VŠB – Technická univerzita Ostrava
Fakulta elektrotechniky a informatiky
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
2020 KOMÁR Matěj
VŠB – Technická univerzita Ostrava
Fakulta elektrotechniky a informatiky
Katedra kybernetiky a biomedicínského inženýrství
Analýza metod uchycení enzymu na elektrodu pro měření glykémie Analysis of Enzyme Attachment Methods to Electrode for Glycemic
Measurement
2020 KOMÁR Matěj
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracoval samostatně. Uvedl jsem všechny literární prameny a publikace, ze kterých jsem čerpal.
V Ostravě dne ………
Podpis studenta
Poděkování
Děkuji vedoucí práce slečně Ing. Kláře Fiedorové za vedení, odbornou pomoc, cenné rady a připomínky bez kterých by tato práce nikdy nevznikla.
Děkuji paní Mgr. Zdence Fohlerové, Ph.D. za vstřícnost a pomoc v chemické pasáži této práce.
ABSTRAKT
Bakalářská práce se zabývá metodami imobilizace enzymu, potřebného pro měření hladiny glykemie. Jednotlivé metody jsou analyzovány a podrobně popsány, podobně jako funkčnost enzymu v těle. Daná metoda imobilizace byla hledána v rešeršní práci, která byla zaměřena na imobilizaci enzymu nezbytného pro měření glykemie, glukosaoxidasy. V práci jsou taktéž uvedeny chemické reakce ovlivněné enzymem působícím na substrát za vzniku produktu. Z uvedených technik je vybrána metoda zesítěním. Cílem práce bylo ověření imobilizace enzymu pomocí vyrobeného elektrodového systému, zasazeného do správného měřícího obvodu. Experimentálním měřením a následnou analýzou dat byla ověřena úspěšnost imobilizace.
KLÍČOVÁ SLOVA
imobilizace, glukosaoxidasa, glykemie, elektrodový systém, měřící obvod
ABSTRACT
The bachelor thesis deals with methods of enzyme immobilization, which are necessary for the measurement of blood glucose levels. Individual methods are analyzed and described in detail, similar to the functionality of the enzyme in the body. The method of immobilization was searched for in the research work, which was focused on the immobilization of the enzyme necessary for the measurement of glycemia, glucose oxidase. The chemical reactions influenced by the enzyme acting on the substrate to produce the product are also mentioned. The cross-linking method is selected from the above techniques. The aim of the work was to verify the immobilization of the enzyme by means of the produced electrode system, inserted into the correct measuring circuit.
KEY WORDS
immobilization, glucose oxidase, glycemia, electrode system, measuring circuit
OBSAH
1 ÚVOD ... 10
2 TEORETICKÁ ČÁST ... 11
2.1 GLUKOSA ... 11
2.2 ENZYM ... 11
2.3 KLASIFIKACE ENZYMŮ ... 11
2.4 KOMPLEX ENZYM – SUBSTRÁT ... 12
2.4.1 Aktivní centrum ... 12
2.5 VYUŽITÍ ENZYMU KMĚŘENÍ HLADINY GLUKOSY ... 13
2.5.1 Glukosaoxidasa ... 13
2.5.2 Hexokinasa ... 14
2.5.3 Další využívané enzymy ... 14
2.6 ANALYTICKÉ METODY ... 14
2.6.1 Elektrochemická metoda ... 14
2.6.2 Fotometrická metoda ... 15
2.6.3 Konduktometrická metoda ... 15
2.7 IMOBILIZACE ENZYMU ... 15
2.8 FYZIKÁLNÍ IMOBILIZACE ... 16
2.8.1 Absorpce ... 16
2.8.2 Zachycení ... 16
2.8.3 Zapouzdření ... 17
2.9 CHEMICKÁ IMOBILIZACE ... 17
2.9.1 Zesítění (Cross-linking) ... 17
2.9.2 Kovalentní vazba... 18
3 REŠERŠE ... 19
3.1 ÚVOD A VÝCHODISKA REŠERŠE ... 19
3.2 PŘÍPRAVA REŠERŠE ... 19
3.3 ZÁVĚR REŠERŠE ... 19
4 PRAKTICKÁ ČÁST ... 20
4.1 VLASTNÍ ELEKTRODOVÝ SYSTÉM ... 21
4.2 MĚŘÍCÍ OBVOD ... 23
4.3 OVĚŘENÍ SPRÁVNOSTI ZAPOJENÍ ... 25
4.4 IMOBILIZACE ZESÍTĚNÍM ... 26
4.4.1 Použitý materiál ... 27
4.4.2 Příprava roztoků ... 27
4.4.3 Příprava elektrody ... 30
5 EXPERIMENTÁLNÍ MĚŘENÍ ... 31
5.1 MĚŘENÍ S ELEKTRODOU A ... 34
5.1.1 Měření s čistou glukosou ... 34
5.1.2 Měření s roztokem glukosy a přidaným enzymem 1 ... 36
5.1.3 Měření s roztokem glukosy a přidaným enzymem 2 ... 37
5.1.4 Měření s imobilizovaným enzymem ... 38
5.1.5 Vyhodnocení výsledků naměřených elektrodou A ... 39
5.2 MĚŘENÍ SELEKTRODOU B ... 39
5.2.1 Měření s čistou glukosou ... 40
5.2.2 Měření s roztokem glukosy a přidaným enzymem 1 ... 41
5.2.3 Měření s roztokem glukosy a přidaným enzymem 2 ... 42
5.2.4 Měření s imobilizovaným enzymem ... 43
5.3 ANALÝZA VÝSLEDKŮ ... 44
5.3.1 I. Část – Měření s různým typem enzymu s elektrodou A ... 44
5.3.2 Měření s různým typem enzymu s elektrodou B ... 44
5.3.3 II. Část – Porovnání výsledků měření s přidaným enzymem 1 ... 45
5.3.4 Porovnání výsledků měření s imobilizovaným enzymem ... 46
5.4 NÁVRH DALŠÍHO KROKU PRÁCE ... 47
6 ZÁVĚR ... 49
7 SEZNAM LITERATURY ... 51
8 PŘÍLOHY ... 53
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A TERMÍNŮ GOx Glukosaoxidasa
IUB Mezinárodní unie biochemie FAD Flavinadenindinukleotid
DM Diabetes mellitus
GDH Glukosadehydrogenasa
POx Peroxidasa
CFO Magnetické nanočástice CoFe2O4
SOL-GEL Skupina látek využívaných k imobilizaci bioprvků tzv. suchý gel Polymer Makromolekula složená z molekul jednoho či více druhů atomů CLEC Cross-linked enzyme crystals
CLEA Cross-linked enzyme aggregates
SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ
OBR.1STRUKTURÁLNÍ VZOREC GLUKOSY [1] ... 11
OBR.2ZÁMEK A KLÍČ [3] ... 12
OBR.3HEXOKINÁSOVÁ REAKCE [5] ... 14
OBR.4FYZIKÁLNÍ ABSORPCE [19] ... 16
OBR.5ZACHYCENÍ [19] ... 17
OBR.6ZAPOUZDŘENÍ [19] ... 17
OBR.7CROSS-LINKING [19] ... 18
OBR.8KOVALENTNÍ VAZBA [19] ... 18
OBR.9NÁVRH ELEKTRODOVÉHO SYSTÉMU ... 21
OBR.10DETAIL ŽLÁBKU ELEKTRODOVÉHO SYSTÉMU ... 22
OBR.11VLASTÍ ELEKTRODOVÝ SYSTÉM... 22
OBR.12ELEKTRODOVÝ SYSTÉM ING.FIEDOROVÉ ... 23
OBR.13SCHÉMA MĚŘÍCÍHO SYSTÉMU ... 24
OBR.14SCHÉMA ZAPOJENÍ [18] ... 25
OBR.15MODIFIKACE ZAPOJENÍ [18] ... 25
OBR.16KONTROLA FUNKČNOSTI OBVODU ... 26
OBR.17PUFR ... 27
OBR.1899% GLYCEROL ... 28
OBR.19ALBUMIN BSA ... 28
OBR.20ENZYM GOX 110U/MG ... 29
OBR.21IMOBILIZAČNÍ SMĚS ... 30
OBR.22APLIKACE IMOBILIZAČNÍ SMĚSI ... 30
OBR.23DIAGRAM MĚŘENÍ S ČISTOU GLUKOSOU ... 32
OBR.24DIAGRAM MĚŘENÍ S GLUKOSOU A PŘIDANÝM ENZYMEM ... 32
OBR.25DIAGRAM MĚŘENÍ S GLUKOSOU A SMĚSÍ S IMOBILIZOVANÝM ENZYMEM ... 33
OBR.26MĚŘÍCÍ SYSTÉM ... 33
OBR.27APLIKACE ROZTOKU ... 34
TAB.1SEZNAM LÁTEK A JEJICH ÚČEL ... 27
