Text práce (719.0Kb)

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Konjugáty oligonukleotid ů s fotodynamicky aktivními a fluorescenci zhášejícími molekulami azaftalocyanin ů

Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Miroslav Miletín PhD.

Hradec Králové 2010 Hana Göringerová

„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány.“

V Hradci Králové Hana Göringerová

Děkuji svému školiteli PharmDr. Miroslavu Miletínovi, Ph.D. za pomoc, radu, optimismus a trpělivost při vypracovávání celé mé diplomové práce. Děkuji také PharmDr. Petru Zimčíkovi, PhD. a Mgr. Kamilu Kopeckému, PhD. za cenné rady a pomoc při vypracovávání experimentální části této diplomové práce.

Obsah

1 ABSTRAKT ... 5

2 ABSTRACT ... 6

3 TEORETICKÁ ČÁST ... 7

3.1 FOTODYNAMICKÁ TERAPIE... 7

3.1.1 Úvod... 7

3.1.2 Princip PDT ... 9

3.2 FLUORESCENCE... 13

3.2.1 Základní teorie fluorescence ... 15

3.2.2 Charakteristiky emise při fluorescenci... 16

3.2.3 Charakteristiky fluoroforu ... 18

3.2.4 Zhášení fluorescence... 20

4 CÍL PRÁCE ... 23

5 METODICKÁ ČÁST... 24

5.1 CLICK CHEMIE... 24

5.1.1 Úvod... 24

5.1.2 Klasifikace click reakcí ... 25

5.1.3 Prostředí pro click reakce ... 27

5.1.4 Cu^I-katalyzovaná alkyn-azidová cykloadice ... 29

6 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ... 34

6.1 REAKCE OLIGONUKLEOTIDŮ SKOMPLEXEM TETRAAMINOFTALOCYANINU PC-A-ZN... 35

6.1.1 Příprava nasyceného roztoku barviva v DMF ... 35

6.1.2 Zjištění extinkčního koeficientu barviva... 36

6.1.3 Vázání barviva na oligonukleotid ... 37

6.1.4 Reakce barviva s anhydridem kyseliny jantarové ... 38

6.2 PŘÍPRAVA FOSFORAMIDITU Q6-1H2... 40

6.2.1 Reakce 2-kyanethyl-N,N-diisopropylchlorfosphoramiditu s Q6-1H2 ... 40

6.2.2 Reakce 2-kyanethyl-N,N,N´,N´-tetraisopropylfosphoramiditu s Q6-1H2 ... 42

6.3 CLICK REAKCE SBARVIVEM P14-1ZN... 43

6.3.1 Click reakce v prostředí DBU a 30% lutidinu v DMF ... 43

6.3.2 Click reakce v prostředí THF (DMSO) a DIPEA... 45

6.3.3 Click reakce v prostředí DMSO a DIPEA... 49

6.4 PURIFIKACE DODANÝCH KONJUGÁTŮ OLIGONUKLEOTIDŮ SE ZHÁŠEČI FLUORESCENCE... 51

7 DISKUZE ... 54

8 ZÁVĚR... 57

9 SEZNAM ZKRATEK ... 58

10 POUŽITÁ LITERATURA ... 59

1 Abstrakt

Tato diplomová práce se zabývá možnostmi vytvoření konjugátů

oligonukleotidů s fotodynamicky aktivními a fluorescenci zhášejícími molekulami azaftalocyaninů.

Žádané konjugáty se nám podařilo vytvořit použitím Cu^I-katalyzované

Huisgenovy 1,3-dipolární alkyn azidové cykloadice, což je nejčastěji používaná metoda click chemie. Během této reakce byl použit oligonukleotid, o sekvenci 25T

modifikovaný hexynylem, navázaný na pevné fázi. Za katalýzy CuI v prostředí THF (případně DMSO) a DIPEA byl zmíněný oligonukleotid konjugován k barvivu

P14-1Zn. Produkt této reakce byl charakterizován měřením UV-VIS spektrofotometru a MALDI-TOF analýzou.

Ostatní postupy, které byly v rámci této diplomové práce provedeny, se ukázaly neúspěšnými, protože nedošlo k navázání barviva k oligonukleotidu na pevné fázi.

2 Abstract

This diploma thesis deals with possibilities of creating conjugates of oligonucleotides with photodynamic or fluorescence quenching azaphthalocyanine molecules.

We created this conjugates by using Copper (I)-catalyzed Huisgen 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes and azides which is the most often used method of click chemistry. Oligonucleotides on solid phase with sequence of 25T modified by hexynyl were utilized during this reaction. These oligonucleotides on solid phase reacted with P14-1Zn dye with CuI as catalyst and THF (DMSO) as a solvent. Products of this reaction were characterized by UV-VIS spectrophotometer and MALDI-TOF analysis.

Other procedures which were made within our diploma thesis turn out to be unsuccessful. The problem was that the dye did not conjugate to oligonucleotides on solid phase.

3 Teoretická č ást

3.1 Fotodynamická terapie

3.1.1 Úvod

Fotodynamická terapie (PDT) je vedle chemoterapie, radioterapie a imunoterapie další možností léčby nádorového onemocnění. Jedná se

o fotochemoterapii, která představuje kombinované použití fotodynamicky aktivní látky (fotosensitizéru(PS)) a světla za přítomnosti kyslíku¹, bez něhož by účinnost PDT byla takřka nulová² (viz. Obrázek 1).

Princip léčby nádorů je založen na celkovém nebo zevním podání

fotodynamicky aktivní látky s následným ozářením UVA nebo viditelným zářením (světlem).¹

Světlocitlivá látka (fotosensitizér) se aplikuje v zásadě trojím způsobem. Buďto je aplikován ve formě topického přípravku obsahujícího příslušnou látku, nebo je zaveden injekčně, a to buď intravenózně (nitrožilně) či intralezionálně (přímo do místa novotvaru). Pro diagnostiku se následně používá Woodova lampa (UV lampa), jež způsobuje fluorescenci fotosensitizéru zpravidla v červené či růžové barvě;

diagnostikovi je tak odhalena velikost, tvar a poloha nádoru.³

Fotosensitizující látka se po určité době selektivně akumuluje v nádoru a pak dojde k ozáření světlem o vhodných vlnových délkách shodných s absorpčním maximem fotosensitizéru. Po absorpci světla dochází ve fotosensitizéru ke vzniku excitovaných stavů, k přesunu transformované energie na kyslík se vznikem singletového kyslíku, který je reaktivnější než základní molekulární stav a vede k oxidaci membránových lipidů a proteinů, což se projevuje cytolýzou a tumorózní destrukcí. Dále může excitovaná forma fotosensitizéru reagovat přímo se substrátem za vzniku volných radikálů substrátu. Volné radikály, především radikály lipidických složek buněčných membrán, jsou pak příčinou destrukce nádoru. Předpokládá se, že oba mechanismy mohou probíhat při PDT současně, avšak jejich relativní podíl na destrukci nádoru závisí na typu a koncentraci fotosensitizéru, na koncentraci kyslíku v nádoru a na vazbě fotosensitizéru na substrát. Výsledným terapeutickým efektem je nekróza, současně s apoptózou nádorových buněk.¹

Výhodou fotodynamické terapie je téměř nulová toxicita použité látky, takže je možno ji (na rozdíl například od chemo či radioterapie) v krátkém čase mnohokrát opakovat. Další výhodou je poměrně přesná selekce nádorových buněk. Metoda tedy zničí pouze nádorové buňky a okolní zdravé zůstanou neporušeny. Nejzřejmější výhoda je, že se řadí mezi neinvazivní metody.

Mezi nevýhody patří omezená možnost použití, neboť světlo používané

k aktivaci fotosensitizátoru proniká nejvýše 1 cm do tkáně, a proto lze fotodynamickou terapii použít pouze na povrchu těla, případně na části orgánů dostupné pomocí

endoskopů a katetrů. Metoda vpichu optického vlákna s aktivizujícím světlem přímo do tkáně se zatím příliš nepoužívá. Nevýhodou při nitrožilní aplikaci fotosensitizéru je několikahodinová (až 48h) fotosensitivita kůže po léčbě. Pacient se tedy musí vyvarovat pobytu na slunci a vystavení se silnému světelnému záření.

