FRAKCIONACE A SPECIACE As, Cd A Zn V NADZEMNÍ BIOMASE PENÍZKU MODRAVÉHO (Thlaspi caerulescens J. & C. PRESL)
B
ARBORAV
ALTEROVÁa, J
IŘINAS
ZÁKOVÁa, R
ICHARDK
OPLÍKb, J
AROSLAVH
AVLÍKa, P
AVELT
LUSTOŠaa O
TOM
ESTEKca Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita, 165 21 Praha 6 – Suchdol,
b Fakulta potravinářské a biochemické technologie, c Fakulta chemicko-inženýrská, Vysoká škola chemicko-technologic- ká, Technická 5, 166 28 Praha 6
szakova@af.czu.cz
Došlo 21.1.11, přepracováno 17.10.11, přijato 11.11.11.
Klíčová slova: penízek modravý, arsen, kadmium, zinek, speciace
Úvod
V lokalitách s kontaminovanou půdou se zpravidla vyskytuje pouze omezený počet druhů rostlin, které jsou na dané podmínky přizpůsobeny a jsou schopny přežít1. Specifickou skupinou jsou tzv. hyperakumulátory, tedy rostlinné druhy s mimořádnou schopností kumulace jedno- ho nebo více rizikových prvků v nadzemní biomase2. Pení- zek modravý (Thlaspi caerulescens, J. & C. Presl) je dvou- letá rostlina, která se vyskytuje zejména v místech s vyso- kým obsahem Zn v půdě. Je považována za hyperakumulá- tor Zn, Cd a Ni (cit.3). Hlavním faktorem hyperakumulace u tohoto druhu je dle některých autorů existence specific- kých přenašečů v plasmatické membráně buněk kořene4. V příbuzném druhu Thlaspi praecox bylo metodou PIXE (Particle Induced X-ray Emission) lokalizováno kadmium ve vakuolách, ve velkých epidermálních buňkách u okraje listů a v podstatně nižší koncentraci v epidermálních buň- kách uprostřed listů5. Nižší koncentrace byly také stanove- ny v buněčných stěnách.
Hyperakumulátory mají účinné mechanismy pro ome- zení nadměrné koncentrace kovů v metabolicky aktivních částech buněk. Některé kovové ionty pravděpodobně zů- stávají v cytoplasmě a vyvolávají oxidační stres tvorbou reaktivních kyslíkových forem. Pomocí antioxidačních systémů, které zahrnují antioxidační enzymy a glutathion, se těmto formám kyslíku rostlina brání. Rovněž byl zazna- menán pokles obsahu chlorofylu a zároveň zvýšení aktivi- ty glutathion reduktasy a vyšší koncentrace anthokyanů v biomase T. praecox při zvýšení obsahu Cd v substrátu.
Naproti tomu v penízku modravém tyto změny pozorová-
ny nebyly6. Tato skutečnost naznačuje vyšší míru toleran- ce penízku modravého k vysokým obsahům Cd v půdě ve srovnání s příbuzným druhem T. praecox. Ve studiu ochranných mechanismů rostlin byla dosud pozornost soustředěna především na ukládání kovů ve vakuolách za účasti fytochelatinů. Jiné mechanismy tolerance byly zatím opomíjeny7. Neexistuje například zatím žádná studie, která by cíleně sledovala souvislost mezi obsahy jednotlivých barviv a koncentrací prvků v rostlinných buňkách.
V našem experimentu jsme se pokusili spojenými analytickými technikami zhodnotit způsob vazby vybra- ných rizikových prvků v nadzemní biomase penízku mod- ravého pěstovaného v půdě s extrémními obsahy As, Cd a Zn. Zvláštní pozornost jsme věnovali možné souvislosti rizikových prvků s anthokyany, která byla již popsána u jiných druhů rostlin810. Využili jsme metody semiprepa- rativní vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverz- ní fázi (RP-HPLC) s následným stanovením obsahu prvků v chromatografických frakcích hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). Dále jsme použili on-line spojení gelové permeační chromatografie (SEC) a ICP-MS. Pro stanovení sloučenin arsenu pak bylo využito metody HPLC- ICP-MS.
