Zobrazit Analysis of Peptides by MALDI-TOF Mass Spectrometry

ANAL›ZA PEPTIDŸ POMOCÕ HMOTNOSTNÕ SPEKTROMETRIE MALDI-TOF

ONDREJ äEDO^*a JOSEF HAVEL

Katedra analytickÈ chemie, P¯ÌrodovÏdeck· fakulta, Masary- kova univerzita, Kotl·¯sk· 2, 611 37 Brno

e-mail: sedo@post.cz

Doölo 7.6.02, p¯epracov·no 17.12.02, p¯ijato 10.1.03.

KlÌËov· slova: anal˝za peptid˘, neuroprotektivnÌ peptidy, MALDI-TOF MS, PSD

⁄vod

V˝znam metody hmotnostnÌ spektrometrie s laserovou desorpcÌ a ionizacÌ za ˙Ëasti matrice (MALDI) v poslednÌ dobÏ neobyËejnÏ vzr˘st·. D˘vodem je schopnost tÈto techniky ioni- zovat za ˙Ëasti matrice i velkÈ biomolekuly (>1 000 000 Da) a detegovat vzniklÈ ionty v analyz·toru mϯenÌm doby letu (TOF), coû d·v· metodÏ nezastupitelnou roli zejmÈna v ana- l˝ze lidskÈho proteomu, v souËasnosti nejrozs·hlejöÌm v˝- zkumnÈm projektu v oblasti p¯ÌrodnÌch vÏd.

KromÏ molekulovÈ hmotnosti je metoda MALDI-TOF MS schopna poskytnout ˙daje i o struktu¯e peptid˘. Zv˝öenÌm v˝konu laseru je moûnÈ dos·hnout nadmÏrnÈ excitace mole- kul analytu, kterÈ se v d˘sledku p¯ebytku energie rozpadajÌ na menöÌ fragmenty (obr. 1), z jejichû molekulov˝ch hmotnostÌ lze odvodit Ë·st sekvence aminokyselin nebo celou strukturu peptidu. Sledov·n m˘ûe b˝t rozpad molekul peptidu p¯Ìmo v iontovÈm zdroji metodou ISD/ISF (in-source decay/frag- mentation ñ rozpad/fragmentace ve zdroji) nebo bÏhem letu v analyz·toru TOF metodou PSD (post-source decay ñ rozpad za iontov˝m zdrojem).

P¯i PSD jsou laserov˝mi pulsy zÌsk·ny molekulovÈ ionty vöech peptid˘ z analyzovanÈ smÏsi, zvolen˝peptid je pak od ostatnÌch separov·n pomocÌ tzv. iontovÈ br·ny (ion gate, viz obr. 2). BÏhem letu se Ë·st iont˘ rozpad·. Kinetick· energie tÏchto iont˘ se distribuuje na vznikajÌcÌ fragmenty v z·vislosti na jejich hmotnosti. V reflektronu potÈ doch·zÌ k separaci iont˘ na z·kladÏ r˘znÈ kinetickÈ energie. Metoda PSD byla

˙spÏönÏ aplikov·na pro urËov·nÌ struktury peptid˘ izolova- n˝ch z ûivoËiön˝ch tk·n̹, p¯i studiu exprese gen˘²nebo pro identifikaci protein˘ urËenÌm malÈ Ë·sti jejich struktury³. S jejÌ pomocÌ lze lokalizovat posttranslaËnÌ modifikace jako nap¯Ì- klad radik·lovou nitraci⁴nebo fosforylaci⁵. Metoda ISD se pouûÌv· mÈnÏ Ëasto kv˘li nutnosti p¯edchozÌ separace analy- zovanÈho peptidu, navÌc lze s jejÌ pomocÌ zÌskat informaci jen o Ë·sti struktury peptid˘⁶.

P¯Ìtomnost urËit˝ch druh˘ peptid˘ v mozku m· spojitost s Alzheimerovou chorobou. Vedle tzv.β-amyloid˘ a prese-

nilin˘, kterÈ poökozujÌ mozkovÈ synapse, byl v ned·vnÈ do- bÏ objeven peptid nazvan˝humanin^7,8, kter˝naopak neuro- ny chr·nÌ p¯ed neurotoxick˝mi ˙Ëinky patologick˝ch pepti- d˘. Jde o peptid s molekulovou hmotnostÌ 2686,3 a struk- turou Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu- -Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala. Mecha- nismus jeho neuroprotektivnÌho p˘sobenÌ nebyl doposud ob- jasnÏn, jeho biologick· ˙Ëinnost m˘ûe b˝t v˝raznÏ ovlivnÏna substitucÌ nÏkterÈ z aminokyselin.