TAB.2POSTUP VÝROBY VÝSLEDNÉHO ROZTOKU A NANESENÍ NA ELEKTRODU ... 30
TAB.3NAMĚŘENÉ HODNOTY S ROZTOKEM ČISTÉ GLUKOSY ... 35
TAB.4NAMĚŘENÉ HODNOTY GLUKOSY S PŘIDANÝM ENZYMEM 1 ... 36
TAB.5NAMĚŘENÉ HODNOTY GLUKOSY S PŘIDANÝM ENZYMEM 2 ... 37
TAB.6NAMĚŘENÉ HODNOTY GLUKOSY S IMOBILIZOVANOU SMĚSÍ ... 38
TAB.7NAMĚŘENÉ HODNOTY S ROZTOKEM ČISTÉ GLUKOSY (B) ... 40
TAB.8NAMĚŘENÉ HODNOTY GLUKOSY S PŘIDANÝM ENZYMEM 1(B) ... 41
TAB.9NAMĚŘENÉ HODNOTY GLUKOSY S PŘIDANÝM ENZYMEM 2(B) ... 42
TAB.10NAMĚŘENÉ HODNOTY GLUKOSY S IMOBILIZOVANOU SMĚSÍ (B) ... 43
GRAF 1ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S ČISTOU GLUKOSOU ... 35
GRAF 2ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S GLUKOSOU A PŘIDANÝM ENZYMEM 1 ... 36
GRAF 3ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S GLUKOSOU A PŘIDANÝM ENZYMEM 2 ... 37
GRAF 4ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S GLUKOSOU A IMOBILIZOVANOU SMĚSÍ ... 38
GRAF 5ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S ČISTOU GLUKOSOU (B) ... 40
GRAF 6ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S GLUKOSOU A PŘIDANÝM ENZYMEM 1(B) ... 41
GRAF 7ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S GLUKOSOU A PŘIDANÝM ENZYMEM 2(B) ... 42
GRAF 8ZÁVISLOST NAPĚTÍ NA ČASE, MĚŘENÍ S GLUKOSOU A IMOBILIZOVANOU SMĚSÍ (B) ... 43
GRAF 9POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ PŘI MĚŘENÍ S ELEKTRODOU A S PŘISYPANÝM ENZYMEM 1 A ENZYMEM 2 ... 44
GRAF 10POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ PŘI MĚŘENÍ S ELEKTRODOU B S PŘISYPANÝM ENZYMEM 1 A ENZYMEM 2 ... 45
GRAF 11POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ PŘI MĚŘENÍ OBOU ELEKTRODOVÝCH SYSTÉMŮ S PŘIDANÝM ENZYMEM 1 ... 46
GRAF 12POROVNÁNÍ MĚŘENÍ S IMOBILIZOVANOU SMĚSÍ ELEKTRODY A A ELEKTRODY B ... 47
10
1 ÚVOD
Práce se zabývá obecným popisem enzymu a zkoumáním technik jeho imobilizace. Tato biomakromolekula slouží ke vzniku a urychlování elektrochemických reakcí v těle, jenž probíhají nepřetržitě a pomáhají správné funkčnosti lidského organismu. V dnešní době je známo více než 3000 enzymů, přičemž každý svou specifičností ovlivňuje jinou látku. Bakalářská práce zkoumá enzymy specifické pro glukosu, díky kterým jsme schopni určit hladinu cukru v krvi, glykemii. Konkrétně enzym glukosaoxidasa je v tomto odvětví nejdůležitější, jelikož díky jeho funkci vzniká produkt právě potřebný pro měření glykemie. Nemoc spojená se zvýšenou hladinou cukru v krvi, Diabetes mellitus, bývá označována jako jedna z nejvíce gradujících a nebezpečných civilizačních nemocí, tudíž si myslím, že zkoumání funkčnosti a vlastností těchto molekul je nadmíru potřebná.
Teoretická část zkoumá obecný popis enzymu, jejich klasifikaci a názvosloví, přičemž enzym GOx je zařazen konkrétně. Dále je také rozebrán komplex enzym – substrát a aktivní centrum enzymu, které je nepostradatelné u enzymových katalytických reakcí. Jsou probírány jednotlivé enzymové reakce, které díky základním oxidačně redukčním reakcím tvoří produkty potřebné k měření koncentrace glukosy. V závěru teoretické části jsou popsány jednotlivé metody imobilizace enzymu, které se svým principem dělí na dvě skupiny, a to fyzikální a chemickou imobilizaci. Byla provedena rozsáhlá rešerše metod imobilizace enzymu na jejichž základu se vybrala metoda imobilizace zesítěním, která je provedena v praktické části práce.
Praktická část slouží k popisu měřícího aparátu, který se skládá z měřícího obvodu a elektrodového systému, kde obě tyto části vychází z diplomové práce Ing. Kláry Fiedorové. Je podrobně popsán měřící obvod s potřebnými úpravami vstupujícího napětí vhodného k použití v této práci. Taktéž byl vyroben vlastní elektrodový systém s použití elektrod se žlábky, kde se předpokládala lepší imobilizace enzymu z hlediska plochy elektrody pro imobilizaci. V experimentálním měření je poté použit, jak vlastní, tak původní elektrodový systém. Výsledky se poté porovnávají a vyhodnocují, jelikož jednotlivé části systému nejsou totožné. Liší se zejména velikostí a tvarem imobilizační plochy elektrody. Zda má tato skutečnost dopad na konečný výsledek měření, je uvedeno v již zmíněné kapitole experimentálního měření.
11
2 TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Glukosa
Sladká, dobře rozpustná látka ve vodě, řadící se do skupiny aldohexos. Při fyzické námaze se rychle vstřebává a tím se stává zásadním energetickým zdrojem pro organismus. Hladina glukosy v krvi je známa pod pojmem glykemie.
Obr. 1 Strukturální vzorec glukosy [1]
[1]
2.2 Enzym
Enzym je proteinová makromolekula, na které probíhají katalytické reakce. Tyto reakce lze chápat jako různé chemické změny, které závisí např. na koncentraci reaktantů či jejich povaze. Urychlení reakce se poté nazývá katalýza. Opakem ke katalýze je inhibice, tedy zpomalení. Enzym tedy řadíme mezi biokatalyzátory. Enzymy se uplatňují téměř ve všech průmyslových odvětvích, kterými jsou potravinářský, textilní a pro nás nejdůležitější lékařský.
Obecně se enzymy dělí do dvou skupin:
- Jednosložkové enzymy
o Tvořen pouze z bílkoviny
- Dvousložkové enzymy (=komplex Holoenzym) o Tvořen z bílkovinné složky Apoenzymu
o Tvořen nebílkovinnou složkou Kofaktorem, kterým může být:
▪ Prostetická skupina – s apoenzymem spojena pevnou kovalentní vazbou
▪ Koenzym – organická molekula nesoucí funkční skupinu, s apoenzymem pojen velmi slabě, často řazen mezi deriváty vitamínů
[1], [2]
2.3 Klasifikace enzymů
V dávných dobách se enzymům připisovaly náhodné triviální názvy s koncovkou -in, přičemž některé používáme dodnes, např. trypsin, pepsin. Následovalo přiřazení koncovky -asa a to vždy podle substrátu, který byl enzymem katalyzován, např. lipasa, amylasa. S rostoucím poznáním ovšem bylo zapotřebí přesné a jednotné nomenklatury. Proto IUB zavedla v roce 1961 systémové názvy. Vzniká
12
Obr. 2 Zámek a klíč [3]
tedy hlavních šest tříd, které jsou pojmenovány podle katalyzované reakce – oxidoreduktasy, transferasy, hydrolasy, lyasy, isomerasy, ligasy. Každému enzymu je přiřazeno kódové číslo, jenž jej jednoznačně klasifikuje.
