VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ
BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
STŘEDOEVROPSKÝ TECHNOLOGICKÝ INSTITUT
CENTRAL EUROPEAN INSTITUTE OF TECHNOLOGY (CEITEC)
SKUPINA EXPERIMENTÁLNÍ BIOFOTONIKY
EXPERIMENTAL BIOPHOTONICS GROUP
AUTOFOKUSAČNÍ MODUL PRO KOHERENCÍ ŘÍZENÝ HOLOGRAFICKÝ MIKROSKOP
AUTOFOCUS MODULE FOR COHERENCE CONTROLLED HOLOGRAPHIC MICROSCOPE
STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST
STUDENT PROFRSSIONAL ACTIVITY OBOR: 2 FYZIKA
JIHOMORAVSKÝ KRAJ
AUTOR PRÁCE Jakub Dokulil
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE Ing. Zbyněk Dostál, Ph.D.
SUPERVISOR
Brno 2019
Abstrakt
Koherencí řízený holografický mikroskop je zařízení, které kromě pozorování buněk umožňuje také jejich kvantitativní analýzu, avšak pro získání kvalitních dat je zapotřebí aby byl správně nastavený, což mimo jiné závisí na defokusaci vzorku. Tento problém je v současnosti řešen softwarovým autofokusem, který se pro některé aplikace jeví jako méně vhodný. Proto byl navržen přídavný autofokusační modul, využívající metodu axiální lokalizace pomocí výrových svazků. Optická sestava byla počítačově simulována v programu Zemax. Pro sestavu byla navržena vhodná spirální maska. Na základě simulací byla sestavena experimentální sestava, která byla otestována.
Klíčová slova
Vírové svazky, axiální lokalizace, holografický mirkoskop, optický design.
Abstract
Coherence-controlled holographic microscope is a device that, in addition to observing cells, also allows quantitative analysis, but it is necessary to set it up properly to obtain quality data, which depends, among other things, on defocusing the sample. This problem is currently solved by software autofocus, which appears to be less suitable for some applications. That is why an additional autofocus module was designed based on the method of axial localization using vortex beams. The optical setup was computer-simulated in Zemax. A suitable spiral mask has been designed for this system. Based on the simulations, an experimental set has been built and tested.
Key words
Vortex beams, axial localization, holographic microscope, optical design.
Prohlášení
Prohlašuji, že svou Středoškolskou odbornou činnost na téma „Autofokusační modul pro koherencí řízený holografický mikroskop“ jsem vypracoval samostatně pod vedením vedoucího práce a s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou všechny citovány v práci a uvedeny v seznamu literatury na konci práce.
Dále prohlašuji, že tištěná i elektronická verze práce SOČ jsou shodné a nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a změně některých zákonů (autorský zákon) v platném změní.
Brno 22. února 2019
Poděkování
Děkuji dr. Petru Bouchalovi za navržení spirální masky pro experiment a Ing. Jakubu Sadílkovi za její výrobu. Dále bych chtěl poděkovat Gymnáziu Brno, Křenová, konkrétně panu řediteli Mgr. Miroslavu Markovi a paní RNDr. Miluši Barákové za vstřícnost při omlouvání absence, způsobené prací v laboratoři. Největší dík patří dr. Zbyňku Dostálovi, mému vedoucímu, za čas věnovaný mé práci, pečlivost a věcné připomínky.
Obsah
Úvod 1
1 Optická mikroskopie 3
1.1 Světelný mikroskop . . . 3 1.2 Optické víry . . . 7 1.3 Axiální lokalizace . . . 9
2 Cíle práce 13
3 Návrh modulu 15
3.1 Návrh osvětlovací část . . . 16 3.2 Návrh zobrazovací části . . . 18 3.3 Návrh masky . . . 20
4 Realizace experimentu 23
4.1 Sestavení a justáž . . . 23 4.2 Experimenty se SM . . . 25
5 Závěr 28
A Spot diagramy 35
B Snímky vírů 36
Úvod
Koherencí řízený holografický mikroskop je zařízení umožňující ne jen pozorování buněk, nýbrž také jejich kvantitativní analýzu, například získat data o rozložení suché hmoty v buňce. Avšak pro získání dat je klíčové správné naladění mikroskopu, jednou z veličin na které závisí je defokusace vzorku. Ačkoli je mikroskop vybaven softwarovým autofokusem, který se však pro některé aplikace jeví jako méně vhodný. Proto je zapotřebí navrhnout hardwarová autofokusační systém, který bude detekovat axiální polohu vzorku. K tomu je zapotřebí použít vhodnou metodu axiální lokalizace.
Pro detekci axiální polohy se jeví jako vhodné použit metodu axiální lokalizace pomocí vírových svazků. Interferencí dvou vhodně vybraných vírových svazků vzniká dvoulaločnatá rozptylová funkce bodu, která rotuje při defokusaci vzorku. Z její rotace tedy lze získat informaci o velikost a směru defokusace.
1 Optická mikroskopie
1.1 Světelný mikroskop
Mikroskop je jeden ze základních optických přístrojů, který slouží k pozorování malých objektů. Klasické mikroskopy byly standardizovaně navrhovány s tubusovou délkou 160 mm.1 Viz schéma na obrázku 1.1(a). Dnes však většina výrobců vyrábí mikroskopy s objektivy navrženými na nekonečnou tubusovou délku a v mikroskopu je vhodně umístěna tubusová čočka (TL – Tube Lens), která vytváří skutečný obraz pozorovaný okulárem. Viz obrázek 1.1(b). Tím přibývá možnost od sebe vzdálit objektiv a okulár (vzniká „nekonečný“ prostor, odtud označeníinfinite systems) a zde je místo pro vložení různých děličů svazků či dalších komponent. Díky této konstrukci jsou dnes mikroskopy modulárními systémy, které uživateli dovolí kombinovat různé pozorovací, mikromanipulační a spektroskopické metody, není obtížné k nim přidávat různé moduly a tím je měnit. Jednotliví výrobci používají tubusové čočky s různými ohniskovými vzdálenostmi, nejčastěji mezi 160 a 200 mm [1].2 Dnes světelné mikroskopy nachází uplatnění především ve vědách o živé přírodě.
1.1.1 Mikroskopové objektivy
Mikroskopový objektiv (MO) je optická soustava zobrazující předmět do nekonečna. Objektiv je charakterizován několika vlastnostmi.
Zvětšení je asi nejdůležitější vlastností MO. Udává kolikrát zvětšený obraz vznikne.
Numerická apertura 𝑁𝐴 je veličinou určující velikost zorného pole objektivu. Je dána vztahem𝑁𝐴=𝑛sin𝛼, kde𝑛je index lomu prostředí a 𝛼je úhel, který svírá aperturní paprsek s optickou osou. S rostoucí numerickou aperturou roste rozlišení a zvětšení, avšak klesá velikost zobrazeného pole.
Pracovní vzdálenost (WD) udává vzdálenost, do které je zapotřebí umístit předmět, aby jej objektiv zobrazil s minimálním vlivem optický vad.
