Nezbytným předpokladem pro začátek klíčení je celková zralost somatických embryí.
U mnoha embryogenních kultur byla sice získána zralá embrya, ale nebyla schopná následného klíčení. Bylo zjištěno, že velmi užitečným postupem je po ukončení maturace embryí vložit desikační fázi (viz 5.4). U některých druhů byla porovnávána somatická embrya po desikaci se zygotickými embryi a byla zjištěna jejich velice nápadná podobnost (Fowke a kol., 1994). Dnes se již běžně tato fáze vkládá mezi maturaci a klíčení.
Důležitost desikace dokládá například pozorování autorů Webstera a kol. (1990). Ti porovnávali úspěšnost klíčících embryí P. glauca x P. engelmanii u dvou variant, jedna
varianta embryí podstoupila desikaci a druhá ne. Ukázalo se, že po jednotýdenním vysychání byl počet klíčících embryí výrazně vyšší a i jejich anatomie byla lepší.
Kvalita naklíčených rostlin se po desikační fázi výrazně zlepšuje. Důkazem je například pozorování u druhu P. korainesis (Li a kol., 2008). Embrya po desikaci byla neprůhledně bílá. Po jednom týdnu embrya zezelenala (obr. 3.1a) a po 5 týdnech pěstování měla již dobře vyvinuté kořeny (obr. 3.1b), které po 8 týdnech dosahovaly 2,0-2,5 cm.
Postranní kořeny byly patrné již po 10 týdnech pěstování (obr. 3.1c).
Složení maturačního média má bezprostřední vliv na průběh celého klíčení, důležitým předpokladem je správná koncentrace všech použitých látek v médiu (viz. 5.5). Role světla při desikaci není zatím moc jasná, ale u P. abies bylo pozorováno zlepšení pozdějšího klíčení, pokud byla desikace embryí prováděna za tlumeného světla (Vágner a kol., 2005). V průběhu klíčení je světlo samozřejmě již vyžadováno.
Rostliny s vyvinutými postranními kořeny, které jsou dostatečně velké, jsou schopné přenosu do prostředí ex vitro, tedy skleníku, kde se dále pěstují za přítomnosti dostatečné teploty a ztlumeného světla (Vágner a kol., 2005).
Obr. 3.1 : Mladé rostliny P. korainesis.
a Somatická embrya po 5 dnech desikace, již viditelně zelená. b Po 8 týdnech s již viditelnými kořeny. c Mladé rostliny po 10 týdnech pěstování, u kterých se vyvíjí postraní kořeny. Úsečka v obrázku odpovídá a 3,5 mm, c 10 mm. Převzato z Li a kol.
(2008).
.
7 Záv ě r
Somatická embryogeneze jehličnanů je proces známý a zkoumaný poměrně dlouho – již několik desetiletí. V otázce pochopit jak celý proces funguje a čím je ve svém průběhu ovlivňován, bylo učiněno mnoho studií, které pomohly proces objasnit a ukázaly způsoby možné optimalizace kultivačních protokolů. Do dnešní doby bylo sepsáno nespočetné množství studií zabývající se zkoumáním nejvhodnějších kultivačních podmínek a neustále nově vznikající práce popisují další možné cesty, jak by mohl být kultivační protokol vylepšen a bylo dosaženo rychleji vývoje kvalitních somatických embryí. Pro optimalizaci protokolů je nutné se zabývat nejen morfologických popisem embryí, ale především jejich vnitřní strukturou, která podmiňuje následný správný vývoj embryí. Ve své práci jsem se pokusila čtenářovi poskytnout ucelený pohled na vznik a následný vývoj somatických embryí, včetně všech dosud dobře prozkoumaných faktorů, které průběh embryogeneze ovlivňují. Ve druhé části jsem se snažila popsat vývoj anatomických struktur, které můžeme během somatické embryogeneze nalézt pod vlivem různé modifikace kultivačních podmínek.
Při sepisování této práce jsem se seznámila se zajímavými poznatky, především faktografickými týkajících se tématu, ale také jsem se naučila pracovat s velkým množstvím literatury a i přes počáteční obtíže, mi tvorba práce přinesla mnoho užitečných zkušeností.
Jsem ráda, že jsem si toto téma vybrala, ve své diplomové práci bych ráda v tomto tématu pokračovala a pokusila popsat strukturální vývoj somatických embryí pod vlivem přidání aromatických cytokininů do média. Tyto nově objevené skutečnosti, založené především na molekurálních metodách, jsou v současné době velkým příslibem pro celkové zlepšené kvality somatických embryí a právě podrobná práce zabývající se vlivem aromatických cytokininů na vývoj somatických embryí doposud chybí.