Nejvýznamnější uplatnění nalézá fotodynamická terapie při léčbě různých druhů tumorů, a to jak maligních (zhoubných) tak benigních (nezhoubných). Nejčastěji se zatím jedná o léčbu paliativní, nebo doplňkovou léčbu léčby jiného druhu (většinou chirurgického zásahu). Jak již bylo zmíněno výše, největším omezením fotodynamické terapie je průchod aktivizujícího světla nejvýše 1 cm do hloubky tkáně. Přesto byla s úspěchem použita pro léčbu nádorů žaludku, tlustého střeva, hlavy a krku, ústní a nosních dutin, hrtanu, hltanu, jícnu, plic, močového měchýře, jater, prsu, genitálií i mozku. Nejčastěji se ovšem používá pro léčbu nejrůznějších kožních tumorů a lézí;

za všechny zmiňme např. aktinickou keratózu, basaliom či T-lymfom. V kožním lékařství se používá také k léčbě lupénky, bradavic, nebo v estetické medicíně k vyhlazení jizev po akné či vrásek, kdy aktivuje fibroblasty k novotvorbě kolagenu.

Využití nachází metoda také při léčbě senilní degenerace makuly (AMD). Velmi nadějnou aplikací je čištění kostní dřeně od leukemických buněk, kdy se pacientovi odebere kostní dřeň, vyčistí se metodou fotodynamické terapie a coby autologní štěp se vrátí zpět pacientovi.³

Obrázek 1 Zjednodušený princip PDT⁵

3.1.2 Princip PDT

Princip PDT lze obecně definovat jako schopnost fotosensibilizujících látek, především organických barviv, vyvolávat za přítomnosti světelného záření oxidaci nejrůznějších látek.¹

Vlnová délka světelného záření aktivujícího fotosensitizér je pro použití PDT velice limitující. Světlo o nižších vlnových délkách proniká živými tkáněmi pouze do hloubky několika milimetrů a zasažená oblast je velice malá.⁴ Při nižších vlnových délkách dochází k pohlcování světla endogenními chromofory, jako je

např. hemoglobin. Optimální rozpětí vlnových délek se pohybuje v oblasti 680-800 nm.

Další zvyšování nad 800 nm pak již není příliš účelné z hlediska nízké energie záření, jež nemusí dostačovat k účinné aktivaci fotosensitizéru.⁵

Fotosensitizér (PS) se obvykle podává intravenózně a rychle se distribuuje do tělesných tkání. Asi za 48-72 hod po podání mohou fotosensitizující látky dosáhnout znatelně vyšší koncentrace v tumorózní tkáni než v okolní zdravé tkáni. Ačkoliv přesný mechanismus selektivního vychytávání fotosensitizéru není dosud zcela pochopen, lze tento proces alespoň částečně objasnit. Je pravděpodobné, že důvod tkví v abnormální fyziologii samotného nádoru, jako je např. nedostatečná lymfatická drenáž, zvýšená fagocytóza, větší propustnost cévní stěny v nádorové tkáni, kyselejší pH v oblasti

Fotosensitizér (excitovaný stav)

Fotosenzitizér (základní stav)

Tkáňový kyslík

ROS

Buněčná toxicita světlo

nádoru. K selektivnímu vychytávání PS také přispívá zvýšené množství receptorů pro LDL (low-density lipoproteiny) na buněčné membráně, které jsou schopny navázat fotosensitizér, a v neposlední řadě také abnormální složení stroma nádorové tkáně.⁶

Selektivně absorbovaný fotosensitizér je následně ozářen světlem odpovídající vlnové délky, čímž se excituje do vyššího energetického stavu (PS٭), což vede

k produkci cytotoxického agens a nekróze tumoru. Tento mechanismus lze popsat následujícím schématem:

PS → PS٭ → Cytotoxické agens → Biologické poškození → Buněčná smrt⁷

Po absorpci světelného kvanta se fotosensitizér transformuje ze základního singletového stavu (S0) do velice krátce trvajícího (v jednotkách nanosekund) excitovaného singletového stavu (S1)² (viz. Obrázek 2). Tento stav trvá velice krátce na to, aby umožnil efektivní interakci s okolním prostředím a vzhledem k tomu se předpokládá, že zanedbatelně ovlivňuje fotodynamickou aktivitu. Z této energetické hladiny se fotosensitizér může uvolnit několika způsoby⁷, které zahrnují procesy jak radiační (fluorescence), tak neradiační (vnitřní konverze a tzv. „intersystem crossing“).

Vnitřní konverze je založena na srážkách s molekulami rozpouštědla a uvolnění energie ve formě tepla.⁸

Procesem „intersystem crossing“ (ISC) fotosensitizér přechází do svého

tripletového stavu (T₁). Při ISC dochází k inverzi spinu jednoho elektronu (je to proces tzv. spinem zakázaný), proto tento přechod je daleko méně preferovaný než

tzv. povolené procesy. Přesto dobrý fotosensitizér prochází tímto procesem s vysokou pravděpodobností, což je podstatné pro vlastní fotodynamickou aktivitu. Ze stavu T₁ se fotosensitizér může uvolnit několika cestami. První cestou je vyzáření fotonu ve formě fosforescence. Další dva procesy jsou již vlastním základem PDT. Rozdělujeme si je na tzv. fotoproces typu I a typu II. Oba fotoprocesy se objevují současně a poměr mezi nimi je ovlivněn použitým fotosensitizérem, substrátem a koncentrací kyslíku.

Obrázek 2Upravený Jablonského diagram pro fotodynamickou terapii¹⁰

S₀ – základní stav fotosensitizéru, S₁, S_n – excitované stavy fotosensitizéru, T₁ – tripletový excitovaný stav fotosensitizéru, hυ diagnostika – diagnosticky excitované fotony, hυ léčba – léčebně excitované fotony

Fotoproces typu I zahrnuje elektronový nebo vodíkový přenos, při kterém dochází ke vzniku radikálových forem fotosensitizéru nebo substrátu. Meziprodukty mohou reagovat s kyslíkem za vzniku peroxidu, superoxidových iontů a hydroxylových radikálů.

Fotoproces typu II je zprostředkován procesem přenosu energie se základním stavem kyslíku (¹O₂) a návratem sensitizéru do jeho základního stavu. Singletový kyslík je základem fotodynamické cytotoxicity díky tomu, že interakce singletového kyslíku s biomolekulami je vysoce účinná.¹⁰ Reaktivní singletový kyslík napadá okolní biomolekuly¹¹ buď oxidací, nebo cykloadicí. Takto modifikované biomolekuly potom přestávají plnit svou biologickou funkci a dochází k poškození buňky, případně až k její smrti.

Celkový efekt PDT je vytvořen spolupůsobením několika mechanismů. V dnešní době se mluví především o třech základních, které umožňují krátkodobou

i dlouhodobou kontrolu nádoru a podílí se i na jeho konečném zničení.

Pomocí ROS mohou být zničeny přímo maligní buňky v nádoru, může dojít ke změně cévního zásobení nádorové tkáně, nebo díky cytokinům a dalším mediátorům zánětu, které jsou uvolněné z napadených buněk, dojde k aktivaci imunitního systému.

Obecně můžeme říct, že hydrofobní fotosensitizéry působí spíš přímým efektem

na buňky, kdežto hydrofilní fotosensitizéry spíše poškozují cévy a brání přísunu živin.¹²

3.2 Fluorescence

Fluorescence je typ luminiscence, která vzniká díky elektromagnetické

excitaci-látka absorbuje světelnou energii při nízké vlnové délce (vyšší energii) a poté emituje světelnou energii při vyšší vlnové délce (nižší energii). Doba mezi absorpcí a emisí je většinou relativně krátká, často v řádu 10^-9 až 10^-8 sekund.¹³

Fluorescence je obvykle studována s vysoce konjugovanými polycyklickými sloučeninami, které existují v jednom z několika energetických stupňů základního stavu, z nichž každý je spojen s určitým uspořádáním elektronů v molekulárních orbitalech.

