Text práce (2.274Mb)

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

Katedra biofyziky a fyzikální chemie

DIPLOMOVÁ PRÁCE

STUDIUM RADIOAKTIVNÍHO ZNAČENÍ

RECEPTOROVĚ-SPECIFICKÉHO PEPTIDU DOTA-NOC

Vedoucí diplomové práce: Doc.Ing. Alice Lázníčková, Csc.

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.

V Hradci Králové dne 5.5.2008 ………..

1. OBSAH

1. OBSAH 4

2. CÍL PRÁCE 7

3. TEORETICKÁ ČÁST 9

3.1. Úvod 10

3.2. Somastotatin a jeho analogy 11

3.3. Somatostatinové receptory 13

3.4. Radioaktivní značení peptidů 14

3.5. Bifunkční chelatační činidla 17

3.6. Příprava radionuklidů 27

3.6.1. Nejpoužívanější radionuklidy 29

3.6.2. Základní požadavky pro používané radionuklidy 31

3.7. Radionuklidová diagnostika 32

3.8. Receptorově specifický peptid DOTA -NOC a jeho radioaktivní značení 33

3.8.1. DOTA-NOC - derivát oktreotidu 33

3.8.2. Vazba peptidu k chelatačnímu činidlu 35

3.8.3. Konjugační skupiny 37

3.8.4. Příklady důležitých konjugačních skupin 38

3.8.5. Postup radioaktivního značení 39

3.8.6. Značení konjugátů DOTA-biomolekula 40

3.8.7. Radionuklidy používané ke značení DOTA-NOC 41

3.9. Hodnocení kvality značených biomolekul 43

3.10. Klinické využití radioaktivně značeného peptidu DOTA-NOC 44

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 46

4.1. Materiály a přístroje 47

4.1.1. Přístroje 47

4.1.2. Chemikálie 47

4.2. Chemická struktura použitých derivátů

4.3.1. Radioaktivní značení derivátů oktreotidu ¹¹¹In 49

4.3.2. Postup značení peptidů 49

4.3.3. Kontrola radioaktivní čistoty značených produktů 50

4.3.3.1. TLC analýza 50

4.3.3.2. HPLC analýza 50

5. VÝSLEDKY A DISKUSE 52

5.1. Studium podmínek značení DOTA- Tyr³-oktreotátu ¹¹¹In 53

5.2. Krátkodobá analýza značení 54

5.3. Dlouhodobější analýza značení 55

5.4. Diskuse 56

6. ZÁVĚR 76

7. SEZNAM ZKRATEK 78

8. SEZNAM LITERATURY 81

9. SOUHRN 88

10. ABSTRACT 89

2. CÍL PRÁCE

 Prostudovat dostupnou literaturu z oblasti receptorově specifických peptidů skupiny somatostatinových derivátů se zaměřením na analog DOTA – Nal³ – oktreotid.

 Prostudovat způsoby radioaktivního značení DOTA – Nal³ - oktreotidu kovovými radionuklidy.

 Připravit radioaktivně značený DOTA – Nal³ - oktreotid a metodou TLC analýzy zjistit jeho radiochemickou čistotu. Stejným způsobem označit další analog somatostatinu DOTA – Tyr³- oktreotát a porovnat zjištěné charakteristiky obou uvedených derivátů.

3. TEORETICKÁ ČÁST

3.1. Úvod

Jedním z nejmladších a rychle se vyvíjejících lékařských oborů je nukleární medicína. Tento lékařský obor využívá neinvazivních metod a zaměřuje se na diagnostiku a terapii pomocí radioizotopů. Umožňuje vyšetření v širokém spektru medicínských oborů, v dnešní době je nejrozšířenější využití v onkologii, kardiologii a neurologii. Její metody minimálně zatěžují lidský organismus, radiační zátěž je srovnatelná, či často menší než při vyšetření pomocí rentgenu. Vedle detekční techniky (tomografie) hrají důležitou roli radiofarmaka, která se někdy nazývají krví nukleární medicíny. Radioaktivní přípravky obsahují radionuklid vázaný na různé chemické či biologicky aktivní látky od anorganických solí po velké molekuly organických látek a komplexních sloučenin. Značí se různé peptidy, proteiny (imunoglobuliny, protilátky), i biologický materiál jako např.

krevní elementy, buňky apod.

Radioaktivně značené látky a jejich využití prodělalo v uplynulých třech desetiletích svůj vývoj. Na začátku to byly receptorově nespecifické látky, u nichž bylo využito jejich fyzikálně chemických vlastností (10). Receptorově specifická radiofarmaka znamenala další stupeň vývoje. Zpočátku to byly především radioaktivně značené monoklonální protilátky. Jejich použití v podmínkách in vitro mělo velmi dobré výsledky, ale v podmínkách in vivo se prokázaly jejich omezené možnosti jako např. pomalá clearence, vysoká aktivita v játrech, nevelký poměr aktivity mezi cíleným místem a okolním prostředím. Také jejich velká molekulová hmotnost a vznik protilátek v organismu pacientů proti aplikovaným protilátkám myšího původu (tzv. HAMA) zamezilo jejich širšímu využití. V další fázi proto byly nahrazeny fragmenty protilátek (např. F (ab´)2 a F ab fragmenty ). Menší rozměr molekul ovlivnil žádoucím způsobem farmakokinetické vlastnosti jako rychlejší pokles hladiny v krvi, vyšší poměr aktivity mezi cílovým místem a okolním prostředím, což je příznivé pro zobrazení. Dodnes mají proto své klinické využití, například k detekci ložisek zánětů (7).

K nejnovějším radioaktivně značeným látkám patří receptorově specifické peptidy.

Peptidy jsou nutnou součástí v základních biologických procesech. Fungují jako hormony,

použití dosažitelných a levnějších radionuklidů a poskytují mnoho možností pro rozvoj radiofarmak.

Diagnostické a terapeutické metody nukleární medicíny využívají vysokého stupně exprese peptidových receptorů na nádorových buňkách v porovnání s normálními buňkami. Tato skutečnost se stala základem metod, které využívají radioaktivního značení pro zobrazení primárních nádorů a metastáz a také k jejich terapii. Peptid, který upoutal největší zájem jako zobrazující agens, je somatostatin a jeho omezující vliv na sekreci některých hormonů (23). Řada neuroendokrinních i neendokrinních nádorů obsahuje vysokou koncentraci somatostatinových receptorů. Byla proto vyvinuta řada somatostatinových analogů a proběhla a probíhá řada studií, které mají ověřit možnost jejich klinického využití.

3.2. Somatostatin a jeho analogy

Somatostatin je peptidový hormon, který se projevuje ve dvou biologicky aktivních molekulárních formách : somatostatin –14 skládající se ze 14 aminokyselin a somatostatin- 28, což je N – koncem rozšířený derivát z 28 aminokyselin. Poprvé byl izolován z hovězího hypothalamu v roce 1973 a postupně byla zjištěna jeho přítomnost v lidském organismu např. v cerebrální kůře, mozkovém kmeni, gastrointestinální soustavě a pankreatu.(24) Tento tkáňový hormon je produkován enteroendokrinními buňkami v epitelu trávicího systému, jsou to tzv. D – buňky v pyloru, Langerhansových ostrůvcích, duodenu, jejunu a dalšími tkáněmi. Jeho funkce je podmíněna přítomností receptorů, které byly nalezeny na buňkách neuroendokrinního systému (přední lalok hypofýzy, thyroidní C buňky, buňky Langerhansových ostrůvků), na buňkách humánních lymfocytů. V trávicím systému působí tlumivě na sekreci peptidových hormonů – tlumí uvolňování růstového hormonu, hormonu štítné žlázy, žaludečních a střevních hormonů gastrinu, cholecystokininu, sekretinu, motilinu, vazoaktivního střevního peptidu VIP, enteroglukagonu GIP, inhibuje sekreci endokrinních a exokrinních hormonů pankreatu.

(SRIF). Snižuje uvolňování růstového hormonu z předního laloku hypofýzy a způsobuje pokles koncentrace thyreotropinu.

