pro náhrady kostní tkáně při akcelerované degradaci

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE

F2

Fakulta strojní

Ústav mechaniky, biomechaniky a mechatroniky

Diplomová práce

Analýza mechanických vlastností porézních keramických pěn

pro náhrady kostní tkáně při akcelerované degradaci

Martin Vltavský

Praha, 2020

Anotační list / Annotation list

Jméno autora: Bc. Martin Vltavský Fakulta:Fakulta strojní

Zadávající ústav: Ústav mechaniky, biomechaniky a mechatroniky

Studijní program: Strojní inženýrství Studijní obor: Biomechanika a lékařské přístroje

Akademický rok: 2019/2020

Název diplomové práce: Analýza mechanických vlastností porézních keramických pěn pro náhrady kostní tkáně při akcelerované degradaci

Vedoucí práce: Ing. Radek Sedláček, Ph.D.

Konzultant práce: Ing. Tomáš Suchý, Ph.D.

Bibliografické údaje:

počet stran 123 počet obrázků 56 počet tabulek 16 počet příloh 4

Bibliografická citace: VLTAVSKÝ, M. Analýza mechanických vlastností porézních keramických pěn pro náhrady kostní tkáně při akcelerované degradaci.

Praha: České vysoké učení technické v Praze, Fakulta strojní, 2020. 123s.

Vedoucí diplomové práce: Ing. Radek Sedláček, Ph.D.

Author’s name: Bc. Martin Vltavský

Faculty: Faculty of Mechanical Engineering

Contracting department: Department of mechanics, biomechanics and mechatronics

Study programme: Mechanical Engineering

Field of study: Biomechanics and Medical Instruments

Academic year: 2019/2020

Title of the thesis: An Analysis of the Mechanical Properties of Porous Ceramic Foams for Bone Tissue Replacements under Accelerated Degradation

Lead supervisor: Ing. Radek Sedláček, Ph.D.

Supervisor: Ing. Tomáš Suchý, Ph.D.

Bibliographic data:

number of pages 123 number of figures 56 number of tables 16 number of appendices 4

Bibliographic citation: VLTAVSKÝ, M. Analýza mechanických vlastností porézních keramických pěn pro náhrady kostní tkáně při akcelerované degradaci.

Praha: České vysoké učení technické v Praze, Fakulta strojní, 2020. 123s.

Vedoucí diplomové práce: Ing. Radek Sedláček, Ph.D.

Cílem této práce byla analýza mechanických vlastností porézních keramických pěn pro náhrady kostní tkáně při akcelerované degradaci.

Pro tyto účely byla navržena metodika, pomocí níž lze zvolené mechanické vlastnosti klasifikovat.

Experiment se skládal z tlakové zkoušky kalcium fosfátových vzorků exponovaných v médiu simulujícím osteoklastickou degradaci po dobu 10 min, 4 hod a 8 hod a doplněn o testování hmotnostních úbytků, mikroskopickou analýzu, stanovení koncentrace volných vápenatých iontů a měření pH média. Vyhodnocovanými parametry mechanických vlastností byly mez pevnosti, elastický gradient, absorbovaná energie, účinnost absorbování energie a práce do destrukce. Využitím statistických metod byla analyzována statistická významnost zjištěných odlišností.

Klíčová slova: Náhrada kostní tkáně, Akcelerovaná degradace, Kalcium fosfátové cementy, Mechanické vlastnosti

The aim of this work was to analyze the mechanical properties of porous ceramic foams for bone tissue replacement during accelerated degradation. For this purpose, a methodology was proposed for classifying selected mechanical properties. An experiment was performed, consisting of a compression test of calcium phosphate samples exposed to the medium mimicking the osteoclastic degradation for 10 min, 4 h and 8 h. Then the weight loss was determined, a microscopic analysis was performed, and the free calcium ion release and the pH of the medium were determined. The ultimate strength in compression, elastic gradient, absorbed energy, energy absorption efficiency and work to fracture were the evaluated mechanical properties parameter. The statistical significance of the detected differences was analyzed by applying standard statistical procedures.

Keywords: Bone tissue replacement, Accelerated degradation, Calcium phosphate cements, Mechanical properties

Poděkování / Prohlášení

Rád bych touto cestou vyjádřil vřelé poděkování Ing. Radku Sedláčkovi, Ph.D. za přijetí, všestrannou pomoc, množství cenných a inspirativních rad, podnětů, doporučení a připomínek, odbornou pomoc při realizaci experimentu a zároveň za velkou trpělivost s obdivuhodnou ochotou při konzultacích poskytnutých ke zpracování této práce. Děkuji také Ing. Tomáši Suchému, Ph.D. za poskytnutí literatury a dalších podkladů a materiálů k tomuto tématu se vztahujících, možnost konzultací a osobních setkání za účelem diskuse o řešeném problému. Dále bych také chtěl poděkovat MUDr. et MDDr.

Martinu Bartošovi, za jeho přínos pro experimentální část při realizaci výpočtové mikrotomografie.

V neposlední řadě patří obrovské poděkování mé rodině za morální a materiální podporu během celého studia a přítelkyni Mirce, bez nichž bych tuto práci nemohl dokončit, a svým přátelům za zpříjemnění vysokoškolského života.

Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracoval samostatně a že jsem uvedl veškeré použité informační zdroje v souladu s Metodickým pokynem o dodržování etických principů při přípravě vysokoškolských závěrečných prací.

Nemám výhrady proti užití tohoto školního díla ve smyslu § 60 zákona č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).

V Praze dne 01. 08. 2020

. . . .