Elektronický stav molekuly určuje rozložení negativního náboje a geometrii molekuly.

Pro každou jednotlivou molekulu existuje několik odlišných elektronových stavů (S0, S1, S2, viz. Obrázek 3), které závisí na celkové elektronové energii a symetrii

různých elektronových spinových stavů. Každý elektronový stav je kromě toho rozdělen na určitý počet vibračních a rotačních energetických stupňů, které jsou spojeny

s atomovým jádrem a vazebnými orbitaly. Základní stav pro většinu organických molekul je singletový stav, ve kterém jsou všechny elektrony spinově spárovány (tzn. mají opačný spin). Při pokojové teplotě má jen velmi málo molekul dostatečné množství vnitřní energie na to, aby existovaly v jiném než nejnižším vibračním stupni základního stavu, a tak proces excitace většinou začíná právě na tomto energetickém stupni.¹⁴

Molekula, která je schopna absorbovat světlo o určité vlnové délce, se nazývá chromoforem.

Molekula, která je schopna nejen přijmout světlo o určité vlnové délce, ale zpětně jej i vyzářit, se nazývá fluorochromem nebo-li fluoroforem.¹⁵

Fluorofory si můžeme rozdělit do dvou obecných tříd:

1. vlastní (vnitřní, intrinsic) - vyskytují se přirozeně např. aromatické aminokyseliny, neurotransmitéry, porfyriny

2. vnější (nevlastní, extrinsic) – jsou přidávány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti, jsou připraveny synteticky¹⁶

Obrázek 3 Jablonského diagram¹⁴

Absorpce energie fluorochromem nastává mezi těsně rozloženými vibračními a rotačními energetickými stupni excitovaných stavů různých molekulových orbitalů.

Různé energetické stupně zahrnuté v absorpci a emisi světla fluoroforem jsou představeny Jablonského energetickým diagramem (viz. obrázek 3). Typický

Jablonského diagram ukazuje základní stav S₀, ale také první S₁ a druhý S₂ excitovaný singletový stav (vodorovný soubor linek).

V obrázku 3 tlustší linky reprezentují elektronové energetické stupně, zatímco tenčí linky označují různé vibrační energetické stavy (rotační energetické stavy nejsou uvedeny). Přenos mezi stavy ukazují přímé nebo vlnité šipky, které závisí na tom, zda je přenos spojen s absorpcí nebo emisí fotonu (přímé šipky) nebo vyplývají z vnitřní molekulární přeměny nebo procesu nezářivé relaxace (vlnité šipky). Svislé šipky jsou

3.2.1 Základní teorie fluorescence

Proces fluorescence se skládá ze tří důležitých částí:

1. Excitace – dochází k absorpci světla příslušné vlnové délky fluoroforem 2. Excitovaný stav – fluorofor prochází vibračními a konformačními

změnami

3. Emise – dochází k vyzáření části světelné energie¹⁵

Foton o energii hν_ex, je získán z vnějšího zdroje, kterým může být laser nebo lampa. Molekula schopná fluorescence je v základním energetickém stavu S₀ a absorpcí energie dojde ke vzniku excitovaného energetického stavu S₁‘. Tento stav trvá pouze omezenou dobu, obvykle od jedné do deseti nanosekund (10^-9). Během této doby molekula fluoroforu prochází konformačními změnami a může být velmi dobrým subjektem pro nesčetné potenciální interakce se svým molekulovým prostředím. V další fázi fluorofor ztrácí část své absorbované energie a vytváří relaxovaný singletový stav S1. V tomto stavu vstupuje do druhé fáze - emise energie hνem. Nakonec v poslední fázi se fluorofor vrátí do svého základního stavu S0 (viz. Obrázek 4).¹³

Obrázek 4 Zjednodušený Jablonského diagram¹³

Molekula fluoroforu začne ve svém základním stavu S₀, a je převedena do excitovaného singletového stavu S₁’, absorpcí energie o specifické vlnové délce. Uvolněním části absorbované energie přejde molekula do relaxovaného singletového stavu S1. Nakonec se molekula vrátí do svého základního energetického stavu uvolněním zbývající energie.

Proces fluorescence je cyklický¹⁵ a pokud není fluorofor nevratně zničen v excitovaném stavu (jev fotovybělování, fotobleaching), potom tentýž fluorofor může být opakovaně excitován a emitovat fluorescenční záření. To je základ vysoké citlivosti fluorescenčních technik.¹⁶

3.2.2 Charakteristiky emise při fluorescenci

Stokesův posun

Energie spojená s emisí je za normálních okolností menší, než energie, která byla absorbována. Proto fotony, které jsou vyzářeny, se přesunou do oblasti větších vlnových délek. Tento jev se nazývá Stokesovým posunem (viz. Obrázek 5) a vyskytuje se prakticky u všech fluoroforů využívaných v běžných výzkumech.

Původ Stokesova posunu je v rychlém sestupu excitovaných elektronů na nižší stupeň vibrační energie S1 stavu. Mimoto emise je obvykle spojená s přesunem základního energetického stavu na vyšší stupeň vibrační energie, což má za následek ztrátu excitační energie na tepelné vyrovnání přebytku vibrační energie. Další faktory jako orientace molekul látky v rozpouštědle, reakce excitovaného stavu, celkové rozložení a přenos rezonanční energie, mohou přispět k oněm větším vlnovým délkám.

V praxi je Stokesův posun měřen jako rozdíl mezi maximální vlnovou délkou v excitačním a emisním spektru konkrétního fluoroforu. Velikost posunu se liší v závislosti na struktuře molekuly a může se pohybovat v rozmezí od několika nanometrů až po několik set nanometrů. Existence Stokesova posunu je klíčová pro mimořádnou citlivost měření fluorescence.¹⁴

Obrázek 5 Stokesův posun¹⁴

Kashovo pravidlo

Emisní spektra jsou za normálních okolností nezávislá na vlnové délce záření, použitého pro excitaci. Po excitaci na vyšší elektronický a vibrační stupeň, je přebytek energie rychle rozptýlen a fluorofor je ponechán na nejnižším vibračním stupni S₁ stavu.

Z této pozice je potom emitován foton.Výjimkou z tohoto pravidla je odlišné

geometrické uspořádání jader v excitovaném stavu oproti základnímu energetickému stavu.¹⁷

Zákon zrcadlové symetrie

Zrcadlová symetrie mezi absorpčním a fluorescenčním pásem platí pro velké množství organických molekul a je způsobena tím, že absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin mají stejnou relativní pravděpodobnost. Většina absorbujících i emitujících molekul se nachází v rovnovážném vibračním stavu, přičemž vibrační struktura základního i excitovaného stavu je stejná. Po absorpci přechází elektron z rovnovážné vibrační hladiny stavu S0 na vyšší vibrační hladinu stavu S1, poté dochází k rychlé vibrační relaxaci na rovnovážnou vibrační hladinu excitovaného stavu

S₁ (v čase 10^-12-10^-13 s) a teprve poté následuje zářivý přechod na vyšší vibrační hladinu stavu S0 a další vibrační relaxace na rovnovážnou vibrační hladinu stavu S0

(viz. Obrázek 6).Výjimky z pravidla zrcadlové symetrie jsou obvykle důsledkem rozdílného geometrického uspořádání atomových jader v excitovaném stavu oproti uspořádání ve stavu základním.¹⁶

Obrázek 6 Ukázka zrcadlové symetrie absorpce a emise¹⁴

3.2.3 Charakteristiky fluoroforu

Molární extinkční koeficient

Molární extinkční koeficient je široce užívaný v oblastech spektroskopie, mikroskopie a fluorescence především proto, že přeměňuje jednotky absorbance na jednotky molární absorpční koncentrace pro různé chemické sloučeniny.