Přirozený somatostatin je metabolicky nestabilní. Je rychle degradován tkáňovými proteázami (plasmatický poločas je 2 minuty). Tato skutečnost znemožňuje jeho klinické využití.

Obr.1. Somatostatin

Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe

Trp

Lys

Thr

S

S

Phe Thr

Ser Cys

Výše uvedené důvody vedly proto k vývoji syntetických látek, analogů somatostatinu, které by byly odolnější vůči biologické degradaci a zachovaly si v co největší míře biologické vlastnosti původní molekuly. Tato snaha vedla ke vzniku derivátů s výhodnějšími vlastnostmi: větší odolnost vůči biodegradaci, dlouhodobějším působením, vyšší afinitou k receptorům a vyšší účinnosti.

Synteticky vyrobené analogy somatostatinu, které jsou používány, jsou oktreotid, lanreotid, vapreotid.

Oktreotid D – Phe – Cys – Phe – D – Trp – Lys – Thr – Cys – Thr(ol)

Lanreotid β – Nal – Cys – Tyr – D – Trp – Lys – Val – Cys - Thr – NH₂

Při syntéze analogů byl zkrácen řetězec aminokyselin za 14 na 8, do řetězce byly zavedeny D – aminokyseliny na citlivá místa peptidu a tím se podařilo prodloužit účinnost analogů in vivo. Vyšší odolnost vůči peptidázám získaly analogy obměnou karboxylové skupiny na C – konci peptidu. Bylo zjištěno(24), že oktreotid je až 2000krát účinnější než somatostatin 14 a preferuje vazbu k receptorovému subtypu sst2.

Dalšími obměnami v molekule somatostatinu vznikají deriváty se zvýšenou schopností vázat radionuklidy a s vyšší afinitou k určitým typům somatostatinových receptorů. Ke zvýšení polarity a umožnění radioiodace se dosáhlo náhradou fenylalaninu v poloze 3 tyrosinem. Nový analog dostal název Tyr³ – oktreotid. Záměnou threoninolu na C – konci za threonin, se zvětšilo buněčné vychytávání a zvýšená clearence u Tyr³ – oktreotátu.

Tyr³ – oktreotid D – Phe – Cys – Tyr – D – Trp – Lys – Thr – Cys – Thr(ol)

Tyr³ – oktreotát D – Phe – Cys – Tyr – D – Trp – Lys – Thr – Cys – Thr – (OH)

3.3. Somatostatinové receptory

Somatostatinové receptory se nacházejí za normálních okolností ve zdravé tkáni gastrointestinálního traktu, CNS, neuroendokrinních buňkách, najdeme je i na lymfocytech. Strukturálně tyto receptory patří do skupiny receptorů spřažených s G – proteinem, pro něž existuje 7 charakteristických transmembránových domén.

Extracelulární část receptoru váže ligand, intracelulární část přenáší signál do buňky a ovlivňuje tak intracelulární procesy. Četnými studiemi bylo dokázáno, že na nádorových buňkách se objevuje mnohem vyšší koncentrace somatostatinových receptorů než je tomu ve zdravé tkáni. Obzvlášť četněji jsou exprimovány na buňkách neuroendokrinních tumorů (6), jako jsou např. gastroenteropankreatické neuroendokrinní nádory. Vysoká hustota byla nalezena také ve feochromocytomech, paragangliomech, plicních karcinoidech (26). Vysoká hustota byla objevena také v malobuněčném plicním nádoru a v nádorech dřeně štítné žlázy (26).

Dalším důležitým poznatkem, který přispěl k výzkumu somatostatinových

subtypů chybět (8). Zkoumání exprese somatostatinových receptorů v lidských tumorech se provádělo metodami jako jsou např. mRNA detekce, receptorová autoradiografie se subtypy selektivních ligandů a imunohistochemické studie. K závěrům těchto studií patří, že existuje heterogenita v expresi individuálních somatostatinových receptorů uvnitř a mezi různými tumory. V některých nádorech převažuje sst 2 a naopak jsou nádory, u nichž sst 2 chybí nebo je v menší hustotě (lidské plicní tumory). Subtypy sst 2 a 5 se vyskytují u adenomů produkujících růstový hormon. Inaktivní adenomy pohlavních žláz a thymon obsahují převážně subtyp sst 3. Endometriální a cervikální tumory zaznamenaly vysoký výskyt subtypů 1, 2, 3. Gastroenteropankreatické neuroendokrinní nádory, medulární thyroidní karcinom a epiteliální nádory ovaria jsou vyjádřeny expresí subtypů 1, 2, 3 a 5 (8).

Přirozený lidský somatostatin se váže ke všem pěti somatostatinovým subtypům.

Afinita somatostatinových analogů je však odlišná. Oktreotid přes výše uvedené výhodné vlastnosti si uchoval vysokou afinitu k subtypům sst 2 a 5, ale obměna jeho molekuly vedla ke ztrátě afinity k subtypu 1.

3.4. Radioaktivní značení peptidů

Využití radioaktivně značených peptidů pro zobrazování a terapii neuroendokrinních nádorů vyžaduje splnění několika podmínek. Jednou z nich je navázání ligandu na příslušný receptor. Dále je to proces internalizace komplexu ligand- receptor do buňky, protože tento postup vede k zadržení radioligandů v cílových buňkách a zajišťuje jejich využití v diagnostice a terapii.

Ke značení peptidů kovovými radionuklidy je nutná přítomnost určitého činitele, který připojí radioaktivní kov k dané biomolekule. Je jím chelatační činidlo (chelátor), které spojením kovu a funkční skupiny molekuly vytvoří komplex. Vzniklý komplex by se měl vázat na somatostatinový receptor. Popsaný postup značení bývá v literatuře označován jako bifunkční postup (19) a činidla využívaná ke vzniku potřebných komplexů

Obr. 2. Schéma bifunkčního postupu

Radiofarmaka vzniklá tímto postupem obsahují tyto části (19) :

1. terčovou (targetingovou) molekulu – peptidový nebo nepeptidový ligand, protilátky

2. spojovač (linker)

3. bifunkční chelatační činidlo 4. radionuklid jako zdroj radiace.

Bifunkční chelatační činidlo silněji váže kovový iont a je kovalentně připojeno k ligandu. Připojení k terčové molekule může být přímé nebo prostřednictvím spojovače (linkeru). Může jím být jednoduchý uhlovodíkový řetězec, který zvyšuje lipofilitu, dlouhý polyethylenový řetězec, který zpomaluje extrakci v hepatocytech, může to být peptidová sekvence (např. polyglycin, polyserin, polyaspartátová kyselina), která zlepšuje hydrofilitu a renální clearence. Spojovač bývá často užíván pro modifikaci farmakokinetiky, ovlivňuje například krevní clearence, snižuje radiaci okolní tkáně a zlepšuje poměr cíl k okolní tkáni (T/B).(19)

Výběr spojovače závisí na farmakokinetických požadavcích na daná radiofarmaka.

Jejich volba má vliv na biodistribuci konečné struktury.

Typy linkerů:

Spojovače, které podléhají metabolismu, jsou např. užívány pro ¹¹¹In značené somatostatinové analogy. Tetrapeptidový spojovač Gly – Gly – L –(p – NO2) – Phe – CONH₂ byl užit k modifikaci farmakokinetiky ⁹⁰Y značené protilátky. (20) V závislosti na druhu radionuklidu a bifunkčního chelatačního činidla s užitím spojovače schopného rychlého metabolismu může se zvýšit clearence radiofarmaka z krve renálním systémem.

Různé kovové radionuklidy mají rozdílné koordinační vlastnosti a vyžadují bifunkční chelatační činidla s různými donorovými atomy a strukturou ligandu. Vzniklý kovový chelát může ovlivnit uptake a biodistribuci radiofarmak malých molekulových hmotností.

V mnohých případech kovový chelát značně přispívá k celkové velikosti a molekulové hmotnosti komplexu. (20) Z uvedených důvodů je výběr bifunkčního chelatačního činidla velmi důležitý.