Úvod. . . 11

1 Stav problematiky. . . 13

1.1 Anatomie a fyziologie kostní tkáně . . . 13

1.1.1 Hierarchická struktura kostní tkáně . . . 14

1.1.2 Kostní buňky a jejich funkce . . . 17

1.1.3 Modelace a remodelace kostní tkáně . . . 18

1.2 Biomechanika kostní tkáně . . . . 20

1.2.1 Biomechanické vlastnosti . . . 20

1.2.2 Kostní defekty a proces hojení . . . 22

1.3 Biomateriály pro náhrady kostní tkáně . . . 23

1.3.1 Vývoj biomateriálů . . . 23

1.3.2 Požadované vlastnosti . . . 25

1.3.3 Charakteristika a definice materiálových vlastností . . . 27

1.3.4 Účinky fyziologického prostředí . . . 28

1.4 Kostní cementy . . . 32

1.4.1 Akrylové kostní cementy . . . 33

1.4.2 Kalcium fosfátové cementy . . . 33

1.4.3 Kostní cement jako kompozit . . . 34

2 Cíle práce. . . 37

3 Metodika experimentů. . . 38

3.1 Metodika pozorování topografie povrchu . . . 38

3.2 Metodika zobrazování struktury materiálů . . . 38

3.3 Metodika testování hmotnostních úbytků . . . 39

3.4 Metodika testování mechanických vlastností materiálů . . . 39

3.4.1 Postup zkoušky . . . 40

3.4.2 Vyhodnocované parametry . . . 40

3.5 Statistická analýza . . . 44

3.5.1 Testy statistických hypotéz . . . 45

3.5.2 Weibullova analýza . . . 46

3.5.3 Grafické zpracování . . . 46

4 Realizace experimentů. . . 47

4.1 Způsob označení materiálů . . . . 47

4.2 Složení a příprava materiálů. . . 48

4.3 Skenovací elektronová mikroskopie . . . 48

4.4 Počítačová mikrotomografie . . . 49

4.5 Testování hmotnostních úbytků . . . 49

4.6 Příprava vzorků pro tlakovou zkoušku . . . 50

4.7 Tlaková zkouška . . . 50

4.7.1 Použitá zařízení . . . 50

4.7.2 Příprava vzorků a jejich roztřídění . . . 51

4.7.3 Průběh zkoušky . . . 51

5 Vyhodnocení. . . 54

5.1 Vyhodnocení tlakové zkoušky . 54 5.1.1 Ověření, zda byla rychlost deformace v požadovaném rozsahu . . . . 55

5.1.2 Ověření, zda stabilní hodnota napětí byla správně nastavena . . . 55

5.2 Statistická analýza . . . 55

6 Výsledky . . . 57

6.1 Skenovací elektronová mikroskopie . . . 57

6.2 Počítačová mikrotomografie . . . 59

6.3 Hmotnostní úbytky . . . 62

6.4 Stanovení pH média . . . 63

6.5 Stanovení koncentrací Ca²⁺. . . 64

6.6 Mechanické parametry zjištěné při tlakové zkoušce . . . . 65

6.6.1 Elastický gradient. . . 65

6.6.2 Mez pevnosti v tlaku . . . . 66

6.6.3 Absorbovaná energie . . . 70

6.6.4 Účinnost absorbování energie . . . 72

6.6.5 Práce do destrukce . . . 73

7 Diskuze. . . 75

Závěr . . . 79

Literatura . . . 81

A Seznam obrázků a tabulek. . . 99 B Seznam použitých zkratek

a symbolů. . . .102 C Tabulky s výslednými

hodnotami. . . .105 D Koláže snímkůµ-CT a SEM. . . .115

Úvod

Zdravé a silné kosti jsou zcela klíčové pro správnou funkci našeho pohybového aparátu, jehož stav výrazně ovlivňuje kvalitu života v každém věku. Ačkoliv kosti mají pozoruhodnou schopnost regenerace, při defektech přesahujících kritickou velikost dochází k překročení regenerační kapacity přirozeně hojivých procesů [1]. Pro tyto patologické situace se již po staletí v chirurgii využívají kostní náhrady. S vývojem medicíny a techniky se jejich aplikace rozšířily, a tak dnes nacházejí uplatnění nejen v chirurgii, ale také v onkologii, traumatologii, stomatologii nebo ortopedii - zde zejména při protetických operacích či spinální fúzi. Každý rok se po celém světě provedou více než 2 miliony kostního štěpování. Štěpování kostí je po krevní transfuzí druhou nejfrekventovanější transplantací tkání na světě [2]. Podle zprávy publikované v Zion Market Research činil globální trh s kostními štěpy a náhradami v roce 2018 přibližně 2 745 milionů USD a očekává se, že do roku 2026 se vyšplhá až ke 4 235 milionům USD se složenou roční mírou růstu (CAGR) kolem 5,6 % během let 2019 až 2026 [3].

V současné době je pro léčbu onemocnění spojených s úbytkem kostní tkáně nebo traumatickým poškozením kosti používána řada přístupů [4]. Za zlatou střední cestu je stále považována transplantace kosti vzaté od samotného pacienta (tzv. autologní kostní štěp). Tento přístup však s sebou nese hned několik vážných nevýhod jako je zatížení organismu pacienta dalším operativním zákrokem, což vede také k prodloužení doby hojení, dále zvýšení rizika možné infekce, použití anestezie a především limitace dostupnosti kostní tkáně [5]. První alternativou, která se nabízí jako náhrada za autologní štěpy, jsou alogenní (dárcovská kost) nebo xenogenní (z jiného druhu: telecí, prasečí) kostní štěpy. V obou případech však hrozí riziko imunologické reakce, přenosu infekce a nebo poklesu mechanické pevnosti [6].

Vzhledem k výše uvedeným rizikovým faktorům kostních štěpů vzrůstá poptávka po syntetických kostních náhradách (viz Obrázek0.1), které by měly kostní tkáň nahradit.

Obrázek 0.1. Vývoj trhu s kostními štěpy a náhradami v letech 2014 - 2026 v USA (upraveno z [7])

Byla navržena a vyvinuta celá řada syntetických materiálů, z nichž některé jsou již komerčně dostupné, zatímco jiné jsou doposud ve fázi vývoje [8]. Mezi těmito materiály přitahují velkou pozornost obzvláště kalcium fosfátové cementy (dále jen CPC), které se vyznačují svým výborným biologickým chováním. Přestože se CPC jeví jako velmi slibné pro regeneraci kostí, v klinické praxi se používají pouze na nezatížené nebo mírně zatížené části. Jednou z jejich slabin majících za následek limitaci jejich použití jsou mechanické vlastnosti, nejen co se týče pevnosti, ale zejména pokud jde o pružnost, houževnatost a spolehlivost [6].

Mezi požadované biologické vlastnosti kostních implantátů patří mimo jiné i biodegradibilita in vivo, tzn. degradace scaffoldu a jeho postupné nahrazování kostní tkání [9]. Ačkoliv existují publikace věnující se degradaci CPC in vivo [10]

i in vitro[11], popisují primárně pouze její kinetiku. Její vliv na změnu mechanických vlastností scaffoldu bývá publikován zřídka. Pro správnou funkci implantátu je však nutné sledovat jejich vlastnosti nejen v suchém stavu, ale také v podmínkách, ve kterých budou následně implantovány v organismu.

Podnětem pro zabývání se danou problematikou bylo získání informací o chování mechanických a strukturálních vlastností CPC v degradačním médiu simulujícím tělní prostředí. Poznatky získané z výsledků práce by mohly napomoci při optimalizaci návrhu přípravy a složení nového kostního cementu a poskytnout simulovaný model toho, jak by mohl materiál reagovat v in vivo podmínkách. Práce je součástí meziuniverzitní spolupráce na grantovém projektu Vývoj a komplexní hodnocení nové injekčně aplikovatelné, resorbovatelné, porézní kostní náhrady s řízeným uvolňováním antimikrobiálních látek (označení NV18-05-00379) finančně podporovaným Ministerstvem zdravotnictví České republiky.

Kapitola 1

Stav problematiky

Návrhy a vývojem biologických náhrad (implantátů) vedoucích k regeneraci poškozených tkání se zabývá vědní odvětví zvané tkáňové inženýrství. Jedná se o multidisciplinární obor, který aplikuje znalosti z biologie, chemie, fyziky, materiálového inženýrství a medicíny na obnovení či zlepšení tkáňové funkce [12].

Jedním z primárních cílů tkáňového inženýrství je in vitro¹ vývoj tkáňových nosičů, tzv. scaffoldů, které mohou poskytnout dočasnou mechanickou podporu pro růst tkáně a stimulaci specifických funkcí buněk a vedou k dosažení úspěšné regenerace poškozených tkání a orgánů. Tkáňové inženýrství nachází uplatnění při léčbě pojivových tkání jako jsou kostní tkáň, zubní tkáň nebo chrupavka, dále při léčbě kardiovaskulárního systému (srdce, cévy), vylučovacího systému (ledviny, močový měchýř), trávicího systému (játra), dýchacího systému (plíce, průdušky), kožního či svalového systému. Nově se začíná prosazovat i při léčbě nervového systému (mícha, mozek), genové terapii nebo například při hormonálních poruchách [13].

Vhodný buněčný scaffold může být připraven pouze za předpokladu dokonalé znalosti struktury, buněčného chování, funkce a degenerace původní imitované tkáně. Jelikož jsou scaffoldy určeny ke styku s živou tkání, musí splňovat striktní mechanobiologické požadavky, aby plnily správně svou funkci a participovaly na regeneraci tkáně [14].

Z těchto důvodů se následující podkapitoly věnují anatomii a fyziologii kostní tkáně, jejímu biomechanickému chování a požadavkům a materiálovým možnostem kostních náhrad se zaměřením na materiály používané pro kostní cementy.

1.1 Anatomie a fyziologie kostní tkáně

Kosti (os, ossis) jsou pevné, tvrdé a v jistém rozmezí i pružné orgány žlutobílé barvy.

Svým souborem tvoří kosterní soustavu (sceletum), která je spolu s připojenými chrupavkami a s kloubními a vazivovými spoji kostí základem pasivního pohybového (lokomočního) aparátu. Skelet dospělého člověka sestává průměrně z 206 kostí, které plní následující mechanické a fyziologické funkce:

1. podpěrný systém těla,

2. pákový systém pro přenos svalových sil,

3. ochrana pro životně důležité vnitřní orgány (např. mozek, plíce apod.),

4. obsahuje specializovanou tkáň na tvorbu krevních částic z kmenových buněk (hemopoéza) - červenou kostní dřeň,

5. hlavní zásobárna minerálních látek - především CaaP

6. homeostáza minerálů - účastní se ukládání a udržení rovnováhy minerálních látek, 7. energetický zdroj - žlutá kostní dřeň: významný zdroj chemické energie vázané

v tukových buňkách [15].

1 In vitroje termín používaný pro studie v umělých podmínkách (tj. ve zkumavce) a termínin vivoznačí práci v přirozených podmínkách, v živém organismu

Jako každý orgán se i kosti skládají z pojivové tkáně - kostní tkáně. Kostní tkáň je specializovaným typem opěrného pojiva sestávajícím z kostních buněk a mineralizované mezibuněčné hmoty (extracelulární matrix - dále jen ECM). Jedná se o dynamickou tkáň, která má do určitého rozsahu jedinečné regenerační a remodelační schopnosti [16].

1.1.1 Hierarchická struktura kostní tkáně

Struktura kosti je tvořena hierarchickými úrovněmi - hrubou makroskopickou úrovní počínaje a úrovní nanočástic konče (viz Obrázek 1.1). Jednotlivé úrovně jsou tvořeny následujícími útvary:

1. makrostruktura - kortikální a spongiózní kost,

2. mikrostruktura - Haversův systém (osteony), jednotlivé trabekuly, 3. nanostruktura - kolagenní vlákna, kolagenní fibrily,

4. sub-nanostruktura - molekuly kolagenu a kostních minerálů [17].