Extinkční koeficient získáme měřením absorbance roztoku o koncentraci jednoho molu cílové sloučeniny v kyvetě s tloušťkou jednoho centimetru při referenční vlnové délce. Referenční vlnová délka je obvykle vlnová délka absorpčního maxima v ultrafialové či viditelné oblasti světla. Extinkční koeficient je přímým měřením schopnosti fluoroforu absorbovat světlo. Chromofor s vysokým extinkčním

koeficientem má také vysokou schopnost fluorescence. Protože vnitřní doba života fluoroforu je nepřímo úměrná extinkčnímu koeficientu, molekuly vykazující vysoký extinkční koeficient mají excitovaný stav s krátkou vnitřní dobou života.¹⁴

Kvantový výtěžek

Kvantový výtěžek je počet emitovaných fotonů vztažený k počtu absorbovaných fotonů.

nr r

r

k k

k

= + Φ

kde kr je počet emitovaných fotonů a knr jsou všechny formy nezářivých přechodů z excitovaného do základního stavu.¹⁷

Nezářivý přechod je ten, při kterém nedojde k emisi fotonu,¹⁷ např. vnitřní konverze, mezisystémová konverze a vibrační relaxace.¹⁶

Kvantový výtěžek se obvykle pohybuje v rozmezí 0 až 1.¹⁴ Pokud je roven jedné, znamená to, že každý foton, který byl absorbován je i vyzářen.¹⁸

Životnost fluorescence

Délka trvání excitovaného stavu je definována jako průměr času, který molekula stráví v excitované formě předcházející návratu do základního energetického

stavu^{17, 19, 20}. Obvyklá délka trvání excitovaného stavu se pohybuje v rozmezí 5 až 15 nanosekund.¹⁹

Životnost fluorescence může být vyjádřena:

nr

r k

k +

= 1 τ

Tento vztah je spojen s vyjádřením kvantového výtěžku, vzhledem k tomu, že mají společného jmenovatele.¹⁹

Doba života fluoroforu za nepřítomnosti neradiačních zhášecích procesů se nazývá vnitřní (též přirozená, radiační) doba života (τn).¹⁶

=Φτ τn

Během trvání excitovaného stavu může fluorofor projít konformačními

změnami, reagovat s ostatními molekulami a difundovat do okolního prostředí. Rozpad intensity fluorescence je funkcí času ve stejném souboru molekul excitovaných krátkým pulzem světla a je vyjádřena exponenciální funkcí (viz. Obrázek 7):

τ t

t I e

I = 0 ⁻

Kde It je intensita fluorescence měřená v čase t, I0 je počáteční intenzita zjištěná okamžitě po excitaci, τ je životnost fluorescence.¹⁴

Obrázek 7 Graf závislosti intenzity fluorescence na čase¹⁴

Čas čas

Při jednoduchém exponenciálním dohasínání se 63% molekul vrátí do základního stavu v čase t < τ a 37% v čase t > τ.¹⁶

3.2.4 Zhášení fluorescence

Zhášení fluorescence lze definovat jako bimolekulární proces, který snižuje kvantový výtěžek fluorescence beze změny fluorescenčního emisního spektra.¹⁶ Existuje mnoho typů zhášecích procesů, které zahrnují reakce excitovaného stavu, přeskupení molekul, přenos energie a tvoření komplexního základního stavu. Jsou dva základní typy zhášení: statické a dynamické (srážkové) zhášení. Oba typy zhášení vyžadují interakci fluoroforu a zhášeče.¹⁷

Během statického zhášení dochází k vytvoření nefluorescenčního komplexu v základním energetickém stavu („ground state complex“) (viz. Obrázek 8). Donorová a akceptorová část vytvoří intramolekulární dimer, který má své vlastní jedinečné vlastnosti. Spektrální vlastnosti nejsou rovny součtu vlastností jednotlivých částí tohoto komplexu. Elektronové vlastnosti dimeru závisejí na dipolární interakci a relativní orientaci tranzitních dipólových momentů donoru a akceptoru.^{16, 21}

Obrázek 8 Statické zhášení

Intramolekulární komplex zhášeče s fluoroforem v základním energetickém stavu

Vzniklé agregáty jsou děleny na H-agregáty a J-agregáty. H-agregáty mají absorpci posunutou k modré oblasti spektra a mají často významně sníženou

fluorescenci. J-agregáty mají absorpci posunutou k červené oblasti spektra a je pro ně

energetického stavu. Následně excitovaný akceptor, kterým může být jiný fluorofor nebo látka nemající fluorescenci, vyzáří energii ve formě fotonu nebo tepla^24,25 (viz. Obrázek 9).

Obrázek 9 Dynamické zhášení

Mezi fluoroforem a zhášečem („quencherem“) dochází k neradiačnímu přenosu energie při excitovaném stavu (*) fluoroforu.

Snížení intenzity fluorescence při dynamickém zhášení je popsáno Stern-Volmerovou rovnicí:

[ ]

[ ]

F K F

q 0

0 =1+ =1+ τ

kde F a F₀ je fluorescence za a bez přítomnosti zhášeče, K je Stern-Volmerova zhášecí konstanta, τ₀ je životnost fluorescence bez přítomnosti zhášeče, [Q] je koncentrace zhášeče. Stern-Volmerova konstanta může být někdy vyjádřena jako K_sv nebo K_v.¹⁷

Pro statické zhášení platí také Stern-Volmerův vztah, a proto se statické a dynamické zhášení liší v závislosti na hodnotách teploty, viskozity a délky života.

Zvýšení teploty vede ke zvýšeným difúzním konstantám zhášečů a povede ke zvýšení dynamického zhášení. V případě statického zhášení naopak zvýšení teploty povede ke snížení vazebných konstant zhášeče a fluoroforu a vyústí v pokles zhášení statickým zhášečem.¹⁷

FRET lze rozdělit na dva způsoby zhášení fluorescence, na Försterův a Dexterův mechanismus zhášení. Försterův mechanismus (známý také jako Coulombův) je založen na klasických interakcích dipól-dipól mezi tranzitními dipóly donoru a akceptoru. Tento mechanismus zhášení je závislý na vzdálenosti donoru a akceptoru energie (R),

vyjádřené vztahem 1/R⁶. Försterův model přenosu energie se vyskytuje typicky na vzdálenost 20 – 60 Å (2 - 6 nm), maximálně 100 Å (10 nm). Závisí také na spektrálním překryvu donoru a akceptoru. Fluorofory a zhášeče musí být tedy

vybírány tak, aby se emisní spektrum fluoroforu a absorpční spektrum zhášeče překrývaly.

Dexterův mechanismus se vyskytuje pouze v případě, jsou-li fluorofor a zhášeč v dostatečně malé vzdálenosti, aby mohlo dojít k překryvu jejich molekulových

orbitalů. Efektivita Dexterova přenosu energie se snižuje, a to podle vztahu e^-R, kde R je vzdálenost fluoroforu a zhášeče. Tento mechanismus zhášení je u většiny

donor-akceptorových párů méně důležitým jevem, nežli mechanismus Försterův.^{21, 22} Vnitřní vlastnosti donorových a akceptorových barviv, jako tvar jejich absorpčního a fluorescenčního spektra, jsou při zhášení probíhajícím oběma mechanismy (Försterovým i Dexterovým) zachovány.²¹

Fluorescenčně rezonanční přenos energie (FRET) lze použít in vivo i in vitro pro měření vzdáleností v řádu nanometrů i změn ve vzdálenostech. Je jednou

z fluorescenčních technik s nejširším využitím pro zkoumání struktury a dynamiky biopolymerů.^24,26

4 Cíl práce

Cílem mé diplomové práce bylo vytvořit konjugáty oligonukleotidů navázaných na pevné fázi s fotodynamicky aktivními a fluorescenci zhášejícími molekulami

azaftalocyaninů, následné odštěpení konjugátů oligonukleotidů z pevné fáze, jejich deprotekce, základní vyčištění a charakterizace pomocí UV-VIS spekter a případně dalších dostupných metod.