Korekce barevné vady – objektivy jsou dle optického návrhu děleny na:
Achromáty – objektivy, které mají korigovanou barevnou vadu pro dvě vlnové délky.
Apochromáty – objektivy s korigovanou barevnou vadou pro tři vlnové délky.
Superchromáty – objektivy s korekcí barevné vady pro čtyři vlnové délky.
Korekce zklenutí – objektivy jsou jsou často korigovány na zklenutí obrazového pole a jsou označovány Plan.
Korekce sférické vady – při biologickém pozorování je často vzorek zakryt krycím sklí- čkem, které do systému vnáší sférickou vadu. Tloušťka sklíčka je vyznačena na objektivu.
1Tento standart byl přijat během 19. století Royal Microscopical Society.
2Konkrétně: Nikon a Leica používají 200 mm, Olympus 180 mm a Zeiss 165 mm.
Mikroskopový objektiv
Vzorek Polní rovina Okulár
(a)
Mikroskopový objektiv
Vzorek umístěný v předmětové ohniskové rovině objektivu
Tubusová čočka Okulár
Polní rovina
(b)
Obrázek 1.1: Optická konstrukce mikroskopu. (a) Schéma klasického mikroskopu. (b) Schéma moderních mikroskopů.
KAPITOLA 1. OPTICKÁ MIKROSKOPIE 1.1. SVĚTELNÝ MIKROSKOP
Obrázek 1.2: Rozptylové funkce dvou blízkých bodů. Na levém obrázku jsou body rozlišitelné.
Na prostředním obrázku jsou body vzdáleny na minimální vzdálenost – dle Rayleighovo rozlišovací schopnosti. Na pravém obrázku jsou body nerozlišitelné. Převzato a upraveno z [2].
Některé objektivy jsou vyráběny s nastavitelným korekčním optickým členem pro různé tloušťky krycích sklíček.
Rozlišení objektivu je omezeno difrakcí na jeho aperturní cloně, je-li objektiv dokonale navržen a vyroben. Pak se každý předmětový bod zobrazí jako difrakčně limitovaná stopa, rozptylová funkce bodu (PSF – Point Spread Function). PodleRayleighova kritériajsou dva body rozlišitelné, pokud maximum intenzity jedné PSF leží v prvním minimu intenzity druhé PSF, viz obrázek 1.2 [2]. Pak vzdálenost maxim obou PSF je nazývána rozlišení 𝑑, které je dáno vztahem
𝑑= 0,61·𝜆
𝑁𝐴 , (1.1)
𝜆 je vlnová délka světla a 𝑁𝐴 numerická apertura objektivu.
1.1.2 Holografický mikroskop
Běžné metody používané v mikroskopii umožňují pouze kontrastní pozorování buněk a nedokáží získávat kvantitativní data o buňkách (např. rozložení hmotnosti). Tato data lze získat pomocí kvantitativního fázového zobrazování (QPI - Quantitative Phase Imaging).
Nejhojněji zastoupenou technikou QPI je digitální holografická mikroskopie (DHM).
Koherencí řízený holografický mikroskop (CCHM – Coherence Controlled Holographic Microscope), jehož schéma lze vidět na obrázku 1.3 [3], je v principu interferometrem. Světlo z nekoherentního zdroje S je rozděleno děličem BS1 do dvou větví, referenční a předmětové.
Kolektor L a kondenzory C osvětlují rovinu vzorku SP a referenční rovinu R. Tyto roviny jsou objektivy O a tubusovými čočkami TL zobrazeny na difrakční mřížku DG (v předmětové větvi) a na zrcátko M2 (v referenční větvi). Mřížka DG a zrcátko M2 jsou výstupními objektivy OL zobrazeny do výstupní roviny OP, kde vzniká interferencí hologram, který je zaznamenávaný detektorem D.
Je známo, že rozložení suché hmoty buňky odpovídá hodnotám fázovému snímku [4], který lze získat numerickým zpracováním hologramu [5], tento mikroskop tudíž umožňuje přímé vážení buněk, viz obrázek 1.4 [6].
Obrázek 1.3: Schéma koherencí řízeného holografického mikroskopu. Zdroj světla (S), kolektor (L), děliče svazku (BS), zrcádka (M), kondenzory (C), rovina vzorku (Sp), referenční rovina (R), mikroskopové objektivy (O), tubusové čočky (TL), difrakční mřížka (DG), výstupní čočka (OL), výstupní rovina (OP), detektor (D). 𝛼 je difrakční úhel prvého řádu difrakční mřížky DG. Převzato a upraveno z [3].
Obrázek 1.4: Fázové obrázky buněk pořízené CCHM TESCAN Q-PHASE [6].
Klíčové pro kvalitu dat získávaných CCHM je jeho seřízení. To je charakterizováno veličinou holografický signál 𝑤[7]. Tato veličina je dána vztahem
𝑤(𝑞⃗𝑡;𝑞⃗𝑓,Δ𝐿,Δ𝑧) = 2𝜋
∞
∫︁
0
𝑖𝐾(𝐾)exp (−2𝜋i𝐾Δ𝐿)×
𝑁𝐴𝑠/𝑛
∫︁
0
𝑖𝑇(𝜅)J0{2𝜋𝐾𝜅·𝑞⃗𝑓} ×
× exp[︁2𝜋i𝐾(︁√
1−𝜅2−1)︁Δ𝑧]︁𝜅d𝜅d𝐾. (1.2) První člen vztahu závisí na rozdílu optických drah obou větví Δ𝐿. Druhý je funkcí vektoru posunu obrazů jednotlivých větví ve výstupní rovině 𝑞⃗𝑓 a třetí člen je funkcí defokusace
KAPITOLA 1. OPTICKÁ MIKROSKOPIE 1.2. OPTICKÉ VÍRY
(a) (b) (c)
Obrázek 1.5: Porovnání mezi průměrnými teoretickými hodnotami holografického signálu ̄𝑤𝑡 a naměřeným průměrným holografickým signálem ̄𝑤𝐷 (křivky se symboly). 𝑀 je velikost poměrného zvětšení mezi oběma větvemi. (a) Závislost holografického signálu ̄𝑤 na posuvu obrazových polí⃗pro Δ𝐿 = 0 a 𝑀 = 1. (b) Závislost změny hodnot signálu ̄𝑤 na velikosti Δ𝐿 pro |𝑞⃗𝑓 −𝑞⃗𝑡(𝑀 −1)|= 0µm a 𝑀 = 1. Závislost holografického signálu ̄𝑤 na defokusaci Δ𝑧 objektivu O1 při 𝑀 = 1, |𝑞⃗𝑓|= 0µm a Δ𝐿= 0µm [7].
vzorku Δ𝑧. Vektor𝑞⃗𝑡 = (𝑥, 𝑦) je vektor kartézských souřadnic ve výstupní rovině OP, který je podělen zvětšením mezi předmětovou rovinou v příslušné větvi a výstupní rovinou OP.