Obrázek 1.1. Hierarchická strukturální organizace kosti (upraveno z [17])

1.1.1.1 Makrostruktura kostní tkáně

Makroskopická stavba kosti vychází z prostorového uspořádání kostní tkáně. Ta se podle uspořádání a průběhu kolagenních fibril v ECM rozděluje na dva základní typy:

fibrilární a lamelární.

Fibrilární kost (vláknitá) je primární, nevyvinutá kostní tkáň, která je složena z plsti kolagenních vláken. U člověka se jedná o první typ kosti vyskytující se v rané fázi ontogeneze (u plodu a u dítěte). V dospělosti je omezena pouze na některé hrbolky či výběžky, na které se upínají svaly, či na okolí vnitroušního labyrintu. Může se také podílet na tvorbě zubního cementu. Vě většině případů je však nahrazena kostí lamelární [16], [18]. Kvůli nepravidelnému uspořádání kostní hmoty a fibril vykazuje malou odolnost vůči mechanickému namáhání. Fibrilární kost také vzniká při sekundárním hojení kosti [16].

Lamelární kost (vrstevnatá) je základem převážné části skeletu. Na rozdíl od fibrilární kosti obsahuje paralelně uspořádaná kolagenní vlákna a vyskytuje se ve dvou formách:

kompaktní kost (substantia compacta) a spongiózní kost (substantia spongiosa).

. . . .

1.1 Anatomie a fyziologie kostní tkáně V lamelární kosti je z 80 % zastoupena kompaktní kost, která je nositelkou především mechanických vlastností skeletu. Její hlavní funkcí je odolat tlaku a tahu. Zbývajících 20 % tvoří spongiozní kost, jejíž funkcí je přenos tlaku na kost kompaktní [16].

Kompaktní kost (kortikální) je tvrdá, hustá, mineralizovaná tkáň. U dlouhých kostí tvoří plášť středního úseku kosti (diafýza)(viz Obrázek 1.2A), ale také obklopuje tenkou slupkou spongiozní kost v epifýzách. Je tvořena buď koncentricky uspořádanými trubicovitými lamelami, nebo destičkovými lamelami, které jsou orientované rovnoběžně s dlouhou osou kosti (viz Obrázek 1.2B) [16].

Obrázek 1.2. Struktura lamelární kostní tkáně na průřezu diafýzou dlouhé kosti. A) Kost kompaktní tvoří až 10 mm silnou vrstvu stěny diafýzy. B) Organizace osteonů s koncentricky uspořádanými lamelami kolem centrálního (Haversova) kanálu. C) Struktura Haversova systému s centrálním kanálem. D) Osteocyt uložený v lakuně

a jeho úzké kostní kanálky (canaliculi ossei) (upraveno z [19]).

Základní stavební jednotkou kompaktní kosti je osteon (někdy označovaný jako Haversův systém). Jedná se o komplex až dvaceti soustředných trubicovitých lamel s centrálním (Haversovým) kanálkem, jenž je vyplněn řídkým vazivem a obsahuje nervová vlákna a krevní mízní cévy (viz Obrázek 1.2C). Centrální kanálky jsou mezi sebou spojeny Volkmannovými kanálky, kterými vstupují cévy a nervy do intersticiálních lamel. Uložení osteonu v kompaktě může být různé (rovnoběžně, v táhlých spirálách, ohnuty do oblouku). Ve stěnách lamel jsou mělké jamky (lakuny) (viz Obrázek 1.2D), ze kterých vycházejí jemné kostní kanálky (canaliculi ossium).

Jednotlivé kostní lamely se skládají ze svazků kolagenních vláken zalitých do amorfní ECM a z osteocytů. Jelikož v každé lamele probíhají svazky kolagenních vláken více méně rovnoběžně, má každá lamela svůj směr průběhu vláken, a dohromady tak vytvářejí komplex vzájemně se různě křížících kolagenních vláken [16], [18], [19].

Spongiózní kost (trabekulární) se vyznačuje houbovitým charakterem a je tvořena lamelosně upravenými trámečky kosti (trabekuly) a ploténkami tvořícími prostorové struktury, jejichž tvar je výsledkem různých mechanických sil působících na kost.

Nachází se všude tam, kde není vytvořena souvislá a jednotná dřeňová dutina - v epifýzách kostí a pod plášťovou vrstvou kompakty. Stavba trabekul a plotýnek je prakticky stejná jako stavba trubicovitých lamel osteonů (viz Obrázek 1.3). Směr průběhu a uspořádání kostních trabekul odpovídá tzv. trajektoriím, což jsou silokřivky, které spojují místa největšího zatížení kosti (viz Obrázek 1.4). Přestavba kosti ve směru trajektorií, označovaná jako architektonika spongiózní kosti, zajišťuje, že maximální pevnosti v daných směrech je dosaženo s minimální spotřebou materiálu (kostní tkáně), tzv. modifikovaný Rouxův zákon. Pro spongiózní kosti je typická vyšší povrchová plocha, která je důležitá pro jejich funkci, zejména homeostázy vápníku [15], [16].

Obrázek 1.3. Struktura spongiózní kosti (upraveno z [20])

Obrázek 1.4. Architektonika spongiózní kosti: průběh trámečků v horním konci

stehenní kosti (převzato z [15])

1.1.1.2 Nanostruktura kostní tkáně

Na nanoskopické úrovni sestává kostní tkáň z mezibuněčné hmoty (ECM). Ukazuje se, že v lamelární kosti ECM tvoří více než 90 % objemu tkáně. Zbytek tvoří převážně buňky a krevní cévy. ECM je kompozitní materiál skládající se z 50 – 60 hm. % anorganické matrice (minerál - většinou vápenaté krystaly bioapatitu), z 30 – 40 hm. % organické matrice (kolagen typu I, proteoglykany, vázaná voda) a z 10 – 20 hm. % vody a tuku [21].

Organická složka ECM se podobá matrici hustých vláknitých tkání, jako jsou šlachy nebo vazy. Největší zastoupení má kolagen typu I, který tvoří až 90 - 95 % organické složky. Zbylá procenta tvoří glykoproteiny, glykosaminoglykany, proteoglykany a regulační faktory [22]. Kolagen je organická makromolekulární látka skládající se ze tří šroubovitě stočených polypeptidových řetězců. Základní jednotkou stavby kolagenních vláken je tropokolagen (↔ 280 nm, ∅1,5 nm). Stupňovitým uspořádáním jednotek tropokolagenu vzniká fibrila, která další agregací vytváří kolagenní vlákna (∅ 0,2 - 20µm) [23], [24], [25].

Anorganická složka neboli minerální fáze kosti plní dvě základní funkce: slouží jako iontový zásobník (rezervoár) pro ukládání přibližně 99 % Ca, přibližně 85 % P a 40 - 60 % Na a M g a dává kosti většinu její tuhosti a pevnosti [22]. Hlavní složku tvoří minerál kalcium fosfát, který je svým složením a strukturou velice podobný minerálům apatitové skupiny. Často bývá označován jako hydroxyapatit (HA) - Ca5(P O4)3(OH).

. . . .

1.1 Anatomie a fyziologie kostní tkáně Jelikož ale lidské kosti neobsahují čistý nebo stechiometrický HA, je v literatuře označován jako bioapatit [26] a vyjádřen vzorcem:

(Ca, N a, M g[])10(P O4, HP O4, CO3)6(OH, F, Cl, CO3, O,[])2, (1.1) kde [] představuje vakanci. Na rozdíl od HA obsahuje bioapatit i další ionty, především CO²⁻₃ a stopy N a⁺, M g²⁺, F e²⁺, Cl⁻, F⁻ [27]. Vzhledem k velmi malé velikosti krystalů (50x25x4 nm) je stanovení přesného složení a krystalové struktury obtížné [28].

1.1.2 Kostní buňky a jejich funkce

Kostní buňky slouží k provádění různých funkcí jako jsou např. tvorba kosti, resorpce kosti či minerální homeostáza. Pocházejí ze dvou buněčných linií: linie mezenchymálních kmenových buněk a linie hematopoetických kmenových buněk. Linie mezenchymálních kmenových buněk sestává z nediferencovaných buněk nebo preosteoblastů,osteoblastů, výstelkových buněk kostí (lining cells) a osteocytů. Hematopoetická linie kmenových buněk se skládá z cirkulujících nebo kostních monocytů, preosteoklastů a osteoklastů [21].

Osteoblasty jsou odpovědné za syntézu organických komponent ECM (osteoid) a podílí se na její mineralizaci především produkcí enzymu alkalické fosfatázy [29]. Navíc mají schopnost regulace odbourávání kosti, neboť zajišťují metabolismus osteoklastů.

Novotvořená ECM je produkována apozicí na již existující mineralizovanou vrstvu, čímž se vytváří typická lamelární struktura osteonů [30].