3.5. Bifunkční chelatační činidla

V molekule chelatačního činidla můžeme rozlišit zpravidla tři části (20) :

 vazebnou jednotku

 ligandovou strukturu

 konjugační skupinu.

Pro ideální chelatátor existuje několik základních požadavků (19) :

 musí tvořit kovový chelát s vysokou termodynamickou stabilitou a kinetickou inertností při neutrální hodnotě pH, aby komplex nepodléhal degradaci za fyziologických podmínek

 musí být odolný vůči radiolýze, ta by mohla způsobit rozpad komplexu

 musí tvořit kovový chelát s minimálním počtem izomerů (tvorba izomerů může mít značný dopad na biologické vlastnosti radiofarmaka)

 výhodná je vyšší hydrofilita, neboť zlepšuje krevní clearence a renální exkreci bifunkčních látek

 konjugační skupina by se měla snadno vázat k biomolekule.

Rozličné kovové radionuklidy mají své rozdílné koordinační vlastnosti a vyžadují chelatátory s rozdílnými donorovými atomy a strukturami ligandů. Výběr bifunkčního chelatačního činidla je závislý na povaze a oxidačním stupni kovového iontu. Vyžaduje dobré pochopení koordinačních vlastností daného radionuklidu. Hlavní význam pro výběr úspěšného chelatátoru má skutečnost, aby disociace radionuklidu z kovového chelátu radiofarmaka in vivo byla co nejmenší. (20)

Pro značení malých biomolekul jsou užívána acyklická i makrocyklická bifunkční chelatační činidla.

1. Vybraná acyklická bifunkční chelatační činidla :

Mezi nejvíce používané patří diethylentetraaminpentaoctová kyselina (DTPA) a její deriváty: anhydrid–DTPA, izothiokyanatobenzyl–DTPA, azofenyl-DTPA, bromacetamidobenzyl – DTPA (BABE).

Lineární bifunkční chelatátory se váží k různým kovovým iontům (např. ¹¹¹In a ⁹⁰Y) a tvoří termodynamicky stabilní komplexy. Předností DTPA analogů je rychlá kinetika tvorby komplexů,umožňující radioaktivně značit i tepelně citlivé struktury (protilátky).

Pokud je však použijeme pro značení biomolekul s dlouhou krevní retencí a pomalou clearence, projeví se často jejich kinetická nestabilita, která se může podílet na uvolnění radionuklidu z chelátu a tak zvýšit ozáření kostní dřeně.(20) Hlavní význam užití DTPA můžeme spatřovat v tom, že např. anhydrid-DTPA je komerčně dostupný, reaguje ochotně s primárními aminy a tvoří s biomolekulou DTPA – konjugát. Reakce může proběhnout za

donorových atomů dostupných pro vytvoření vazby s kovovým iontem a konjugační skupina je umístěna na diethylentriaminové struktuře.

Obr.3. Syntéza p-SCN-Bz-DTPA

2. Struktury vybraných makrocyklických bifunkčních chelatačních činidel

Mimořádné kationtové komplexační vlastnosti makrocyklických sloučenin poprvé popsal Pederson v 70. letech. Bylo připraveno a zkoumáno několik makrocyklických chelátorů s různými donorovými atomy pro koordinační sloučeniny s kovovými ionty. Mezi nimi se jeví jako přínosné tetraazamakrocykly a jejich N- nebo C- substituované deriváty. Jejich kovové komplexy dosahují poměrně vysoké termodynamické stability a kinetické inertnosti. Bylo vyvinuto několik postupů pro syntézu těchto makrocyklů. Jednou z nich je Richman – Atkinsova metoda (20).

Obr.4. Richman – Atkinsova metoda pro syntézu tetraazamakrocyklů

Weismanova metoda syntézy cyklenu (20)

Obr.5. Schéma syntézy cyklenu

Tato syntéza cyklenu probíhá ve dvou krocích a cyklen může být připraven ve vysokém výtěžku a vysoké kvalitě. Výchozí suroviny triethylentetraamin a dithiooxamid jsou levné a dostupné z komerčních zdrojů. Podobný postup byl nedávno objeven užitím triethylentetraaminu a glyoxalu (20) . Cyklen může být připraven ve vysoké kvalitě a ve vysokém výtěžku.

Obr.6. Metoda Schiffovy báze pro syntézu cyklenu

Weismanovy metody se využívá při alkylaci sekundárních aminodusíkových atomů.

Důležitými meziprodukty při syntéze bifunkčních chelatačních činidel typu DOTA, DO3A, jsou monosubstituované makrocykly.

Obr.7. Syntéza monosubstituovaných tetraazamakrocyklů

Parker a kol. popsali syntézu DOTA – nebo DO3A- BFCA užitím monosubstituovaného cyclenu (20). Syntetizovali řadu C- a N- substituovaných analogů pro radioaktivní značení protilátek.

Obr.8.Parkerova metoda pro syntézu monosubstituovaných tetraazamakrocyklů a souvisejících BFCA

Dalším stupněm vývoje bifunkčních chelatačních činidel byly tzv. peptidové metody.

Tímto termínem se rozumí tvorba aspoň jedné peptidové vazby před nebo během cyklizace.Jako příklady uveďme kondenzaci substituovaných esterů kyseliny malonové s lineárními tetraaminy, Michaelovu adici tetraaminů s nenasyceným esterem karboxylové kyseliny a následnou tvorbou intramolekulárního laktamu. Peptidová vazba je obvykle redukována například BH3 nebo LiAlH4 a vzniká odpovídající tetraamin. Meares a kol.

popsali postup syntézy zahrnující tvorbu lineárního tetrapeptidu, redukci jejich vazeb, interamolekulární tosylamidový kruh.(20) Výhodou tohoto postupu je dostupnost výchozí aminokyseliny. Průkopnické snahy v této oblasti vedly k syntézám makrocyklických BFCA a studiím pro jejich užití v radioznačení biomolekul.(20)

Obr.9. Mearesova peptidová metoda syntézy p-NO2-BzDOTA

Kimura a kol. užili peptidový postup pro přípravu C- funkčních BFCA. (20)

Obr.10. Kimurova peptidová metoda syntézy tetraazamakrocyklů

McMurry a kol. připravili dvanáctičlenný tetraazamakrocyklus.

Obr.11. Mc Murryho syntézy p-SCN-Bz-DOTA

Mishra a kol. nedávno popsali postup syntézy 2-(4- nitrobenzyl)- 1,4,7,10 – tetraazacyklododekan – 1,4,7,10- tetraoctové kyseliny. (20) Tento postup je kombinací Richman – Atkinsovy metody a peptidové metody.

Obr.12. Mishrova peptidová metoda pro syntézu p-NH2-Bz-DOTA

Kinetika značení bifunkčního chelatačního činidla DOTA je obvykle pomalá a závisí na podmínkách jako je koncentrace činidla, pH, reakční teplota, doba zahřívání, druh pufru a jeho koncentrace, přítomnost dalších iontů např. Fe³⁺, Zn²⁺atp.(20)

3.6. Příprava radionuklidů

Pro účely nukleární medicíny jsou radionuklidy připravovány ve speciálních zařízeních – v cyklotronu nebo jaderném reaktoru. Využívá se zde uměle vyvolaná jaderná reakce, kdy ze stabilních prvků tzv. terčového materiálu vznikají požadované radionuklidy.

Cyklotron umožňuje urychlení pozitivně nabitých iontů tak, aby byly schopny po dopadu na vhodný terč vyvolat požadovanou jadernou reakci. Terčem bývá nejčastěji kov ve formě tenké folie, jako prášek nebo povlak nanesený na kovové folii ve vrstvě desetin milimetrů. Takto se připravují radionuklidy jako ¹²³I, ¹¹¹In nebo ⁶⁷Ga. Na pracovištích nukleární medicíny bývají tzv. lékařské cyklotrony. Na těch se připravují radioizotopy některých biogenních prvků ( ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O) , protože energie potřebná k vyvolání jaderné reakce je nižší.

V jaderném reaktoru jsou radionuklidy připravovány ozařováním stabilních jader prvků neutrony. Uskutečňuje se v nich řízená řetězová štěpná reakce podle schématu :

AX (n, γ) ^A+1X.