Spektrální funkce𝑖𝐾(𝐾) je závislá na velikosti redukovaného vlnového vektoru𝐾 (𝐾 =|𝐾⃗|), funkce 𝑖𝑡(𝐾⃗𝑡) popisuje rozložení intenzity světla v rovině zdroje světla S, 𝐾𝑇 je velikostí příčné složky vlnového vektoru𝐾⃗,𝐾𝑇 =⃒⃒⃒𝐾⃗𝑇⃒⃒⃒,𝜅=|⃗𝜅|=⃒⃒⃒
𝐾⃗𝑇
𝐾
⃒
⃒
⃒.
Jak klíčové je pro mikroskop jeho naladění lze vidět na obrázku 1.5 [7]. Velikost holo- grafického signálu 𝑤 klesá i při drobné změně kterékoli ze tří veličin. Proto je mikroskop vybaven justážními procedurami, které jej před prováděním experimentu naladí a během experimentu jej udržují najustovaný. Systém, starající se aby mikroskop zůstal zafokusován je pouze softwarový.
1.2 Optické víry
Obvyklými pojmy, se kterými pracujeme při popisu vln libovolného původu, jsou amplituda a fáze. Ačkoliv je fáze při popisu elektromagnetických vln pomocnou veličinou, zavedení vlnoplochy, definované jako plochy konstantní fáze, poskytuje názornou představu o šíření a transformaci elektromagnetického záření. V běžných případech je vlnoplocha popsána spojitou funkcí. V rámci standardních metod popisu elektromagnetického záření byly ne- spojitosti vlnoplochy považovány za oblasti, ve kterých popis selhává, a nebyl na ně brán zřetel. Nová oblast moderní fyzikální optiky, nazývaná singulární optika, pracuje se širokou škálou jevů souvisejících s fázovými singularitami optických polí a s jejich fázovou topologií [8]. To nazýváme optickými víry. Vír v optickém slova smyslu je typem fázové nespojitosti, ve kterém má vlnoplocha tvar šroubovice postupující okolo nespojitého centra na optické ose.
Pro každý vír je rozhodující veličinou topologický náboj. Ten udává kolik listů vlnoplocha má, jeho znaménko pak určuje směr rotace. Topologický náboj víru je ilustrován na obrázku 1.6 [9].
Obrázek 1.6: Na obrázku jsou zobrazeny tvary vlnoploch pro víry s různým topologickým nábojem𝑙, fázové masky, kterými jsou tvořeny, a rozptylové funkce bodů vzniklých fokusací daného svazku. Převzato a upraveno z [9].
Pro vznik šroubovité vlnoplochy je zapotřebí posunout fázi svazku v závislosti na azi- mutální poloze a aperturní rovině optické soustavy. Toho bývá dosaženo různě, například pomocí prostorového modulátoru světla (SLM – Spatial Light Modulator) či spirální masky (SM), někdy také spirální fázové destičky. Taková maska obsahuje zóny, ve kterých je měněna velikost optické dráhy tak, aby vytvořil fázový posuv.
1.2.1 Popis vírů
Víry bývají generovány v monochromatických nedifrakčních svazcích, jejich komplexní am- plitudu𝑈 lze popsat vztahem [10]
𝑈(𝑥, 𝑦, 𝑧) = 𝑢(𝑥, 𝑦;𝛼0) exp(i𝛽0𝑧), (1.3) kde propagační konstanta𝛽0 je velikost osové𝑧-ové složky, vlnového vektrou⃗𝑘 a 𝛼0 velikost jeho složky v rovině os𝑥𝑦.𝛽0 =⃒⃒⃒⃗𝑘⃒⃒⃒cos𝜓, 𝛼0 =⃒⃒⃒⃗𝑘⃒⃒⃒sin𝜓. Vektory jsou zakresleny na obrázku 1.7.
Pro vytvoření Besselovského vírového svazku, tak jak je používán v experimentech, je zapotřebí zachovat amplitudu a s azimutální polohou 𝜃 posunout fázi vlny. Fázový posun 𝐹(𝜃) je pospán funkcí
𝐹(𝜃)≈exp(i𝑙𝜃+ i𝜅)
kde 𝑙 ∈ {±1,±2, . . .} je topologický náboj víru a 𝜅 fázový posuv. Komplexní amplituda Besselovského svazku𝑈(𝑟, 𝜃, 𝑧) pak může být psána jako
𝑈(𝑟, 𝜃, 𝑧) = 𝐽𝑙(𝛼0𝑟) exp(i𝑚𝜃+ i𝜅+ i𝛽0𝑧), (1.4)
KAPITOLA 1. OPTICKÁ MIKROSKOPIE 1.3. AXIÁLNÍ LOKALIZACE
x
z
y
~k
¯
0®
0 ÃObrázek 1.7: Vlnový vektor⃗𝑘a jeho složky. Propagační konstanta𝛽0 je jeho složeka ve směru osy 𝑧,𝛽0 =⃒⃒⃒⃗𝑘⃒⃒⃒cos𝜓. 𝛼0 je složka roviny ↔𝑥𝑦, 𝛼0 =⃒⃒⃒⃗𝑘⃒⃒⃒sin𝜓.
kde souřadnice (𝑥, 𝑦) jsou převedeny na polární (𝑟, 𝜃), (𝑥, 𝑦) = (𝑟cos𝜃, 𝑟sin𝜃) a 𝐽𝑙 je Besselova funkce𝑙-tého řádu prvního druhu. Intenzita vírových svazků je závislá na fázovém posuvu𝜅, poloze 𝑧 a azimutální poloze 𝜃.
1.3 Určování axiální polohy pomocí vírů
Velmi slibnou aplikací optických vírů je jejich použití na lokalizaci osové polohy. Nejčastěji je toho využito v mikroskopech pro získání 3D informace. Mikroskop je doplněn o 4𝑓 systém s prostorovým modulátorem světla v aperturní rovině mikroskopu, který vytváří optický vír. Modulací vznikají víry, které spolu interferují a vytváří dvoučetnou rozptylovou funkci bodu (DH PSF – double helix point spread function). Tato funkce má podobu dvoučetné symetrie, která se projevuje jako dvě světlé stopy (laloky). Při praktickém použití metody je sledováno rozostření v předmětovém prostoru, které se projevuje rotací DH PSF. Při pevné pozici detektoru je tak možné z úhlového otočení DH PSF stanovit axiální pozici zobrazeného bodu s nanometrovou přesností [11]. Právě tím že DH PSF na rozdíl od rozptylové funkce běžného svazku rotuje, tak se stává ideální pro tyto účely. Srovnání obou rozptylových funkcí lze vidět na obrázku 1.8 [12].
Technika axiální vírové lokalizace je součástí metod vyvíjených skupinou prof. W. E. Moer- nera, laureáta Nobelovy ceny za chemii v roce 2014 [13]. Vírová rotace obrazu byla úspěšně použita v celé řadě experimentů umožňujících určení polohy a orientace jednotlivých molekul.
