovném připojení k počítači již nezměnilo.. 3.2.2. Enzymy. Po přidání enzymů do vzorku s LHCP se doba života zvýšila na (8,9 ± 0,6) µs. Z transientních spekter jsme dostali hodnotu (9,6 ± 0,4) µs. Při dalším měření se nám dobu života podařilo prodloužit z (1,69 ± 0,09) µs na (9 ± 2) µs a dle fitu transientních spekter na (7,2 ± 0,3) µs. Jednalo se však o stejný den, kdy jsme měřili pomocí CCD kamery i vyfoukaný vzorek a kdy měřicí program ještě nebyl zcela odladěn. V tomto případě došlo k nezahrnutí „pouzeÿ dvou měření, 25.

(30) Obrázek 3.3: Kinetika dohasínání tripletních stavů karotenoidů LHCP naměřená při posledním experimentu s enzymy. Kladný signál v první mikrosekundě je způsobený rozptýleným laserovým zářením a fluorescencí. Nafitovaná hodnota doby života tohoto měření činila T = (9,4 ± 0,4) µs. avšak i ty mohly mít signifikantní vliv na výsledek fitu. Při posledním experimentu s enzymy již program fungoval bez problémů, používali jsme hustější sadu zpoždění a navíc jsme monitorovali koncentraci kyslíku ve vzorku. Doba života fluoroforu na sondě činila před měřením i po měření kinetik pomocí fotonásobičem 3,14 µs (10 %) a dobu života karotenoidů se podařilo protáhnout na (9,3 ± 0,9) µs. Z transientních spekter jsme obdrželi hodnotu T = (9,7 ± 0,2) µs, přičemž τ po doměření mírně vzrostlo na 3,15 µs (9 %). Pokles intenzity signálu vzorku s enzymy po měření s CCD kamerou pozorovaný v stacionárních absorpčních spektrech odpovídá poklesu intenzity po měření vyfoukaného vzorku. Na základě měření pH se podařilo vyvrátit obavy z okyselování vzorku v důsledku rozkladu D-glukono-1,5-laktonu na kyselinu glukonovou, jelikož naměřené pH vzorku s enzymy se shodovalo s pH příslušného pufru. Lze tedy usoudit, že k degradaci vzorku s LHCP docházelo pouze následkem měření a nikoli v důsledku působení enzymů. Nezměněné pH také nasvědčuje vhodnosti použitých koncentrací jednotlivých látek.. 26.