Experimentální část Původ materiálu
Na pokusném políčku ČZU, které se nachází na břehu řeky Litavky poblíž závodu Kovohutě Příbram, kde došlo před několika desetiletími k protržení odkalovacích nádrží s následkem extrémní kontaminace půdy rizikovými prv- ky, byly odebrány průměrné vzorky nadzemní biomasy penízku modravého (ekotypy Ganges a Mežica) ve vrchol- né fázi vegetace. Celkové obsahy As, Cd a Zn v této půdě jsou: 611±20 mg kg1 As, 27,4±0,9 mg kg1 Cd a 3217±42 mg kg1 Zn.
Stanovení celkového obsahu prvků v rostlinném materiálu
Vzorky rostlinného materiálu byly vysušeny lyofiliza- cí, rozemlety na analytickou jemnost a zhomogenizovány.
Rozklad vzorků pro účely stanovení rizikových prvků byl proveden na suché cestě s použitím mineralizátoru Apion (Tessek, ČR). Navážky vzorku (1 g) v ampulích z borosilikátového skla byly rozkládány v proudu oxidují- cích plynů (O2 + O3 + NOx) při teplotě 400 °C po dobu 10 h (cit.11). Získané popely byly rozpuštěny ve 20 ml 0,2 mol l1 HNO3. Obsah prvků v připravených minerali- zátech byl stanoven optickou emisní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP OES) s axiální orien- tací plazmové hlavice na přístroji Varian VistaPro (Varian, Austrálie).
Příprava vzorku pro RP-HPLC a chromatografické podmínky
Složky biomasy penízku rozpustné v methanolu byly děleny chromatografií na reverzní fázi. Extrakt byl připra- ven třepáním 2 g vzorku s 50 ml 80% methanolu po dobu 3 h na třepačce, odstředěním (9000 rpm, 10 min, Hettich Zentrifugen) a filtrací supernatantu přes celulosový filtr (0,45 m). Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na vakuové odparce, získaný odparek byl zvážen a rozpuštěn v takovém objemu 40% methanolu, aby výsledný roztok pro následnou frakcionaci měl koncentraci rozpuštěných látek 100 mg ml1 (cit.12).
K separaci složek extraktu a jejich rozdělení do frakcí byla použita kapalinová chromatografie na reverzní fázi v semipreparativním měřítku. Kapalinový chromatograf Dionex Summit (Dionex Inc., US) pracoval v konfiguraci:
pumpa P 680, detektor s diodovým polem UVD 340 U, termostat kolon TCC-100, nástřikový ventil Rheo- dyne se smyčkou 100 l. Byla použita kolona Luna C18 25010 mm, 15 m (Phenomenex Inc., USA). Chro- matografické podmínky byly obdobné podmínkám, které dříve publikovali Weber a Konieczynski10. Pro eluci děle- ných látek byla použita programovaná změna složení mo- bilní fáze (složka A: kyselina mravenčí 0,05% , složka B:
100% methanol, průběh gradientu: start 100 % A, 5 min 100 % A, 50 min 60 % B, průtok 3 ml min1). Teplota kolony byla udržována na hodnotě 30 °C. Nástřik byl 100 l extraktu. Eluované látky byly detegovány při vlno- vých délkách 530 nm a 330 nm.
Frakce efluentu byly odebírány do zkumavek po 1 min od okamžiku nástřiku ve třech opakováních (tj. ze tří nástřiků extraktu). Ze zkumavek bylo odpařeno rozpouště- dlo (při 80 °C) a zkumavky byly uchovány pro následné stanovení prvků ve frakcích metodou ICP-MS. Obsah zku- mavek byl rozpuštĕn v 10 ml 0,3 mol l1 HNO3 s přídav- kem vnitřního standardu (40 ng ml1 Ge, Rh, Bi a 20 ng ml1 In) a v získaných roztocích byly stanoveny vybrané prvky metodou ICP-MS s použitím spektrometru Elan DRC-e (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA).