Osteocyty jsou klidové formy osteoblastů, jež jsou zcela uzavřeny v mineralizované ECM. Těla buněk jsou jednotlivě uložena v lakunách umístěných mezi lamelami matrix. Osteocyty vysílají dlouhé cytoplazmatické výběžky, které probíhají v tenkých kanálcích (canaliculi ossium) spojujících sousední buňky, čímž vytvářejí komunikační síť uvnitř kosti, prostřednictvím které je zajišťována látková výměna [29], [30], [31]. Z biomechanického hlediska jsou osteocyty považovány za mechanické senzory kosti [32], jejichž nejdůležitější funkcí je mechanotransdukce. Mechanotransdukce je složitý proces pomocí kterého buňky dokáží detekovat mechanický signál přicházející z extracelulárního prostoru, přenést jej do buňky a vyvolat příslušnou biochemickou odezvu (produkce ECM, exprese genů, růst, dělení, atd.) [33].

Osteoklasty jsou velké (50 - 100 µm) pohyblivé mnohojaderné buňky s četnými výběžky, které jsou specializovány na resorbci (odbourávání) mineralizované ECM [30]. Jsou uloženy na povrchu kostní tkáně v malých prohloubeninách, které se nazývají Howshipovy lakuny. Na povrchu osteoklastu se objevují četné invaginace (zvlněný lem), které výrazně zvětšují resorpční povrch buňky [31]. Osteoklasty vylučují kyselou fosfatázu, kolagenázu a další protelytické enzymy, které atakují kostní matrix a uvolňují zvápenatělou základní hmotu, což způsobuje prostředí s nízkým pH v oblasti pod zvlněným lemem [29]. Bezprostředními prekurzory osteoklastů jsou krevní monocyty, jejichž splýváním osteoklasty vznikají a tvoří tak součást mononukleárního fagocytárního systému [31].

1.1.2.1 Interakce mezi kostními buňkami a umělým materiálem

Pro správnou funkci implantátu je klíčová jeho integrace do živé kosti, tzv.

osteointegrace (osseointegrace) [34], která je zprostředkovaná na mikroskopické úrovni interakcí buněk tkáně s jeho povrchem [35]. Implantát pak následně tvoří substrát, na kterém probíhá iniciální buněčná adheze, proliferace, migrace a diferenciace.

Prakticky ihned po implantaci se implantát ocitá v přímém kontaktu s fyziologickými tekutinami, které kompletně vyplní veškerý prostor na rozhraní mezi kostí a implantátem. Předně dochází ke kontaktu s molekulami vody a posléze s rozpustnými proteiny [35], které na povrch implantátu adherují buď slabými vazebnými interakcemi nebo silnějšími kovalentními vazbami. Po několika sekundách od implantace se na povrchu materiálu vytvoří adsorbovaná proteinová vrstva, která zprostředkovává nepřímou buněčnou interakci s povrchem implantátu [36]

a také zajišťuje přenos signálu buňkám přes její povrchové receptory - integriny [37].

Integriny jsou molekuly sloužící jako regulátor interakce mezi buňkami a implantátem [38]. Mezi důležité proteiny podílející se na dlouhodobé adhezi buněk patří proteiny ECM (kolagen, fibronektin, vitronektin a fibrinogen) [39], a dále proteiny buněčné membrány a cytoskeletu, jejichž vzájemné interakce umožňují signalizaci a aktivaci transkripčních faktorů a regulaci genové exprese [40]. Hlavními adhezními strukturami mezi buňkou a ECM jsou tzv. fokální adheze. Jde o nahromadění integrinových transmembránových receptorů na extracelulární straně, které umožňují buňce přijímat nejen biochemické, ale i mechanické signály (mechanosensing), na jejichž základě mohou regulovat organizaci cytoskeletu v podobě změn morfologie nebo orientace a tvorby fokálních adhezí.

Kolem sedmého dne po implantaci se na rozhraní kosti a implantátu vytváří kalus, který slouží jako biodegradibilní zásobárna signalizačních molekul (tvoří gradient růstových faktorů poblíž povrchu implantátu) [36]. Faktory jako TGF-β, BMPs a další regulují diferenciaci osteoprogenitorových buněk v osteoblasty, které pak zahajují depozici mezibuněčné hmoty a následnou mineralizaci, jako při formační fázi remodelace (viz sekce 1.1.3). V konečné fázi migrace buňky pojivové tkáně přilnou k povrchu implantátu vytvořením silné fokální adheze, čímž začíná fáze diferenciace.

Mezi druhým a čtvrtým týdnem implantace je vytvořena nová kostní tkáň, přičemž je tento proces doprovázen remodelací [40].

1.1.3 Modelace a remodelace kostní tkáně

Kosti jsou v každodenním životě neustále vystaveny namáhání, které může být způsobeno jak vnějším zatížením, například gravitační sílou země, tak i činností kosterního svalstva [41]. Způsobem, jak namáhání ovlivňuje tvar a strukturu kosti, se zabýval v roce 1892 anatom Julius Wolff [42], který přišel se svou hypotézou, že každé mechanické zatížení je zodpovědné za změnu struktury kostí. Tato hypotéza bylo později označena jako Wolffův zákon¹. V praxi to znamená, že struktura kosti se přizpůsobuje podle působení sil a směru zatěžování tak, aby v daném směru dosahovala maximální pevnosti za použití minima materiálu. Dnes je však vztah mezi mechanickou zátěží a strukturou považován za mnohem komplexnější a bývá nahrazován termínem funkční adaptace kosti [43].

Základními buněčnými mechanismy regulujícími strukturu kostní tkáně jsou remodelace a modelace (konstrukce). Kostní remodelace je kontinuální proces k udržení

1 „Každá změna ve funkci a formě kosti vede k nevratným změnám v interní struktuře kosti samotné“

. . . .

1.1 Anatomie a fyziologie kostní tkáně mechanické integrity kostí a regulaci kalciofosfátového metabolismu. Nejrychlejší remodelace kosti probíhá u člověka do 25. roku života, kdy dosáhne tzv. vrcholu kostní hmoty - PBM. Poté následuje individuálně dlouhá vyrovnaná remodelace, což znamená, že intenzita resorpce se rovná intenzitě novotvorby kosti. Ve stáří již převažuje úbytek kostní hmoty, což způsobuje různé kostní defekty (např. osteoporóza) [44].

Proces kostní remodelace probíhá v resorpční-formovací sekvenci skládající se ze čtyř po sobě jdoucích fází, které u většiny jedinců ve věku 19 – 60 let trvají přibližně 200 dní (viz Obrázek1.5):

1. resorpční fáze - signály z osteocytů aktivují osteoklasty, které zahájí resorpci staré kosti;

2. reverzní fáze - přechod od resorpce k tvorbě nové kosti;

3. formační fáze - uvolnění růstových faktorů aktivuje osteoblasty k vytvoření nové kosti a následné mineralizaci;

4. klidová fáze - v kosti nedochází k žádným změnám [45].

Obrázek 1.5. Schéma resorpční-formovací sekvence remodelace kosti s dobou remodelačního cyklu (upraveno z [46] a [47]).

Remodelace je řízena zpětnou vazbou organismu¹, která funguje na principu piezoelektrického jevu [49]. Vlivem zatížení se krystaly kostních minerálů deformují (stlačují nebo natahují) a generují náboj, který nutí osteoklasty k vyšší aktivitě a činnosti odstraňující starou kostní tkáň. Tvorba kosti je umožněna aktivitou osteoblastů, jež produkují základní hmotu – osteoid [44].

Aktivita osteoklastů současně s aktivitou osteoblastů udržují homeostázu hladiny vápníku, jehož celková koncentrace v séru činí 2,25 – 2,75 mmol.l⁻¹ [50]. Při poklesu hodnot začne produkce parathormonu, který způsobí aktivaci osteoklastů a vápník se začne uvolňovat do krve. Při vzestupu hodnot se zvýší koncentrace kalcitoninu, který inhibuje osteoklasty, a vápník se začne ukládat do kostí [51].

1 Regulace zpětné vazby je založena na hypotéze Mechanostatu [48].

1.2 Biomechanika kostní tkáně

Z biomechanického hlediska lze kost charakterizovat jako nehomogenní, anizotropní, kompozitní materiál, jenž sestává z pevné a tekuté fáze. Každá fáze představuje zásadní, přitom ale odlišný příspěvek k jeho mechanickým vlastnostem [52].

