Zobrazit Proanthocyanidins and Their Antioxidation Activity

V

K

, Z

Ř

, E

B

, K

K

, D

J

, K

M

, L

O

, P

D

, L

J

, J

C

a L

C

a Katedra farmaceutické botaniky a ekologie, ^b skupina ADINACO, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Uni- verzita Karlova v Praze, Heyrovského 1203, 500 05 Hra- dec Králové, ^cCentrum pokročilých studií,Fakulta vojen- ského zdravotnictví, Univerzita obrany, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové, ^d Ústav chemie přírodních látek, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6 opletal@faf.cuni.cz

Došlo 13.12.11, přijato 20.1.12.

Rukopis byl zařazen k tisku v rámci placené služby urychleného publikování.

Klíčová slova: flavonoid, procyanidin, třísloviny, anti- oxidanty, rostlinné látky

Obsah 1. Úvod

2. Struktura, typy a výskyt proanthocyanidinů*

3. Absorbce a metabolismus proanthocyanidinů 4. Antioxidační působení

4.1. Zhášení radikálů

4.2. Chelatace přechodných kovů 4.3. Inhibice enzymů

4.4. Peroxidace lipidů 5. Další biologické účinky 6. Závěr

1. Úvod

Rostlinné metabolity – především sekundární – jsou velmi širokou skupinou látek, vykazující různé biologické

účinky. Velkému zájmu se těší látky fenolové povahy, zejména polyfenoly, které byly a jsou široce zkoumány z důvodu potenciálního použití v prevenci a terapii zejmé- na tzv. civilizačních chorob. Polyfenoly typu flavonoidů a látek z nich odvozených jsou rozsáhlou skupinou slouče- nin¹ (započítáme-li do této skupiny další sloučeniny, jako jsou fenolové kyseliny, kumariny aj., překročí v součas- nosti tento počet 10 000 sloučenin). Za posledních zhruba 100 let bylo publikováno více než 60 000 prací na téma flavonoidních látek, v případě proanthocyanidinů je počet prací přibližně desetinový. Flavonoidy jsou však všeobec- ně známou a významnou skupinou (rutin, hesperidin) s mnoha prakticky využitelnými účinky², avšak doposud opomíjenou skupinou polyfenolů, neméně důležitou, jsou některé typy tříslovin (zejména třísloviny kondenzované).

Polyfenolům byla věnována řada rozsáhlých přehle- dových prací (např.³), protože jsou běžně přijímány v potravě; např. u červeně a modře zbarvených brambor mohou hrát přítomné anthocyany a další fenolové slouče- niny zajímavou roli přirozených antioxidantů v lidské stra- vě⁴. Studiu na obsah anthocyanů jsou také podrobeny nové a dosud nepříliš známé druhy ovocných dřevin, jako např.

Lonicera coerulea L. (Loniceraceae)⁵. Rovněž je důležité hodnocení antioxidační aktivity ovocných a zeleninových šťáv, jehož výsledky jsou do velké míry ukazatelem obsa- hu příznivě působících polyfenolů⁶. Přítomnost polyfeno- lických látek v pochutinách, jako je čokoláda⁷ a čaj⁸, je známa, stejně tak jako příznivé účinky na fyziologické procesy v lidském organismu. Polyfenoly jsou však také přítomny i v široce používaných produktech, jako je např.

pivo (jejich obsah je pro organoleptické vlastnosti chmelo- vých přípravků bezesporu důležitý)⁹. Ukázalo se, že výraz- ný vliv na aktivitu antioxidantů mají vnější faktory¹⁰. Při technologických procesech, jako je např. pyrolýza dřevní hmoty, při které dochází k výrazným změnám v obsahu a složení polyfenolových sloučenin, hrají vliv nejen pod- mínky procesu, ale i složení suroviny¹¹. Samotný výraz

„polyfenol“ je však velmi vágní a někdy matoucí, pouze naznačuje, že v molekule sloučenin je vyšší počet (220) fenolových hydroxylů, nehovoří však zároveň o povaze základního skeletu. Proto by měl být tento výraz používán k označení široké skupiny látek, které se vyskytují v určité rostlinné surovině (flavonoidy, třísloviny, fenolové kyseli- ny, některé lignany).