[3], [4]
2.4 Komplex enzym – substrát
Domněnku o existenci tohoto komplexu vyslovili v roce 1913 britští enzymologové Mentenová a Michaelis. Jak je jistě patrné, komplex (SE) vzniká sloučením substrátu (S) s enzymem (E), obecné schéma reakce je vyjádřeno rovnicí (2.1):
𝑆 + 𝐸 ↔ 𝑆𝐸 (2.1)
Má-li vzniknout komplex, musí se srazit molekuly vstupujících látek. Enzymové molekuly jsou ve srovnání s malými substrátovými molekulami obrovské, čímž vzniká podmínka pro reakční prostředí, podle které toto prostředí musí mít vysokou koncentraci molekul substrátu. Reakční rychlost je tedy funkcí substrátové koncentrace a popisuje ji rovnice Mentenové a Michaelise (2.2).
𝑣 = 𝑉[𝑆]
𝐾𝑀+ [𝑆] (2.2)
v…reakční rychlost V…mezní rychlost
[S]…substrátová koncentrace
KM…Michaelisova konstanta, která znázorňuje substrátovou koncentraci při dosažení poloviny mezní rychlosti
[2], [3]
2.4.1 Aktivní centrum
Všechny enzymové reakce probíhají v malé oblasti molekuly, a to konkrétně aktivním centru, popř.
místu. S tímto faktem pracuje teorie zámku a klíče (enzym a substrát). Teorie tvrdí, že do aktivního místa zapadá pouze substrát s vhodnou velikostí a tvarem (viz Obr. 2). Díky aktivnímu centru je tedy každý enzym specifický pro jinou látku.
[3]
13
2.5 Využití enzymu k měření hladiny glukosy
Existuje několik metod pro měření glykemie, např glukometrické testovací proužky, kontinuální glukometry, laboratorní testy nebo fermentační test, jenž pomocí chemické reakce měří hladinu glukosy v moči. Tento typ měření se ale vyznačoval značnou nepřesností. Proto byly vyvinuty metody měření glykémie na základě enzymových reakcí, které jsou považovány za nejpřesnější.
V dnešní době se mezi nejrozšířenější metody měření glykemie, založené na enzymových reakcích, řadí využívání glukosoxidasové a hexokinasové reakce. Vlivem těchto reakcí dochází ke vzniku barevného produktu, volných elektronů či peroxidu vodíku, jenž se dále analyzuje. Základem je enzym, který jakožto bílkovina katalyzuje reakci.
[5]
2.5.1 Glukosaoxidasa
Enzym GOx je označen čísly 1.1.3.4. Toto označení lze chápat jako – třída (oxidoreduktasy), podtřída (donorem H je skupina CHOH), skupina (akceptorem je kyslík), číslo enzymu ve skupině.
Z výše uvedeného kódového čísla je identifikace enzymu jasná. Oxidoreduktasy katalyzují oxidačně redukční reakce. Je to jedna z nejpočetnějších enzymových tříd, přičemž všechny enzymy mají povahu složených bílkovin. Reakce jsou realizovány přenosem vodíku (dehydrogenasy, transhydrogenasy), kyslíku (oxidasy) či elektronů (transelektornasy).
Tento enzym je nezbytný k stanovení glukosy. Základem je oxidace glukosy v přítomnosti GOx obsahující kofaktor FAD (2.3).
𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 + 𝐺𝑂𝑥/𝐹𝐴𝐷 → 𝑘𝑦𝑠𝑒𝑙𝑖𝑛𝑎 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑛𝑜𝑣á + 𝐺𝑂𝑥/𝐹𝐴𝐷𝐻2 (2.3)
𝐺𝑂𝑥/𝐹𝐴𝐷𝐻2+ 𝑂2→ 𝐺𝑂𝑥/𝐹𝐴𝐷 + 𝐻2𝑂2 (2.4) Na detekci právě vzniklého peroxidu vodíku (2.4) jsou založeny dnešní analytické metody. (viz kapitola 2.6)
Peroxid vodíku se dále rozpadá:
𝐻2𝑂2→ 2𝐻++ 𝑂2+ 2𝑒− (2.5)
Dochází ke vzniku kyslíku, vodíku a volných elektronů. Měření úbytku kyslíku se využívá u jiné metody určování glykemie.
[4], [6], [7]
14 2.5.2 Hexokinasa
Jedná se o druhý nejpoužívanější enzym určený k měření glykemie. Výsledkem katalytické reakce (2.6) glukosy a hexokinasy je glukoso-6-fosfát.
𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎𝐻𝑒𝑥𝑜𝑘𝑖𝑛𝑎𝑠𝑎→ 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑜 − 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓á𝑡 (2.6) Vzniká NADP+, jenž se následně redukuje na NADPH
Konečná hodnota NADPH je úměrná koncentraci glukosy v krvi.
[5]
2.5.3 Další využívané enzymy
Mezi další, již méně využívané enzymy, se řadí zejména peroxidasa (POx) a glukosadehydrogenasa (GDH) nesoucí kofaktor NADP+.
Při reakci glukosy a GDH dochází k redukci NADP+ na NADPH (2.7). Právě tento zredukovaný kofaktor je nezbytný pro měření glykemie.
𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 + 𝑁𝐴𝐷𝑃+𝐺𝐷𝐻→ 𝑘𝑦𝑠𝑒𝑙𝑖𝑛𝑎 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑛𝑜𝑣á + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 (2.7) [7]
2.6 Analytické metody
Aby se našlo klinické využití výše popisovaných enzymových reakcí, byla potřeba přijít na metody detekce produktů vzniklých při chemické reakci mezi enzymem a glukosou. Při analýze koncentrace glukosy v krvi pomocí enzymů se nejčastěji využívá elektrochemické metody, méně fotometrické. Tyto metody najdou uplatnění jak v laboratorních, tak domácích podmínkách, což je nezbytné zejména pro pacienty s DM.
2.6.1 Elektrochemická metoda
Metoda spočívá v měření elektrických veličin, nejčastěji elektrického proudu, který lze měřit pracovní elektrodou. V takovém případě se jedná o amperometrickou metodu. Na testovacím proužku
Obr. 3 Hexokinásová reakce [5]
15 se nachází kapilára, skrze kterou je do přístroje nasávána krev. Enzym se podílí na oxidaci glukosy za vzniku glukonolaktonu a peroxidu vodíku (2.8).
𝛽 − 𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 + 𝑂2+ 𝐻2𝑂𝐺𝑂𝑥→ 𝛽 − 𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑛𝑜𝑙𝑎𝑘𝑡𝑜𝑛 + 𝐻2𝑂2 (2.8) Čím více je glukosy v krvi, tím více vzniká peroxidu vodíku. Ten je poté elektrolyticky rozkládán na kationty vodíku a anionty kyslíku. Tyto anionty poté putují k anodě, čímž vzniká jejich proud, který se následně měří glukometrem jako proud elektrický.
[8], [9], [10]
2.6.2 Fotometrická metoda
Tato metoda je starší, dnes už méně používaná. Do přístroje se vkládá testovací proužek s vrstvou GOx, na který se nanáší krev. Probíhá stejná reakce jako u amperometrické metody (2.8). Opět vzniká, jako odpadní produkt, peroxid vodíku, jenž se bezbarvým chromogenem zredukuje, přičemž díky enzymu POx vzniká barevná látka (2.9). Opět platí, že čím více glukosy v krvi je, tím více vzniká peroxidu vodíku a také barevné látky, která se dále detekuje fotometrií.