Připravují se tak klinicky významné radionuklidy ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁹⁹Mo (zdroj ^99mTc), ¹³¹I,

125I. Jaderný reaktor dále slouží k přípravě radionuklidů, které vznikají při ozáření vzorků obohaceného uranu. Pro nukleární medicínu mají význam ⁹⁹Mo, ¹³¹I, ¹³³Xe. Příkladem takové štěpné reakce je např.

235U + n → ²³⁶U → ¹³¹I + ¹⁰²Y + 3n.

Radionuklidové generátory produkují radionuklidy s krátkým poločasem rozpadu, které nezpůsobují vyšetřovanému velkou radiační zátěž a umožňují kvalitní zobrazení při diagnostice. Tento způsob přípravy je založen na existenci dvojice radioaktivních prvků.

Dlouhodobější mateřský radionuklid se přeměnou ß^- nebo elektronovým záchytem mění na dceřiný radionuklid s krátkým poločasem přeměny. Oba prvky lze od sebe oddělit, protože mají rozdílné chemické vlastnosti. Nejdůležitější je generátor ⁹⁹Mo /^99mTc, protože

Tabulky radionuklidů užitých pro zobrazení γ – zářiče:

β – zářiče:

Radionuklid Poločas přeměny [h]

Způsob rozkladu Energie [keV]

Způsob produkce

99mTc 6,02 γ 141

99Mo/^99mTc generátor

111In 67,2

Auger, EC (100) 172 247

Cyklotron Cd(p,n)¹¹¹In

67Ga 78,1 EC, Auger

93 185 300

Cyklotron ⁶⁸Zn(p,2n)⁶⁷Ga

123I 13 EC

159 27

Cyklotron ¹²⁴Te(p,2n)¹²³I

Radionuklid Poločas přeměny [h]

Způsob rozkladu (%) Energie [keV]

Způsob produkce

18F 1,83 β⁺, EC 635 Cyklotron ¹⁸O(p,n)¹⁸F

124I 76,8 β⁺, EC 790

1530 2130

64Cu 12,9 β⁺ (19,3)

β^- (39,6) EC (45)

654 573

Reaktor, cyklotron

68Ga 1,14 β⁺ (90)

EC (10)

820 1895

68Ge/⁶⁸Ga generátor

86Y 14,7 β⁺ (33)

EC (66)

1250 1600 2020 2340

Cyklotron ⁸⁶Sr(p,n)⁸⁶Y

67Cu 61,9 β^- (100)

γ

395 484 577 91 93 185

Akcelerátor

90Y 64,1 β^- (100) 2280 ⁹⁰Sr/⁹⁰Y generátor

3.6.1. Nejpoužívanější radionuklidy

1. ⁶⁶Ga, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸Ga

Všechny uvedené izotopy jsou vhodné pro γ scintigrafii a PET zobrazení. ⁶⁷Ga bylo poprvé použito v humánní medicíně v r. 1953. Tento izotop vzniká v cyklotronu nukleární reakcí z obohaceného zinku :

68Zn (p, 2n) ⁶⁷Ga

68Ga je produkt ⁶⁸Ge / ⁶⁸Ga generátoru. ⁶⁸Ge má poločas rozpadu 280 dní, ⁶⁸Ga pouze 68 minut (1). Generátor je komerčně dostupný,ale využití tohoto systému je málo časté.

Pozitronový zářič ⁶⁶Ga je opět cyklotronovým produktem. Patří mezi izotopy se středním poločasem rozpadu (9,5 h). Jeho vznik umožňuje malý lékařský cyklotron :

66Zn (p, n ) ⁶⁶Ga

67Ga a ⁶⁸Ga se využívají pro značení radiofarmak.

2. ¹¹¹In, ^113mIn

111In je jedním z nejpoužívanějších radionuklidů s poločasem rozpadu 67,9 h. Je produkován cyklotronem :

111Cd (p, n) ¹¹¹In

Mateřský prvek se rozkládá elektronovým záchytem, přitom dochází k emisi γ fotonů o energii 173keV a 247 keV. Využívá se při γ scintigrafii.

113mIn je produkováno ¹¹³Sm / ^113mIn generátorem. Mateřský nuklid má poločas rozpadu 115 dní – dceřiný 1,7 hodiny. V poslední době se k radioaktivnímu značení využívá již méně a je nahrazováno ^99mTc.

3. ^99mTc

Vzniká v radionuklidovém generátoru ⁹⁹ Mo/ ^99m Tc. V současné době je tento radionuklid nejvíce využívaným v nukleární medicíně. Jeho poločas rozpadu je 6hodin.

Přeměna mateřského radionuklidu :

99 Mo → ^99m Tc + β^- + ν

Pro široké využití technecia při radioaktivním značení je příznivá kombinace nízké ceny a snadné dosažitelnosti , dobré zobrazovací vlastnosti, příznivá dozimetrie a vysoká specifická aktivita tohoto radionuklidu. Nevýhodou je složitý chemismus, jde o polyvalentní prvek vyskytující se v oxidačních stupních od –1 do +7 a nutnost redukovat jej před vazbou do komplexu, protože se z generátoru získává ve formě technecistanu.

4. ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu

První radionuklidy této řady slouží k diagnostickým účelům, ⁶⁴Cu a ⁶⁷Cu byly použity k terapeutickým účelům. V nukleární medicíně se pro snadnou dostupnost preferuje radionuklid ⁶⁴Cu pro značení proteinů, peptidů a agens s dlouhou krevní clearence. Využívá se i ⁶⁰Cu pro agens s krátkou krevní clearence (tzv. hypoxické agens).

V současné době se získává z lékařského cyklotronu z obohaceného ⁶⁴Ni :

64Ni (p, n) ⁶⁴Cu

Podobně se získávají i další izotopy: ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu.

5. ⁸⁶Y, ⁹⁰Y

90Y je čistý vysokoenergetický ß ^– zářič (2,27 MeV s poločasem rozpadu 64,06 h).

Vzniká rozkladem mateřského nuklidu ⁹⁰Sr s poločasem rozpadu 27, 8 let.

86Y je pozitronový zářič a je produktem nukleární reakce

6. Lanthanoidy

Vznikají v jaderných reaktorech a můžeme je rozdělit podle energie záření :

nízkoenergetické je ¹⁷⁷Lu, středně energetické zářiče jsou ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm a vysoce energetické zářiče ¹⁶⁶Ho a ⁹⁰Y.

Tyto radionuklidy jsou používány při terapii nádorových onemocnění. Jejich volba závisí na velikosti tumoru a jeho lokalizaci. Středně nebo nízkoenergetické ß^- zářiče (

153Sm, ¹⁷⁷Lu) jsou lepší pro menší metastázy, vysoce energetické ß^- zářiče jako ⁹⁰Y jsou určeny pro velké tumory.

3.6.2. Základní požadavky pro používané radionuklidy

Nukleární medicína využívá radioaktivně značených peptidů pro diagnostické a terapeutické účely. Diagnosticky používané radionuklidy by měly splňovat tyto požadavky :

 měly by emitovat čisté záření gama v rozmezí 100 – 300 keV, perspektivní se jeví i zářiče ß⁺

 fyzikální poločas přeměny radionuklidů musí být přiměřený době klinického vyšetření

 produktem radioaktivní přeměny má být stabilní nuklid.

Radionuklid je pacientu aplikován prostřednictvím radiofarmaka. Ionizující záření je detekováno scintilačním detektorem, který pořídí snímek rozložení radiofarmaka ve vyšetřované oblasti po určité době od aplikace.

Při radioterapii je nutno doručit vysoké terapeutické dávky radiofarmaka do cílového orgánu za minimálního ozáření okolní zdravé tkáně. Základními požadavky pro terapeuticky používané radionuklidy jsou :

 musí emitovat záření ß^- , perspektivní jsou i zářiče α

 poločas přeměny by neměl být příliš dlouhý, ale i krátký poločas je nevýhodný, protože se aplikace musí častěji opakovat.