Obrázek 1.8: Srovnání standardní a rotující PSF. (a) DH PSF skládající se z dvou laloků při defokusaci vzorku rotuje. Z její rotace lze určit směr defokusace. (b) Standartní PSF, u které se mění pouze velikost stopy [12].
Trojrozměrnou lokalizací světélkujících molekul pomocí DH PSF bylo dosaženo superrozlišení při zobrazení rozlehlých biologických struktur [14]. Vírová lokalizace obrazu bodu byla také úspěšně implementována v metodách koherentní a nekoherentní digitální holografie [15]. Nová technika rotace obrazu využívající vírového samozobrazení rozšířila aplikační potenciál metody a umožnila její použití jak pro fluorescenční, tak i nekoherentně osvětlené transparentní objekty lokalizované v tmavém poli [11].
Obrázek 1.9: Sestava pro axiální lokalizaci. FL jsou Fourierovské čočky,𝑓 jsou jejich ohniska,
±Δ𝑧 je defokusace obrazového bodu, Δ𝛽𝑚 je rozdíl propagačních konstant dvou vln [16].
Při užití spirální masky pro vytvoření opt. vírů, je zapotřebí umístit masku do aperturní roviny mikroskopového objektivu FL1, jak lze například vidět na obrázku 1.9 [16]. Maskou světlo prochází skrz𝑀 soustředných mezikruží o normalizovaných poloměrech𝜌𝑚a největším poloměru 𝑅max. Každé z nich prostorově moduluje vlnoplochu tak, že vzniká jeden vír s topologickým nábojem 𝑙𝑚. DH PSF rotující úměrně defokusaci vzorku vzniká pouze pokud jsou splněny podmínky
𝜌𝑚 = √︂𝑚
𝑀 a (1.5)
𝑙𝑚 = 𝑙0+𝑚·Δ𝑙. (1.6)
Přičemž podmínka (1.5) zajišťuje samozobrazení pro specifické hodnoty defokusačního koe-
KAPITOLA 1. OPTICKÁ MIKROSKOPIE 1.3. AXIÁLNÍ LOKALIZACE
(a) (b)
Obrázek 1.10: Spirální maska. (a) Ilustrace typů spirální masek a jejich výhody či nevýhody [12]. (b) Změna amplitudy a fáze při průchodu maskou [10].
ficientu 𝐴, který lze stanovit vztahem 𝐴 = 𝑅𝑚𝑎𝑥2
2
(︃Δ𝑧
𝑓12 +Δ𝑧′ 𝑓22
)︃
.
Pak má obraz Δ𝑙 laloků, kde Δ𝑙 je rozdíl topologických nábojů použitýchh vírů. DH PSF rotuje úměrně změně koeficientu 𝐴, při změně osové polohy předmětu Δ𝑧 či obrazu Δ𝑧′. Pokud posouváme s detekrorem v obrazovém prostoru, Δ𝑧 = 0, Δ𝑧′ ̸= 0, pak
𝑑𝜙′
𝑑Δ𝑧′ = konst.
Perioda otáčení Λ′ způsobující rotaci DH PSF o 360∘ je dána vztahem 𝑑𝜙′
𝑑Δ𝑧′ = 2π Λ′. Pro𝑁𝐴′ =𝑅max/𝑓2 lze získat velikost Λ′ vztahem
Λ′ = 2𝜆𝑀Δ𝑙
𝑁𝐴′2 . (1.7)
Pokud nastává situace, kdy je detektor stabilní a je pohybováno s předmětem, Δ𝑧 ̸= 0, Δ𝑧′ = 0. Pak lze periodu vyjádřit
Λ = 2𝜆𝑀Δ𝑙
𝑁𝐴2 , (1.8)
𝑁𝐴=𝑅max/𝑓1. Na periody Λ a Λ′ imají vliv maximální průměr mezikruží. Konstrukcí masky tedy lze kontrolovat citlivost systému. Výhody či nevýhody jednotlivých typů masek lze vidět na obrázku 1.10 (a) [12].
2 Cíle práce
Jak bylo zmíněno v části 1.1.2. Koherencí řízený holografický mikroskop je vybaven pouze softwarovým autofokusem, který se pro některé biologické aplikace jeví jako méně vhodný.
Například při mitóze se buňky zakulatí a vzdálí se od sklíčka, na kterém jsou běžně přisedlé.
Pokud je softwarový autofokus nastavený na jednu buňku, která se od sklíčka vzdálí pak se mikroskop přeostří do jiné roviny a ostatní buňky se tím rozostří, což znemožňuje jejich kvantitativní analýzu. Jak lze vidět na obrázku 1.5 (c) správné zaostření mikroskopu je klíčové pro kvalitu obrazu, proto by bylo vhodné mikroskop vybavit autofokusem hardwarovým.
Autofokusační systém bude detekovat axiální polohu krycího sklíčka a při její změně opět zaostří vzorek. Pro autofokusační modul je vhodné využít axiální lokalizaci za pomocí vírových svazků, jelikož z rotace DH PSF lze poznat jak velikost tak směr defokusace.
K vytvoření hardwarového autofokusu je nutné splnit následující cíle:
• teoreticky navrhnout sestavu modulu, která bude využívat metodu axiální lokalizace pomocí vírových svazků,
• sestavu počítačově simulovat a optimalozovat,
• navrhnout pro tuto sestavu vhodnou spirální masku,
• sestavit a najustovat navrženou sestavu,
• otestovat funkčnost sestaveného optického systému.
3 Návrh autofokusačního modulu
Cílem konstrukce, je získat dvoulaločnatou rozptylovou funkci bodu, DH PSF, která nese informaci o axiální poloze vzorku Δ𝑧, pozorovaného mikroskopem. Použití DH PSF je vhodné právě proto, že díky rotaci obrazce lze jednoznačně určit směr, ve kterém je vzorek defokusován, jak lze vidět na obrázku 1.8. Navíc tato technika umožňuje určovat axiální polohu s vysokou přesností.
Modul lze rozdělit na dvě části: osvětlovací a zobrazovací.
Osvětlovací část do systému dodává IR záření, který modul využívá.
Zobrazovací část slouží k zobrazení bodu vzorku, tak aby bylo dosaženo samozobrazení a vznikla DH PSF.
Teoretické schéma modulu lze vidět na obrázku 3.1. Světlo z IR LED je kolektorem zaostřeno do 5µm pinhole, která vytváří bodový zdroj. Záření z bodového zdroje je kolimováno kolimátorem. Svazek projde děličem. Mikroskopový objektiv svazek fokusuje na vzorek, kde vzniká jasný bod. Záření se odrazí zpět do objektivu a následně je odkloněno do zobrazovací části. V zobrazovací části se nachází 4𝑓 systém, zobrazující se zvětšením -1 zadní ohniskovou rovinu objektivu do roviny spirální masky, kde jsou vytvořeny víry. Svazek je tubusovou čočkou zfokusován na kameru, kde vzniká DH PSF. Přehled použitých komponent je v tabulce 3.1.