𝐻2𝑂2+ 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑘𝑜𝑣𝑎𝑛é 𝑏𝑎𝑟𝑣𝑖𝑣𝑜𝑃𝑂𝑥→ 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑜𝑣𝑎𝑛é 𝑏𝑎𝑟𝑣𝑖𝑣𝑜 + 𝐻2𝑂 (2.9) Nevýhodou měření je zkreslení výsledků vnějším zdrojem světla a dlouhá doba měření.
[8], [10]
2.6.3 Konduktometrická metoda
Tento způsob měření je založen na schopnosti vedení elektrického proudu elektrolytem. Změny vodivosti sledované u biochemických reakcí vyžadují spotřebu či produkci iontů, nebo změnu velikostí nabitých částic. Tímto způsobem se nejčastěji stanovují neutrální lipidy, které po lipázovém štěpení poskytnou H+ ionty. Lze také stanovit močovinu při reakci s ureázou.
[9]
2.7 Imobilizace enzymu
Dle principu se mezi imobilizační techniky enzymu nejčastěji řadí:
- Fyzikální
o Absorpce o Zachycení o Zapouzdření - Chemický
o Zesítění
o Kovalentní vazba
16 Enzymy jsou rozpustné ve vodě, proto je, pro jejich další použití, nezbytná opětovná izolace. Tento problém se vyřešil nalezením výše uvedených technik, pomocí kterých se enzym upevní na daný nosič.
Mezi výhody užití těchto technik se řadí např. opakované užití enzymů či jejich zvýšená stabilita.
Činnost enzymů závisí na jejich aktivitě. Aktivita je popsána jako rychlost reakce, kterou enzym katalyzuje. Jednotku je katal (kat). Katal určuje kvantum enzymů, jenž způsobují přeměnu molu substrátu za sekundu. V praxi se užívají zlomky jednotky, jelikož je příliš velká (nkat, ukat).
Největším kritériem při výběru dané metody jsou vlastnosti daného enzymu, dostupnost chemikálií a vybavenost laboratoře, jelikož se jedná o značně náročné operace, vyžadující přesných postupů a chemické čistoty.
Při imobilizaci je nezbytné dodržet:
1. Zachování aktivity a specifičnosti enzymu
2. Zabránění vzniku nespecifických vazeb z následku imobilizace 3. Vyhnutí se extrémním podmínkám – teplota, iontové síly, pH…
[9], [11]
2.8 Fyzikální imobilizace
Princip fyzikální imobilizace spočívá v zachycení enzymu pomocí van der Waalsových sil či vodíkových můstků, zachycení v sol-gel materiálu, gelu či polymeru. Jelikož byl tento typ imobilizace vyvinut poměrně dávno, je považován za jednodušší, ovšem ne tak přesný jako chemický.
2.8.1 Absorpce
Jedná se o nejrychlejší, nejjednodušší a nejlevnější imobilizační techniku. Enzym se v roztoku naváže na pevný nosič pomocí slabých sil, většinou elektrostatických, např. van der Waalsových, vodíkových či iontových a za vhodných podmínek, jenž udržují enzymatickou aktivitu. Neabsorbované molekuly enzymu se z povrchu odstraní promytím pufrem. Jelikož nedochází k téměř žádnému poškození enzymové aktivity ani nosičů, může se tato technika opakovaně používat. Největší nevýhodou jsou bohužel velice slabé fyzikální síly – vlivem změny teploty či pH může docházet k vyluhování enzymů. Příkladem absorpce může být imobilizace GOx na kyselinu tříslovou modifikovanou CFO.
[12], [13], [14], [15]
Obr. 4 Fyzikální absorpce [19]
2.8.2 Zachycení
Enzym není přímo připojen k povrchu nosiče, ale zachycen v polymerní síti – gelové, organické či anorganické mřížce, která umožňuje překročení pouze substrátu či produktu. Proces probíhá ve dvou krocích – enzym se smíchá s roztokem monomeru, a poté dochází k polymeraci tohoto roztoku změnou
17 podmínek, nebo chemickou reakcí. Jelikož je enzym uzavřen v síti mřížky, moha by tato metoda zlepšit stabilitu daného enzymu a minimalizovat jeho vyluhování. K vyluhování může ale docházet vlivem velkých pórů mřížky nosiče. Mezi běžné nosiče se řadí agar, želatina či triacetát celulózy.
[12], [15], [16]
Obr. 5 Zachycení [19]
2.8.3 Zapouzdření
Je to způsob zachycování, při kterém jsou enzymy uzavřeny v polopropustné sférické membráně – ta může být např. lipoidní či polymerní. Membrána umožňuje molekulám malé velikosti, jako je substrát nebo produkt difuzi dovnitř a ven, kdežto enzym je stále obklopen touto membránou, tím pádem vzniká minimální riziko jeho úniku. Jednou z nevýhod této metody je požadavek na přesnou kontrolu velikosti pórů membrány.
[15]
Obr. 6 Zapouzdření [19]
2.9 Chemická imobilizace
Při chemické imobilizaci se tvoří nové vazby mezi enzymem a nosičem. Tento typ imobilizace je novější, mnohdy rychlejší a také přesnější. Ovšem kvůli náročnosti, a to jak finanční, tak časové (příprava), je volba typu imobilizace složitá.
2.9.1 Zesítění (Cross-linking)
Jedná se o rychlou a jednoduchou metodu prováděnou tvorbou inter-molekulárních zesítění kovalentními vazbami mezi molekulami enzymu. Technika je prováděna za pomoci multifunkčního činidla, např. glutaraldehydu, potřebného pro připojení enzymových molekul do zesítěných trojrozměrných agregátů. Pokud enzym nemá dostatek volných aminoskupin, přidává se inertní bílkovina s potřebným množstvím volných aminoskupin, např. BSA (albumin).
18 Rozeznáváme dva typy zesíťující imobilizace:
- CLEC – použití zesíťujícího enzymového krystalu
o Výhodou je denaturační odolnost – tepelná, způsobená organickým rozpouštědlem, nebo proteolýzou
o Nevýhodou je krystalizace enzymu vyžadující enzym velmi vysoké čistoty (nákladné) - CLEA – použití zesíťujícího enzymatického agregátu
o Jednoduchá příprava ve dvou krocích – precipitace proteinů a stabilizace agregátů síťováním nejčastěji s glutaraldehydem
Obě metody pracují s glutaraldehydem, který se řadí mezi nejrozšířenější univerzální reaktanty v technologii enzymové. U CLEA je potřebný pro intermolekulární enzymové zesítění, jenž zabraňuje uniknutí enzymu z povrchu nosiče a zároveň zvyšuje stabilitu biokatalyzátoru. Mezi glutaraldehydem a enzymem dochází ke tvorbě retikula, které se váže na povrch senzoru.
Díky těmto pozitivům se bakalářská práce v praktické části zabývá právě touto metodou.
[12], [15], [17]
Obr. 7 Cross-linking [19]
2.9.2 Kovalentní vazba
U této metody se pomocí kovalentních vazeb vytváří pevné komplexy funkčních skupin na molekulách enzymu a nosiče. Mezi takové skupiny se řadí např. karboxylová skupina, aminoskupina, fenolová, thiolová, hydroxylová či imidazolová skupina.
Imobilizace kovalentní vazbou poskytuje velice silné vazby mezi enzymem a nosičem, proto téměř nedochází k úniku enzymu. Poměrně vysoké riziko vězí v denaturaci enzymu, jelikož během procesu prochází různými chemickými modifikacemi, jež mohou poškodit funkční enzymovou skupinu.
Obr. 8 Kovalentní vazba [19]
[15]
19
3 REŠERŠE
3.1 Úvod a východiska rešerše
Hlavním cílem rešeršní práce bylo vyhledat metody imobilizace enzymu GOx, s jejich následným popisem. Bylo nezbytné zjistit, na jakém principu fungují a jaký přínos má daná technika pro medicínu.
Bylo použito několik níže uvedených e-databází, přičemž jednotlivé články se volily dle četnosti citací a roku vydání.