3.7. Radionuklidová diagnostika

Radiofarmaka jsou převážně využívána k diagnostice patologických stavů pomocí zobrazovacích metod. Princip diagnostických metod nukleární medicíny je v aplikaci stopového množství radionuklidu do těla pacienta nejčastěji intravenózně. Specifický radionuklid produkuje záření gama, které umožní detekci záření vně těla pacienta a umožní zobrazit prostorovou i časovou distribuci radiofarmaka v těle pacienta. Pro diagnostické účely se používají radionuklidy s krátkým poločasem přeměny, je potřeba, aby jejich přítomnost v těle pacienta byla po dobu vyšetření a poté se co nejrychleji rozpadly.

Základním zobrazovacím detektorem v nukleární medicíně je gama kamera, která snímá foton γ z těla pacienta. Pořizují se tak např. celotělové scany při vyhledávání kostních metastáz, vyšetřuje se srdeční činnost. Pořídí-li se série planárních obrazů pacienta pod různým úhlem kamery, získá se metodou tomografické rekonstrukce zobrazení distribuce radiofarmaka v těle. Mluvíme o jednofotonové emisní tomografii (SPECT). Pro SPECT je výhodnější použití více gama kamer v různých úhlech najednou, čímž se zvýší množství detekovaných fotonů a tím i kvalita zobrazení.

Další zobrazovací metodou je pozitronová emisní tomografie (PET). Využívá radionuklidů , jejichž produktem přeměny jsou β⁺ částice (pozitrony). Z místa rozpadu radionuklidu vyletují v opačném směru dva fotony gama o energii 511 keV. Výhoda tkví v tom, že během vyšetření je detekováno více užitečných fotonů a získává se kvalitnější obraz v porovnání se SPECT. Nejpoužívanější radionuklid pro PET je ¹⁸F.

V současné době již existují velmi výkonné i když velmi drahé hybridní systémy SPECT / CT a PET / CT. Jedná se o kombinaci tomografického zobrazení rentgenovým zářením a nukleárně medicínského tomografického zobrazení. Výhodou takového vyšetření je současné získání velmi kvalitního zobrazení anatomických struktur a odpovídajícího zobrazení funkčního.

3.8. Receptorově specifický peptid DOTA-NOC a jeho radioaktivní značení

3.8.1.DOTA-NOC - derivát octreotidu

Tetradekapeptid somatostatin (SS 14) má malou terapeutickou hodnotu zapříčiněnou jeho krátkým poločasem in vivo. Proto byly vyvinuty analogy somatostatinu, které si zachovaly spektrum účinků původní látky a navíc získaly větší odolnost vůči biologické degradaci. Konformační analýzy a studie vztahu struktury a funkce těchto analogů(1) ukázaly, že sekvence důležitá pro biologickou aktivitu závisí na β- konformačním fragmentu Phe-Trp-Lys-Thr, který odpovídá aminokyselinám 7-10 u somatostatinu 14. Došlo k nasyntetizování analogů s kratším řetězcem, hledaly se sloučeniny se zvýšenou a prodlouženou aktivitou. Jedním z nepředpokládaných důsledků strukturního zjednodušení však byla ztráta velkého spektra vazebné afinity původního somatostatinu. Po objevu mnohočetnosti receptorových subtypů somatostatinu, pochopení jeho struktury a funkce, bylo zjištěno, že krátký řetězec syntetických analogů somatostatinu má vysokou afinitu k receptorovému subtypu sst 2, mírnou až nízkou afinitu k sst 3 a 5, ale žádnou nebo velmi nízkou ke sst 1 a 4.

Deriváty somatostatinu se využívají in vivo pro receptorovou scintigrafii a cílenou radionuklidovou terapii v nukleární onkologii. Dnes již klasickým radioaktivně značeným somatostatinovým analogem užitým pro in vivo zobrazení endokrinně řízených tumorů je octreotid s komerčním názvem Octreoscan (¹¹¹In-DTPA-octreotid).

Většina lidských receptorově pozitivních nádorů exprimuje různé subtypy receptorů. Je zde značný rozdíl mezi různými druhy nádorů a mezi nádory stejného typu u rozličných pacientů. Ve většině nádorů je nejfrekventovanější subtyp sst 2, ale v určitém počtu tumorů je tento subtyp nepřítomen nebo vyjádřen ve velmi malé hustotě, kdežto ostatní subtypy přítomny jsou. Bylo proto nutné hledat deriváty a izotopy, které mohou zacílit více než jeden receptorový subtyp in vivo.

Bylo provedeno mnoho modifikací struktury oktreotidu.(9) Adice kovového

Struktura oktreotidu byla zkoumána prostřednictvím NMR a rentgenovou difrakcí(9) a tyto studie ukázaly, že existuje v roztoku ve dvou konformačních formách, lišících se na C- konci. Konformační změna probíhá v oblasti D-Trp 4-Lys 5. Všechny analogy oktreotidu uchovávají tuto kritickou sekvenci a pouze jemné modifikace způsobují β-listovou konformaci na bočním řetězci aminokyselin(Phe 3 a Thr 6). Mezi klinicky užívanými analogy somatostatinu (oktreotid, lanreotid, vapreotid) byly provedeny modifikace v poloze 3 substitucí tyrosinu namísto fenylalaninu. Dále byla provedena strukturní změna na C-konci (Thr-NH2 v lanreotidu, Trp-NH2 ve vapreotidu, Thr(ol) v oktreotidu) a/nebo na N-konci (D-2Nal v lanreotidu místo D-Phe v oktreotidu a vapreotidu, právě tak jako v poloze 6 (Thr v oktreotidu nahrazen Val v lanreotidu a vapreotidu). Je obtížné odhadnout změny ve vazebné afinitě, znatelné je v konjugátech s radiokovy, např.Y^III DOTA-TOC a Y^III DOTA-OC – tyto konjugáty s Tyr v pozici 3 mají zvýšenou afinitu pro sst 2, ale sníženou k sst 3 a 5.(9)

Na základě výše uvedených skutečností lze předpokládat, že modifikace v pozici 3 v derivátech oktreotidu modifikovaných komplexanem DOTA by mohla znamenat změnu afinitního profilu k receptorovým subtypům sst 3 a 5. Dalším předpokladem bylo začlenění objemných aromatických zbytků do struktury, čímž by se zlepšila vazebná afinita k sst 3 a 5. V literatuře (9) byla popsána syntéza a farmakologické hodnocení malého souboru sloučenin kov-DOTA-peptid odvozených od oktreotidu modifikací v poloze 3.Dle těchto předpokladů bylo nasyntetizováno 24 sloučenin, které lze uspořádat do několika tříd podle povahy aminokyselin na pozici 3 peptidové sekvence.

Patří sem tyto skupiny:

 Phe-deriváty (na pozici 3 je phenylalaninový substituent)

 Tyr-deriváty (tyrosinový substituent)

 Deriváty s heterocyklickým bočním řetězcem

 Deriváty s polyaromatickým bočním řetězcem

 Deriváty s alifatickým bočním řetězcem.

Největší afinitní profil v této sérii a dobrou internalizaci s sst 2 a 3 ukázaly konjugáty 2- naftylaninu ze skupiny derivátů s polyaromatickým bočním řetězcem a benzothiofenový ze skupiny s heterocyklickým řetězcem. Vžil se pro ně název DOTA-NOC a DOTA-BOC.

Mohou být značeny ¹¹¹ In, ⁹⁰ Y, ¹⁷⁷ Lu, ⁶⁸ Ga a mohou být účinně zacíleny na receptorové subtypy sst 2, 3, 5. Znamená to také rozšíření spektra cíleně zaměřených tumorů a zvýšení cytotoxické radioaktivní dávky k těmto subtypům receptorů v tumorech.