1.2.1 Biomechanické vlastnosti

Kostní tkáně se vyznačují viskoelastickými vlastnostmi a nelineárním průběhem zátěžové křivky [52]. Z hlediska pevnosti se řadí mezi pevné materiály. Maximální pevnosti v daném směru je dosaženo s minimální spotřebou materiálu [16]. Ačkoli kosti vykazují určitou minimální plastickou deformaci, chovají se spíše jako křehké sklo, než tvárný kov, tzn. dochází ke křehkému lomu již při malých deformacích [53]. Hlavními složkami určujícími biomechanické vlastnosti kostní tkáně jsou tuhý (vysoko modulární) apatit a měkká (nízko modulární) extracelulární matrix tvořena kolegenními vlákny. Kolagenní vlákna jsou pevná, odolávají tahu, ale pro jiné typy zatížení jsou poddajná. Minerální látky ve formě apatitu dodávají kosti tvrdost a křehkost, proto je demineralizovaná kost měkká a poddajná. Deproteinizovaná kost je naopak tvrdá, křehká a snese tak pouze malé zatížení v tahu. Díky synergickému efektu, který se u kompozitních materiálů uplatňuje, má kost výsledné mechanické vlastnosti lepší než její jednotlivé fáze [54], [55]. V následující Tabulce1.1jsou vypsány některé základní mechanické vlastnosti spongiózní a kompaktní kosti.

Tabulka 1.1. Mechanické vlastnosti kompaktní a spongiózní kosti

Mechanická vlastnost Kompaktní kost Spongiózní kost Ref.

Deformace do destrukce [%] 1 - 3 5 - 7 [56]

Mez pevnosti v tlaku [MPa] 100 - 200 2 - 20 [57]

Youngův modul pružnost [GPa] 15 - 25 0,1 - 2,0 [57]

Práce do destrukce [kJ.m⁻²] 1 - 15 - [58]

Lomová houževnatost [MPa.m^0,5] 2 - 12 0,1 - 0,8 [56]

Absorbovaná energie [MJ.m⁻³] - 1 - 6 [59]

Kompaktní kosti se vyznačují nízkou makroporozitou (5 − 15 % [60]), která je způsobena interkortikálními kanálky a závisí na lokaci kosti v těle, a dále vysokou hustotou, která dává kompaktní kosti dobré mechanické a strukturální vlastnosti.

Naopak spongiózní kosti se vyznačují vysokou porozitou (75−95 % [61]).

Typickým problémem při mechanických zkouškách je velký rozptyl naměřených hodnot, který z velké části souvisí s faktory ovlivňujícími mechanické vlastnosti. Tyto faktory jsou dány jednak podmínkami vlastního experimentu, tak i fyziologickým stavem. Veškeré vlastnosti jsou výrazně interindividuální a závislé na okamžitém stavu osoby i na její komplexní historii (genetické předpoklady, výživa, životní styl aj.) [62]. Klíčovým rozlišením mechanických vlastností dle typu kostní tkáně je rozdělení

. . . .

1.2 Biomechanika kostní tkáně na kompaktní a spongiózní. Mezi faktory způsobené podmínkami experimentu patří například orientace (viz Obrázek 1.6A) a rychlost zatížení, stav vzorku (suchý/vlhký) [63], konzervace a skladování [64] apod. Z fyziologických faktorů je nutné jmenovat především věk, vnitřní strukturu, obsah minerálů, porozita a zdánlivou hustotu (viz Obrázek1.6B).

Vzhledem k viskoelastickým vlastnostem kostní tkáně závisí mechanické vlastnosti kosti na rychlosti deformace. S rychlostí deformace stoupá mez pevnosti a elastický modul a naopak klesá maximální dovolená deformace a absorbuje se větší množství energie [65]. Díky elastické anizotropii kostních tkání se modul pružnosti liší v závislosti na směru aplikovaného zatížení [66].

Vliv věku na mechanické vlastnosti je významný a v mnoha publikacích uváděný.

Obecně se dá říci, že se s věkem snižuje modul elasticity, schopnost absorbovat deformační energii (viz Obrázek 1.6C-D) a lomová houževnatost [67], [68]. Změny v minerálním složení kosti jsou spojeny především se změnami modulu elasticity (viz Obrázek 1.6E), ale mají vliv i na další mechanické vlastnosti (pevnost, tvrdost) [62].

Negativně ovlivňuje mechanické vlastnosti i porozita. Se zvyšující se porozitou klesá pevnost i pružnost. Všechny zmíněné faktory se navíc navzájem prolínají a vzájemně ovlivňují [69].

Obrázek 1.6. Faktory ovlivňující mechanické vlastnosti kosti. A) Anizotropie kosti [70]. B) Křivka napětí-deformace pro kompaktní a trabekulární kost s různými hodnotami hustoty [71]. C) Závislost modulu pružnosti na věku [67]. D) Závislost práce do destrukce na věku

[67]. E) Závislost koncentrace vápníku v kostní tkáni na modulu pružnosti [72].

1.2.2 Kostní defekty a proces hojení

Mechanická zátěž provokuje adaptační mechanismy, které mohou mít charakter regeneračních a revitalizačních procesů nebo naopak mohou ve své negativní formě vést k patologické reaktibilitě organismu, provokovat degenerativní procesy, způsobit orgánovou dysfunkci apod. Martin a Burr ve své studii [73] určili jednotlivé prahové hodnoty přetvoření udávaném v mikrostrainech,¹které vymezují remodelaci a modelaci kosti. K patologickému přetěžování kostní tkáně dochází za hranicí 3 500 – 4 000 µε.

K porušení a praskání tkáně dochází za hodnotou 25 000 µε, která v praxi vede ke zlomenině kosti (fraktuře) [47].

Zlomeniny rozlišujeme na úrazové, únavové (stresové), které vznikají na základě opakovaných mikrotraumat při přetěžování a patologické, vznikající při oslabení kosti například metastázou. Další možné dělení zlomenin je dle počtu úlomků na dvou-, tří- , čtyřúlomkové a tříštivé. Z tohoto hlediska jsou nejzávažnější zlomeniny tříštivé, pro které zatím neexistuje vhodná metoda fixace [74].

Kost je v in vivo podmínkách vystavena různým typům mechanického namáhání (tah, tlak, ohyb, krut, smyk), nejčastěji však kombinovanému namáhání. Podle strukturních a materiálových charakteristik kostí a vnějšího uspořádání působících sil může docházet ke zlomeninám ohybovým, smykovým, kompresním, v krutu a tahovým s charakteristickým tvarem a průběhem lomu. Mechanismy selhání jsou dány nejen způsobem aplikovaného zatížení, ale také složením a mikrostrukturou tkáně, jejími mechanickými a strukturálními vlastnostmi, mírou a frekvencí zatížení.

Zlomenina kosti však může vzniknout i jejím cyklickým zatěžováním , zde hovoříme o tzv. únavové zlomenině. Tento typ zlomeniny se objevuje po delších intervalech namáhavé aktivity spojené se svalovou únavou. Patologická fraktura je naopak způsobena spíše nemocí v místě patologického zeslabení kosti (např. nádorem, zánětem - akutní osteomyelitida apod.) než zraněním. Nejčastější příčinou je osteoporóza, která je charakterizována nedostatkem vápníku, což způsobuje úbytek kostní hmoty a deterioraci kostní architektury. Patologická zlomenina může být také projevem tzv.

Pagetovy choroby [66].

Kostní tkáň má fascinující schopnost seberegenerace při hojení kostních zlomenin (fraktur). Díky bohatému cévnímu zásobení se kostní tkáň dobře hojí, avšak hojení není neomezené a je závislé na rozsahu defektu a dalších faktorech [75]. Regenerace probíhá pomocí dvou mechanismů: primárního a sekundárního [52].

Primární hojení se uplatňuje při jednoduchých frakturách, kdy části vzniklé zlomením kosti jsou blízko u sebe a nedochází k vytvoření hematomu. Nastává remodelace osteoklasty, které vytvářejí „tunel“ umožňující cévám a nervům vrůst a zahájení regeneraci kosti [14], [52].

Složitější sekundární mechanismus nastává při komplikovanějších zlomeninách.

V místě lomu se z porušených kostních cév vytváří nejprve krevní výron - hematom a vzniká granulační tkáň. Z té postupně vzniká vazivový svalek, z něhož chrupavčitý svalek, který osifikuje a kalcifikuje ukládáním vápenatých solí. Poté je nahrazen kostním svalkem (callus osseus). Kostní svalek je pomalu (1 - 4 roky) přestavován na pevnou lamelózní kost a díky tomu se obnovuje kostní architektonika [14], [16].

Jakmile kostní defekt přesáhne velikost, při níž je kost schopna seberegenerace, je nutný chirurgický zásah. V současné době je tradiční metodou pro augmentaci

1 µε: 1 000µε= přetvoření 0,1 %, tzn. přetvořeníε= 0,001

. . . .