Celá rešerše je uvedena v příloze A.
3.2 Příprava rešerše
Formulace tématu: Imobilizace enzymu
Klíčová slova: ((immobilization AND enzyme AND glucose oxidase)) OR (adsorption) OR (covalent bonding)
Časové rozmezí: 2015–2019 Jazykové vymezení: Angličtina Typy dokumentů: Odborné články
EIZ: Science Direct, Web of Science, IEEE Xplore, Nature, Science
3.3 Závěr rešerše
Rešerše ukázala, že existuje nepřeberný počet typů imobilizací, které se liší buďto principem – fyzikální, chemický, nebo jednotlivými modifikacemi prvků procesu. Asi nejčastěji byla nalezena imobilizace pomocí fyzikální absorpce, jelikož je považována za nejrychlejší a nejlevnější, což sebou nese jistá úskalí hlavně co se úspěšnosti týče. Důsledkem nejpočetnějšího užití jsou desítky forem těchto fyzikálních nosičů na bázi vzácných kovů či pracujících se základními fyzikálními silami.
Bakalářská práce se zabývá typem zesítění ,,cross-linking‘‘, jenž funguje na principu tvorby silných chemických vazeb mezi enzymy, které se pomocí multifunkčního činidla vážou na povrch nosiče čímž nedochází k jejich úniku.
20
4 PRAKTICKÁ ČÁST
Na základě provedené rešerše a dostupnosti řešení byla vybrána pro imobilizaci metoda zesítění.
Kvůli náročnosti metody proběhlo několik konzultací s odborným pracovištěm z VUT. K ověření funkčnosti imobilizační techniky bude využit měřící obvod a systém elektrod vytvořený v diplomové práci Ing. Kláry Fiedorové. [18] Prvotní míchání chemikálií a tvorba roztoků byla kontrolována Mgr.
Zdenkou Fohlerovou Ph.D. Měřící obvod je sestaven na nepájivém poli, bylo tedy nezbytné sestavit elektrodu vybavenou vývody vhodnými k aplikaci na pole. Elektrodový systém, vhodný k měření koncentrace glukosy v krvi, musel být dosazen do výše zmíněného měřícího obvodu, který napájel elektrodu zdrojovým napětím vhodným k měření signálu odpovídajícího koncentraci glukosy. Také se do něj zavádí dvě elektrody a musí být schopen pojmout určité množství roztoku.
Principem měřícího obvodu je přenos elektrické energie skrze roztok čisté glukosy z jedné elektrody do druhé. V tomto roztoku se nachází volné ionty, které pomocí přivedené elektrické energie tvoří elektrický proud. Proto bylo nezbytné vytvořit systém o dvou elektrodách, kde jedna zajišťuje přívod napětí a druhá detekuje vzniklý elektrický proud. Tento proud je ale velice malý, proto musí být obvod schopen detekovat a vyhodnocovat i takto malé proudy.
Enzym se do roztoku přidává z důvodu obrovského množství volných iontů v krvi, jenž dokážou přenášet elektrickou energii. Přidaný enzym zajistí reakci pouze s určitým druhem molekuly, konkrétně glukosou. Po přidání enzymu reakce probíhá rychleji a vzniklý proud je nepatrně vyšší.
Při reakci enzymu a glukosy vzniká glukonolakton a peroxid vodíku, jenž se dále rozkládá na kyslík a vodík. Tímto rozkladem dochází ke zvyšování elektrického proudu. Aby k tomuto rozkladu došlo, je potřeba zajistit, pomocí napěťových děličů, potenciál 0,6 – 0,69 V. Jelikož se na výstupu neměří proud ale napětí, byly do obvodu za druhou elektrodou zakomponovány operační zesilovače, které převádí proud na napětí.
Důležitou hodnotou roztoku je koncentrace glukosy. Při průchodu proudu čistým roztokem glukosy pozorujeme na výstupu nižší napětí, než při použití glukosy a enzymu. Z teoretických znalostí víme, že roztoky s nižší koncentrací, budou na výstupu ukazovat nižší napětí než roztoky s koncentrací vyšší.
V roztoku s menší koncentrací je totiž méně volných iontů přenášejících elektrickou energii.
[18]
21
4.1 Vlastní elektrodový systém
Základem konstrukce bylo zvolení vhodných materiálů, které neovlivňují chemické procesy mezi glukosou a enzymem a umožňují přesné měření. Proto byly vybrány pozlacené elektrody, jelikož zlato nikterak neovlivňuje chemické reakce v roztoku. Jako nádoba pro aplikaci roztoků byla zvolena silikonová hadička, která svými rozměry umožňovala snadnou aplikaci chemikálií a správné uchycení elektrod. Silikon svými vlastnostmi, podobně jako zlato, neovlivňuje funkčnost systému, proto byla jeho volba jasná.
Elektrodový systém se do nepájivého pole připojí pomocí patice, respektive pomocí pinheadů, které správně zapadají do zdířek nepájivého pole. Tato součástka zajišťuje, skrze měděný drát, přívod a odvod napětí z elektrody k dalšímu zpracování.
Obr. 9 Návrh elektrodového systému
- Silikonová hadička tvoří prostor, do kterého jsou vstřikovány roztoky a přidáván enzym. Díry pro zavedení elektrod jsou vyvrtány v různé výšce. Průměr hadičky je 6 mm, výška nad těsněním činí 9 mm. Prostor pro zavedení roztoku činí 2,545 ∙ 10-4 l.
- Těsnění je vyrobeno z tyčinky používané v tavné pistoli. Tyčinky jsou složeny ze směsí syntetických pryskyřic, parafínu a kopolymeru, přičemž směs je absolutně nevodivá a nijak neovlivňuje probíhající chemické reakce.
- Patice zahrnuje dvouřadý systém se šesti vývody.
- Měděný drát spojuje pozlacenou elektrodu s vývodem patice. V našem případě jejich délka není podstatná.
- Elektrody tvoří základ celého systému. Tyto dva malé válečky spojuje měděný drát s vývodem patice a jsou upevněny v silikonové hadičce. Elektrody mají průměr 1,6 mm a délku 17 mm.
Imobilizovaný enzym se aplikuje do žlábku v přední části elektrody (viz Obr. 10).
[18]
22
Obr. 10 Detail žlábku elektrodového systému
Na pracovní elektrodu je přiváděno napětí a je na ní aplikován imobilizovaný enzym. Z druhé elektrody je odváděn signál dále do obvodu, kde se následně zpracovává. Žlábkovité elektrody byly zvoleny z důvodu snadné aplikace enzymu s poměrně vysokou šancí jeho uchycení
V experimentálním měření byly použity dva elektrodové systémy. V rámci různorodosti a porovnávání výsledků byl vypůjčen elektrodový systém vyrobený Ing. Klárou Fiedorovou, který taktéž sloužil jako inspirace k tvorbě vlastního elektrodového systému.
Obr. 11 Vlastí elektrodový systém
23
Obr. 12 Elektrodový systém Ing. Fiedorové
Principiálně se jedná o stejný systém, pouze jednotlivé elektrody jsou jiného rozměru. Konkrétně v průměru se liší o 1 mm. Vlastní systém obsahuje soustavu elektrod o průměru 1,6 mm, tento systém disponuje elektrodami o průměru 0,6 mm. Taktéž tvar elektrod je různý. Dopad, který bude mít tato skutečnost na celý proces, bude vysvětlen v kapitole experimentálního měření. (viz kapitola 5)
4.2 Měřící obvod
Hlavním předpokladem byl vznik velmi malého proudu, čímž vznikla podmínka sestavit obvod tak, aby byl schopen zpracovávat takto malé hodnoty. Dále bylo nezbytné přivést napětí v rozmezí 0,6 – 0,69 V na pracovní elektrodu, kvůli správné reakci peroxidu vodíku, konkrétně jeho rozkladu. Obvod taktéž musí být schopen převést proud na hodnoty napětí, jenž je pro tyto účely vhodnější. Po zpracování těchto podmínek a předpokladů byl navrhnut obvod, který zajistí přívod potřebné hodnoty napětí pracovní elektrodě, dále dokáže měřit proud a následně jej převést na výstupní napětí. Zdroj napětí a měřidla na výstupu jsou nezbytné součásti obvodu.