V roce 1957 definoval Bate-Smith¹² třísloviny jako ve vodě rozpustné fenolové sloučeniny s relativní molekulo- vou hmotností od 500–3000. Mezi jejich charakteristické

PROANTHOCYANIDINY A JEJICH ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITA

* Autoři použili při psaní některých odborných výrazů formy, které vznikly po konzultaci s Ústavem pro jazyk český AV ČR (a které pracovní skupina v publikační oblasti používá) a to zejména u termínů, které jsou v odborné veřejnosti diskuto- vány [proanthocyanidiny (místo proantokyanidiny), fenolový (místo fenolický, i když je tento výraz běžně používán].

vlastnosti se řadí schopnost vytvářet nerozpustné kom- plexy s proteiny, polysacharidy, nukleovými kyselinami, nebo alkaloidy. Kromě této obecné vlastnosti vykazují třísloviny řadu dalších biologických aktivit, které často souvisí s jejich antioxidační aktivitou. Třísloviny se dělí podle struktury a biogenetického původu na „hydrolyzo- vatelné“ (estery kyseliny gallové s glukosou), ellagitaniny (estery kyselin gallové a ellagové s glukosou) a „konden- zované“ (proanthocyanidiny – flavanolové kondenzáty).

Další skupinu tvoří ještě tzv. třísloviny „složené“. Naše sdělení se zabývá tříslovinami kondenzovanými, protože jsou v přírodě hojně zastoupeny a jsou významnou součás- tí lidské stravy.

2. Struktura, typy a výskyt proanthocyanidinů Mezi tzv. „flavonoidy“, které zahrnují především velkou část flavonů a flavany, z jejichž hydroxyderivátů vznikají kondenzované třísloviny, je poměrně velký rozdíl (obr. 1). Flavony jsou zpravidla žlutavé až žluté, bez chuti až nahořklé, zatímco katechiny – základní stavební jednot- ky proanthocyanidinů – jsou narůžovělé se sladko-trpkou chutí.

Kondenzované třísloviny jsou oligomerní nebo poly- merní sloučeniny vycházející z flavan-3-olů (katechinů).

Při zahřátí jejich ethanolových roztoků se rozkládají na anthocyanidiny, a proto bývají také nazývány proantho- cyanidiny (nebo procyanidiny). Základní strukturní jednot- kou těchto kondenzátů jsou deriváty flavan-3-olu (+)- katechin a ()-epikatechin (obr. 2).

Flavan-3-ol obsahuje dvě centra chirality (C-2, C-3), a proto mohou existovat 4 základní pentahydroxyflavano- vé isomery (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavany):

(+)-katechin (1) 2R, 3S (trans) ()-epikatechin (2) 2R, 3R (cis) ()-katechin (ent-katechin) (3) 2S, 3R (trans) (+)-epikatechin (ent-epikatechin) (4) 2S, 3S (cis) Podobným způsobem existují gallokatechin a epi- gallokatechiny (3,3’,4’,5,5’7-hexahydroflavan); zejména ()-epigallokatechin (EGC) a ()-epigallokatechin-3-galát (EGCG) jsou hlavními obsahovými složkami polyfenolo- vého komplexu zeleného čaje. Ačkoliv biosyntéza těchto látek v rostlinách umožňuje vznik všech čtyř isomerů,

zcela běžně se v přírodě vyskytují pouze dva: (+)-katechin (gallo-) a ()-epikatechin (gallo-) (obr. 2). U kondenzova- ných tříslovin existuje velká strukturní rozmanitost, která je způsobena různým počtem a polohou hydroxylových skupin, stereochemií na centrech chirality, nebo typem a polohou mezimolekulových vazeb. Uváděny jsou různé O- methylace, C-, O-glykosylace a O-galloylace. Podle pozic hydroxylů na flavanech jsou proanthocyanidiny děleny na:

procyanidiny (3,5,7,3’,4’-OH), prodelfinidiny (3,5,7,3’,4’,5’-OH), propelargonidiny (3,5,7,4’-OH), profisetinidiny (3,7,3’,4’-OH), prorobinetinidiny (3,7,3’,4’,5’-OH), proguibourtinidiny (3,7,4’-OH), proterakacinidiny (3,7,8,4’-OH), promelakacinidiny (3,7,8, 3’,4’-OH).