1.3 Biomateriály pro náhrady kostní tkáně narušeného nebo nedostatečného procesu regenerace kostí spongioplastika, která bývá doplněna zpravidla u komplikovaných zlomenin nebo u zlomenin, u nichž došlo k fraktuře na více namáhaném místě, osteosyntetickou fixací. Ta s sebou však přináší rizika pooperačních komplikací (infekce, vznik zánětu aj.), která vedou k zájmu o kompenzaci spongioplastiky jinou neinvazivní metodou s cílem získání náhrad kostních štěpů s mechanobiologickými vlastnostmi, které jsou co nejvíce identické s lidskou kostí [1].

1.3 Biomateriály pro náhrady kostní tkáně

V roce 1976 se na Mezinárodním sympoziu Clemsovy univerzity o biomateriálech definoval biomateriál jako systémově a farmakologicky inertní substance určená k implantaci nebo začlenění do živého systému [76]. Tato definice byla v průběhu let několikrát obměněna s tím, jak se věda rozvíjela a měnil se pohled na biomateriály.

Jeden z nejvýraznějších autorů, který se zabýval definicí nejen biomateriálů je prof.

David F. Williams, který v roce 1999 ve svém Slovníku biomateriálů [77] uvedl, že biomateriál je určený k propojení s biologickými systémy pro hodnocení, léčbu, augmentaci nebo nahrazení jakékoli tkáně, orgánu, nebo funkce těla. Tentýž autor spolu s Zhangem posléze z důvodu rozšiřujících se možností použití biomateriálů navrhli současnou definici:

„Biomateriál je materiál navržený tak, aby měl podobu, která může prostřednictvím interakcí s živými systémy řídit jakýkoli terapeutický nebo diagnostický postup.“ [78]

Široká znalost možností biomateriálů využívaných v kostních náhradách je signifikantní pro správné vyhodnocení jejich aplikace. Korektní volba biomateriálu umožní navrhnout a vyrobit scaffold s požadovanými vlastnostmi, který bude interagovat s živými systémy a sloužit jako mechanická podpora pro vrůst a regeneraci kostní tkáně při kostních defektech.

1.3.1 Vývoj biomateriálů

Historicky se využití materiálu za účelem nahrazení částí lidského těla nebo tkání po traumatu nebo po těžké nemoci datuje do starověku. Mezi nejstarší dochované zmínky o náhradách patří tzv. Káhirský palec, cca z roku 1060 př.n.l. Tehdy se nejběžněji používal přírodní materiál jako např. dřevo nebo zvířecí kůže [79]. S rozvojem medicíny se však zvyšovala potřeba dokonalejších možností náhrady, které by adekvátněji splňovaly požadavky léčebných terapií. Počátkem 60. let minulého století se zintenzivnil vývoj biomateriálů. Začal být kladen důraz na materiály, které nezpůsobí negativní biologickou odezvu při umístění do fyziologického prostředí.

Materiály, které jsou používány v současné době pro kostní náhrady, lze rozdělit do tří hlavních skupin podle jejich původu, a to na kostní štěpy (autologní, alogenní, xenogenní), kostní náhrady biologického původu (demineralizovaná kostní matrice, kostní minerál, korál) a syntetické kostní náhrady [6]. Pro náhrady kostní tkáně bylo během posledních šesti desetiletí vyvinuto a úspěšně použito několik syntetických biomateriálů, mezi které patří kovy a jejich slitiny, keramika, polymery a jejich kompozity [6]. Jejich vývoj lze rozdělit do čtyř generačních stádií na základě vzájemných reakcí biomateriálu a lidského organismu (viz Obrázek1.7).

Výsledkemprvní generace biomateriálůbyly biologicky inertní materiály, které měly spíše splňovat fyzické požadavky, než schopnost interakce s tkání. Byly navrženy tak,

Obrázek 1.7. Technologický vývoj biomateriálů (upraveno z [80])

aby byly tělem tolerovány a nevyvolávaly nežádoucí fyziologické reakce [81]. Prvními úspěšně používanými bioinertními materiály v ortopedických kostních implantátech byly kovy a jejich slitiny. Prvotně používané karbonová a vanadová ocel, které po vystavení tělním tekutinám relativně rychle korodovaly, úspěšně nahradily v tomto ohledu vhodnější nerezová ocel (nejpoužívanější typ 316L), slitiny kobaltu a chromu (Co- Cr) a později titan a jeho slitiny (Ti-6Al-4V). Dalšími bioinertními materiály, jejichž použití doznalo rozšíření v rámci první generace, byla keramika (zirkonia, aluminia) a některé polymery (např. polymethylmethakrylát - PMMA nebo UHMWPE) [82], [83].

Druhá generace biomateriálů byla definována vývojem schopnosti bioaktivních materiálů interagovat s biologickým prostředím za účelem zlepšení osteokonduktivity (integrace) mezi povrchem implantátu a kostí. To bylo umožněno napodobením struktury a funkce ECM. Hlavní skupinou tvořící druhou generaci je bioaktivní keramika. Mezi nejběžněji používané patří bioaktivní skla (bioskla), skelná keramika a kalcium fosfáty (CaP). Uplatňují se např. v náhradách kůstek středního ucha či částí obratlů. Bioaktivní keramika je také hojně využívána na potahování kovových materiálů, které nejsou bioaktivní per se[82].

Druhou fází vývoje byla konstrukce degradabilních náhrad, které umožnily postupné vstřebávání uvnitř těla pacienta. Tuto schopnost poskytují biodegradabilní polymery umožňující postupnou resorpci a úplné nahrazení regenerujícími se tkáněmi. Polymery lze rozdělit dle jejich původu na biologické (kolagen, chitosan, kyselina hyaluronová) a syntetické. Nejpoužívanějšími syntetickými polymery jsou kyselina polymléčná (PLA), polyglykolová (PGA), poly-ε-kaprolakton (PCL), kopolymery těchto látek a polykarbonáty [83].

S rozvojem tkáňového inženýrství na přelomu 20. století se začala vyvíjet třetí generace biomateriálů, která se zcela liší od předchozích dvou. Byla navržena tak, aby při interakci s hostitelskou tkání stimulovala specifické buněčné interakce na úrovni molekulární biologie, tj. interakce s buněčnými integriny a přímé ovlivnění buněčné proliferace, diferenciace a organizace ECM. U těchto biomateriálů se kombinují koncepce biologické aktivity a biologické rozložitelnosti za vzniku bioaktivních

. . . .

1.3 Biomateriály pro náhrady kostní tkáně a biodegradibilních kompozitních materiálů v podobě trojrozměrných scaffoldů. Pro aplikaci těchto materiálů se používají dva hlavní přístupy: klasická „triáda“ tkáňového inženýrství skládající se z osázení scaffoldu in vitro kmenovými buňkami a růstovými faktory a nebo stimulace potřebné regenerace poškozené tkáněin situ [84]. Současným trendem je snaha o napodobení vlivu ECM na buňky přípravou nanostrukturovaných materiálů, od kterých se očekává zářná budoucnost [80].

Prozatím na začátku svého vývoje jsou tzv. chytré (smart) bioaktivní materiály, u kterých se očekává, že budou schopné reagovat na mechanické a nebo elektrické stimuly ve tkáni. Tyto materiály se označují jako průkopníci pro čtvrtou generaci vývoje [85]. Jedná se především o piezoelektrické materiály, v nichž mechanická stimulace vyvolává elektrickou odezvu a vice versa [86]. Velký úspěch se očekává od tzv. vodivých polymerů, za jejichž objev dostali autoři Nobelovu cenu za chemii [87]. Smart materiály nacházejí uplatnění nejen pro náhrady tkání, ale také jako různé zdravotnické biosenzory či buněčné a tkáňové aktuátory [88]. Další oblastí výzkumu jsou nové aditivní technologie pro přípravu trojrozměrných tkání. Jednou z nejnadějnějších je metoda 3D a 4D biotisku, která umožňuje tvorbu trojrozměrných tkání postupným ukládáním biomateriálů obsahujících kmenové buňky do přesně definovaných souřadnic vrstvu po vrstvě [89], [90].

Jednotlivé generace vývoje biomateriálů je nutné vnímat spíše jako konceptuální změny ve vnímání kritéria biokompatibility. V žádném případě nelze konstatovat, že příchod nové generace materiálů zcela překoná a nahradí ty předchozí [83]. Všechny typy dosud vyvinutých materiálů nacházejí svoje využití v klinické praxi a jejich výběr se řídí specifickými požadavky na vlastnosti implantátu vzhledem k jeho umístění v tkáni, fyziologický stav a možná rizika (dráždivost, alergie, nesnášenlivost) pacienta.

1.3.2 Požadované vlastnosti

Biomateriály, které přicházejí do styku s lidským tělem, musejí splňovat přísná kritéria.

To je dáno nejen zvyšujícími se požadavky na jejich kvalitu a bezpečnost, ale také neustálou inovací a vývojem nových materiálů a výrobků [14].