Pro další možné užití mikroskopu je zapotřebí vybrat vhodnou vlnovou délku, kterou bude autofokusační modul využívat. Ta nesmí být v okolí vlnové délky 1080 nm, jelikož na ní nejčastěji stavěny optické pinzety, viditelné spektrum od 380 nm do 760 nm používá mikroskop pro zobrazení a jakékoli záření o kratších vlnových délkách může způsobovat mutace v buňkách, tudíž je nevhodné pro biologické aplikace. Právě proto byla pro modul vybrána vlnová délka 𝜆 = 850 nm. Jako zdroj záření byla vybrána 1 W LED, podrobné specifikace viz [18].
Tabulka 3.1: Přehled použitých komponent. Všechny optické prvky jsou vyrobeny z optického skla N-BK7 s povrchovou vrstvou pro rozsah vlnových délek od 650 do 1 050 nm. Označení komponent odpovídá „Part Number“ ve webovém katalogu firmy Thorlabs [17].
Komponenta Typ komponenty Ohnisková vzdálenost
Optický průměr
Označní komponenty
Dírková clona – – 20µm P20D
Kolimátor best form čočka 50 mm 25.4 mm LBF254-050
Čočky 4𝑓 systému plan-konvexní čočka 125 mm 25.4 mm LA1986 Tubusová čočka best form čočka 100 mm 25.4 mm LBF254-100
Dělič svazku – – 25.4 mm CCM1-BS014/M
Numerická apertura (NA) 0,25 0,5 0,75 0,95 Pracovní vzdálenost
(WD) 10,5 mm 2,1 mm 0,66 mm 0,25 – 0,16
mm
Rozsah vlnových délek blízké UV – IR
Při návrhu je využito mikroskopových objektivů od firmy Nikon. Tyto objektivy mají velmi dobře korigované vady a jsou použitelné napříč spektrem vlnových délek. Parame- try objektivů jsou v tabulce 3.2. Při návrhu bylo uvažováno o mikroskopovém objektivu jako o paraxiálně zobrazující čočce, protože vnitřní konstrukce objektivu není uživatelsky dostupná, protože optický design objektivu si výrobci chrání. Samotné objektivy mají velmi dobře korigované vady a jsou precizně vyrobeny. Lepší aproximace se tedy pro ně nenabízí.
Systém byl simulován a optimalizován v programu Zemax.
3.1 Návrh osvětlovací část
Záření z LED je fokusováno do dírkové clony o průměru 5 µm. Velikost této clony byla vypočtena tak, aby se zobrazila na vzorek jako difrakčně limitovaný obraz. Proto její velikost byla spočítána z Rayleighova kritéria, rov. (1.1). Clona je zobrazena kolimátorem a mikroskopovým objektivem s celkovým zvětšením𝑍
𝑍 = 𝑓k
𝑓MO,
kde 𝑓k je ohnisková vzdálenost kolimátoru a 𝑓MO je ohnisková vzdálenost mikroskopového objektivu. dva rozeznatelné body jsou dle Rayleighova kritéria jsou od sebe vzdálené
𝑑 = 0,61·𝑍·𝜆 𝑁𝐴 .
Nejmenší obraz je schopen rozlišit objektiv Plan Fluor 20, je schopen rozlišit dva body vzdálené
𝑑= 0,61·5·0,850µm
0,5 = 5,185µm.
Svazek je zkolimován best form čočkou1 s ohniskovou vzdáleností 𝑓𝑘 = 50 mm, jelikož best form čočky jsou nejméně zatíženy sférickou vadou při zobrazování z bodu do nekonečna.
Následně je svazek zfokusován mikroskopovým objektivem na vzorek, kde vytváří difrakčně limitovaný obraz clony.
1Best-form čočky jsou čočky tvarem velmi podobné plan-konvexním, avšak místo rovného povrchu je zakřivený povrch s velkým poloměrem křivosti.
KAPITOLA 3. NÁVRH MODULU 3.2. NÁVRH ZOBRAZOVACÍ ČÁSTI
Dichronické zrcadlo
Kolimátor Dělič svazku
40×
plan fluor
Mikroskopový objektiv
4 f s y s t é m
Spirální maska Tubusová čočka Kamera
20×/0.20 5μm pinhole
Mikroskopový objektiv
IR LED
Obrázek 3.1: Infračervené záření z LED je mikroskopovým objektivem zobrazeno do 5µm dírkové clony. Ta slouží jako pseudobodový zdroj světla. Best form čočka vytváří kolimovaný svazek, který je objektivem zobrazen na sklíčko, od kterého se odráží zpět do objektivu. Za ním je IR záření odděleno od zbytku světla pomocí dichronického zrcátka. Děličem svazku je pak odveden do zobrazovací části. V té je umístěn 4𝑓 systém se spirální maskou, která vytváří dva optické víry. Spirální maska je zároveň umístěna v ohniskové rovině tubusové čočky a na kameře vzniká DH PSF. Celá soustava využívá infračerveném záření o vlnové délce 850 nm.
Dichronické zrcadlo Kolimátor
Dělič svazku
20×
plan fluor
Mikroskopový objektiv
20×/0.20
5 μm pinhole
Rovina vzorku
Obrázek 3.2: Nalevo je teoretické schéma osvětlovací části modulu. Napravo je simulace chodu paprsků provedená programem Zemax.
3.2 Návrh zobrazovací části
Zobrazovací část sestavy vychází ze schématu na obrázku 1.9, na kterém je maska umístěna v aperturní rovině objektivu, v jehož předmětovém ohnisku se předmět nachází. Tato maska generuje dva víry, zobrazené tubusovou čočkou na detektor, na němž vzniká DH PSF, rotující při defokusaci obrazu.
Masku však v tomto případě nelze umístit přímo do aperturní roviny mikroskopového objektivu. Ta se nachází v jeho výstupní pupile a její umístění do ní by způsobilo, že by mikroskop dále nebyl nepoužitelný pro pozorování vzorku. Proto je zapotřebí IR záření odklonit dichronickým zrcátkem do 4𝑓 systému, který zobrazuje aperturní rovinu objektivu se zvětšením -1 do roviny opticky s ní sdružené – do roviny spirální masky. Umístěním spirální masky do této roviny dojde ke vzniku dvou vírových vln, které jsou fokusovány tubusovou čočkou na kameru. Na ní vzniká DH PSF, která má přibližnou velikost difrakčně limitované stopy. Stopu bodu pro soustavu bez fázové masky s objektivem Plan Fluor 20 lze vidět na obrázku 3.4. Stopy bodů zobrazených dalšími objektivy lze vidět v příloze A.
Simulace v Zemaxu nezahrnuje simulaci masky a optických vírů, jelikož Zemax je program pro geometrické simulace a nelze v něm provádět vlnové simulace.
KAPITOLA 3. NÁVRH MODULU 3.3. NÁVRH MASKY
Dichronické zrcadlo Dělič svazku
20×
plan fluoro
Mikroskopový objektiv 4 f systém
Tubusová čočka
Spirální maska Kamera
Rovina spirální masky
Aperturní rovina MO
Rovina vzorku
Obrázek 3.3: Nalevo je teoretické schéma zobrazovací části modulu. Napravo je simulace chodu paprsků provedená programem Zemax.