Pro procyanidiny skupiny B (dimery) a C (trimery) je charakteristické C-C přemostění obvykle mezi C-4 horní- ho flavanolu a C-6 nebo C-8 dolní jednotky. Procyanidiny skupiny A obsahují kromě této vazby navíc etherový můs- tek mezi C-2 horní jednotky a C-7 a/nebo C-5 dolní jed- notky (obr. 3). Připojením dalších flavanů vznikají poly- mery zahrnující až padesát monomerů. Časté jsou zejména polyepikatechiny a kopolymery procyanidinů a prodelfi- nidinů ^13,14.

Proanthocyanidiny byly izolovány z mnoha druhů rostlin a jsou často součástí lidské stravy. Jejich nejroz- sáhlejší skupinu tvoří procyanidiny skupiny B. Pro- cyanidin B-1 se nachází např. v grepu, čiroku, brusinkách, B-2 v jablcích, třešních, B-3 v jahodách, chmelu a B-4 v malinách a ostružinách¹⁵. Známými zdroji proantho- cyanidinů jsou červené víno, zelený čaj, kakao nebo čoko- láda¹⁶ (obr. 2, obr. 3).

Obr. 1. Základní struktura flavonů a flavanů flavony flavany

O

OH

R OH

HO

OH

O

OH

OH

OH HO

OH

O O

OH HO

OH 1

2 OH OH R

O

OH

R OH

HO

OH

OH R

OH

5

3 OH

4

Obr. 2. Nejčastější strukturní jednotky kondenzovaných tříslovin: (+)-katechin (1); ()-epikatechin (2); (+)-gallokatechin (3); ()-epigallokatechin (4); ()-epigallokatechin-gallát (5)

3. Absorbce a metabolismus proanthocyanidinů Dlouhou dobu se předpokládalo, že se proantho- cyanidiny nevstřebávají v důsledku své velké molekulové hmotnosti a také schopnosti vytvářet nerozpustné kom- plexy se složkami potravy, případně „tříslit“ proteiny tkání

trávicího ústrojí a stávat se tak biologicky málo dostupný- mi. V současnosti sice existují studie, které potvrzují, že jsou více vstřebatelné, než se myslelo, stále však v jejich biologické dostupnosti zůstává hodně otazníků¹⁷.

Obecně pro proanthocyanidiny platí, že jejich ab- sorbce klesá s rostoucím stupněm polymerizace. V poku- Obr. 3. Příklady oligomerních procyanidinů: procyanidin B-1 (6, epikatechin-(4β→8)-katechin); procyanidin B-2 (7, epikatechin- (4β→8)-epikatechin); procyanidin B-3 (8, katechin-(4α→8)-katechin); procyanidin B-4 (9, katechin-(4α→8)-epikatechin); procyanidin A-1 (10, epikatechin-(4β→8,2β→7)-katechin; procyanidin A-2 (11, epikatechin-(4β→8,2β→7)-epikatechin; procyanidin C-1 (12, epikatechin -(4β→8)-epikatechin-(4β→8)-epikatechin); procyanidin C-2 (13, epikatechin-(4α→8)-katechin-(4α→8)-katechin)

sech in vitro bylo zjištěno, že proanthocyanidiny do veli- kosti trimerů procházejí přes střevní sliznici bez většího omezení. S další polymerizací se prostupnost snižuje a transport hexamerů prakticky neprobíhal¹⁸. Biologická dostupnost těchto látek však není prostou funkcí počtu fenolových hydroxyskupin, ale zahrnuje celou skupinu faktorů, jak bylo prokázáno u flavan-3-olů z čaje a kakaa, jako je stav trávicího ústrojí, vazba na matrici tráveniny, množství podaných látek, úroveň exprese trávicích enzy- mů u dotyčného jedince a forma, v níž se tyto látky nachá- zejí¹⁹. U potkana bylo např. zjištěno, že proanthocyanidi- nové dimery A1, A2 a B2 jsou absorbovány z tenkého střeva, aniž by došlo ke konjugaci nebo methylaci²⁰.