24
Obr. 13 Schéma měřícího systému
Zdroj napětí je sestaven z dvou tužkových baterií o hodnotě 1,5 V. Jsou zapojeny do série, díky čemuž získáváme zdroj o napětí 3 V. Ze získaného zdroje se lehce dosáhne potřebných 0,6 – 0,69 V.
Navrhovaný obvod nejdříve musí transformovat napětí na požadovanou hodnotu, kterou přivádí na pracovní elektrodu. Tato část je sestavena napěťovými děliči a operačními zesilovači, jež jsou zapojeny jako sledovače. Byly použity rezistory o hodnotách 100 a 150 kΩ. Za elektrodovým systémem dochází k detekci proudu, který je přiváděn do operačního zesilovače a následně převeden na napětí. Ke změně záporného na kladné napětí slouží další operační zesilovač. Dále se v obvodu nachází odporový trimer, který se musí před každým měřením zkontrolovat. Elektrodový systém se do obvodu zapojuje pomocí pinheadů. Jako měřidlo byl použit osciloskop a multimetr.
K sestavení obvodu byly použity odporové děliče a čtyři operační zesilovače typu chopper.
V napájecí části je přes napěťový dělič získáno napětí 1,5 V, které je dále vedeno do kladného vstupu OZ, jenž slouží jako sledovač napětí. Na vstupu i výstupu je tedy napětí stejné. Toto napětí je dalším napěťovým děličem opět sníženo na požadovanou hodnotu 0,6 V, přivedeno na druhý OZ, jenž taktéž slouží jako sledovač. Tato hodnota je přiváděna na pracovní elektrodu.
V měřící části se nachází OZ, který převádí proud na napětí, kdy jeho výstupní napětí závisí na hodnotě trimeru, napětí pracovní elektrody a odporu roztoku, ve kterém se nachází elektrody. Do posledního OZ, který je zapojen jako invertor, tedy vstupuje záporné napětí, jenž se mění na kladné.
Toto napětí není nijak zesíleno a je rovno koncentraci glukosy v analyzovaném roztoku.
[18]
25
4.3 Ověření správnosti zapojení
Ke zjištění funkčnosti zapojení se musel obvod modifikovat, viz obrázek níže.
Jak lze zpozorovat, z obvodu byl odstraněn elektrodový systém, za který byl dosazen 600 kΩ rezistor. Odporový trimer je nastaven na hodnotu 1 MΩ. Na vstup přidaného rezistoru je přivedeno 0,6 V, vzniká tedy proud 1µA a konečná hodnota napětí celého obvodu je rovna 1 V.
𝐼 =𝑈
𝑅= 0,6
600000= 1 𝜇𝐴 (4.1)
[18]
Obr. 14 Schéma zapojení [18]
Obr. 15 Modifikace zapojení [18]
26 Pomocí osciloskopu byla tato hodnota ověřena.
4.4 Imobilizace zesítěním
Vybraný typ imobilizace zesítěním vyžaduje přesný postup tvorby imobilizačního roztoku.
Důležitou roli hraje jak typ a plocha elektrody, na kterou se enzym imobilizuje, tak vlastnosti imobilizovaného enzymu. Během procesu tvorby imobilizačního roztoku se muselo dbát na přesné výpočty množství jednotlivých látek a přesného odměření pomocí mikrovah. Tento proces byl prováděn pod odborným dozorem.
Jelikož plocha elektrod je relativně malá, výsledné hodnoty pomocí výpočtů jsou v řádech mikro.
Proto se počítalo s větší plochou elektrody a upravoval se počet použitých jednotek enzymu glukosaoxidasy. Imobilizační roztok se dále upravoval podle potřeby, kdy byla možnost zvýšit viskozitu roztoku přidáním želatiny, či zvýšit počet obsahu enzymu na jednotku plochy. Vyrobený roztok se uschoval v mrazícím zařízení, kde mohl být, kvůli chladnému prostředí, uschován až do doby použití.
Obr. 16 Kontrola funkčnosti obvodu
27 4.4.1 Použitý materiál
K výrobě imobilizační směsi byly použity látky uvedené v tabulce níže.
Tab. 1 Seznam látek a jejich účel
Materiál Účel
50 mg/ml albuminu (BSA) Slouží k ředění množství enzymu na elektrodě a eliminuje nespecifické interakce
5% glycerol Pro uskladnění a stabilizaci enzymu
2% glutaraldehyd (GA) Činidlo pro zesítění enzymu a BSA Glukosaoxidasa (GOx), 110 U/mg Enzym, pomocí něhož se stanovuje
glykemie
50 mM fosfátový pufr Pufr, ve kterém jsou látky rozpuštěny
Dále byl v experimentálním měření použit roztok glukosy o různé koncentraci, který se jako analyt stanovuje. Všechny roztoky se nanášely na zlaté elektrody.
4.4.2 Příprava roztoků Krok 1
- Nejprve bylo zapotřebí vyrobit pufr. Pro jednu tabletu pufru je potřeba 200 ml vody. Takto rozpuštěný pufr byl použit k ředění všech roztoků.
- Pomocí výpočtu bylo dopočítáno množství 25 % glutaraldehydu potřebného pro vytvoření 2%
roztoku glutaraldehydu ředěného pufrem
25 % … 10 𝑚𝑙
2 % … 𝑥 𝑚𝑙 (4.2)
- Výsledné množství činí 0,8 ml
Obr. 17 Pufr
28 Krok 2
- Ke smíchání roztoku glycerolu se opět vycházelo z jednoduché rovnice, kde bylo zapotřebí zjistit množství 99 % glycerolu potřebného pro vytvoření 5% roztoku glycerolu ředěného pufrem.
99 % … 10 𝑚𝑙
5 % … 𝑥 𝑚𝑙 (4.3)
- Výsledné množství činí 0,505 ml
Obr. 18 99 % glycerol
Krok 3
- Roztok albuminu byl připraven smícháním 50 mg BSA a 1 ml pufru.
- Roztok enzymu GOx byl vyroben smícháním 5,7 mg GOx a 1 ml pufru.
Obr. 19 Albumin BSA
29 Krok 4
- Vycházelo se z celkového objemu směsi naneseného na elektrodu. Součtem jednotlivých množství roztoků byl dopočítán konečný počet jednotek enzymu.
63 𝜇𝑙 … 𝑥 𝑈
5 𝜇𝑙 … 1 𝑈 (4.4)
- Počet jednotek enzymů je tedy roven 12,6 U Krok 5
- V dalším kroku bylo nezbytné zjistit počet jednotek enzymu pro konečné množství roztoku GOx (1 ml). Víme, že 20 µl roztoku GOx má 12,6 U, toto číslo se tedy musí dosadit do rovnice ze které vyjde počet jednotek enzymu pro 1 ml.
1000 𝜇𝑙 … 𝑥 𝑈
20 𝜇𝑙 … 12,6 𝑈 (4.5)
- Výsledek činí 630 U Krok 6
- Na etiketě enzymu GOx je psána hodnota jednotek 110 U, pro toto měření je ale potřeba roztok o počtu jednotek rovných 630 U. Je nezbytné dopočítat množství enzymu pro vytvoření potřebného roztoku.
110 𝑈 … 1 𝑚𝑔
630 𝑈 … 𝑥 𝑚𝑔 (4.6) - Konečné množství enzymu GOx je tedy 5,7 mg
Obr. 20 Enzym GOx 110 U/mg
30 4.4.3 Příprava elektrody
Výsledný roztok, o objemu 63 µl, byl smíchán a jeho část nanesena na pracovní elektrodu. Po nanesení se směs nechala zaschnout. Postup míchání konečné směsi je znázorněn v tabulce níže.