Plan 10 13,6 1 000 193
Plan Fluor 20 3,4 270 48
Plan Fluor 40 0,94 70 12
Plan Apo 40 1,51 70 12
50 μm
Obrázek 3.4: Stopa bodu zobrazeného zobrazovací částí soustavy s objektivem Plan Fluor 20.
Modré jsou jednotlivé vytrasované paprsky. Černá kružnice je velikost difrakčně limitované stopy bodu.
3.3 Návrh masky
Jak bylo zmíněno v části 1.3, při vytvoření víru pomocí spirální masky ovlivňují její para- metry vzniklé víry. Proto musí být navržena maska pro konkrétní vlnovou délku. Zároveň je zapotřebí zohlednit velikost výstupní pupily objektivu, jelikož ta ovlivňuje velikost svazku.
Pro optimální přesnost detekce defokusace by se měl poloměr největšího prstence co nejvíce blížit k poloměru výstupní pupily.
Pro modul byla navržena spirální maska generující dva víry s topologickými náboji 𝑙1 =
−1 a 𝑙2 = +1. Maska obsahuje dvě soustředná mezikruží která jsou radiálně rozdělena na 8 segmentů, které postupně posouvají fázi v rozsahu 0 až 2π, viz 1.10 (b). Jako substrát pro masku byla vybrána planparalelní deska o tloušťce 1 mm ze skla N-BK7. Na ni je nanesena vrstva PMMA (polymethylmetakrylát) a následně reflexní vrstva, viz obrázek 3.5.
Hloubka jednotlivých zón a poloměry mezikruží byly napočítány Ing. Petrem Bouchal- em, Ph.D. pro dosažení maximální přesnosti modulu s použitými objektivy. Předpokládané přesnosti masky spolu s hloubkami ostrosti lze vidět v tabulce 3.3. Rozměry masky jsou na obrázku 3.6. Hloubku jednotlivých zónℎ(𝑗)𝑖 lze vyjádřit vztahem
ℎ(𝑗) = π8 + (𝑗−1)· π4
2π · 𝜆
𝑛PMMA−1. (3.1)
KAPITOLA 3. NÁVRH MODULU 3.3. NÁVRH MASKY
N-BK7 PMMA Reflexní vrstva
h
Obrázek 3.5: Řez maskou s jednotlivými vrstvami.
Tabulka 3.4: Hloubky ℎ(𝑗) jednolivých zón𝑗.
𝑗 1 2 3 4 5 6 7 8
ℎ𝑗 [nm] 111 332 553 775 996 1 217 1 438 1 660
V tomto vztahu je 𝑗 číslo segmentu, 𝜆 vlnová délka použitého světla a 𝑛PMMA index lomu PMMA. Hloubky pro jednotlivé segmenty lze vidět v tabulce 3.4. Pro výpočet byl použita hodnota 𝑛PMMA = 1,478 viz [20].
1
2 3
4 5 6 7
8
1 2 3 4 56
7 8
Obrázek 3.6: Výkres navržené masky s očíslováním jednotlichých segmentů𝑗. Data z simulací se stala podkladem pro experimentální ověření funkčnosti systému.
4 Realizace experimentu
Podle návrhu modulu byla poskládána experimentální sestava, viz obrázek 4.1. Při realizaci byl pro mechanické uložení jednotlivých komponent použit cage systém od firmy Thorlabs, viz [17]. Ten je tvořen čtyřmi tyčemi, které spojují destičky, do nichž jsou upevněny jednotlivé komponenty. Optické komponenty byly umístěny do malých tubusů, aby byly při manipulaci nedošlo k jejich poškození. Při stavbě experimentálního modulu nebylo použito dichronické zrcadlo, jelikož sestava zatím není napojena na mikroskop, tudíž není zapotřebí dělit IR záření od viditelného světla.
4.1 Sestavení a justáž
Při odměřování vzdáleností byly nejprve změřeny vzdálenosti optických povrchů čoček od hran destiček, následně byla dopočítána a odměřena vzdálenost mezi jednotlivými destičkami, jak lze vidět na obrázku 4.3. Po umístění čočky do takto dané vzdálenosti byla upravena její poloha.
Při sestavovální byla použita dírková clona o průměru 20µm místo 5µm, jelikož se zdála být vhodná pro větší propustnost světla.
Nejprve byla sestavena osvětlovací část modulu. Bylo zapotřebí vyzkoušet různé vzdálenosti mezi diodou kolektorem a 20µm dírkovou clonou pro získání co nejjasnějšího bodového zdroje. Pro osvětlovací část byl nakonec použit jako kolektor mikroskopový objektiv Nikon Plan 20. Po naladění byla clonka nahrazena mřížkou s kruhovými otvory pro snazší seřízení modulu. Kolimátor byl umístěn od mřížky přibližně do vzdálenosti vycházející ze simulací.
Za něj byl připevněn dělič svazku následovaný mikroskopovým objektivem Nikon Plan 10.
Do roviny vzdálené o pracovní vzdálenost tohoto objektivu od vstupní pupily byl umístěn čip CCD kamery a následně byla upravena poloha kolimátoru pro vytvoření rovnoběžného svazku mezi kolimátorem a mikroskopovým objektivem. Poté byla vyměněna mřížka zpět za dírkovou clonu, čip byl nahrazen zrcátkem, které simuluje vzorek, na destičce s mikrometrickým posuvem. V zobrazovací části za děličem svazku byla umístěna první čočka 4𝑓 systému a za ní byla umístěna druhá čočka 4𝑓 systému. Následně bylo odejmuto zrcátko před mikroskopovým objektivem a bylo do objektivu svíceno laserovým svazkem svazkem z He-Ne laseru. Do aperturní roviny objektivu byla umístěna mřížka a pro pozdější vložení masky byla zaznačena rovina, ve které za 4𝑓 systémem vznikal ostrý obraz této mřížky. Za tuto rovinu byla v umístěna tubusová čočka tak, aby její ohnisko leželo v rovině masky. Následně bylo zpět umístěno zrcátko před mikroskopový objektiv a byla za tubusovou čočku umístěna kamera tak, aby v rovině jejího čipu vznikal ostrý obraz dírkové clony. Byla použita kamera Imaging source DFK 51AU02 s rozlišením 1600×1200 a velikostí jendoho pixelu 4,4 µm.
IR LED
Mikroskopový objektiv Dírková clona
Kolimační čočka Dělič svazku Mikroskopový
objektiv Zrcadlo 4f systém Spirální maska Tubusová čočka Kamera
Obrázek 4.1: Experimentální sestava.
KAPITOLA 4. REALIZACE EXPERIMENTU 4.2. EXPERIMENTY SE SM
Tyče
Destička pro uchycení komponent Tubus s čočkou
Obrázek 4.2: Cage systém. Destičky s komponentami jsou připevněny k tyčím cage systému díky 4 otvorům.
1.