Frakcionace specií prvků metodou SEC-ICP-MS Extrakt vzorku byl připraven z navážky 0,5 g vzorku třepáním s 50 ml 0,02 mol l1 roztoku Tris-HCl, pH 7,5, po dobu 1 h při teplotě 20 °C a následným odstředěním (20 min, 20 000 g, 4 °C). V extraktu byl nejprve stanoven celkový obsah stopových prvků, aby po následné chroma- tografické analýze bylo možné provést hmotnostní bilanci.
Frakcionace specií S, Zn, As a Cd byla provedena on line spojením SEC a ICP-MS. Mobilní fáze byla totožná s tlumivým roztokem, do něhož byly rozpustné složky vzorku extrahovány. Byla použita kolona Superdex 75 10/300 GL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) a průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min1. Prvky byly v eluovaných frakcích kvantifikovány externí kalibra- cí na základě dat získaných technikou pokolonového ná-
střiku kalibračních roztoků do toku čisté mobilní fáze.
Podrobnosti jsou uvedeny v práci Koplíka a spol.13. Pro detekci většiny prvků byly použity standardní podmínky ICP-MS. Sloučeniny síry byly detegovány měřením inten- zity oxidových iontů 48(SO)+. K eliminaci rušivého vlivu chloridů při detekci arsenu metodou ICP-MS bylo použito měření v režimu DRC s argonem jako kolizním plynem14. Stanovení sloučenin arsenu
Při stanovení sloučenin arsenu ve vzorku penízku modravého bylo postupováno následovně. Vzorek byl ex- trahován do 10 ml 0,05 mol l1 NH4H2PO4 z navážky 1,0 g vzorku třepáním přes noc. Jednotlivé sloučeniny arsenu byly stanoveny metodou HPLC-ICP-MS s použitím kapali- nového chromatografu HP 1100 (Agilent, SRN) a spektro- metru HP 4500 (Agilent). Byla použita iontově výměnná kolona Hamilton PRP-X100 (250×4,1 mm, 10 m, Hamil- ton, Reno, USA) a mobilní fáze 0,02 mol l1 roztok NH4H2PO4 (pH 6,0) s průtokem 1,5 ml min1. Podrobnosti již byly publikovány dříve15,16.
Výsledky a diskuse
Celkové obsahy prvků v biomase penízku modravého potvrdily hyperakumulační schopnost tohoto druhu v případě Cd a Zn, zatímco obsah As byl významně nižší (Cd: Ganges 683 a Mežica 719 g g1 sušiny, Zn: Ganges 10570 a Mežica 5801 g g1 sušiny, As: Ganges 4,72 a Mežica 4,00 g g1 sušiny).
Pro posouzení možných interakcí As, Cd a Zn s barvi- vy byly frakce methanolového extraktu získané semipre- parativní chromatografií na reverzní fázi analyzovány na obsah těchto prvků. Obr. 1 ukazuje chromatogram se spek- trofotometrickou detekcí při 530 a 330 nm, který svědčí o přítomnosti pigmentů, a současně znázorňuje koncentra- ce prvků v příslušných frakcích. Anthokyany vykazují v kyselém prostředí silnou absorpci při 510540 nm. Při 330 nm jsou detegovány zejména fenolové kyseliny odvo- zené od kyseliny skořicové a některé flavonoidní sloučeni- ny (flavanony, flavony a flavonoly a jejich glykosidy)17. Anthokyany byly detegovány ve frakcích 1728 a dále 30 a 43. Nejvyšší koncentrace As byla zjištěna ve frakci 5 (As: 1,53 ng ml1). Dále jsme As zaznamenali ve frakcích 2055, tedy v oblasti, kde jsou eluovány mimo jiné i ant- hokyany. U Zn a Cd byly nejvyšší hodnoty zjištěny ve frakcích 4 a 5 (Zn – frakce 4: 1220 ng ml1, Cd – frakce 5:
4,29 ng ml1), přičemž v následujících frakcích se již tyto prvky vyskytují jen ve stopách. Tyto výsledky ukazují, že většina rozpustného Zn a Cd se pravdĕpodobně vyskytuje ve vzorku penízku ve volných formách, které jsou z kolony eluovány prakticky v mrtvém čase. U arsenu je sice část obsahu eluována rovněž zhruba v mrtvém čase, většina rozpustného obsahu se však nachází v nerozlišené široké zóně (2055 min). Nelze tedy vyloučit přítomnost arsenu ve formě organoprvkových sloučenin, jak pozorovali např.