Studie, která se zabývala stabilitou proanthocyanidinů v kyselém žaludečním prostředí, uvedla, že vysokomole- kulární sloučeniny jsou degradovány na vstřebatelné mo- nomery a dimery²¹. Naproti tomu jiná studie uvádí, že vyšší proanthocyanidiny nejsou v žaludečním prostředí rozkládá- ny a vstřebávají se jen monomery a dimery²². Tento rozpor se může vysvětlit např. povahou podaného proanthocyanidi- nu, resp. profilu podané směsi těchto látek, kdy některé pro- anthocyanidiny mohou být degradovatelnější než jiné.

Podle jedné studie je ()-epikatechin hlavní biologic- ky dostupnou látkou po podání a metabolizaci proantho- cyanidinů B-2 a B-5, zatímco jiná studie uvedla, že proant- hocyanidin B-2 je absorbován i vyloučen nezměněný a metabolizován je pouze částečně^23,24. Je zřejmé, že po podání proanthocyanidinů velmi záleží na kvantitativním složení směsi a modelu, na kterém je biotransformace stu- dována; dosud však není k dispozici dostatečné množství studií pro metaanalýzu.

Důležitý vliv má také střevní mikroflora. Je známo, že část neabsorbovaných tříslovin je rozložena střevními mikroorganismy za vzniku různých fenolických produktů, které se mohou vstřebat a podílet na různých farmakolo- gických účincích²⁵. Význam mají také nevstřebané vyso- komolekulární třísloviny a komplexy tříslovina-protein, které si uchovávají antioxidační aktivitu a mohou tak při- spívat k ochraně zažívacího traktu²⁶. Dimerní procyanidiny jsou v lidském střevě metabolizovány na 2-(3,4-di- hydrofenyl)octovou kyselinu a 5-(3,4-dihydroxyfenyl)-γ- -valerolakton jako hlavní metabolity²⁷. Tímto způsobem dochází i ke štěpení a metabolizaci proanthocyanidinů o vyšší molekulové hmotnosti, které jsou konjugovány s potravní vlákninou²⁸. Širší pohled na metabolismus a mikrobiální transformaci flavan-3-olů z potravního řetěz- ce a biologické aktivity jejich metabolitů podává přehledo- vá studie Monagasové a spol.²⁹.

U proanthocyanidinů ze semen vinné révy (Vitis vini- fera L., Vitaceae), které jsou používány ke snížení hladin cholesterolu, bylo zjištěno, že tyto látky snižují hladiny cholesterolu zvýšením exkrece žlučových kyselin v důsledku regulace CYP7A1 (cit.³⁰). Je pravděpodobné, že tímto způsobem se budou chovat i proanthocyanidiny z jiných vegetabilních zdrojů a modifikací některých iso- enzymů této cytochromové rodiny mohou ovlivnit metabo- lismus exogenně podávaných látek (léčiv); dosud však na toto téma není reprezentativní počet sdělení.

4. Antioxidační působení

Antioxidanty jsou definovány jako látky, které při působení v nízkých koncentracích významně inhibují nebo zpomalují oxidační destrukci ostatních látek (resp. tkání).

V posledních letech jsou antioxidačně účinné látky podro- beny velkému zájmu z důvodu jejich léčebného využití. Je to dáno spojováním vývoje řady lidských nemocí s oxidač- ním stresem. Volné radikály (resp. RNOS-reaktivní dusí- katé a kyslíkaté částice) hrají důležitou úlohu např.

v patogenezi stárnutí, různých kardiovaskulárních chorob, diabetes mellitus 2. typu nebo zhoubného bujení³¹.

Mezi základní mechanismy antioxidačního působení tříslovin se řadí zhášení volných radikálů, chelatace pře- chodných kovů a schopnost inhibovat prooxidační enzy- my.

4.1. Zhášení radikálů

Základem radikály zhášecího působení polyfenolů, tedy i kondenzovaných tříslovin, je schopnost antioxidantu poskytnout elektron radikálu za současného vytvoření stabilnější, méně reaktivní radikálové struktury. Mezi nej- častější a nejjednodušší antioxidační testy patří metody využívající zhášení DPPH [1,1-difenyl-2-(2,4,6-tri- nitrofenyl)hydrazyl]  nebo ABTS⁺ [2,2-azinobis(3-ethyl- 2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)] radikálu³². Bylo zjiš- těno, že mnoho kondenzovaných tříslovin působí jak proti DPPH³³, tak proti ABTS⁺ radikálu^31,32.