Obr.13. DOTA- NOC

N HOOC

NH O N

COOH

N HOOC

N H

N O S

NH O

O

HN NH

HN O

NH₂ O

HN

HO O NH S

O HN

HO HO

DOTA- Nal 3 – oktreotid

DOTA – D-Phe-Cys-1-Nal-D Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol) cyklo2-7

1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctová kyselina - D-Phe-Cys-1-Nal-D-Trp- Lys-Thr-Cys-Thr(ol)cyklo2-7

3.8.2.Vazba peptidu k chelatačnímu činidlu

Radioaktivně značené receptorově specifické peptidy před svým použitím v diagnostice a terapii procházejí několika kroky přípravy. Na začátku je syntéza peptidu, v případě DOTA-NOCu je to oktreotid substituovaný v poloze 3 naftylalaninem. Dalším krokem je syntéza chelatátoru DOTA, popsaná v předchozí části práce a jeho vazba na

atomů makrocyklické chelatační kostry. Ve druhém postupu je k jednomu ze čtyř acetátových chelatačních ramének připojen spojovač (linker). Oba případy mohou znamenat tvorbu izomerních struktur. Konjugace biomolekuly vede ke značné změně termodynamické stability a kinetické inertnosti v porovnání s DOTA-komplexem.

V posledním případě je biomolekula konjugována s jednou ze čtyř acetátových skupin přes amidovou vazbu.

Obr.14.

Posledním krokem je pak výběr správného radionuklidu dle účelu použití a jeho příprava v příslušném zařízení (postchelatační postup).

Při značení protilátek se někdy volí jiný postup, vazba radionuklidu k chelatačnímu činidlu a následná vazba radioaktivního komplexu na biologicky aktivní strukturu (prechelatační postup).

V klinické praxi se příprava radiofarmak provádí zjednodušeně z komerčně dostupných a předem připravených zásobních neradioaktivních souprav – kitů.

3.8.3. Konjugační skupiny

Tyto skupiny mají sloužit ke spojení bifunkčního chelatačního činidla a biomolekuly. Patří k nim např. aktivovaný disulfid, diazobenzen, HCl, anhydrid, bromo- nebo jodoacetamid, izothiokyanát, N-hydroxysukcinimidester (NHS), aldehyd, keton a maleinimid.(20) Je třeba také získat reaktivní skupinu, která může sloužit jako držadlo pro konjugaci BFCA. Tyto skupiny mohou být součástí biomolekuly nebo jsou připraveny k získání elektrofilní závislosti. Velmi často tuto funkci plní primární amin nebo thiol.

Funkční skupiny reagují s primárními aminy včetně DTPAdianhydridu, NHS aktivovanými estery, isothiokyanáty, aldehydem nebo ketonem, zatímco maleinimid je reaktivní s thiolem.

Obr.15. Přehled některých důležitých konjugačních skupin

3.8.4. Příklady důležitých konjugačních skupin

DTP anhydrid

Je komerčně dostupný a ochotně reaguje s primárními aminy při tvorbě DTPA biomolekulového konjugátu. Pro syntézy konjugátů byl použit i anhydrid DOTA. Výtěžek této reakce je však často velmi nízký.

NHS-aktivované estery

Aktivované estery mají reaktivní meziprodukty s vysokou selektivitou pro alifatické aminy. Optimální pH pro reakci ve vodném prostředí je 8-9.

Molekula obsahující karboxylovou skupinu může být převedena na svůj NHS-ester.

Byly používány pro protilátky a jejich fragmenty. Ve vodě rozpustný NHS ester byl užit pro konjugaci biomolekuly k DOTA.

Izothiokyanáty

Tvoří thioureové vazby s primárními aminy proteinů nebo peptidů. Jsou poněkud více stabilní ve vodě než NHS-estery a reagují s aminy ve vodném prostředí při pH 9-9,5.

Nesmí být použity pro modifikaci proteinů, které jsou citlivé k alkalickému pH.

Aromatické izothiokyanáty byly užity pro konjugaci biomolekul k DTPA a DOTA.

Aldehydy a ketony

Mohou reagovat s primárními a sekundárními aminy k tvorbě Schiffovy báze. Ta je relativně nestálá, snadno proběhne zpětná reakce. Jejich tvorba se zvyšuje při bazickém pH. Molekuly, které obsahují aldehydovou nebo ketonovou skupinu, mohou být převedeny do své formy Schiffovy báze. Tyto konjugační skupiny nejsou užívány pro konjugaci malých biomolekul, byly použity pro značení protilátek a jejich fragmentů.

Maleinimid

Je skupina reagující selektivně s thiolem protilátky, aby vytvořila thioéterovou vazbu bez vzájemného působení histidinu a ostatních reaktivních skupin. Optimální pH pro reakci je okolo7, použití je omezeno skutečností, že mnoho malých biomolekul neobsahuje thioskupinu.

3.8.5. Postup radioaktivního značení

Všeobecně existují dva postupy pro značení biomolekul radionuklidy:

prelabelingový a postlabelingový postup. Volba závisí na účelu použití a především na typu biomolekuly.

V postlabelingovém postupu je chelatační činidlo BFCA nejprve vázáno k biomolekule buď přes spojovač (linker) nebo přímo a vytvoří konjugát BFCA- biomolekula. Radioaktivní značení může proběhnout reakcí vzniklého konjugátu s chloridem radiokovu v roztoku pufru v přítomnosti redukovaného chelatačního agens(jako je citrát).(20)

Kinetika značení DOTA-biomolekula je obvykle pomalá. Jsou nutné podmínky – vyšší pH, zvýšená teplota – k tomu, abychom dosáhli rychlého značení a vysokého výnosu.

Tento postup se využívá pro biomolekuly, které nejsou citlivé k vysokému pH nebo zvýšené teplotě.

Obr.16. Postupy radioaktivního značení

Prelabelingový postup zahrnuje tvorbu kovového komplexu s chelatačním činidlem a poté konjugaci tohoto komplexu kov-BFCA s biomolekulou v odděleném kroku. V tomto postupu není biomolekula vystavena drsným podmínkám, které jsou užity v chelatačním kroku. Používá se k výzkumným účelům, ale pro rutinní klinické využití není příliš praktický.(20)

3.8.6.Značení konjugátů DOTA-biomolekula

Jak už bylo uvedeno výše, kinetika značení těchto konjugátů je obvykle pomalá a závislá na podmínkách. Existuje mnoho faktorů ovlivňujících výtěžek značení. Zahrnují množství DOTA-biomolekula konjugátu, pH reakční směsi, teplota a doba zahřívání, druh pufru a jeho koncentrace, stabilizační agens a jeho koncentrace, přítomnost ostatních izotopových kovů, které způsobují kontaminaci – Fe³⁺ a Zn²⁺.(20)

1.Kontaminace kovovým iontem

Chelatační účinnost makrocyklických chelátorů je oslabena koncentrací kontaminujících izotopových kovů Al, Ca, Ce, Cr, Cu, Fe, La, Ni, Tb, Zn, Zr. Během značení by měla být tato kontaminace minimalizována v reakční směsi. Koncentrace všech kontaminujících kovů by neměla být větší než koncentrace radionuklidu.

2. Koncentrace konjugátu BFCA-biomolekula

Účinnost radioaktivního značení je popisována jako schopnost chelátoru tvořit komlex s radionuklidem při nízké koncentraci za mírných podmínek. Je závislá na podmínkách značení. V literatuře se uvádí (20), že účinnost značení DOTA analogů radionuklidy byla maximální, když poměr chelátor : radionuklid byl větší než 3. Je třeba si uvědomit, že když se kov naváže k BFCA, vytvoří se požadovaný komplex. Skutečnost, že roztok radionuklidu je často kontaminovaný ostatními izotopovými prvky ve vyšších koncentracích než radionuklidy, je třeba vzít v úvahu.

3. Teplota zahřívání a reakční čas

Výhodné je značení za mírných podmínek – za pokojové teploty, ale často vyžaduje

4. Druh pufru a jeho koncentrace

Výběr pufračního agens závisí na optimální hodnotě pH pro vytvoření komplexu.