8 Použitá literatura
o Attree SM, Budimir S & Fowke LC (1990). Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured shoots and cotyledons of seedlings from stored seeds of black and white spruce (Piceamariana and Picea glauca). Can. J. Bot., 68: 30-34
o Attree SM, Moore D, SawhneyVK & Fowke LC (1991). Enhanced maturation and desiccation tolerance of white spruce (Picea glauca [Moench] Voss) somatic embryos: effects of a non-plasmolyzing water stress and abscisic acid. Ann. Bot., 68: 519-525
o Attree SM & Fowke LC (1993). Embryogeny of gymnosperms: advances in synthetic seed technology of conifers. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 35: 1-35
o Becwar MR, Nagmani R & Wann SR (1990) Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda). Can. J. For. Res., 20: 810-817
o Bozhkov PV & von Arnold S (1998). Polyethylene glycol promotes maturation but inhibits further development of Picea abiessomatic embryos. Physiol. Plant., 104: 211-224
o Bozhkov PV, Filonova LH & von Arnold S (2002). A key developmental switch during Norway spruce somatic embryogenesi is induced by a withdrawal of growth regulators and is associated with cell death and extracellular acidification. Biotech. Bioeng., 77: 658-667
o Carneros E, Celestino C, Klimaszewska K, Park YS, Toribion M & Bonga JM (2009). Plant regeneration in Stone pine (Pinus pinea L.). Plant Cell Tiss. Organ Cult., 98: 165-178.
o Dunstan DI, Bethune TD & Bock CA (1993). Somatic embryo maturation from long-term suspension cultures of white spruce (Picea glauca). In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 29: 109-112
o Dunstan DI, Dong J-Z, Carrier DJ & Abrams S (1998). Events following ABA treatment of spruce somatic embryos. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant, 34: 159-168
o Durzan DJ & Chalupa V (1976). Growth and metabolism of cells and tissue of jack pine (Pinus banksiana). III. Growth of cells in liquid suspension cultures in light and darkness. Can. J.
Bot., 54: 456-467
o Durzan DJ (1980). Progress and promise in forest genetics. In Proceedings of the 50th Anniversry Konference, Paper Science and Technology, The Cutting Edge, My 8-10. 1979. The Institute of Paper Chemistry, Appleton, WI, 31-60
o Find JI (1997). Changes in endogenous ABA levels in developing somatic embryos of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.) in relation to maturation medium, desiccation and germination.
Plant Sci., 128: 75-83
o Finer JJ, Kriebel HB & Becwar MR (1989). Inition of embryogenic callus and suspension cultures of eastern white pine (Pinus strobus). Plant Cell Reports, 8: 203-206
o Fischerova L, Fischer L, Vondrakova Z & Vagner M (2008). Expression of the gene encoding transcription factor PaVP1 differs in Picea abies embryogenic lines depending on their ability to develop somatic embryos. Plant Cell Rep., 27: 435-441
o Fowke LC, Attree SM & Rennie PJ (1994). Scanning elektron microscopy of hydrated and desiccated mature somatic and zygotic embryo sof white spruce (Picea glauca (Moench.) Voss.). Plant Cell Reports, 13: 612-618.
o Gösslová M (2000). Smrk ztepilý (Picea abies (L.) Karst.): somatická embryogeneze probíhající v tekutých médiích a zygotická embryogeneze, Karlova Univerzita v Praze, deponováno v knihovně PřF UK.
o Gupta PK & Durzan DJ (1987). Biotechnology of somatic polyembryogenesis and plantlet regeneration in loblolly pine. Bio/Technology, 5: 147-151
o Gutmann M, von Aderkas P, Label P & Lelu M (1996). Effects of abscisic acid on somatic embryo maturation of hybrid larch. J. Exp. Bot., 47: 1905-1917
o Hakman I & Fowke LC (1987). Somatic embryogenesis in Picea glauca (white spruce) and Picea mariana (black spruce). Canadian Journal of Botany, 65: 656-659
o Hakman I, Fowke LC, von Arnold S & Eriksson T (1985). The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce). Plant Sci., 38: 53-59
o Hakman I & von Arnold S (1988). Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of Picea glauca (white spruce). Physiol. Plant., 72: 579-587
o Hartig K & Beck E (2006). Crosstalk between auxin, cytokinins, and sugars in the plant cell cycle.
Plant Biology, 8: 1-8
o Havelková L (2010). Úloha cytoskeletu v morfogenezi rostlinných buněk. Karlova Univerzita v Praze, deponováno v PřF UK
o
o Hay EI & Charest PJ (1999). Somatic embryo germination and desiccation tolerance in conifers.
In: Mohan Jain S, Gupta PK & Newton RJ (eds) Somatic Embryogenesis inWoody PlantsVol.