Obecně pro proanthocyanidiny platí, že zhášecí akti- vita roste s počtem hydroxylů, obzvláště jsou-li v o-uspo- řádání, a s navázáním kyseliny gallové. Dále je ovlivněna také velikostí molekuly, když roste od monomerů k trimerům, pak ale opět klesá^33,34.

Porovnání antioxidačních aktivit ve skupině B-typu procyanidinů nepřineslo jednoznačné výsledky. Např.

jedna studie dokládá vyšší aktivitu procyanidinu B-2 než procyanidinů B-3 a B-5 proti DPPH radikálu, zatímco jiná studie neprokázala rozdíl ve zhášení ABTS⁺ radikálu mezi šesti různými B-procyanidiny³⁴. Také aktivita procyanidi- nů B-1 a B-3 proti superoxidovému radikálu byla téměř stejná³⁵. Tyto odlišnosti nejsou překvapivé, protože jedna sloučenina může působit různě proti různým radikálům.

Kromě dvou výše zmíněných, experimentálně používa- ných radikálů, bylo prokázáno zhášení dalších radikálů, např. superoxidového³³, hydroxylového³⁶, peroxylu nebo NO (oxidu dusnatého)³⁷.

Třísloviny vykazují velký antioxidační potenciál díky vyšší molekulové hmotnosti a současně vysokému stupni hydroxylace aromatických kruhů. Při porovnání antioxi- dačních schopností různých typů polyfenolů na základě zhášení ABTS⁺ radikálu, kyseliny chlorné a FRAP testu pro hodnocení redukční síly antioxidantů vyplynulo, že z hodnocených sloučenin jsou nejúčinnější dimerní pro- cyanidiny. Následovaly flavanol, flavonol, hydroxyskoři- cové kyseliny a jednoduché fenolové kyseliny³⁸.

Bylo také zjištěno, že na rozdíl od jiných fenolových antioxidantů by proanthocyanidiny nemusely vykazovat

prooxidační aktivitu. Vlastnost významných antioxidantů, monomerních flavon(ol)ů, působit jako prooxidanty již byla prokázána. Kvercetin a jiné flavon(ol)y totiž při zhá- šecích reakcích vytváří o-chinonové struktury, které mo- hou v dalších redoxních reakcích působit jako prooxidan- ty. Naproti tomu studie, která využívala techniky elektro- nové spinové rezonance (ESR), používané pro studium volných radikálů, a která se zabývala mechanismem antio- xidačního působení kondenzovaných tříslovin, prokázala opak. Proanthocyanidinové o-chinony, vzniklé po reakci s radikálem, podléhají následným nukleofilním adičním reakcím, při kterých vznikají z původních molekul složi- tější struktury, které si uchovávají vysoký počet hydroxy- lových skupin a tím i svou antioxidační aktivitu (obr. 4).

Proanthocyanidiny jsou tak z tohoto hlediska lepšími anti- oxidanty než monomerní flavon(ol)y³⁹.

Monomerní a oligomerní procyanidiny jsou jedny z hlavních účinných látek extraktů z kůry borovice přímoř- ské (Pinus pinaster Aiton subsp. atlantica D. del Villar, Pinaceae). Tato borovice pochází z jižních oblastí Francie a v mnohých zemích je používána jako surovina pro kardi- oprotektivní přípravek (Pycnogenol^®), který vyvolává např. vasorelaxační působení, inhibici angiotensin konver- tujícího enzymu (ACE), nebo zlepšení permeability kapi- lár. Komplexní výtažek vykazuje více biologických aktivit než izolované složky, z čehož vyplývá, že obsahové látky působí synergicky. Oligomerní procyanidiny se podílí na jeho vysoké radikály zhášecí aktivitě. K celkové antio-

xidační ochraně přispívá také schopnost regenerace askor- bylového radikálu a ochrany endogenního vitaminu E a glutathionu (GSH) před oxidačním poškozením⁴⁰. Pro- cyanidinové oligomery epikatechinové série mají kromě scavengerové aktivity schopnost inhibovat aktivitu DNA polymerasy⁴¹. Jejich perorální podávání (např.