Ideální pro značení DOTA konjugované biomolekuly je 0,5 M amoniový acetátový pufr při pH = 7 - 7,5. Bylo zjištěno, že hodnota pH reakční směsi má dopad na rychlost chelatace. Např.čas požadovaný k chelataci 94% ⁹⁰ Y byl při pH = 6,5 17 - 148 minut, ale pouze 1 - 10 minut při pH = 7,5 , když koncentrace DOTA-konjugátů byla 97 - 870 μM a

90 Y koncentrace v rozmezí 0,83 - 6,1μM.

DOTA a její deriváty mají tendenci existovat v roztoku v několika formách a jejich konformace je určena stupněm protonace DOTA. Např., dominantní forma při pH = 3,6-5 je H3(DOTA)^-, zatímco při pH = 6-7 je ve formě H2(DOTA)^2- . Tvorba Y(DOTA)^- komplexů po stupuje přes dva meziproduktové komplexy YH2(DOTA)⁺ a YH(DOTA).

Obr.17. Struktury možných komplexů yttria

Výzkum bifunkčních chelatačních činidel a nových radioaktivně značících technologií je důležitý. Významná je skutečnost, že populace receptorů je často limitována.

Užití velkého množství nenaznačeného BFCA-biomolekula konjugátu může bránit vazbě radioaktivně označeného peptidu na receptorová místa. Proto musí mít BFCA vysokou účinnost značení a tvořit kovové komplexy s vysokou specifickou aktivitou.

3.8.7. Radionuklidy používané ke značení DOTA-NOC

1. ¹¹¹In - DOTA- NOC

Tento somatostatinový radiopeptid má podle studie (4) 3-4krát větší vazebnou afinitu k sst 2 a zvýšenou k sst 3 a 5 v porovnání se stejně označeným DOTA-TOC. Bylo také prokázáno vyšší vychytávání v tumorech a receptorově pozitivních tkáních. Pokusy na krysích modelech ukázaly, že tento radiopeptid má vysoký uptake v ledvinách (až 2,5krát vyšší než v tumoru).

2. ⁶⁸ Ga - DOTA-NOC

Byla navržena metoda (26) pro značení DOTA-NOC tímto radionuklidem, byla vyzkoušena a prokázala spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Pomocí radioHPLC a TLC metodami byla prokázána radiochemická čistota značeného konjugátu vyšší než 99%.

Naznačený komplex byl stabilní během tří hodin a v pozorovaném čase se nevyskytl žádný radiolytický jev. Tato stabilita je dostatečná pro zobrazení v diagnostice. Další studie (32) prokázala vysokou afinitu tohoto analogu pro somatostatinové receptory subtypu sst2 a 5.

PET zobrazení vykazovalo vysoký uptake v játrech a kostních metastázách (32), dále ve slezině, pohlavních orgánech a štítné žláze. Toto radiofarmakum má potřebný potenciál pro primární diagnostiku pacienta při podezření nebo prokázaným receptorově pozitivním tumorem.

3. ⁹⁰ Y - DOTA- NOC

Takto označený radiopeptid má využití především v terapii. Podle studie (8) má vyšší afinitu k receptorovým subtypům sst 2, 3 ,5.

4. ¹⁷⁷ Lu - DOTA-NOC

V literatuře byla popsána studie (31), v níž byla hodnocena peptidově receptorová terapie pomocí dvou peptidů značených luteciem : ¹⁷⁷ Lu-DOTA-NOC a ¹⁷⁷ Lu- DOTA-TATE.

Byly zkoumány poločas rozpadu a průměrné absorpční dávky pro orgány a tumory u pacientů s neuroendokrinními tumory s vysokým vyjádřením somatostatinových receptorů.

Orgánový uptake byl sledován a ověřován PET a CT metodami. Tato studie potvrdila in

3.9. Hodnocení kvality značených biomolekul

Mezi používané metody kontroly kvality radiofarmak a tím i značených peptidů patří stanovení radioaktivity, radionuklidová čistota a radiochemická čistota. Zaměřím se na posledně jmenovanou metodu, kterou jsem použila v experimentální části své práce.

Radiochemická čistota je definována jako část celkové radioaktivity obsažená v přípravku v požadované formě. Vyjadřuje se v procentech. Radiochemické nečistoty vznikají v důsledku rozkladu chemické formy nebo vazbou radionuklidu na chemické nečistoty v přípravku. Praktickým příkladem je přítomnost volného ^99m technecistanu a koloidní formy v přípravcích značených tímto radionuklidem. Přítomnost radiochemických nečistot má za následek zkreslení scintigrafického zobrazení v důsledku nízké akumulace v cílovém orgánu a vysoké kumulaci v okolní tkáni. Rovněž může změnit biodistribuci radiofarmaka a nepřiměřeně zvýšit absorbovanou dávku pacienta.

Nejčastěji používanou metodou k určení radiochemické čistoty je tenkovrstvá chromatografie (TLC, ITLC-SG). Je to jednoduchá, časově i instrumentálně nenáročná metoda umožňující realizaci zkoušky v řádu desítek minut. Na strip tenké vrstvy se nanáší vzorek značeného peptidu a ponoří se do mobilní fáze, kterou bývá nejčastěji organické rozpouštědlo (aceton, ethanol, acetonitril), případně pufr. Vyvíjení chromatogramu trvá několik minut. Značené peptidové konjugáty migrují s čelem rozpouštědla. Po vyjmutí se chromatogram usuší a detekuje pomocí přístrojů. Pomocí této metody zjišťujeme výtěžek radioznačení. V současné době je široce využívána, jak bylo už uvedeno, pro jednoduchost provedení, rychlost separace látek, snadné vyhodnocování a možnost používání mikrogramových množství vzorků. Provedení analýzy navíc zjednodušuje komerční výroba sorbentu s pojidlem, což zaručuje standardní vlastnosti materiálu.

Pro kontrolu kvality radiofarmak je další metodou vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC. Je velmi přesnou metodou a umožňuje i separaci izomerů.

Separační účinnost závisí na velikosti částic stacionární fáze. Nalezením vhodných účinných stacionárních fází a citlivých detektorů je umožněno její široké využití při analýze velké škály sloučenin. Principem metody je dělení látek mezi stacionární fází naplněnou v koloně a mobilní fází procházející kolonou za vysokého tlaku. Protože

a testovaných výrobcem, které mohou zajistit rovnoměrnost a homogennost náplně, tedy stacionární fáze. Detektory pro HPLC musí být mimořádně citlivé, univerzální, snadno reprodukovatelné.Pro analýzu kvality radiofarmak se využívají různé průtokové detektory radioaktivity. Získáme chromatogram závislosti aktivity na čase. To umožňuje identifikaci eluátu a jeho čistotu.

3.10. Klinické využití radioaktivně značeného peptidu DOTA- NOC

Jak už bylo výše uvedeno, somatostatinový analog DOTA-NOC má širší receptorovou specifitu k somatostatinovým receptorům, především k subtypům sst 2 a 5, ale také k sst 3. Tato skutečnost zvyšuje možnost navázání radioaktivně označeného peptidu k těmto receptorům, které jsou exprimovány v různých typech lidských tumorů, jak prokázaly četné studie.(5,10,23,27) V současné době probíhají klinická hodnocení syntetických analogů oktreotidu značených různými nuklidy a zkoumají se jejich možnosti využití pro diagnostické zobrazení a cílenou radioterapii.

K těmto studiím patří i hodnocení ⁶⁸ Ga-DOTA-NOC jako zobrazovací agens a jeho srovnání s ⁶⁸Ga-DOTA-TOC, který vyniká kvalitou zobrazení, ale vykazuje vysokou selektivitu jen pro receptorový subtyp sst2.(11) Studie se zúčastnilo 40 pacientů s neuroendokrinními tumory různého typu. ⁶⁸Ga-DOTA-NOC ukázal zvýšený uptake v tumorech i většině orgánů. Jeho širší receptorová specifita umožní všestrannější využití při diagnostice různých typů tumorů.

Slibné výsledky poskytla také studie zaměřená na sledování pacientů podrobených peptidově receptorové radioterapii pomocí ¹⁷⁷Lu-DOTA-NOC a ¹⁷⁷Lu-DOTA-TATE.