4 (pp. 61–69). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands
o Hazubska-Przybyl T & Bojarczuk K (2008). Somatic embryogenesi of selected spruce species (Picea abies, P. omorika, P. pungens 'glauca' and P. breweriana). Acta societatis botanicorum polonia., 77: 189-199
o Ibaraki1 Y & Kurata K (2001). Automation of somatic embryo production. Molecular breedinf of woody plants., 18: 365-374
o Jasik J, Salajova T & Salaj J (1995). Developmental anatomy and ultrastructure of early somatic embryo in European black pine (Pinus nigra Arn.). Protoplasma, 185: 205-211
o Kong L, Attree SM, Evans DE, Binarova P,Yeung EC & Fowke LC (1999). Somatic embryogenesis in white spruce: studies of embryo development and cell biology. In: Jain SM, Gupta PK & Newton RJ (eds) Somatic Embryogenesis inWoody PlantsVol. 4 (pp. 1-28).
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands
o Kong L & Yeung EC (1992). Development of white spruce somatic embryos: II. Continual shoot meristem development during germination. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 28p: 125-131
o Kong L & Yeung EC (1994). EC Effects of ethylene and ethylene inhibitors on white spruce somatic embryo maturation. Plant Sci., 104: 71-80
o Krogstrup P (1986). Embryo-like structures from cotyledons and ripe embryos of Norway spruce (Picea abies). Can. J. For. Res., 16: 664–668
o Kumštýřová L (1999). Somatická embryogeneze smrku ztepilého (Picea abies (L.) Karst.) probíhající na pevných médiích. Karlova Univerzita v Praze, deponováno v PřF UK.
o Lelu MA & Label P (1994). Changes in the levels of abcisic acid and its glucose ester conjugate during maturation of hybrid larch (Larix x leptoeuropea) somatic embryos, in relation to germination and plantlet recovery. Physiologia Plantarum, 92: 53-60.
o Li CHH, Liu BG, Kim TD, Moon HK & Choi YK (2008). Somatic embryogenesis and plant regeneration in elite genotypes of Picea koraiensis. Plant Biotechnik Rep, 2: 259-265.
o Malá J, Máchová P, Cvrčková H, Karady M, Novák O, Mikulík J, Hauserová E, Greplová J, Strnad M & Doležal K (2009). Micropropagation of Wild Service Tree (Sorbus torminalis [L.]
Crantz): The Regulative Role of Different Aromatic Cytokinins During Organogenesis. J.
Plant Growth Regul., 28: 341-348,
o Misra S, Attree SM, Leal I & Fowke LC (1993). Effect of abscisic acid, osmoticum, and desiccation on synthesis of storage proteins during the development of white spruce somatic embryos. Ann. Bot., 71: 11-22
o Mo LH & von Arnold S (1991). Origin and Development of Embryogenic Cultures from Seedlings od Norway spruce (Picea abies). Journal of Plant Physiology, 138: 223-230
o Roberts DR, Flinn BS,Webb DT,Webster FB & Sutton BCS (1989). Characterization of immature embryos of interior spruce by SDS–PAGE and microscopy in relation to their competence for somatic embryogenesis. Plant Cell Rep., 8: 285-288
o Roberts DR, Sutton BCS & Flinn BS (1990). Synchronous and high frequency germination of interior spruce somatic embryos following partial drying at high relative humidity. Can. J.
Bot., 68: 1086-1090
o Salajova T, Jasik J, Kormutak A, Salaj J & Hakman I (1996). Embryogenetic culture initiation and somatic embryo development in hybrid firs (Abies alba x Abies cephalonica, and Abies numidica). Plant Cell Reports, 12: 199-202
o Schwarzerová K, Vondráková Z, Fischer L, Boříková P, Bellinvia E, Eliášová K, Havelková L, Fišerová J, Vágner M & Opatrný Z (2010). The role of acetin isoforms in somatic embryogenesis in Noeway spruce. BMC Plant Biology, 10: 89
o Skiver K & Mundy J (1990) Gene Expression in Response to Abscisic Acid and Osmotic Stress.
The Plant Cell, 2: 503-512
o Stasolla C, Kong L,Yeung EC & Thorpe TA (2002a). Maturation of somatic embryos in conifers:
morphogenesis, physiology, biochemistry and molecular biology. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 38: 93-105
o Steward FC, Mapes MO & Mars K (1958). Growth and organized development of cultured cells.
II. Organization in cultures grown from freely suspended cells. American Journal of Botany., 45: 705-708
o Svobodová H (2001). Maturation of Norway spruce somatic embryo: Selected structural and biochemical aspects. Karlova Univerzita v Praze, deponováno v PřF UK.
o Svobodová H, Albrechtová J, Kumštýřová L, Lipavská H, Vágner M & Vondráková Z (1999).
Somatic embryogenesis in Norway spruce: Anatomical study of embryo development and influence of polyethylene glycol on maturation process. Plant Physiol. Biochem., 37 :209-221