2.
3.
Čočka Tubus
Destička pro připevnění komponent
Tyče
Obrázek 4.3: Postup při odměřování vzdáleností mezi jednotlivými čočkami.
4.2 Experimenty se spirální maskou
Jelikož při dokončení sestavení experimentu nebyla vyrobena spirální maska, byl systém prvně otestován se spirální maskou navrženou pro vlnovou délku 650 nm. S touto spirální maskou se úspěšně podařilo zachytit DH PSF, čímž se potvrdilo správné najustování a funkce systému.
Jakmile byla dokončena spirální maska vyrobenáspeciálně pro tuto soustavu, byla do ní vložena. Při prvních experimentech bylo vidět že obraz při defokusaci rotuje, avšak obraz byl velmi malý a laloky nebylo možné od sebe rozlišit, viz obrázek 4.6, proto byla znovu seřízena zobrazovací část systému a tubusová čočka s ohniskovou vzdáleností 𝑓TL100 = 100 mm byla nahrazena tubusovou čočkou TTL200-A od firmy Thorlabs, viz [17], s ohniskovou vzdáleností 𝑓TL200 = 200 mm, pro získání většího obrazu.
Obrázek 4.4: První zachycená DH PSF s maskou navrženou pro vlnovou délku 650 nm. Výška obrázku odpovídá 924 µm.
Obrázek 4.5: Nalevo zapůjčená spirální maska navržená pro vlnovou délku 650 nm. Napravo spirální maska vyrobená podle návrhu z části 3.3.
(a) (b) (c) (d)
Obrázek 4.6: Sfrérickou aberací zatížený obraz získaný při prvním experimentu se spirální maskou navrženou pro tento experiment a s mikroskopovým objektivem Nikon Plan Fluor 20. Mezi obrázky (a) až (d) je rozdíl defokusace 1µm, vzorek je defokusován od od 0 µm do 3µm. Výška obrázku odpovídá 281,6 µm.
KAPITOLA 4. REALIZACE EXPERIMENTU 4.2. EXPERIMENTY SE SM
Po justáži systému byly jednotlivé víry fokusovány do různých vzdáleností na optické ose a ne do jednoho bodu, a tak nevznikla DH PSF. Což bylo způsobeno sférickou vadou. Jak bylo zmíněno v části 1.1.1, objektivy mají korigovanou sférickou vadu pro určitou tloušťku krycích sklíček. Sférická vada se takto neprojevila v předchozím experimentu, jelikož maska navržená pro tento experiment má větší průměr mezikruží, tudíž jimi prochází paprsky vzdálenější od optické osy, které jsou více zatíženy sférickou vadou. Proto bylo před zrcátko simulující vzorek umístěno krycí sklíčko. Vzniklé snímky zachycují oba víry zfokusované do shodné vzdálenosti, což vedlo k jejich interferenci. Jak lze vidět na obrázku 4.7, obraz rotoval při defokusaci vzorku. Výsledné snímky pro tři ze čtyř mikroskopových objektivů lze vidět v příloze B. Systém nebyl otestován s mikroskopovým objektivem Nikon Plan Apo 40, jelikož nebyl zrovna dostupný.Lze vidět že jednotlivé laloky DH PSF se překrývají. To je pravděpodobně způsobeno velikostí zobrazovaného bodu vzorku, jehož jsou rozptylovou funkcí. Proto je při dalších experimentech nutné použít dírkovou clonu o velikosti podle teoretického výpočtu v části 3.1.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Obrázek 4.7: Zachycené víry s objektivem Nikon plan 10 mezi jednotlivými snímky je rozdíl defokusace 16 µm. Snímky jsou pro rozsah defokusace od -48 µm (snímek (a)) po 40 µm (snímek (l)). Výška obrázku odpovídá je 880µm.
zachycením DH PSF se spirální maskou navrženou pro jinou vlnovou délku. Byla navržena a vyrobena spirální maska pro tento systém. Spirální maska byla následně umístěna do systému a po korekci otvorové vady krycím sklíčkem byla zachycena DH PSF, rotující s defokusací vzorku. Avšak jednotlivé laloky zachycené DH PSF nebylo možné od sebe rozlišit, překrývaly se, proto je do budoucna zapotřebí systém vylepšit.
Pro získání lepší DH PSF je zapotřebí použít v experimentu menší dírkovou clonu, která vytváří jasný bod, jehož je rozptylovou funkcí. Dále je do budoucna nutné vytvořit program, který bude rozpoznávat natočení DH PSF. Pro implementaci do koherencí řízeného holografického mikroskopu by bylo vhodné systém zmenšit a následně jej implementovat.
Literatura
[1] GOULETTE, Travis, Charles D. HOWARD a Michael W. DAVIDSON. Infinity Optical Systems. MicroscopyU [online]. Nikon Instruments, 2019 [cit. 2019-02-06]. Dostupné z:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/infinity-optical-systems [2] The Rayleigh criterion [online]. 2018 [cit. 2018-12-30]. Dostupné z:
https://www.researchgate.net/figure/The-Rayleigh-criterion-Two-points-are-regarded-as-just-resolved-when-the-principal_
fig3_298070739
[3] LOŠŤÁK, M; CHMELÍK, R; SLABÁ, M; SLABÝ, T, 2014: Coherence-controlled holographic microscopy in diffuse media. OPTICS EXPRESS 22 (4), p. 4180 - 4195.
DOI: https://doi.org/10.1364/OE.22.004180.
[4] Davides, H. G.; Wilkins, M. H. F.; Chayen, J.; a kol. The Use of the Interference Microscope to Determine Dry Mass in Living Cells and as a Quantitative Cytochemical Method. Quarterly Journal of Microscopical Science, rocčník s3-95, č. 31 1954: s.
271–304.
[5] Harris, F. On the use of windows for harmonic analysis with the discrete Fourier transform. Proceedings of the IEEE, ročník 66, cč. 1 Leden 1978: s. 51–83 ISSN 0018- 9219 doi:10.1109/PROC.1978.10837.
[6] ŠTRBKOVÁ, Lenka, Daniel ZÍCHA, Pavel VESELÝ a Radim CHMELÍK. Automated classification of cell morphology by coherence-controlled holographic microscopy. J. of Biomedical Optics. 2017. DOI: https://doi.org/10.1117/1.JBO.22.8.086008. [7] DOSTÁL, Z. Automatizované procedury pro Koherencí řízený holografický mikroskop.
Vysoké učení technické v Brně, Fakulta strojního inženýrství, 2016, 82 s., Vedoucí prof. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D.
[8] BOUCHAL, Zdeněk. Optické víry – nový směr rozvoje singulární optiky. Čs. čas. fyz.
2003, (1), 11-19.