1.3.2.1 Biokompatibilita

Jedním z nejdůležitějších kritérií odlišující materiály pro tkáňové inženýrství od jakýchkoli jiných je jejich snášenlivost v biologickém prostředí, tzv. biokompatibilita.

Biomateriál ani scaffold nesmí být toxické a po implementaci do organismu nesmí vyvolávat protizánětlivou reakci organismu [91]. Další důležitou podmínkou je jejich cytokompatibilita. Přítomnost biomateriálu v organismu nesmí negativně ovlivňovat funkci buněk, ale naopak musí umožňovat jejich adhezi na povrchu scaffoldů, popř.

migraci buněk do struktury scaffoldů [14].

1.3.2.2 Biodegradabilita

Scaffoldy ve většině případů nemají plnit funkci permanentního implantátu. Postupem času by měly být nahrazeny kostní tkání. V ideálním případě by biomateriály neměly vyvolávat žádné nežádoucí reakce v sousedních nebo vzdálených tkáních. Takovým požadavkům vyhovují biodegradibilní materiály, jejichž degradační produkty musí být biokompatibilní a netoxické. Degradabilita daných biomateriálů by měla co nejvíce korespondovat s nově se tvořící tkání. Nemělo by docházet k destrukci scaffoldu dřív, než bude nová tkáň vytvořena, ale také ani příliš pozdě, aby scaffold nebránil v růstu nové tkáně [14].

1.3.2.3 Biologické vlastnosti

Materiály pro scaffoldy by měly být osteokonduktivní, osteoinduktivní a mít schopnost osseointegrace. Osseointegrace značí schopnost materiálů začlenit se do okolní kostní tkáně. Hlavní úlohou osteokonduktivních materiálů je zprostředkování strukturní opory pro infiltraci a regeneraci novotvořené kosti. Mezi osteokonduktivní materiály patří např. autologní štěp, alogenní štěp, HA, kolagen. Osteinduktivní materiály mají za funkci indukovat diferenciaci nediferencovaných kmenových buněk do osteogenních nebo indukovat kmenové buňky k proliferaci [34].

1.3.2.4 Výrobní a ekonomická kritéria

V případě scaffoldů je také velice důležité možnost převést produkt z malého laboratorního měřítka do komerčně dostupné verze splňující správnou výrobní praxi.

Z ekonomického hlediska je důležité, aby byl produkt dostupný. V klinické praxi se preferují produkty, které jsou dostupné a nepotřebují speciální přípravy před jejich aplikací. Ty prodlužují a prodražují celou proceduru od získání buněk nebo jejich několikatýdenní kultivace in vitro[14].

1.3.2.5 Fyzikální a chemické vlastnosti povrchu

Na fyzikálních a chemických vlastnostech povrchu materiálů závisí kvantita a prostorové uspořádání adsorbovaných proteinů, které mají zásadní vliv na adhezi, růst a diferenciaci buněk v daném materiálu. Jmenovitě se jedná o smáčivost, povrchovou energii, topografii, drsnost a tuhost povrchu. Cílem je připravit implantační materiál, který by se svými chemickými vlastnostmi blížil co nejvíce chemickému složení lidské kosti, respektive byl by tvořen stejnými minerálními složkami jako kost, čímž by ovlivnil vlastní biokompatibilitu implantátu a jeho přijmutí organismem.

Správná buněčná adheze je podporována smáčivými, neboli hydrofilními povrchy, které vykazují úhel smáčení ξ≤60^◦. Pro lepší adhezi a proliferaci buněk jsou povrchy scaffoldů často potahovány nebo modifikovány proteiny extracelulární matrice, jako je kolagen nebo fibronektin [92], [93].

Drsnost povrchu je důležitá nejen z pohledu makrodrsnosti, která zlepšuje upevnění implantátu v kostní tkáni, ale také z nanodrsnosti (nerovnosti nižší než 100 nm).

Povrchy s nanodrsností pozitivně ovlivňují počáteční adhezi a následnou proliferaci.

Tento předpoklad vychází z hierarchického uspořádání kostní tkáně, neboť velikosti složek ECM se pohybují v nanoměřítku [94].

1.3.2.6 Strukturální vlastnosti

Mezi nezbytné vlastnosti patří porézní trojrozměrná struktura scaffoldu, jež by se měla podobat struktuře kosti. Mezi hlavní parametry patří porozita a velikost pórů. Scaffold by měl mít propojenou makroporézní síť obsahující póry s minimálním doporučeným průměrem 100 - 300 µm pro pronikání buněk, růst tkáně, vaskularizaci a dodávání živin do centra regenerující tkáně [95]. Kromě makropórů (> 100µm) by měl scaffold obsahovat i mikropóry (< 20µm) [96].

1.3.2.7 Mechanické vlastnosti

Ideálně by se mechanické vlastnosti kostní náhrady měly shodovat s vlastnostmi nahrazované kostní tkáně. Kromě mechanických vlastností je důležitá i shoda správného přenosu zatížení na danou kost v daném místě. Pokud je do kosti implantován

. . . .

1.3 Biomateriály pro náhrady kostní tkáně biomateriál s vyšší tuhostí, bude kost podle Wolffova zákona podrobena sníženému mechanickému namáhání, které postupně vede k resorpci kosti. Tento jev se v literatuře popisuje jako „stress-shielding“ (stínění napětí). Bylo zjištěno, že přizpůsobení tuhosti implantátu tuhosti hostitelské tkáně omezuje účinek tohoto jevu [80].

1.3.3 Charakteristika a definice materiálových vlastností

Jak bylo uvedeno v předchozí sekci (viz 1.3.2), velkou roli v úspěchu implantátu in vivo hrají celkové materiálové vlastnosti velkou. Ty jsou z hlediska mechanického chování určeny kombinací mechanických a strukturálních vlastností a ovlivněny účinky fyziologického prostředí. Pro popis materiálových vlastností je důležitá znalost nejen parametrů charakterizující danou vlastnost, ale i metody testování pro jejich evaluaci.

1.3.3.1 Mechanické vlastnosti

Mechanickými vlastnostmi je kvantitativně hodnoceno chování materiálu za působení vnějších mechanických sil. Mezi základní mechanické vlastnosti patří pružnost, pevnost, plasticita a houževnatost, zatímco další vlastnosti jako tvrdost, odolnost proti únavě či odolnost proti tečení jsou považovány při určitých podmínkách namáhání za odvozené od těchto základních. Aby bylo možné vlastnosti materiálu reprodukovat a navzájem porovnávat, musí být zkušební postupy a zkušební podmínky jednotné a přesně definované. Proto je většina mechanických zkoušek normalizovaná [97].

Ze všech možných mechanických zkoušek jsou nejběžněji používané jednoosé zkoušky (tahová, tlaková). Při daném zatížení ve známém směru se odpovídající deformace znázorňuje na křivce napětí-deformace (smluvní diagram), ze které lze získat informace o pevnosti, pružnosti a dalších mechanických vlastnostech [98]. Křivka napětí-deformace je tvořena elastickou a plastickou částí. Sklon (směrnice tečny) křivky v elastické části udává pružnost materiálu, která představuje schopnost materiálu vykazovat před porušením pružnou deformaci. K jejímu vyhodnocení se obvykle používá Youngův modul pružnosti. Hranicí mezi elastickou a plastickou částí je mez pružnosti, po jejímž překročení se tkáň po odeznění zátěže nevrací do původního stavu, ale nastává plastická deformace. Dalším významným bodem je mez pevnosti, která v případě, že je překročena, způsobí porušení soudružnosti tkáně a vznik trhlin. Křivka napětí- deformace končí tzv. bodem destrukce, v němž dochází např. ke zlomení kosti. Pevnost je schopnost materiálu odolávat vnějšímu silovému působení, které se snaží porušit celistvost materiálu. Z hlediska příjmu energie je pevnost popsána velikostí plochy pod křivkou napětí-deformace. Houževnatost je materiálová vlastnost, která udává schopnost materiálu odolávat vnějšímu napětí, aniž by došlo ke vzniku trhlin. Měřítkem houževnatosti bývá nejčastěji práce spotřebovaná na deformaci a porušení, ale také např. hodnota lomové houževnatosti [55], [97], [99].

1.3.3.2 Strukturální vlastnosti

Architektura a mikrostruktura materiálu významně přispívá k jeho celkovým vlastnostem, ovlivňuje jeho mechaniku a způsob, jakým tělo reaguje s materiálem.

Jedním z nejvlivnějších parametrů ovlivňujícím strukturální vlastnosti je porozita, dále to mohou být charakteristika zrn, fázové rozdělení a permeabilita.

Velikost a distribuce pórů může být měřena řadou technik. Jednou z metod je např. rtuťová porozimetrie, která charakterizuje pórovitost vytlačováním rtuti do pórů.