5 Metodická č ást

5.1 Click chemie

5.1.1 Úvod

Click chemie je chemická filozofie, která byla představena K. Barry

Sharplessem v roce 1999 na 217. setkání Americké chemické společnosti. Jedná se o nový přístup, který by měl usnadnit proces hledání a přípravy nových struktur, které by mohly být použity v terapii.²⁷ Click chemie by neměla nahradit dnes existující metody vyhledávání nových léčiv, ale rozšířit a doplnit je.^27,28,29 Podstatou tohoto přístupu je snaha vytvořit látky spojením malých jednotek dohromady přes heteroatom (C-X-C). Záměrem je vyvinout rozšiřující se sadu silných, selektivních a modulárních

„bloků“, které pracují spolehlivě při použití v malém i velkém měřítku.²⁷ Skutečná síla click chemie leží v její schopnosti vytvořit nové struktury, které se nemusejí nezbytně podobat již známým farmakoforům.³⁰

Doktor Sharpless definoval click chemii jako skupinu reakcí, které musí být modulární, široké v rozsahu, s velkým výtěžkem, které vytvářejí pouze neškodné vedlejší produkty, které mohou být odstraněny nechromatografickými metodami a musí být stereospecifické (ale nemusí být enantioselektivní). Charakteristickými rysy těchto reakcí jsou jednoduché reakční podmínky (ideálně by proces neměl být citlivý

ke kyslíku a vodě), rychlá dostupnost počátečních reagencií a materiálu. Během reakcí by se neměla používat rozpouštědla, nebo pokud se použijí, tak pouze ta, která jsou neškodná (jako třeba voda), nebo ta, která mohou být snadno odstraněna. Jednoduchá musí být i izolace produktů. Pokud se vyžaduje čištění konečného produktu, musí být provedeno nechromatografickými metodami jako krystalizace nebo destilace.

Mezi podmínky je zahrnuto i to, že konečný produkt musí být stabilní za fyziologických podmínek.²⁷

Použití click chemie je tedy velmi široké. Zahrnuje syntézu 1,4-substituovaných triazolů, modifikaci peptidové funkce triazoly, přizpůsobení přírodních produktů a léčiv, objevování léčiv, supramolekulární chemii, polymery, apod.³¹

Původně byla click chemie vyvinuta jako prostředek pro objevování léčiv.

Nicméně její dosud nejúspěšnější aplikace je v oblastech polymerní chemie.

Click reakce se používají při tvorbě blokových kopolymérů, které mají množství farmaceutických aplikací. Jsou značně užívány při vytváření různých nanočásticových struktur jako micel, nanosfér, nanokapsulí, atd.³⁴

Filozofie click chemie poskytla mocný nástroj i při tvorbě biomakromolekul s nevídanými strukturálními charakteristikami a vlastnostmi. Odlišné syntetické strategie využívají alkyn-azidovou cykloadici k vazbě syntetických polymerů s nukleovými kyselinami, peptidy, cukry, proteiny a dokonce s viry a buňkami.³²

5.1.2 Klasifikace click reakcí

Click chemie zahrnuje skupinu důležitých vazebných reakcí, které lze jednoduše uskutečnit, mají vysoké výtěžky, vyžadují jen minimální čištění a jsou všestranné ve spojování různých struktur bez předběžných protekčních kroků. Důležitou

skutečností je, že click reakce dosahují svých vyžadovaných charakteristik, tím, že mají velkou termodynamickou hnací sílu, obvykle větší než 20 kcal mol^-1.³⁰

Existují čtyři hlavní typy click reakcí (viz. Obrázek 10 ):

1. Cykloadice nenasycených kruhů, zvláště 1,3-dipolární cykloadiční reakce, ale také Diels-Alderovy cykloadice³⁰

2. Nukleofilní substituce, štěpení kruhu nestálých heterocyklických elektrofilů jako aziridinů, epoxidů, cyklických sulfátů, aziridiniových iontů, atd.³⁰

3. Karbonylová chemie non-aldolového typu, jako tvorba urey, thiourey, aromatických heterocyklů, oximů, etherů, hydrazonů, amidů atd.²⁷

4. Adice na násobné uhlíkové vazbě, např. oxidační reakce, jako epoxidace, dihydroxylace, Michaelovy adice apod.^27,30

Z těchto čtyř základních klasifikací je nejvíce využívaná cykloadice a to zejména Cu^I-katalyzovaná Huisgenova 1,3-dipolární cykloadice (HDC) azidů a terminálních alkynů, při které dochází k vytvoření 1,2,3-triazolů.³³

Obrázek 10 Hlavní klasifikace click reakcí s příklady, Nu-nukleofil, EWG-skupiny uvolňující elektrony³⁴

5.1.3 Prostředí pro click reakce

Click reakce probíhají ve dvou možných prostředích, a to v roztoku nebo na pevné fázi.

Click reakce v roztoku

Click reakce, které probíhají v roztoku, často upřednostňují prostředí vody než organického rozpouštědla. Tato skutečnost je dána následujícím:

1. Click reakce často probíhají ochotně v horké vodě, aby poskytly jediný produkt, dokonce i když jeden či více reaktantů, stejně tak jako produktů vypadají, že jsou nerozpustné v tomto médiu. Reakce mezi organickými sloučeninami ve vodném prostředí mohou mít vyšší rychlostní konstanty než reakce v organickém médiu. Jedním z možných vysvětlení pro takovýto jev je, že volná energie organických molekul je podstatně větší, když jsou špatně rozpustné ve vodě a často jeví zvýšenou reaktivitu, která nahrazuje nízkou koncentraci zúčastněných molekul.³⁵

2. Nukleofilní adice epoxidových („homokarbonyl“) a aziridinových

(homoimin) elektrofilů (stejně jako episulfoniových či aziridiniových iontů) je podporována rozpouštědlem, které je nejvíce kompatibilní s vodíkovými vazbami, vznikajícími během tohoto procesu. Z tohoto pohledu je voda jedinečná a z téhož důvodu je skvělým prostředím pro reverzibilní karbonylovou chemii.²⁷

3. Dvě důležité podskupiny click reakcí olefinů a acetylenu jsou oxidace elektrofilním reagentem a cykloadiční reakce. Tyto procesy jsou buď souběžné nebo zahrnují polarizovatelný nukleofil/elektrofil, a tak voda není interferujícím médiem.³⁶ Obecně se cení především toho, že použití vody nabízí největší vliv na rozlišení reaktivity konkurenčních

nepolarizovatelných a polarizovatelných sloučenin.

4. Vysoce příznivá reakce dvou rozpuštěných látek (při 0,1M koncentraci) je obvykle rychlejší než nízká hnací síla vedlejší reakce jedné rozpuštěné látky s vodou jako rozpouštědlem.

5. Díky své vysoké tepelné kapacitě je voda velmi dobrý chladič a má vhodnou teplotu varu. Obojího lze využít pro velký počet procesů.

Voda je považována za ideální rozpouštědlo také díky vlivu na životní prostředí a nízké ceně. Výhoda, která je málo ceněna, ale má obrovský důsledek je, že většina hydroxylových skupin a aminoskupin neinterferuje s click reakcí ve vodě. Důsledkem je zrušení procesu vázání a odstraňování chránících skupin.²⁷

Click chemie na pevné fázi

Click reakce v roztoku je bezpochyby důležitou součástí click chemie, přesto její úspěch na pevné fázi vytváří z této reakce nástroj nezbytný při objevování nových léčiv.