Experiment·lnÌ Ë·st

C h e m i k · l i e a p ¯ Ì s t r o j e

Pro p¯Ìpravu vöech roztok˘ byla pouûita voda redestilo- van· v k¯emennÈ aparatu¯e od fy. Heraeus (NÏmecko), aceto- nitril a kyselina trifluoroctov· byly dod·ny firmou Merck

Obr. 2. SchÈma principu funkceiontovÈ br·ny; ionty jsou bÏ- hem pr˘letu mezi destiËkami iontovÈ br·ny vychylov·ny napÏtÌm V_p. V okamûiku, kdy iontovou br·nou proch·zejÌ ionty zvolenÈho peptidu (Ëas t_p), je napÏtÌ V_pvypnuto, a pouze tyto ionty pokraËujÌ d·le do reflektronu

Obr. 1. Struktura a n·zvoslovÌ fragment˘ vznikajÌcÌch rozpadem peptid˘, struktura vnit¯nÌho fragmentu

0 V / V_p

V_p 0 V

0 V

V_p V

t_p t

TOF H⁺

ñHNñCHóCOóNHóCHñCOñ

ñHN=CH

ñHNñCHóCO

ñHNñCHóCOóNH₃

NH ñCHñCOñ₃

CHñCOñ COóNHóCHñCOñ

H NñCHñCOñNHñCHñCO₂ R

| R| R

| R|

R

| R

|

R| R

| R

| R

| x a

b y

z c

+ +

+ +

+ +

+

* Ondrej äedo zÌskal 1. mÌsto za nejlepöÌ studentskou vÏdeckou pr·ci v oboru analytickÈ chemie v celost·tnÌ soutÏûi o cenu firmy Merck v Praze 6.ñ7. ˙nora 2002.

(NÏmecko). Jako matrice pro MALDI byla pouûita kyselina α-kyan-4-hydroxysko¯icov· (CHC ñ 3-(4-hydroxyfenyl)-2- -kyanpropenov· kyselina) od firmy Sigma-Aldrich (NÏmec- ko).

Anal˝zy byly provedeny na hmotnostnÌm spektrometru MALDI-TOF Axima-CFR (Kratos Analytical Shimadzu Cor- poration, Anglie).

P ¯ Ì p r a v a v z o r k ˘

Pro anal˝zu byl pouûÌv·n nasycen˝ roztok matrice CHC

ve smÏsi 0,1% trifluoroctovÈ kyseliny a acetonitrilu 1:1. Bylo postupov·no tak, ûe 1µl roztoku matrice byl s 1µl vzorku smÌch·n p¯Ìmo na destiËce spektrometru a smÏs byla potÈ suöena proudem vzduchu p¯i laboratonÌ teplotÏ.

V˝sledky a diskuse

Metodou PSD bylo analyzov·no nÏkolik peptid˘ s mole- kulov˝mi hmotnostmi 1000ñ2500, p¯iËemû u vöech byl po- zorov·n vznik iont˘ typu a, b a y, fragment˘ vytvo¯en˝ch

Obr. 4. NalezenÌ Ë·sti sekvence aminokyselin v nezn·mÈm peptidu; koncentrace peptidu 10µmol.l^ñ1,matrice CHC, namϯeno v reflektronovÈm pozitivnÌm mÛdu se zpoûdÏnou extrakcÌ a iontovou br·nou nastavenou na 1610ñ1635 Da, v˝kon laseru 2,33 mW; 1 ñ Gly, 2 ñ Ala, 3 ñ Ser, 4 ñ Pro, 5 ñ Val, 6 ñ Cys, 7 ñ Leu/Ile, 8 ñ Asn, 9 ñ Lys/Gln, 10 ñ Met, 11 ñ His, 12 ñ Arg, 13 ñ Trp, 14 ñ CO-Met-NH₃, 15 ñ [M+H]⁺