Kuehnelt a spol.18 u různých druhů suchozemských rostlin, nicméně předpoklad vyslovený Azizem19 o souvislosti obsahu arsenu s anthokyanovými barvivy potvrzen nebyl.
Extrakce biomasy penízku modravého 0,02 mol l1 roztokem Tris-HCl ukázala snadnou uvolnitelnost Cd a Zn (Cd: Ganges 68 a Mežica 62 % z celkového obsahu, Zn:
Obr. 1. Chromatogramy methanolového extraktu penízku (ekotyp Ganges) získané metodou RP-HPLC se spektrofotometrickou detekcí při 530 nm a 330 nm a s vyznačením koncentrací kadmia, zinku a arsenu v příslušných frakcích
mAU280 nm
mAU280 nm
mAU280 nm
Ganges a Mežica 75 % celkového obsahu). Chromatogra- fická výtĕžnost při SEC, která vypovídá o zastoupení sta- bilních komplexů ve vzorcích, byla však velmi nízká (Zn:
Ganges 0,43 % a Mežica 0,64 % z extrahovaného obsahu, Cd: Ganges 2,0 % a Mežica 1,3 % z extrahovaného obsa- hu). To znamená, že převážná část rozpustného Zn (cca 99 %) a rozpustného kadmia (cca 98 %) připadá na iontové formy (hydratované ionty Zn2+ a Cd2+) a labilní komplexy.
Sloučeniny Zn a Cd eluované při SEC analýze v rozmezí mrtvého a celkového objemu kolony jsou různé organické komplexy, u nichž lze odhadnout molekulovou hmotnost.
Jejich podíl však činí jen cca 0,5 % u zinku a 12 % u kadmia. Obr. 2 a 3 ukazují eluční křivky zinku a kadmia ve vzorcích ekotypů Mežica a Ganges společně s eluční
křivkou sloučenin síry. U obou vzorků byly stabilní kom- plexy zinku detegovány v nízkomolekulární oblasti ve dvou frakcích (hlavní frakce: tR = 30 min, odhad Mr 1 kDa a minoritní frakce: tR = 28 min, odhad Mr 12 kDa). Kad- mium je distribuováno mezi tři frakce, které však mají u jednotlivých ekotypů rozdílné proporce (vysoko- molekulární frakce: tR = 16 min, odhad Mr 120 kDa, střed- ně-molekulární frakce tR ≈ 22 min, odhad Mr 1015 kDa a nízkomolekulární frakce: tR ≈ 28 min, odhad Mr 1
2 kDa). Nízkomolekulární frakce sloučenin kadmia se kry- je s minoritní nízkomolekulární frakcí zinku a frakcí slou- čenin síry. Zdá se tedy, že pouze menší část stabilních spe- cií zinku a kadmia je asociována se sirnými ligandy (pravděpodobně peptidy typu metalothioneinů).
Obr. 2. Eluční křivky zinku, kadmia a síry získané metodou SEC-ICP-MS při analýze extraktu penízku modravého, ekotyp Mežica 0
10000 20000 30000 40000
0 1000 2000 3000 4000 5000
10 15 20 25 30 35 40
I(66Zn) [cps]
I(48SO,111Cd) [cps]
t[min]
111Cd
48SO
66Zn
Obr. 3. Eluční křivky zinku, kadmia a síry získané metodou SEC-ICP-MS při analýze extraktu penízku modravého, ekotyp Ganges 0
10000 20000 30000 40000 50000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
10 20 30 40 50
I(66Zn) [cps]
I(48SO, 111Cd) [cps]
t[min]
66Zn
111Cd
48SO
Jiná je situace u arsenu. Ze vzorku penízku modravé- ho (ekotyp Ganges) se tlumivým roztokem (pH 7,5) extra- huje 29 % arsenu. Při separaci rozpustných forem arsenu metodou SEC-ICP-MS byly detegovány dvě frakce (tR = 28 min, obsah As 0,14 g g1 sušiny a tR = 40 min, obsah As 1,1 g g1 sušiny, viz obr. 4). První frakce se kryje s minoritní frakcí zinku a frakcí sloučenin síry, u nichž byla molekulová hmotnost odhadnuta na 12 kDa. Může se jednat např. o komplexy arsenu s fytochelatiny. Druhá frakce, v níž je obsažena většina rozpustného arsenu, měla eluční objem větší než celkový objem mobilní fáze v koloně. To znamená, že u této složky došlo k retenci za účasti jiného než molekulárně-vylučovacího mechanismu.