[9] Světelné víry|Laboratoř. Laboratoř digitální optiky [online]. Olomouc, 2015 [cit. 2018- 09-29]. Dostupné z: http://ldo.optol.cz/cs/?page_id=2711
[10] BOUCHAL, Petr a Zdeněk BOUCHAL. Flexible non-diffractive vortex microscope for three-dimensional depth-enhanced super-localization of dielectric, metal and fluorescent nanoparticles. Journal of Optics. 2017, 19(10). DOI: 10.1088/2040-8986/aa87fb. ISSN 2040-8978. Dostupné také z: http://stacks.iop.org/2040-8986/19/i=10/a=
105606?key=crossref.ce410179bd98028624a42ccbaa6dbf8e
[13] GUSTAVSSON, Anna-Kari. Single-Molecule Projects: Development of Novel Microscopies for Three-Dimensional Super-Resolution Imaging and Tracking of Single Molecules.The Moerner Lab [online]. Stanford: Stanford University Department of Chemistry [cit. 2019-02-11]. Dostupné z: https://web.stanford.edu/group/
moerner/sms_3Dsmacm.html
[14] LEE, Hsiao-lu D., Steffen J. SAHL, Matthew D. LEW a W. E. MOERNER. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys.
Lett. 2012. DOI: https://doi.org/10.1063/1.3700446.
[15] BOUCHAL, Petr a Zdeněk BOUCHAL. Non-iterative holographic axial localization using complex amplitude of diffraction-free vortices.Optics express. 2014, 22(24), 30200 - 30216. DOI:http://dx.doi.org/10.1364/OE.22.030200.
[16] Baranek, M; Bouchal, P; Siler, M; Bouchal, Z, 2015: Aberration resistant axial localization using a self-imaging of vortices. OPTICS EXPRESS 23(12), p. 15316 - 15331, DOI:https://doi.org/10.1364/OE.23.015316
[17] Thorlabs, Inc. [online]. 2019 [cit. 2019-02-12]. Dostupné z: https://www.thorlabs.de/
[18] InfraRed 1W 120°,D8 GT-P04IR4101.GM Electronic [online]. 2019, 2019 [cit. 2019-02- 12]. Dostupné z:https://www.gme.cz/infrared-1w-120-d8-gt-p04ir4101
[19] THE IMAGING SOURCE. Imaging Source Catalog [online]. 2011, 16 s. [cit. 2019-02-21].
Dostupné z:https://ivsimaging.com/Products/The-Imaging-Source-DFK-51AU02 [20] Refractiveindex.info: Refractive index database [online]. 2019 [cit. 2019-02-21].
Dostupné z: https://refractiveindex.info/?shelf=organic&book=poly%
28methyl_methacrylate%29&page=Szczurowski
[21] HALLIDAY, David, Robert RESNICK, Jearl WALKER a Petr DUB. Fyzika. 2., přeprac. vyd. Brno: Vysoké učení technické v Brně, nakladatelství Vutium, 2013.
Překlady vysokoškolských učebnic. ISBN 978-80-214-4123-1.
[22] GRIS-SÁNCHEZ, I., D. VAN-RAS a T. BIRKS. The Airy fibre: an optical fibre that guides light diffracted by a circular aperture[online]. In: . s. 11 [cit. 2018-12-26]. Dostupné z:https://arxiv.org/pdf/1601.03841.pdf
[23] Microscope Objective Specifications.MicroscopyU: The source for microscopy education. [online]. Nikon Instruments, 2018, 2018 [cit. 2019-01-16]. Dostupné z: https://www.
microscopyu.com/microscopy-basics/microscope-objective-specifications
Seznam obrázků
1.1 Optická konstrukce mikroskopu. . . 4
1.2 Rozptylové funkce dvou blízkých bodů. . . 5
1.3 Schéma koherencí řízeného holografického mikroskopu. . . 6
1.4 Fázový obrázek buněk. . . 6
1.5 Porovnání mezi teoretickými a naměřenými hodnotami holografického signálu. 7 1.6 Ilustrace vírového svazku. . . 8
1.7 Vlnový vektor⃗𝑘. . . 9
1.8 Srovnání standartní a rotující PSF. . . 10
1.9 Sestava pro axiální lokalizaci. . . 10
1.10 Spirální masky. . . 11
3.1 Schéma modulu . . . 17
3.2 Schéma a simulace chodu paprsků osvětlovací částí. . . 18
3.3 Schéma a simulace chodu paprsků osvětlovací částí. . . 19
3.4 Stopa bodu zobrazeného zobrazovací částí soustavy. . . 20
3.5 Řez maskou s jednotlivými vrstvami. . . 21
3.6 Výkres navržené masky s očíslováním jednotlichých segmentů 𝑗. . . 21
4.1 Experimentální sestava. . . 24
4.2 Cage systému. . . 25
4.3 Postup při odměřování vzdáleností mezi jednotlivými čočkami. . . 25
4.4 První zachycená DH PSF. . . 26
4.5 Použité spirální masky. . . 26
4.6 Obraz získaný při prvním experimentu s navrženou spirální maskou. . . 26
4.7 Víry získané s objektivem Nikon plan 10. . . 27
A.1 Stopy bodů na kameře pro jednotlivé objektivy. . . 35
B.1 Víry získané s objektivem Nikon plan 10. . . 36
B.2 Víry získané s objektivem Nikon Plan Fluor 20. . . 37
B.3 Víry získané s objektivem Nikon Plan Fluor 40. . . 38
Seznam tabulek
3.1 Přehled použitých komponent. . . 15 3.2 Vlastnosti použitých objektivů. . . 16 3.3 Teoretické hodnoty přesnosti detekce defokusace Δ𝑧 pro jednotlivé objektivy. 20 3.4 Hloubky ℎ(𝑗) jednolivých zón 𝑗. . . 21
50 μm
(a)
50 μm
(b)
50 μm
(c)
50 μm
(d)
Obrázek A.1: Simulace zobrazení bodu zobrazovací částí modulu. Černá kružnice značí Airyho disk. (a) Nikon Plan 10. (b) Nikon Plan Fluor 20. (c) Nikon Plan Fluor 40. (d) Nikon Plan Fluor 40.
Příloha A Spot diagramy
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g) (h)
(i) (j) (k) (l)
Obrázek B.1: Zachycené víry s objektivem Nikon plan 10 mezi jednotlivými snímky je rozdíl defokusace 8 µm. Snímky jsou pro rozsah defokusace od -48 µm (snímek (a)) po 40 µm (snímek (l)). Výška obrázku odpovídá je 880µm.
PŘÍLOHA B. SNÍMKY VÍRŮ
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)
Obrázek B.2: Zachycené víry s objektivem Nikon Plan Fluor 20 mezi jednotlivými snímky je rozdíl defokusace 4µm. Snímky jsou pro rozsah defokusace od -16µm (snímek (a)) po 16 µm (snímek (i)). Výška obrázku odpovídá je 1179,2µm.
(a) (b) (c)
(d)
(e) (f) (g)
Obrázek B.3: Zachycené víry s objektivem Nikon Plan Fluor 40 mezi jednotlivými snímky je rozdíl defokusace 1 µm. Snímky jsou pro rozsah defokusace od -3 µm (snímek (a)) po 3 µm (snímek (g)). Výška obrázku odpovídá je 880µm.