Obr. 3. PSD spektrum lidskÈho luteinizaËnÌho a vyluËovacÌho hormonu (struktura pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂);

koncentrace peptidu 10 µmol.l^ñ1, matrice CHC, namϯeno v reflektronovÈm pozitivnÌm mÛdu se zpoûdÏnou extrakcÌ a iontovou br·nou nastavenou na 1170ñ1190 Da, v˝kon laseru 1,67 mW; 1 ñ a₁, 2 ñ b₁, 3 ñ SY, 4 ñ WS, 5 ñ y₃-NH₃, 6 ñ y₃, 7 ñ SYGL-28, 8 ñ a₂, 9 ñ b₂, 10 ñ y₄, 11 ñ a₃, 12 ñ b₃-H₂O, 13 ñ y₅, 14 ñ b₃, 15 ñ SYGLR-NH₃, 16 ñ a₄, 17 ñ y₆, 18 ñ b₄-H₂O, 19 ñ b₄, 20 ñ b₅, 21 ñ y₇, 22 ñ a₆, 23 ñ b₆, 24 ñ y₈, 25 ñ a₇-NH₃, 26 ñ a₇, 27 ñ b₇-NH₃, 28 ñ b₇, 29 ñ [M+H]⁺

1400

600 1000 1800

m z/ 20

40

0

200 I, %

1

3

4 5 6

7

9 8

10 11

13 12

1

8

8

4

8

2 12

2 13

5 14 1

15

7

1400

600 1000

m z/ 60

80

20 40

0 200 I, %

1 2

3 5 4

6 7

9

8 10

11 13

12 14

15 16

17 18 19

20

21 22 23 24

25 26

28

27

29

odötÏpenÌm vody nebo amoniaku od tÏchto iont˘ a vnit¯nÌch fragment˘ (p¯Ìklad jednoho z namϯen˝ch PSD spekter je uveden na obr. 3).

U r Ë e n Ì s t r u k t u r y Ñ n e z n · m È h o ì p e p t i d u V tomto p¯ÌpadÏ byl analyzov·n peptid o Ñnezn·mÈì struk- tu¯e, jejÌû urËenÌ popÌöeme jako uk·zku. Monoizotopick· re- lativnÌ hmotnost tohoto peptidu byla zjiötÏna anal˝zou ve smÏsi se Ëty¯mi jin˝mi peptidy se zn·m˝mi hmotnostmi, kterÈ slouûily jako vnit¯nÌ kalibraËnÌ standardy. V˝sledn· hodno- ta molekulovÈ hmotnosti Ñnezn·mÈhoì peptidu byla urËena

s p¯esnostÌ 23 ppm (1618,851±0,037). S pouûitÌm vyööÌ ener- gie laseru pak byla provedena anal˝za pomocÌ PSD. P¯i vy- hodnocov·nÌ spekter bylo vyuûito skuteËnosti, ûe se mole- kulovÈ hmotnosti iont˘ typu a a b liöÌ o 28 Da. Z takto identifikovan˝ch moûn˝ch iont˘ typu b se poda¯ilo urËit Ë·st sekvence aminokyselin (obr. 4). Vöechny zjiötÏnÈ ˙daje byly potÈ zaps·ny do programu ProteinProspector MS-Seq (cit.⁹), ve kterÈm byl v datab·zi OWL (aktualizace 7.2.2001) nalezen pouze jeden peptid odpovÌdajÌcÌ zadan˝m parametr˘m. älo o peptid bombesin, kter˝m· monoizotopickou molekulovou hmotnost 1618,815 a strukturu pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn- -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

Obr. 5. HmotnostnÌ spektrum smÏsi vzniklÈ p¯i syntÈze deriv·tu neuroprotektivnÌho peptidu; vodn˝roztok o koncentraci 0,1 mg.ml^ñ1, matrice CHC, mϯeno v reflektronovÈm pozitivnÌm mÛdu se zpoûdÏnou extrakcÌ, v˝kon laseru 1,57 mW; srovn·nÌ teoretickÈho modelu molekuly C₁₀₈H₁₈₆N₃₂O₂₉S + H⁺(ve v˝¯ezu naho¯e) s detailnÌm pohledem na pÌk hlavnÌho produktu (ve v˝¯ezu dole)