Takové chování mohou vykazovat iontové specie arsenu.
Chromatografická výtěžnost arsenu je však vysoká (90 % celkového rozpustného obsahu). Iontoměničovou chroma- tografií byly ve stejném vzorku zjištěny pouze anorganické formy arsenu. Do fosfátového tlumivého roztoku přechází extrakcí 71 % z celkového obsahu, přičemž 65 % rozpust- ného arsenu připadá na arsenitanové ionty a 35 % na arse- ničnanové ionty.
Pro lepší pochopení specifického chování hyperaku- mulátorů je vhodné uvést porovnání mechanismů příjmu Cd a Zn u penízku modravého a penízku rolního, který není hyperakumulátorem20. Bylo zjištĕno, že hladiny fyto- chelatinů jsou u obou druhů srovnatelné21. Toto zjištĕní bylo zaznamenáno i u jiných hyperakumulujících druhů rostlin. Raab a spol.22 studovali metody extrakce a separa- ce komplexů arsenu s fytochelatiny v nadzemní biomase trávy medyňku vlnatého (Holcus lanatus L.), který je tole- rantní k vysokým obsahům As v půdě, ale není hyperaku- mulátorem a kapradiny křídelnice krétské (Pteris cretica L.), která je jedním z mála popsaných hyperakumulátorů arsenu. U medyňku bylo ve formĕ komplexu s fytochelati- nem vázáno 13 % arsenu a u křídelnice to bylo pouze 1 %.
Lze tedy konstatovat, že syntéza fytochelatinů u hyperaku- mulujících rostlin nejspíš nebude hlavním a jediným me-
chanismem tolerance vůči zvýšeným obsahům Cd a Zn.
Jak naznačuje literatura, větší význam mohou mít v tomto případě komplexy s organickými kyselinami, např.
s kyselinou citronovou23 a šťavelovou24. V případě arsenu pak výsledky ukazují vedle anorganických forem rovněž na přítomnost stabilních komplexů, jejichž případná identi- fikace zůstává jako námět pro další výzkum.
Tato práce vznikla za podpory výzkumného záměru MŠMT ČR MSM 6046070901. Dále je třeba poděkovat prof. Walteru Goesslerovi, vedoucímu oddělení analytické chemie katedry chemie Univerzity ve Štýrském Hradci (Rakousko) za pomoc při stanovení sloučenin arsenu v biomase penízku modravého.
LITERATURA
1. Schat H., Llugany M., Bernhard R. v knize: Terry N., Bañuelos G. (ed.): Phytoremediation of Contaminated Soils and Water, str. 389. Lewis Publishers CRC, Boca Raton 2000.
2. Baker A. J. M.: New Phytol. 106, 93 (1987).
3. Robinson B. H., Leblanc M., Petit D., Brooks R. R., Kirkman J. H., Gregg P. E. H.: Plant Soil 203, 47 (1998).
4. Schwartz C., Echevarria G., Morel J. L.: Plant Soil 249, 27 (2003).
5. Vogel-Mikuš K., Regvar M., Mesjasz-Przybyłowicz J., Przybyłowicz W.J., Simčič J., Pelicon P., Budnar M.: New Phytol. 179, 712 (2008).
6. Pongrac P., Zhao F. J., Razinger J., Zrimec A., Regvar M.: Environ. Exp. Bot. 66, 479 (2009).
7. Cosio C., DeSantis L., Frey B., Diallo S., Keller C.: J.
Exp. Bot. 56, 765 (2005).