Díky kombinatorní chemii na pevné fázi je v tomto procesu umožněno vytvářet nové knihovny sloučenin pro biologické testování.³⁰

Syntézy na pevné fázi jsou oblíbené právě proto, že dovolují reakci, která

nedosáhla „click“ statusu, aby byla použita jako click reakce - to je v situacích, kde jsou vyžadovány velmi vysoké výtěžky a jednoduché čištění. Tyto atributy jsou dosaženy využitím velkého přebytku reaktantů v mobilní fázi.²⁷

Nevýhodou je, že se jedná o metodu velmi drahou, hodně ztrátovou na reagenciích a rozpouštědlech. Je velmi těžké vytvořit velké množství produktu a i když se provádí syntéza ve velkých poměrech, výtěžek je jen malý. Dalším problémem je z pohledu chemické technologie zavedení a odštěpení částí molekul sloužících k vazbě na pevnou fázi.²⁷

Navzdory určitým limitům můžeme říct, že alkyl-azidová cykloadice na pevné fázi má potenciál vytvořit početnou skupinu molekul různých funkcí. Obecně

cykloadice probíhají snadněji na pevné fázi, ale mohou prokázat více citlivosti ke stérickým faktorům než v roztoku. Začlenění triazolu do peptidu probíhá na pevné fázi bez problémů, což je určitá výhoda vzhledem k úspěšné syntéze moderních peptidů

5.1.4 Cu^I-katalyzovaná alkyn-azidová cykloadice

Jedná se o nejčastěji používanou metodu click chemie, která je v současné době i nejefektivnější variantou Huisgenovy 1,3-dipolární cykloadice³⁷ azidů a alkynů za vzniku 1,2,3-triazolů. Azidy a alkyny jsou inertní vůči většině biologických

a organických podmínek, zahrnujících vysoce funkcionalizované biologické molekuly, molekulární kyslík, vodu a většinu běžných reakčních podmínek v organické

syntéze.^38,39

Navzdory tomu, že rozklad azidu je termodynamicky preferovaným jevem, kinetické faktory dovolují alifatickým azidům zůstat téměř „neviditelnými“, dokud se nesetkají s vhodným dipolarofilem.³⁹ Kinetická stabilita alkynů a azidů je přímo zodpovědná za jejich pomalou cykloadici, která zpravidla vyžaduje zvýšenou teplotu a dlouhý reakční čas. Dobrá regioselektivita v nekatalyzované Huisgenově cykloadici je pozorována ve spojovacích reakcích, které obsahují vysoce elektron-deficitní terminální alkyny. Reakce s jinými alkyny obvykle poskytují směsi 1,4- a 1,5-regioisomerů

(viz. Obrázek 11). ⁴⁰

Obrázek 11 Huisgenova cykloadice

Směs 1:1

Teprve nedávné objevy výhod katalýzy alkyn-azidového spojení měďnými ionty objasnila hlavní přednosti cykloadice.

Cu^I katalýza zlepšila regioselektivitu tak, aby se vytvářely pouze 1,4-regioisomery (viz. Obrázek 11). Reakce probíhá asi 10⁷ krát rychleji než při nekatalyzovaném průběhu a čištění se ve většině případů skládá pouze z filrace konečného produktu.

Ve většině případů se nevyžaduje zvýšení teploty, ale reakce může probíhat při velkém teplotním rozmezí (0-160°C), v různých druzích rozpouštědel (i vodě) a v různém rozmezí pH (5-12).^40,39,41

Dalším důvodem, proč je tato reakce velmi oblíbená, je biologická aktivita 1,2,3-triazolů. Tyto heterocykly fungují jako rigidní vazebné jednotky, které mohou napodobovat atomové rozmístění a elektronové vlastnosti peptidové vazby bez téže vnímavosti k hydrolytickému štěpení (viz. Obrázek 12).⁴⁰

Obrázek 12 Topologické a elektronické podobnosti amidů a 1,2,3-triazolů

Samozřejmě existují určité strukturní rozdíly mezi vazbou triazolů a amidů.

Nejvíce patrný je jeden atom navíc v kostře triazolu, což vede k vzrůstu vzdálenosti mezi R¹ a R² o 1,1 Å oproti vzdálenosti v amidové vazbě (viz. Obrázek 12). Dalším rozdílem je přítomnost většího dipólového momentu u triazolů.⁴²

Možná v souvislosti se svou schopností napodobovat určité aspekty peptidové vazby, hodně známých 1,2,3-triazolů vlastní různou biologickou aktivitu,

včetně anti-HIV aktivity, selektivní inhibice β₃ adrenergních receptorů, antibakteriální aktivity, účinné antihistaminové aktivity a dalších.⁴⁰

Mechanismus reakce

Obecně můžeme říct, že cykloadice probíhají souběžným mechanismem.

vs. 26 kcal/mol v jednotlivé reakci).⁴⁴ Kromě toho stupňovitě katalyzovaná HDC reakce má aktivační bariéru o 11 kcal/mol nižší než souběžná katalyzovaná reakce.⁴⁰

Předpokládá se, že prvním krokem reakce je π komplexace Cu^I dimeru do alkynu (1 v Obrázek 13). Potom nastane odštěpení terminálního vodíku a vytvoří se acetylid.⁴¹ Ve skutečnosti se v závislosti na podmínkách reakce může vytvořit několik rozdílných druhů Cu-acetylidového komplexu (2 reprezentuje pouze jednu z variant).⁴⁴

π komplexace Cu^I snižuje pKa terminálního alkynu na 9,8, což umožňuje deprotonaci ve vodném prostředí bez přídavku báze.⁴⁰ Jestliže bylo použito nezásadité organické rozpouštědlo např. acetonitril, potom musí být přidána báze jako 2,6-lutidin nebo N,N´-diisopropyethylamin (DIPEA).⁴⁵

Další průběh mechanismu reakce je znázorněn na obrázku 13.

Obrázek 13 Mechanismus HDC reakce

Ligandy jsou označeny jako L a symbolizují různé složky, které závisí na použitém katalyzátoru.

Například, pokud je jako katalyzátor použit CuBr, pak je ligandem bromid³⁴

Jako katalyzátor jsou používány sloučeniny, které obsahují Cu^I. Zdroji Cu^I jsou Cu^I soli (CuI, CuBr atd.), in situ redukované Cu^II soli⁴⁰ (redukčním činidlem je askorbát sodný, ale také hydrazin a tris(karboxyethyl)phosphin)³⁴, obzvláště síran měďnatý a proporcionace Cu⁰ a Cu^II.⁴⁰

Problémy této reakce

Cu^I-katalyzovaná cykloadice vytváří triazoly s vysokou spolehlivostí

a efektivitou, ale jako v každé reakci, tak i v této existují určité problémy. V několika případech vědci oznámili vznik vedlejších produktů díky alkynovému homocouplingu (proces, který také katalyzuje měď). Kromě toho se azidová vazba může ukázat problematickou pro vysoce elektrondeficitní azidy nebo polyalkynové substráty, které mají schopnost koordinačně nasytit Cu^I.⁴⁰

Homocoupling alkynů

Jak už bylo nastíněno dříve, click chemie probíhá téměř vždy s vysokým výtěžkem a bez vytváření vedlejších produktů. V mimořádných případech, kdy jsou výtěžky malé, se předpokládá, že viníkem je právě homocoupling alkynů (viz. Obrázek 14).⁴⁰

Obrázek 14 Mechanismus Cu-katalyzovaného acetylenového couplingu

Cu^I nasycení

Cu^I-katalyzovaná alkyn-azidová cykloadice vyžaduje nestabilní ligandy okolo Cu^I, aby umožnily kompetitivní azidovou vazbu. U flexibilních polyalkynů, např.

tetraalkynů, může blízkost alkynů ve skutečnosti koordinačně nasytit Cu^I atomy chelatací (viz. Obrázek 15)⁴⁰

Obrázek 15 Neúspěšná cykloadice alkynu 60 a azidu 61

6 Experimentální č ást

Průběh reakcí a čistota produktů a meziproduktů byly kontrolovány tenkovrstvou chromatografií na deskách Merck Silikagel 60 F254. Detekce byla prováděna světlem vlnové délky 254 nm a 366 nm. Vyvíjecí soustavy jsou uvedeny u jednotlivých reakcí.