Z nedestruktivních metod je nejčastější používána mikropočítačová tomografie (µ-CT), která slouží ke konstrukci 3D struktury, ze které lze dále analyzovat vlastnosti jako

jsou: porozita, velikost pórů, rozdělení fází a anisotropie. Další možností, která se používá spíše pro materiály s jemnou pórovitostí, je adsorpce dusíku, ve které jsou molekuly plynu fyzicky adsorbovány na pevný povrch [100].

1.3.4 Účinky fyziologického prostředí

Při navrhování a testování materiálů pro kostní náhrady je důležité mít na paměti, že implantáty budou fungovat ve fyziologickém prostředí sestávajícím z žíravého solného roztoku při 37^◦C, jehož účinky jsou důležité pro životnost a biologickou odpověď materiálu. Kromě normálních interakcí s buňkami a tkáněmi musí implantáty také přežívat imunitní odpovědi, včetně velkých změn pH a zánětu tkáně, ke kterým dochází bezprostředně po implantaci nebo jsou spouštěny degradací materiálu implantátu.

Pro stálé implantáty typu náhrad kloubů a protéz je žádoucí, aby materiál byl schopen v požadovaném časovém intervalu zachovat svou funkci, aniž by došlo k nekontrolovatelné degradaci a negativnímu ovlivnění okolní tkáně jejími produkty.

Naopak v aplikacích týkajících se např. postupného uvolňování léčiv nebo scaffoldů je degradace nepostradatelnou vlastností a je vyžadována v řádu dnů [101].

Přestože se termín degradace či biodegradace stal důležitým pojmem ve tkáňovém inženýrství, neexistuje pro něj sjednocená definice a vědci ji popisují rozdílně. Lze ji definovat jako biologický proces, při kterém se organické látky pomocí mikroorganismů rozkládají na jednodušší látky a mění se vlastnosti materiálu vyvolané degradací v průběhu času (např. pokles mechanické pevnosti a ztráta hmoty implantátu) [102].

Biodegradace může probíhat různými mechanismy: hydrolyticky, oxidačně, enzymaticky nebo fyzikální degradací (bobtnání, mechanická zátěž). První zmíněný degradační mechanismus je založen na štěpení hydrolyticky citlivé vazby X-Y molekulou vody za vzniku produktů X-H a Y-OH. Ve většině případů jsou u polymerů tyto vazby esterové, ale můžou být i fosfátové, uhličitanové apod.

Pointou hydrolytického štěpení je snížit molekulovou hmotnost (štěpení řetězců) za vzniku monomerních látek, které mohou difundovat skrz povrch a uvolňovat se do tělních tekutin, v nichž automaticky degradují. Tím implantát ztrácí hmotnost.

Rychlost degradace je závislá na difuzi vody, rozpustnosti monomerů a geometrii biomateriálu [103], [104]. Další typem mechanismu je oxidační degradace. Probíhá během zánětlivých reakcí. Leukocyty a makrofágy produkují reaktivní druhy kyslíku (ROS)(např. superoxidy O⁻₂), které způsobují štěpení řetězců [105], [106].

Třetím typem je enzymatická degradace, která je založena na funkci enzymu (biokatalyzátoru), jenž podporuje, iniciuje a urychluje reakce [107]. Fyzikální degradace probíhá za působení vnější mechanické zátěže.

1.3.4.1 Charakterizace a vyhodnocení degradace

Při degradačních procesech dochází ke změnám fyzikálních i chemických vlastností scaffoldů, jež je nutné sledovat a charakterizovat. K těmto účelům slouží degradační zkoušky, které lze rozdělit na povrchové, mezi které jsou řazeny např. spektroskopické metody používané spíše k vyhodnocení prvotních fází degradace a nebo objemové, které zahrnují nejčastěji používané mechanické zkoušky či měření molekulární i celkové hmotnosti. K nejběžnějším vlastnostem a technikám používaným k vyhodnocení průběhu degradace patří:

1. absorpce vody (míra bobtnání) a úbytek hmoty (hmotnostní úbytek), 2. molekulární hmotnost,

. . . .

1.3 Biomateriály pro náhrady kostní tkáně 3. morfologie,

4. mechanické vlastnosti, 5. krystalinita [108].

1.3.4.2 Biodegradační média

Překotný vývoj biomateriálů s sebou přináší nové vědecké i technické výzvy pro navrhování a výrobu implantačních materiálů, ale také požadavky na vývoj nových metod pro jejich přesnější vyhodnocení [109]. Cílem použití biodegradačních médií je simulace složení biologického prostředí a nahrazení testování materiálů in vivo.

Pro biodegradační testování se používají různé typy roztoků napodobující reálné fyziologické prostředí jako je simulovaná tělní tekutina (SBF), moč a močovina, nebo také fyziologické roztoky (SPS) či pufrovací roztoky (BS). Může být ale použito i různých agresivnějších enzymatických, bakteriálních roztoků [110], [111] či buněčných roztoků [112].

Výběr vhodného média je založen na druhu a rozpustnosti biomateriálu a může se lišit složením, vlastnostmi i rychlostí působení. Ačkoliv se všechna zmíněná degradační média používají pro simulaci tělního prostředí, volba média významně ovlivňuje změny mechanických vlastností scaffoldu. Média mají tedy odlišný vliv na jejich degradaci [113]. Nesmírnou výhodou použití degradačních médií pro testování degradace biomateriálů je výrazné snížení testování vin vivo podmínkách na zvířatech [114].

Simulovaná tělní tekutina

Mezi nejvíce používané modelové degradační médium patří roztok označovaný v literatuře zkratkou SBF. SBF je roztok blízký koncentraci iontů anorganické složky lidské krevní plazmy, udržovaný za mírných podmínek pH a stejné fyziologické teploty [115]. Do odborné literatury a později i praxe zavedl SBF Kokubo a kol. [116], kteří testovali změny na povrchu bioaktivní sklokeramiky. Ukázali, že tvorba apatitu in vivo na povrchu sklokeramiky A–W může být reprodukována v nebuněčné SBF s koncentracemi iontů téměř stejnými jako koncentrace lidské krevní plazmy [116].

Porovnání koncentrací lidské krevní plazmy s SBF je zobrazeno v tabulce níže (viz Tabulka 1.2).

Původní složení SBF je však některými autory kritizováno z důvodů použití pufru Tris a absence proteinů či iontů SO²⁻₄ [117], [118], [119]. K odstranění těchto nedostatků byly zavedeny nové modifikované roztoky c-SBF, r-SBF, n-SBF (viz Tabulka 1.2) s koncentrací iontů blížící se co nejvíce lidské krevní plazmě [114].

Tabulka 1.2. Koncentrace iontů v lidské krevní plazmě v porovnání se SBF a jejími modifikacemi [114]

Lidská krevní

SBF c-SBF r-SBF n-SBF plazma

Ionty Koncentrace [mM]

N a⁺ 142.0 142.0 142.0 142.0 142.0

K⁺ 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

M g²⁺ 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Ca²⁺ 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Cl⁻ 103.0 148.8 147.8 103.0 103.0

HCO₃⁻ 27.0 4.2 4.2 27.0 4.2 HP O²⁻₄ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

SO²⁻₄ 0.5 0.0 0.5 0.5 0.5

pH 7.2 - 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4

Fyziologický roztok

Hlavní sloučeninou tvořící základní fyziologický roztok je 0,8% N aCl (8 g.L⁻¹ N aCl). Jedná se o isotonický roztok, tj. má přibližně stejnou osmolaritu jako krevní plazma. Modifikací k základnímu fyziologickému roztoku jsou například Hankův roztok nebo Ringerův roztok.

Ringerův roztok (RR), pojmenovaný podle britského fyziologa S. Ringera, je druh izotonického fyziologického roztoku s přídavkem draselných a vápenatých iontů. Možnou úpravou Ringerova roztoku je přidání laktátu jakožto pufru (Hartmannův roztok) [120].

Hankův roztok (HBSS), vyvinutý roku 1949 vědci J.H. Hanksem a Wallacem, patří mezi vyvážené solné a fyziologické roztoky. Oproti RR má sníženou koncentraci KCl.

V některých případech se do HBSS uměle přidává hořčík ve formě síranů (M gSO4) nebo glukoza [121],[122].

Pufrovací roztoky

Pufrovací roztoky patří mezi nejpoužívanější média v biologickém, chemickém i medicínském výzkumu v oblasti biodegradace. Pufry sestávají ze směsi slabých kyselin a jejich konjugovaných bází, solí, jejichž hlavním cílem je schopnost i po přidání kyseliny nebo zásady udržet relativně stabilní pH, a zabránit tak denaturaci enzymů. Ideálně by měly být inertní, tedy nebýt reaktivní s ostatními složkami roztoku.

V přírodě existuje mnoho systémů, které používají pufry pro regulaci pH. Například