8. Hale K. L., McGrath S. P., Lombi E., Stack S. M., Terry N., Pickering I. J., George G. N., Pilon-Smits E.
A. H.: Plant Physiol. 126, 1391 (2001).
0 1000 2000 3000 4000
0 50 100 150 200 250
10 20 30 40 50
I(48SO) [cps]
I(75As) [cps]
t[min]
48SO 75As
Obr. 4. Eluční křivky arsenu, a síry získané metodou SEC-ICP-MS při analýze extraktu penízku modravého, ekotyp Ganges
9. Hale K. L., Tufan H. A., Pickering I. J., George G. N., Terry N., Pilon M., Pilon-Smits E. A. H.: Physiol.
Plant. 116, 351 (2002).
10. Weber G., Konieczyński P.: Anal. Bioanal. Chem.
375, 1067 (2003).
11. Miholová D., Mader P., Száková J., Slámová A., Sva- toš Z.: Fresenius’ J. Anal. Chem. 345, 256 (1993).
12. Phippen W. B., Simon J. E.: J. Agric. Food Chem. 46, 1731 (1998).
13. Koplík R., Borková M., Mestek O., Komínková J., Suchánek M.: J. Chromatogr., B 775, 179 (2002).
14. McShane W. J., Pappas R. S., Paschal D.: J. Anal. At.
Spectrom. 22, 630 (2007).
15. Ruiz-Chancho M. J., López-Sánchez J. F., Schmeisser E., Goessler W., Francesconi K. A., Rubio R.: Che- mosphere 71, 1522 (2008).
16. Száková J., Tlustoš P., Goessler W., Findenig S., Richtrová E., Balik J.: Cent. Eur. J. Biol. 4, 107 (2009).
17. Merken H. M., Beecher G. R.: J. Agric. Food Chem.
48, 577 (2000).
18. Kuehnelt D., Lintschinger J., Goessler W.: Appl. Or- ganometal. Chem. 14, 411 (2000).
19. Azíz A.: Bangladesh J. Bot. 30, 17 (2001).
20. Lasat M. M., Baker A. J. M., Kochian L. V.: Plant Physiol. 112, 1715 (1996).
21. Ebbs S., Lau I., Kochian L.: Planta 214, 635 (2002).
22. Raab A., Feldmann J., Meharg A. A.: Plant Physiol.
134, 1113 (2004).
23. Callahan D. L., Baker A. J. M., Kolev S. D., Wedd A.
G.: J. Biol. Inorg. Chem. 11, 2 (2006).
24. Pavlík M., Pavlíková D., Száková J., Vašíčková S., Tlustoš P.: ve sborníku (Macková M., Macek T., De- mnerová K., Pazlar V., Nováková M., ed.) 4th Sympo- sium on Biosorption and Bioremediation, VŠCHT Praha, 26.-30.8. 2007, s. 11. VŠCHT, Praha 2007.
B. Valterováa, J. Szákováa, R. Koplíkb, J. Havlíka, P. Tlustoša, and O. Mestekc (a Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences, Prague; b Faculty of Food and Biochemical Technology, c Faculty of Chemical Engineering, Institute of Chemical Technology, Prague): Fractionation and Speci- ation of As, Cd and Zn in Aboveground Biomass of Alpine Pennycress (Thlaspi caerulescens J. & C. Presl)
Fractionation and speciation of selected hazardous elements (As, Cd, Zn) in alpine pennycress (Thlaspi caer- ulescens J. & C. Presl) growing in extremely contami- nated soil were investigated using coupled analytical tech- niques. A semipreparative RP-HPLC followed by determi- nation of the elements in chromatographic fractions by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP MS) was applied to identification of interactions of the elements with plant pigments. The elements in plant extracts were detected by SEC coupled on-line with ICP-MS. For deter- mination of As species HPLC – ICP MS was used. Total contents of the elements in T. caerulescens biomass con- firmed hyperaccumulation of Cd and Zn, their contents reaching up to 719 and 10 570 g g1 of dry matter, respec- tively. A predominant part of extractable Zn (ca 99 %) and Cd (ca 98 %) was present in ionic forms and labile com- plexes. A possible phytochelating synthesis was not con- firmed as the dominant mechanism of plant tolerance to enhanced Cd and Zn concentrations. Inorganic As species were also identified. The results indicate the presence of stable complexes but require further research.