Sloupcová chromatografie byla prováděna na silikagelu Merck Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm).

K měření spektra ve viditelné oblasti bylo použito přístroje SHIMADZU UV 2401 PC: UV-VIS recording spectrophotometer.

Čištění oligonukleotidů a jejich konjugátů bylo provedeno pomocí Puri-Pak^TM kolonek (ChemGenes Corporation, 33 Industrial Way, Wilmington, MA 01887; postup popsán v kapitole 6.4) a Sephadex kolonek typu Sephadex G-25 Medium DNA Grade (Pharmacia Biotech/ GE Healthcare Bio-Sciences AB, SE-751 84 Uppsala, Sweden).

Hmotnostní spektra byla měřena na MALDI-TOF Bruker Autoflex II mass spectrometru.

6.1 Reakce oligonukleotid ů s komplexem tetraaminoftalocyaninu Pc-A-Zn

Pc-A-Zn

Mr=637,972 g/mol

Sumární vzorec C₃₂H₂₀N₁₂Zn

6.1.1 Příprava nasyceného roztoku barviva v DMF

0,0064 g barviva bylo za teploty 70°C rozpuštěno v 1 ml DMF. Následovala centrifugace po dobu 4 minut rychlostí 1800 otáček/min. Bylo odebráno 0,750 ml roztoku a zjistilo se, že na dně zkumavky se nevyskytuje žádná usazenina ani nerozpuštěné barvivo.

Proto bylo přidáno dalších 0,0062g barviva a roztok byl míchán za teploty 70°C.

Směs se stala viskóznější. Po centrifugaci a odebrání 0,750 ml se opět nevyskytla žádná usazenina.

Následovalo opětovné přidání 0,0082g barviva, rozpouštění při 70°C,

centrifugace a odebrání 0,750 ml roztoku. Ukázalo se, že na dně zkumavky zůstala část nerozpuštěného barviva - roztok se stal nasyceným.

6.1.2 Zjištění extinkčního koeficientu barviva

V 1,6240 ml DMF bylo rozpuštěno 1,036 mg barviva (vznikl 1mM roztok barviva v DMF). Bylo odebráno 0,3 ml 1 mM roztoku barviva v DMF a toto množství bylo doplněno do 3 ml DMF (došlo ke zředění původního roztoku na 100µM roztok).

Následně došlo k naředění tohoto roztoku nejdříve na 10µM a následně na 2 µM roztok.

Obě dvě koncentrace (10 µM, 2 µM) byly změřeny na UV-VIS spektrofotometru.

Tabulka 1 Absorbance naměřená u 2 µM a 10 µM roztoku Pc-A-Zn

UV-VIS Spektrum1 2µM roztok Pc-A-Zn

2 μM

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2

300 400 500 600 700 800 900

absorbance

Koncentrace roztoku (µM)

A (při 355 nm)

A (při 715 nm)

ε (715 nm) (Ml^–1cm^–1)

2 0,1521 0,1861 93050

10 0,6365 0,8329 83290

6.1.3 Vázání barviva na oligonukleotid

Použitý oligonukleotid - 25T modifikovaný bromhexylem navázaný na pevné fázi

1. K 0,5 ml nasyceného roztoku barviva bylo přidáno 0,0035 g oligonukleotidu vázaného na pevné fázi a tato směs byla míchána při teplotě 35°C. (Teplota míchání měla být 55°C. Díky technické vadě teploměru, který ukazoval teplotu o 20°C nižší, než byla teplota

skutečná, byla tato směs míchána jen při již zmíněných 35°C)

2. K 0,5 ml nasyceného roztoku barviva bylo přidáno 0,0036 g oligonukleotidu vázaného na pevné fázi a tato směs byla míchána při 55°C.

3. K 0,5 ml nasyceného roztoku barviva (roztok připraven opětovně, dle stejného postupu jako v kapitole 6.1.1). Bylo přidáno 0,0032 g oligonukleotidu vázaného na pevné fázi a tato směs byla míchána při 55°C.

Všechny tři reakční směsi byly promyty DMF a ethanolem. Ke všem byl přidán 1 ml AMA (32% roztok amoniaku a 40% roztok methylaminu v poměru 1:1), který způsobil odštěpení oligonukleotidu od pevné fáze. Po uběhnutí hodiny byly všechny pokusy změřeny UV-VIS spektrofotometrem.

Tabulka 2 Absorbance směsí vzniklých reakcí oligonukleotidu s Pc-A-Zn

Pokus číslo

A (při 740nm)

A (při 264nm)

Počet nmol oligonukleotidu

ve vzorku

1 * 0,3560 15,0491

2 0,0461 0,2127 20,3032

3 * 0,4811 45,9232

* při této vlnové délce se v UV-VIS spektru neobjevil žádný peak-tzn. že barvivo nebylo v daném roztoku přítomno (nenavázalo se na oligonukleotid)

UV-VIS Spektrum 2 Pokus 3 reakce Pc-A-Zn s oligonukleotidem použitým v kapitole 6.1.3

Pokus 3

-0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

200 300 400 500 600 700 800 900

vlnová délka (nm)

absorbance

6.1.4 Reakce barviva s anhydridem kyseliny jantarové

Rovnice reakce Pc-A-Zn s anhydridem kyseliny jantarové

Pro zjištění výsledků reakce bylo zapotřebí najít vhodnou soustavu pro TLC.

Kombinace rozpouštědel použitých při hledání soustavy jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3 Kombinace rozpouštědel použité při vyhledávání soustavy vhodné pro TLC

Soustava číslo

Benzín (ml)

THF (ml)

CH3COOH (ml)

DCM (ml)

TEA (ml)

1 40 10

2 45 5

3 45 5 20

4 8 40

5 4 40

6 4 40 2

7 4 40 2

Bylo zjištěno, že nejvhodnější soustavou je směs THF a benzínu v poměru 10:1.

Zjištěný Rf=0,4286

6.2 P ř íprava fosforamiditu Q6-1H2

Q6-1H2

Mr=1123,41 g/mol

Sumární vzorec C₅₆H₈₂N₂₄O₂

6.2.1 Reakce 2-kyanethyl-N,N-diisopropylchlorfosphoramiditu s Q6-1H2

1. V 1,16 ml bezvodého acetonitrilu bylo rozpuštěno 12,5 mg

2-kyanethyl-N,N-diisopropylchlorfosphoramiditu. Následně byl přidán triethylamin 15µl a směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 10 minut. Mezitím došlo k rozpuštění 54,8 mg Q6-1H2 v 1,16 ml bezvodého acetonitrilu. Tento roztok byl přidán k původní směsi a vše bylo mícháno po dobu 30 minut. Do roztoku bylo po 30 minutách

přidáno ještě 12,5 mg 2-kyanethyl-N,N-diisopropylchlorfosphoramiditu a 16µl triethylaminu.

Rovnice reakce Q6-1H2 s 2-kyanethyl-N,N-diisopropylchlorfosphoramiditem

Pro identifikaci vzniklého produktu bylo nutno najít vhodnou soustavu rozpouštědel. Tato soustava byla poté využita pro TLC:

Tabulka 4 Kombinace rozpouštědel použité při vyhledávání soustavy vhodné pro TLC

Soustava číslo

DCM (ml)

EAC (ml)

TEA (ml)

Benzín (ml)

1 12,6 8,4 1

2 12,6 8,4

3 12 12

4 4 16

5 8 16

6 12 12

Pro provedení TLC byla zvolena směs DCM a benzínu v poměru 1:1. Při použití této soustavy byl Rf roven 0,4.

6.2.2 Reakce 2-kyanethyl-N,N,N´,N´-tetraisopropylfosphoramiditu s Q6-1H2

28,2 mg barviva Q6-1H2 bylo naváženo a rozpuštěno v 0,7 ml bezvodého DMF.