Tab. 2 Postup výroby výsledného roztoku a nanesení na elektrodu
Proces
1. Smíchat 40 µl roztoku BSA s 1 µl roztoku glycerolu
2. Přidat 20 µl GOx a promíchat
3. Přidat 2 µl roztoku GA
4. Promíchat a nanést na pracovní elektrodu 5 µl směsi
5. Nechat zaschnout
Výsledná směs byla poměrně tuhé konzistence, což bylo způsobeno glycerolem, který tvoří želatinu. Díky přidanému enzymu byla zbarvena do žluta, nebyla čirá jako např. roztok pufru.
Obr. 21 Imobilizační směs
Směs byla nanesena na elektrodu, kde následně po dobu jedné hodiny schnula. Po zaschnutí byl elektrodový systém připraven k použití a ověření imobilizace enzymu.
Obr. 22 Aplikace imobilizační směsi
31
5 EXPERIMENTÁLNÍ MĚŘENÍ
Během experimentálního měření byly použity 4 typy roztoků glukosy. Roztoky se lišily v molární koncentraci, která má zásadní vliv na hodnotu měřeného proudu. Platí zde jednoduché pravidlo, a to, že čím vyšší molární koncentraci glukosa má, tím vyšší proud bude naměřen. Toto tvrzení je spjato s množstvím volných iontů v glukose, které vedou elektrický proud. Měření s čistou glukosou se provádí z důvodu odhadu chování elektrodového systému, po přidání enzymu totiž dochází k zřetelným změnám, díky kterým lze poznat, zda se imobilizace zdařila či ne. Dále platí, že po přidání enzymu do glukosy, bude hodnota měřeného proudu nepatrně vyšší než u měření s čistou glukosou. Zde záleží na množství přidaného enzymu, čím více enzymu je přidáno tím vyšší napětí je měřeno. Je tedy velice pravděpodobné, že při měření s přidáváním enzymu bude naměřeno vyšší napětí než u měření se směsí s imobilizovaným enzymem. V této směsi totiž zdaleka není tolik enzymu.
V této práci se používaly roztoky glukosy o koncentraci 3, 7, 12 a 18 mM a jako enzym byla vybrána glukosaoxidasa. Množství podávaného enzymu bylo vždy 0,01 g. K vytvoření konečné směsi s imobilizovaným roztokem byl použit enzym GOx disponující aktivitou 110 U/mg. Po každém pokusu měření byl elektrodový systém vymyt destilovanou vodou a až poté mohl být znova použit.
Bylo v plánu vytvoření další směsi enzymu s aktivitou 100 U/mg, ale kvůli nedostačujícím podmínkám, především nemožnosti přístupu do laboratoře, k ní nedošlo. V podkapitole 5.4 budou provedeny výpočty potřebné k výrobě dané směsi a bude uveden závěr, jak by tento enzym ovlivnil měření. Krom roztoků glukosy musely být všechny roztoky, směsi a enzymy uschovány v mrazícím zařízení, aby nedošlo k jejich znehodnocení.
Hlavním cílem práce bylo najít a ověřit metodu imobilizace enzymu, potřebné k měření glykemie.
Během ověřování metody dochází k biochemickým reakcím, jež jsou stěžejní. Tato reakce probíhá jedním směrem, přičemž její rychlost a sílu ovlivňuje koncentrace použitých látek nebo teplota. Reakcí glukosy a GOx vzniká peroxid vodíku, jenž dál reaguje za vzniku vodíku, kyslíku a elektronů. Tyto elektrony jsou poté zaznamenávány ve formě proudu protékajícím referenční elektrodou. Celý proces je popsán v podkapitole 2.5.1.
Postup měření znázorňují následující diagramy.
[18]
32
Obr. 23 Diagram měření s čistou glukosou
Obr. 24 Diagram měření s glukosou a přidaným enzymem
33
Obr. 25 Diagram měření s glukosou a směsí s imobilizovaným enzymem
Na Obr. 26 je vyobrazen měřící systém.
Obr. 26 Měřící systém
34 Cely měřící systém je složen z několika části:
1. Měřící obvod 2. Zdroj napětí 3. Multimetr 4. Kontrolní váha 5. Enzym GOx
6. Pipety s jednotlivými roztoky glukosy 7. Destilovaná voda
8. Injekční stříkačka pro aplikaci analyzovaného roztoku do elektrodového systému 9. Lžíce pro aplikaci přesného množství enzymu do elektrodového systému
10. Sběrná sklenice
Do měřícího obvodu je přivedeno napětí a pomocí trimeru bylo na multimetru upraveno na 1 V. Po úpravě výstupního napětí je měřící obvod připraven. Do elektrodového systému jsou aplikovány roztoky glukosy z pipet, viz Obr. 27.
Obr. 27 Aplikace roztoku
5.1 Měření s elektrodou A
Za elektrodu A je považován vlastní elektrodový systém. Tento systém obsahuje elektrody s malými žlábky, které zde jsou kvůli lepšímu nanesení imobilizační směsi a efektivnímu uchycení.
Systém je podrobně popsán v podkapitole 4.1. Na Obr. 10 lze vidět popisovaný žlábek.
5.1.1 Měření s čistou glukosou
Jak bylo uvedeno v úvodu této kapitoly, při měření s čistou glukosou byly použity 4 roztoky s různou koncentrací, konkrétně 3, 7, 12 a 18 mM. Hodnota koncentrace je zásadní pro měřené napětí na výstupu. Měření s čistou glukosou je důležité pro odhad chování elektrody.
35 Při měření se odečítaly hodnoty ve třech časových okamžicích a pokaždé se měření opakovalo třikrát. Tyto hodnoty byly odečítány pomocí multimetru. Po každém odměření se systém proplachoval destilovanou vodou. Nicméně lze zpozorovat, že v rámci měření jedné koncentrace hodnoty v každém časovém okamžiku rostly. Na elektrodách tedy vždy nepatrné množství glukosy zůstalo, jelikož při měření s čistou glukosou nedochází k jejímu rozpadu. Tuto skutečnost zobrazuje Tab. 3.
Tab. 3 Naměřené hodnoty s roztokem čisté glukosy
Graf 1 Závislost napětí na čase, měření s čistou glukosou
Do grafického okna byl náhodně vybrán zástupce z měření každé koncentrace. Lze zpozorovat, že hodnoty mají poměrně lineární průběh. Jak bylo předpokládáno, s rostoucí koncentrací roste i výstupní napětí, což je způsobeno množstvím volných iontů schopných vést elektrický proud. Výsledky se tudíž shodují s předpokladem a měření lze uznat za úspěšné.
0,9 0,95 1 1,05 1,1 1,15 1,2 1,25 1,3 1,35
0 5 10 15 20
Napětí [V]
Čas [s]
Naměřené napětí závislé na čase
3 mM 7 mM 12 mM 18 mM
[V] počáteční stav [V] po 10 sekundách [V] po 20 sekundách 3 mM
1,001 1,114 1,129
0,998 1,012 1,119
1,015 1,079 1,188
7 mM
1,110 1,147 1,162
1,119 1,127 1,188
1,148 1,162 1,201
12 mM
1,192 1,206 1,212
1,203 1,199 1,225
1,194 1,200 1,247
18 mM
1,253 1,268 1,276
1,285 1,297 1,301
1,287 1,288 1,326
36 5.1.2 Měření s roztokem glukosy a přidaným enzymem 1
V další části měření se aplikovala čistá glukosa, do které byl po určitém čase přidán enzym. Dle předpokladu by výsledné hodnoty výstupního napětí měly být nepatrně vyšší než u měření s čistou glukosou. Jako enzym byl zvolen GOx s aktivitou 110 U/mg. Tato aktivita určuje množství přeměněného substrátu na produkt v určitém časovém intervalu. Tato fáze měření je důležitá kvůli zjištění, jak se elektroda chová po přidání enzymu. Chování lze popsat tak, že reakce dosáhne v určitém časovém intervalu saturace, tedy že dojde k vyčerpání vazeb. Časové rozmezí činilo 10 – 20 s. Po uplynutí zmíněného časového intervalu dochází k postupnému klesání výstupního napětí. Výsledky měření jsou uvedeny v Tab. 4.