Obr. 6. PSD spektrum deriv·tu neuroprotektivnÌho peptidu; matrice CHC, namϯeno v reflektronovÈm pozitivnÌm mÛdu se zpoûdÏnou extrakcÌ a iontovou br·nou nastavenou na 2420ñ2450 Da, v˝kon laseru 3 mW; 1 ñ y₃, 2 ñ b₄-NH₃, 3 ñ y₄, 4 ñ a₆-NH₃, 5 ñ a₆, 6 ñ b₆-NH₃, 7 ñ b₆, 8 ñ y₅, 9 ñ y₆-NH₃, 10 ñ b₇-NH₃, 11 ñ y₆, 12 ñ y₇-NH₃, 13ñ b₈-NH₃, 14 ñ y₇, 15 ñ y₈, 16 ñ y₉, 17 ñ y₁₀, 18 ñ y₁₁, 19 ñ y₁₂-NH₃, 20 ñ b₁₃, 21 ñ a₁₄, 22 ñ y₁₃, 23 ñ b₁₄, 24 ñ b₁₅, 25 ñ y₁₅-H₂O, 26 ñ b₁₆, 27 ñ y₁₆, 28 ñ a₁₈, 29 ñ b₁₈, 30 ñ a₁₉, 31 ñ b₁₉, 32 ñ y₁₉, 33 ñ b₂₀, 34 ñ y₂₀, 35 ñ [M+H]⁺

2000

1000 1500 2500

m z/ 4

8

0

500 I, %

1 23

3 5 4

6

7 9

18 10

21 13

12 8 11

22 14

17 20 2

19

24

15 16 25

26 27 28

29

30 31

32 33

34

35

1400 1700 2000 2300 2600 2900

m z/ 60

80 100

20 40

0 1100 I, %

I, % I, %

1215,0576 1850,1023 2195,2843

2429,3892

2429,3929

2428, 3868

2430, 3854

2431, 3971 2325, 3593

2528, 4136 2658, 4933 2427

2427

2433 2433

2429 2429

2431 2431

m z/ m z/ 100

100

50 50

0 0

2428,3868 2428,3852

2430,3854

2429,3929

2431,3971

2432,3949

2433,3962 2431,3939

2432,4456 2430,3932

A n a l ˝ z a s m Ï s i p e p t i d ˘

PomocÌ metody MALDI-TOF byla analyzov·na smÏs vznik- l· p¯i pokusu o syntÈzu deriv·tu neuroprotektivnÌho peptidu humaninu. CÌlem anal˝zy bylo potvrzenÌ struktury hlavnÌho produktu a pokus o urËenÌ sloûenÌ fragment˘ peptidu obsaûe- n˝ch v prepar·tu. Na z·kladÏ struktury p¯edpokl·danÈho produk- tu syntÈzy (Ala-Arg-Gly-Phe-Gly-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr- -Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala) byla vypo- ËÌt·na jeho teoretick· molekulov· hmotnost a isotopov˝vzor je- ho molekulov˝ch pÌk˘, kterÈ byly srovn·ny s namϯen˝m spek- trem (obr. 5). Metodou PSD byla potvrzena struktura hlavnÌho produktu (obr. 6) a nalezena struktura dalöÌch dvou peptid˘.

Z deseti mϯenÌ intenzit pÌk˘ vöech ionizovan˝ch produkt˘

bylo odhadnuto zastoupenÌ hlavnÌho produktu na 30,9±3,1 %.

D e r i v a t i z a c e p e p t i d ˘ a j e j i c h a n a l ˝ z a JednÌm z mnoha Ëinidel, kter· by mohla slouûit k urËov·- nÌ struktury protein˘, je komplex oxid osmiËel˝ñbipyridin (OsO₄-bipy), kter˝ podle literatury^10,11reaguje v peptidov˝ch

¯etÏzcÌch p¯edevöÌm s tryptofanem a ze sterick˝ch d˘vod˘ nenÌ schopen pronikat do vnit¯nÌch Ë·stÌ struktur protein˘. Na obr. 7 je uvedeno srovn·nÌ spektra peptidu bombesinu derivatizova-

nÈho OsO₄-bipy s modelem vytvo¯en˝m na z·kladÏ p¯edpo- kl·danÈho mechanismu reakce.