Následně bylo přidáno 18 mg 2-kyanethyl-N,N,N´,N´-tetraisopropylfosphoramiditu a 2,4 mg 5-ethylthiotetrazolu. Tato směs byla třepána do rozpuštění 5-ethylthiotetrazolu a pak bylo přidáno 0,045ml N-methylimidazolu. Následujících 5 hodin byla směs míchána při laboratorní teplotě.⁴⁷

Rovnice reakce Q6-1H2 s 2-kyanethyl-N,N,N´,N´-tetraisopropylfosphoramiditem

Pro identifikaci produktu vzniklého reakcí bylo nutno najít vhodnou soustavu rozpouštědel, jejichž kombinací by vzniklo nejlepší prostředí pro provedení TLC:

Tabulka 5 Kombinace rozpouštědel použité při vyhledávání soustavy vhodné pro TLC

Soustava číslo

DCM (ml)

EAC (ml)

TEA (ml)

Aceton (ml)

Toluen (ml)

1 12,6 8,4 1

2 12,6 8,4

3 12 6

6.3 Click reakce s barvivem P14-1Zn

P14-1Zn

Mr=1285,11 g/mol

Sumární vzorec C₆₂H₇₀N₁₄OS₆Zn

6.3.1 Click reakce v prostředí DBU a 30% lutidinu v DMF

Použitý oligonukleotid - 25T modifikovaný hexynylem, navázaný na pevné fázi

K 2,95 mg oligonukleotidu navázaném na pevné fázi byly postupně přidávány barvivo P14-1Zn, kyselina askorbová, jodid měďný, DBU a 30% lutidin v DMF (navážky jsou uvedeny v tabulce 6). Směs těchto látek byla míchána po dobu

24 hodin.^{40, 48} Následně byly všechny vzorky promyty DMF a byl k nim přidán 0,5 ml AMA. Po uplynutí cca 1 hodiny byly vzorky změřeny na UV-VIS spektrofotometru s výsledky uvedenými v tabulce 7.

Rovnice reakce P14-1Zn s oligonukleotidem (25T) modifikovaným hexynylem navázaným na pevné fázi

Tabulka 6 Navážka reagencií použitých v click reakci v kapitole 6.3.1

Pokus číslo

P14-1Zn (g)

CuI (g)

Kys. askorbová (g)

DBU (g)

30% lutidin (g)

1 0,64 0,095 0,088 15µl 2,6 ml

2 0,65 0,095 0,088 15µl 2,6 ml

Tabulka 7 Absorbance směsí vzniklých click reakci oligonukleotidu s P14-1Zn

Pokus číslo

A (při 360 nm)

A (při 713 nm)

A (při 267 nm)

Počet nmol oligonukleotidu

ve vzorku

1 -0,0109 -0,0082 0,8962 63,8203

Tabulka 8 Absorbance směsi pokusu 2 po vyčištění OPC metodou

Pokus číslo

A (při 713 nm)

A (při 268,5 nm)

Počet nmol oligonukleotidu ve

vzorku

2 * 0,0624 9,170909

* při této vlnové délce se v UV-VIS spektru neobjevil žádný peak-tzn. že barvivo nebylo v daném roztoku přítomno (nenavázalo se na oligonukleotid)

UV-VIS Spektrum 3 Pokus 2 click reakce s P14-1Zn v DBU po vyčištění metodou OPC

Pokus 2 po OPC

-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

200 300 400 500 600 700 800 900

vlnová délka (nm)

absorbance

6.3.2 Click reakce v prostředí THF (DMSO) a DIPEA

Barvivo P14-1Zn, oligonukleotid vázaný na pevné fázi a jodid měďný byly naváženy do baňky vyfoukané argonem. Poté byl přidán THF (DMSO – dle tabulky 9) a DIPEA. Navážky jednotlivých součástí jsou uvedeny v tabulce 9. Tato směs byla

míchána po dobu 72 hodin při teplotě 50°C.⁴⁸ Po uplynutí 72 hodin byly všechny čtyři pokusy promyty THF, diethyletherem a následně vysušeny. K pokusu č. 1, 2, 3 byl přidán 0,5 ml 32% roztoku amoniaku, k pokusu číslo 4 0,5 ml AMA. Pokusy byly ponechány v tomto roztoku cca hodinu. Potom byly vyčištěny na Sephadexu a následně změřeny na UV-VIS spektrofotometru.

Tabulka 9 Navážky reagencíí použitých v click reakci v kapitole 6.3.2

Pokus číslo

P14-1Zn2 (g)

Oligonukleotid (g)

CuI (g)

DIPEA (g)

THF (µl)

DMSO (µl)

1 0,0063 0,0025 0,001 0,0182 200 -

2 0,0067 0,0026 0,002 0,0231 200 -

3 0,011 0,0029 0,001 0,019 - 200

4 0,0063 0,0025 0,0021 0,0179 - 200

Tabulka 10 Absorbance směsí vzniklých click reakcí v kapitole 6.3.2

Pokus číslo A

(při 360 nm)

A (při 708 nm)

A (při 265 nm)

Počet nmol oligonukleotidu

ve vzorku

1 0,3461 0,2528 2,6983 33,7288

2 0,2284 0,1637 1,6816 30,5746

3 0,1480 0,0965 1,0905 19,8273

4 0,3214 0,2076 2,3233 42,2418

UV-VIS Spektrum 4 Pokus 1 click reakce s barvivem P14-1Zn v THF

Pokus 1

1,5 2 2,5 3 3,5

Absorbance

UV-VIS Spektrum 5 Pokus 2 click reakce s barvivem P14-1Zn v THF

Pokus 2

0 0,5 1 1,5 2 2,5

200 300 400 500 600 700 800 900

vlnová délka (nm)

absorbance

UV-VIS Spektrum 6 Pokus 3 click reakce s barvivem P14-1Zn v DMSO

Pokus 3

0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

200 300 400 500 600 700 800 900

vlnová délka (nm)

absorbance

UV-VIS Spektrum 7 Pokus 4 click reakce s barvivem P14-1Zn v DMSO

Pokus 4

0 0,5 1 1,5 2 2,5

250 350 450 550 650 750 850

vlnová délka (nm)

absorbance

MALDI-TOF Spektrum 1 Sekvence 499R6 před click reakcí (modrá) a po provedení pokusu 1(červená)

1000 1500

Intens. [a.u.]

6.3.3 Click reakce v prostředí DMSO a DIPEA

V tomto pokusu byl použit stejný postup jako v kapitole 6.3.2. s tím rozdílem, že oligonukleotid vázaný na pevné fázi byl odlišný od toho použitého v kapitole 6.3.2.

Sekvence použitých oligonukleotidů jsou uvedeny v tabulce 11. Barvivo P14-1Zn, oligonukleotid vázaný na pevné fázi a jodid měďný byly naváženy do baňky vyfoukané argonem. Poté se přidal DMSO a DIPEA. Navážky jednotlivých součástí jsou uvedeny v tabulce 12. Tato směs byla míchána po dobu 72 hodin při teplotě 50°C.⁴⁸ Po uplynutí 72 hodin byly všechny čtyři pokusy promyty THF, diethyletherem a následně vysušeny.

Poté bylo přidáno 0,5 ml AMA. Pokusy byly v roztoku AMA ponechány cca 90 minut.

Potom byly vyčištěny na Sephadexu a následně změřeny na UV-VIS spektrofotometru (Tabulka 13).

Tabulka 11 Sekvence oligonukleotidů použitých v kapitole 6.3.3

Název sekvence

*499R7 (1) CAG CAC CAT CAC TCC TTC TAT CGT C

*499R8 (2) TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T

*499R9 (3) AGG GAA GGT TAG GGG GGA AAA GAA AA

Tabulka 12 Navážky reagencíí použitých v click reakci v kapitole 6.3.3

Pokus číslo

P14-1Zn2 (g)

Oligonukleotid (nmol)

CuI (g)

DIPEA (g)

DMSO (µl)

1 0,0070 40 0,0022 0,0152 200

2 0,0061 40 0,0022 0,0152 200

3 0,0061 40 0,0016 0,0136 200