Výzkumu se zúčastnilo 96 pacientů s neoperovatelnými neuroendokrinními nádory s vysokou expresí somatostatinových receptorů.(31) V průběhu studie byl srovnáván uptake v těle i tkáních a v tumorech, poločas rozpadu a průměrné absorpční dávky do normálních orgánů a do tumorů. Cílem peptidově receptorové radioterapie je doručit co nejvyšší dávku radiace k tumoru a ostatní orgány zasáhnout co nejméně. Aktuální

významným faktorem je poměrně značná variabilita mezi pacienty v hustotě různých subtypů receptorů, v typech tumorů a také v absorbci dávek.(31) Porovnání uptaku obou označených peptidů v celém těle a ve tkáních ukázalo, že větší hodnoty vykazuje DOTA- NOC, pouze uptake v ledvinách a ve slezině byl srovnatelný. Vyšší uptake v tumorech se ukázal u DOTA-TATE. Z hlediska dozimetrie se velikost průměrných absorbovaných dávek obou agens téměř nelišila, ale bylo zjištěno, že okamžitý maximální uptake vykazoval ¹⁷⁷Lu DOTA-NOC a s postupem času se snižoval. U ¹⁷⁷Lu DOTA-TATE nastal maximální uptake až 3 hodiny po aplikaci.

V této studii (31) byla použita k ochraně ledvin infuze aminokyselin, která se podává 30 minut před aplikací terapeutické dávky a dále se pokračuje za 4 hodiny. Tato koinfuze aminokyselin redukuje ledvinovou expozici a poskytuje možnost zvýšení průměrné absorbované dávky k dosažení tumoru.

V poslední době se stále rozšiřuje soubor somatostatinových analogů. Patří k nim např. DOTA-NOC-ATE (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctová kyselina-1- Nal³,Thr⁸-oktreotid) a DOTA-BOC-ATE [DOTA, BzThi³,Thr⁸]- oktreotid. Bylo provedeno preklinické hodnocení těchto nových analogů značených ¹¹¹In a srovnáno s ¹¹¹In-DOTA-TOC, který je považován za zlatý klinický standard.(8) U těchto receptorově specifických peptidů byla zjištěna zvýšená afinita k lidským receptorovým subtypům sst 2, 3, 5 a střední afinita k sst 4 ( DOTA-TOC má afinitu jen k sst 2). V buňkách krysích modelů byla zjištěna vyšší internalizace konjugátů než u DOTA-TOC, dvakrát větší v normální tkáni, v tumorech srovnatelný se standardem. Ledvinový uptake byl značně nižší pro oba nové radiopeptidy. Ve studii prokázaly oba analogy výhodnější vlastnosti a ukázalo se jejich možné budoucí využití v zobrazení i terapii tumorů.

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1. Materiály a přístroje

4.1.1. Přístroje

 Ionizační komora

 Vyhodnocovací zařízení – RITA STAR

 - GINA STAR

 Vybavení pro TLC

o proužky ITLC ^tmSC (Gelman Science – USA) skleněná vlákna potažená silikagelem

o nádoba s mobilní fází

 Zahřívač – Dry bath incubator (MS Major Science)

 Automatické pipety Finnpipette 0,5-10μl, 10-100μl

 Míchačka Microshaker ML-1 (Premed ČR)

4.1.2. Chemikálie

 0,4 M acetátový pufr s 0,24 M kyselinou gentisovou o pH = 5,005

 roztok ¹¹¹In-InCl₃ v 0,04 M kyselině chlorovodíkové o koncentrace radioaktivity 370 MBq/ml

o výrobce – GE Healthcare Amersham, Velká Británie

 Peptidy (pi CHEM, LINZ )

o DOTA – Nal³ – Octreotide (DOTA – NOC) o DOTA – Tyr³ - Octreotate (DOTA – TATE)

 octan amonný (Merck)

 superčistý CH3COONa (Merck)

 CH3COOH p.a. (Lachema)

 methanol (Sigma)

 superčistá voda (voda čištěná reverzní osmózou na zařízení Millipore)

4.2. Chemická struktura použitých derivátů oktreotidu

4.2.1. DOTA – Nal³- oktreotid

N HOOC

NH O N

COOH

N HOOC

N H

N O S

NH O

O

HN NH

HN O

NH₂ O

HN

HO O NH S

O HN

HO HO

Molekulová hmotnost : 1 455,7

4.2.2. DOTA – Tyr³- oktreotát

N HOOC

NH O N

COOH

N HOOC

N H

N O S

NH O

O

HN NH

HN O

NH₂ O

HN O NH S

O HN

HO HO

OH

4.3. Metodika

4.3.1. Radioaktivní značení derivátů oktreotidu ¹¹¹In

Deriváty oktreotidu, DOTA – Nal³ – oktreotid a DOTA – Tyr³- oktreotat, byly označeny radionuklidem ¹¹¹In-InCl3. Bylo použito tzv. postlabelingového postupu značení.

Byly prověřovány podmínky značení s ohledem na dosažení požadované co nejvyšší radiochemické čistoty, jako je poměr chemických množství ligandu a radionuklidu, vliv objemu pufru na dosaženou radiochemickou čistotu značeného peptidu. Radiochemická čistota byla stanovena metodou tenkovrstvé chromatografie. Dále byla zkoumána závislost čistoty produktu na čase v krátkodobém i dlouhodobějším časovém rozmezí. Účelem bylo prokázat použití radioaktivně značených peptidů v delším časovém intervalu po označení a srovnat stabilitu radioznačení uvedených analogů somatostatinu.

4.3.2. Postup značení peptidů

Postup přípravy chelátů DOTA – Nal³ – oktreotidu a DOTA – Tyr ³ – oktreotátu s ¹¹¹In probíhal za stejných podmínek následujícím způsobem. V Eppendorfově zkumavce z polypropylenu o objemu 0,5 ml jsme k 25 μl 0,4 M acetátového pufru s 0,24 M kyselinou gentisovou o pH= 5,005 přidali 1µl peptidu (o koncentraci 1µg/ 1µl v superčisté H2O) a 15μl ¹¹¹InCl3 v 0,04 M kyseliny chlorovodíkové. Vzniklé směsi byly zhomogenizovány na třepačce. Poté byly umístěny do zahřívače, kde byly temperovány při teplotě 92,5°C po dobu 25 minut. K těmto směsím jsme přidali 10µl fyziologického roztoku. Z obou radioaktivně označených peptidů jsme odpipetovali 2-3 µl k provedení analýzy na tenké vrstvě.

4.3.3. Kontrola radiochemické čistoty značených produktů

4.3.3.1. TLC analýza

TLC analýza byla uskutečněna na vrstvách ITLC ^TMSC (Gelman Sciences,USA), které jsou tvořeny skleněnými vlákny potaženými silikagelem, s mobilní fází 10% (m/V) octanu amonného s methanolem v poměru objemu 1:1. Po 25 minutách byly proužky vyjmuty z mobilní fáze a vysušeny. Rozložení aktivity ve stripu bylo stanoveno pomocí měřiče radiochromatogramů fy RAYTEST, který snímá ve zvoleném časovém intervalu aktivitu pomocí vícekanálového detektoru. Výstupní hodnoty byly detekovány počítačovým systémem s programem RITA STAR (měřič) a vizualizovány v podobě grafu programem GINA STAR.

4.3.3.2. HPLC analýza

K ověření radiochemické čistoty připraveného komplexu peptidů označených ¹¹¹In byla pro srovnání provedena HPLC analýza na zařízení Agilent Systém 1100 na koloně Lichnocart: Lichnospher RP-C18 (125x4 mm, 5 μm). Průtoková rychlost mobilní fáze byla 0,5 ml/min. Jako detektor byl použit radiometr Polon s vyhodnocením pomocí programu Clarity.

Mobilní fáze : A : 0,1% TFA B : CH3 CN

Gradient HPLC

0 – 5 min 0 % B

5 – 15 min 0 – 30 % B

15 – 20 min 30 % B

20 – 25 min 30 – 100 % B

25 – 30 min 100 %B

Obr.18. Příklad HPLC analýzy ¹¹¹In-DOTA-Tyr³-oktreotátu

Obr.19. Příklad HPLC analýzy ¹¹¹In-DOTA-Nal³-oktreotidu

5. VÝSLEDKY A DISKUSE