Z·vÏr

Byla vytvo¯ena a provϯena metodologie urËov·nÌ mole- kulov˝ch hmotnostÌ a struktury peptid˘ metodou MALDI- -TOF MS. ZÌskanÈ zkuöenosti byly ˙spÏönÏ aplikov·ny p¯i urËov·nÌ sekvence aminokyselin v peptidech a p¯i kontrole Ëistoty a potvrzenÌ struktury novÈho deriv·tu neuroprotek- tivnÌho peptidu humaninu. Demonstrov·na byla principi·lnÌ moûnost ionizace peptid˘ derivatizovan˝ch OsO₄-bipy.

NÏkterÈ peptidy byly laskavÏ poskytnuty prof. RNDr. Emi- lem PaleËkem, DrSc., z Biofyzik·lnÌho ˙stavu AV »R, Brno.

Tato pr·ce je souË·stÌ projektu Ministerstva ökolstvÌ, ml·de- ûe a tÏlov˝chovy »eskÈ republiky, projekt Ë. CEZ: J 07/98:

143100011.

LITERATURA

1. Marvin L. F., Zatylny C., Leprince J., Vandry H., Henry J.: Peptides 9, 1391 (2001).

Obr. 7. Srovn·nÌ modelovÈho spektra (a) derivatizovanÈho peptidu bombesinu o struktu¯e C₇₁H₁₁₀N₂₄O₁₈S (bombesin).OsO₄.C₁₀H₈N₂(OsO₄- -bipy).H⁺, vypoËÌtanÈho na z·kladÏ p¯irozenÈho isotopovÈho zastoupenÌ prvk˘, s namϯen˝m spektrem (b); mϯeno v reflektronovÈm pozitivnÌm mÛdu se zpoûdÏnou extrakcÌ, v˝kon laseru 1,67 mW

2025 2029 2033 2037 2041

m z/ 60

80 100

20 40

0 2021 I, %

2023,8222

2026,8260 2027,8291

2028,8284 2029,8325

2030,8322

2032,8371

2033,8376

2034,8384 2035,8394

2038,8444

2031,8316

2025 2029 2033 2037

m z/ 60

80 100

20 40

0 2021 I, %

2023,5428

2026,7118 2027,7286

2028,7161

2032,7940 2033,8722

2036,3004

2030,7653

2031,7650

a

b

2. Ovsyannikova G., Johnson K. L., Naylor S., Poland G.

A.: J. Immunol. Methods 246, 1 (2000).

3. Flad T., Kalbacher H., Kaufmann R., Spangler B., Meyer H.: Immunol. Lett. 56, 336 (1997).

4. Sarver A., Scheffler N. K., Shetler M. D., Gibson B. W.:

J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 439 (2001).

5. Talbo G. H., Suckau D., Malkoski M., Reynolds E. C.:

Peptides 22, 1093 (2001).

6. Reiber D., Grover T. A., Brown R. S.: Anal. Chem. 70, 673 (1998).

7. Hashimoto Y., Niikura T., Tajima H., Yasukawa T., Sudo H., Ito Y., Kita Y., Kawasumi M., Kouyama K., Doyu M., Sobue G., Koide T., Tsuji S., Lang J., Kurokawa K., Nishimoto I.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6336 (2001).

8. PatoËka J., Slaninov· J.: Cesk. Slov. Psychiat. 98, 221 (2002).

9. http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0u/msseq.htm; 23.11.

2001.

10. Deetz J. S., Behrman E. J.: J. Org. Chem. 45, 135 (1980).

11. Emerman M., Behrman E. J.: J. Histochem. Cytochem.

30, 395 (1981).

O. äedo and J. Havel (Department of Analytical Chemi- stry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno): Analysis of Peptides by MALDI-TOF Mass Spectrometry

The MALDI-TOF MS method can be used for the exact determination of molecular weight of peptides. Detailed study of fragmentation of metastable ions after leaving the ion source (post-source decay, PSD) makes it possible to determine also the sequence of amino acids in peptides. If complete primary structure cannot be reliably determined due to the complexity of PSD spectra, the missing part of the sequence can be found in Internet bases. Because of a simple preparation of samples and short analysis times, MALDI-TOF MS is an extraordina- rily suitable method for checking purity of peptide prepara- tions. It can be also used for study of peptide derivatization.