Tab. 4 Naměřené hodnoty glukosy s přidaným enzymem 1
Graf 2 Závislost napětí na čase, měření s glukosou a přidaným enzymem 1 0,9
1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6
0 10 20 30 40
Napětí [V]
Čas [s]
Naměřené napětí závislé na čase
3 mM 7 mM 12 mM 18 mM
[V] počáteční stav [V] přidání enzymu
po 10 sekundách [V] po 40 sekundách 3 mM
1,002 1,025 1,108
1,217 1,146 1,316
1,216 1,225 1,302
7 mM
1,110 1,166 1,514
0,660 0,669 1,383
1,012 1,020 1,453
12 mM
1,205 1,205 1,518
1,062 1,066 1,521
1,205 1,215 1,522
18 mM
1,314 1,410 1,523
1,260 1,305 1,444
1,106 1,106 1,309
37 V grafickém okně je opět vykreslen náhodně vybraný zástupce z každého měření. Jak bylo předpovězeno, napětí na výstupu je nepatrně vyšší než výstupní napětí u měření s čistou glukosou.
Roztok se v saturaci blížil k hodnotě 1,5 V. Tato hodnota bude dále ověřena v následujících měřeních.
5.1.3 Měření s roztokem glukosy a přidaným enzymem 2
Jako enzym 2 lze označit opět glukosaoxidasu, ovšem s rozdílnou aktivitou, a to 100 U/mg. Měření bude probíhat za stejných podmínek, jako měření předchozí. Taktéž množství enzymu zůstává stejné.
Jediný rozdíl je v počtu provedení měření. Vždy se měřilo pouze jednou, neboť bylo k dispozici poměrně malé množství enzymu.
Tab. 5 Naměřené hodnoty glukosy s přidaným enzymem 2
Počáteční stav [V] Přidání enzymu po 10 sekundách [V]
Napětí po 40 sekundách [V]
3 mM 1,020 1,093 1,242
7 mM 1,199 1,187 1,397
12 mM 1,268 1,270 1,538
18 mM 1,301 1,300 1,545
Graf 3 Závislost napětí na čase, měření s glukosou a přidaným enzymem 2
Hodnoty výstupního napětí enzymu 2 vůči enzymu 1 nejsou až tak rozdílné. Důležitý fakt hraje poměrně malý rozdíl enzymové aktivity. Jediným zpozorovaným rozdílem byl časový interval saturace, který nastával v rozmezí 15 – 20 s po přidání enzymu.
0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6
0 10 20 30 40
Napětí [V]
Čas [s]
Naměřené napětí závislé na čase
3 mM 7 mM 12 mM 18 mM
38 5.1.4 Měření s imobilizovaným enzymem
Tato fáze měření je v celé práci zcela stěžejní. Hlavním úkolem bylo ověření imobilizace enzymu a následné nanesení na pracovní elektrodu. Ověření spočívá v okamžité reakci roztoku až do hodnoty saturace. Po dosažení této hodnoty výstupní napětí postupně klesá. Výsledky měření jsou uvedeny v Tab. 6.
Imobilizace enzymu proběhla typem zesítění, která je podrobně popsána v podkapitole 2.9.1.
Samotná imobilizace a tvorba potřebných roztoků byla prováděna pod odborným dohledem.
Tab. 6 Naměřené hodnoty glukosy s imobilizovanou směsí
Graf 4 Závislost napětí na čase, měření s glukosou a imobilizovanou směsí 0,9
1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6
0 10 20 30 40
Napětí [V]
Čas [s]
Naměřené napětí závislé na čase
3 mM 7 mM 12 mM 18 mM
[V] počáteční stav [V] okamžitá změna
napětí [V] po 40 sekundách 3 mM
1,198 1,545 1,124
1,101 1,545 1,122
0,976 1,544 0,999
7 mM
1,206 1,544 1,217
1,222 1,544 1,206
1,221 1,544 1,174
12 mM
1,196 1,545 1,312
1,258 1,544 1,324
1,303 1,545 1,289
18 mM
1,283 1,546 1,444
1,307 1,546 1,403
1,306 1,545 1,401
39 Ve všech pokusech měření se hodnota blížila číslu 1,545 V, s konečnou platností lze tedy tuto hodnotu považovat jako saturační. Této hodnoty bylo dosaženo v časovém intervalu 1 – 2 s, čímž došlo ke splnění předpokladu. Chemická reakce se dostavila dříve než v případě přisypání enzymu, protože se všechen imobilizovaný enzym dostal do kontaktu s glukosou okamžitě na rozdíl od přisypání enzymu.
Původně bylo v plánu ověření imobilizace pomocí potenciostatu, ale z důvodu nedostupnosti laboratoře to nebylo možné. Testování úspěšnosti imobilizace enzymu bylo založeno na ověření chování elektrodového systému při měření s čistou glukosou a poté s přidaným enzymem. Pomocí výsledků těchto měření se dalo odhadnout chování elektrodového systému s imobilizovanou směsí.
Dále byla naplánována imobilizace enzymu 2, ale bohužel z nedostupnosti laboratoře a laboratorního vybavení k ní nemohlo dojít. Jak bylo uvedeno v úvodu této kapitoly, v podkapitole 5.4 bude uveden výpočet a závěr, jak by tento enzym působil.
5.1.5 Vyhodnocení výsledků naměřených elektrodou A
Ve všech fázích měření byl splněn základní předpoklad, a to, že čím vyšší koncentrace glukosy byla použita, tím vyšší výstupní napětí bylo naměřeno. Taktéž po přidání enzymu bylo výstupní napětí nepatrně vyšší než u měření s čistou glukosou, čímž byl splněn další předpoklad. Nejpodstatnější fází bylo měření s imobilizovanou směsí. Zde musela daná chemická reakce proběhnout ve velice krátkém časovém intervalu. Tento předpoklad byl opět splněn, přičemž se dosahovalo hodnot saturace.
5.2 Měření s elektrodou B
Jako elektrodu B lze považovat elektrodový systém sestavený Ing. Klárou Fiedorovou. Principem stejný systém, ovšem tvarem elektrod jiný (viz Obr. 12). Nejpodstatnější rozdíl tvořila imobilizační plocha. Zatímco u elektrody A byla plocha žlábkovitá, zde se jednalo o miniaturní ovály. U žlábkovitého tvaru je teoreticky vyšší účinnost uchycení imobilizované směsi. Měření s jinými elektrodami proběhlo z důvodu porovnávání výsledků a ověření funkčnosti.
Měření probíhalo za stejných podmínek, jako měření s elektrodou A. Byly použity stejné roztoky, stejné enzymy a stejná imobilizační směs. Postupy všech fází měření byly taktéž totožné. Jelikož se jednalo o principiálně stejné systémy, předpoklady pro všechny fáze měření se také nemění.
40 5.2.1 Měření s čistou glukosou
Naměřené hodnoty jsou zaznamenány v Tab. 7. Z každé koncentrace byli opět náhodně vybráni zástupci a poté vyneseni do grafu (viz Graf 5). Lze zpozorovat, že výsledné hodnoty jsou o něco málo vyšší, než v případě měření s elektrodou A.
Tab. 7 Naměřené hodnoty s roztokem čisté glukosy (B)
[V] počáteční stav [V] po 10 sekundách [V] po 20 sekundách 3 mM
1,020 1,139 1,146
1,049 1,004 1,116
1,157 1,162 1,170
7 mM
1,142 1,187 1,243
1,143 1,212 1,244
1,211 1,228 1,243
12 mM
1,286 1,295 1,345
1,215 1,288 1,302
1,297 1,358 1,393
18mM
1,345 1,345 1,445
1,347 1,361 1,400
1,347 1,398 1,421
Graf 5 Závislost napětí na čase, měření s čistou glukosou (B) 0,9
1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5
0 5 10 15 20
Napětí [V]
Čas [s]
Naměřené napětí závislé na čase
3 mM 7 mM 12 mM 18 mM