s vitaminem C) má preventivní účinky vůči poškození pokožky ultrafialovým zářením; chrání člověka před vývo- jem erytému a depozicí melaninu⁴². Proanthocyanidiny semen révy chrání buňky lidského očního epitelu před oxidačním stresem cestou snížení aktivity NF-κB (skupina transkripčních faktorů, které se váží na promotory RNA polymerasy II a ovlivňují expresi genů důležitých pro imunitu, zánět, buněčný růst a buněčnou smrt a další významné procesy) a proteinové exprese MAPK (mitogen activated protein kinase). Proanthocyanidiny snižují hladi- nu H2O2 v buňkách s indukovanou apoptózou a snižují také úroveň tvorby ROS⁴³ (reaktivní kyslíkaté částice).

Procyanidinové oligomery epikatechinové série mají kro- mě scavengerové aktivity schopnost inhibovat aktivitu DNA polymerasy⁴¹.

4.2. Chelatace přechodných kovů

Přechodné kovy, např. železo nebo měď, mají v organismu řadu funkcí. Důležitou fyziologickou roli mají např. jako kofaktory antioxidačních enzymů. Obvykle jsou navázány na proteiny, např. ferritin nebo cerulo-

O

OH

OH

OH HO

OH

O O

OH

OH OH

O

O

O

OH HO

OH

O O

OH

OH OH + EGCG

EGCG EGCG chinon

O

HO HO

OH

OH

OH O HO O

HO OH

O

OH

OH

OH HO

OH

O O

OH

OH OH EGCG dimer oxidace

Obr. 4. Polyfenolová reakce epigallokatechin-gallátu (EGCG)

plazmin. Vyskytují-li se ale volně, mohou katalyzovat radikálové reakce. Jedná se např. o známou Fentonovu reakci:

Fe²⁺ + H2O2 → Fe³⁺ + OH^ +HO•

Existuje řada studií, které prokázaly chelatační půso- bení polyfenolů, zejména flavonoidů⁴⁴. Stejným mechanis- mem mohou působit také čajové katechiny⁴⁵. Další studie potvrdila, že chelatace železa a inhibice Fentonovy reakce se podílí na vysoké antioxidační aktivitě procyanidinů z listů vinné révy (Vitis vinifera L., Vitaceae; přípravek Leucoselect^®)⁴⁶.

Schopnost chelatovat kovy byla prokázána také studií, která se zabývala stabilitou komplexů proanthocyanidinů s hlinitými ionty. Tato studie potvrdila, že pro chelatační aktivitu je důležitá přítomnost fenolových skupin, obzvláš- tě v o-poloze B-kruhu. Stabilita komplexů také rostla se zvyšujícím se stupněm polymerace⁴⁷.

Nedávná studie zabývající se možným pozitivním vlivem oligomerních proanthocyanidinů na neurotoxicitu u krys vyvolanou olovem poskytla nejednoznačné výsled- ky. Proanthocyanidiny sice vykazovaly antioxidační a chelatační aktivitu in vitro, nicméně nedocházelo k snížení toxicity in vivo a dokonce docházelo ke kumulaci Pb²⁺ v některých orgánech⁴⁸.

4.3. Inhibice enzymů

Mezi způsoby antioxidačního působení se řadí také inhibice prooxidačních enzymů. Třísloviny mohou snižo- vat tvorbu NO inhibicí synthas oxidu dusnatého (NOS).

Proti mozkové NOS působily např. oligomerní proantho- cyanidiny izolované z chmele (Humulus lupulus L., Can- nabaceae). Tato studie testovala chmelové monomerní katechiny až oktamerní procyanidiny. Nejúčinnější byl procyanidin B-2, zatímco procyanidin B-3, a katechiny enzym neinhibovaly⁴⁹.

Několik studií se zabývalo také působením taninů na lipoxygenasy (LOX), které mohou poškozovat lipidy membrán. Bylo zjištěno, že vysokou inhibiční aktivitu mají např. taniny izolované z mořské hnědé řasy Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell (Lessoniaceae) tzv. florotani- ny. Působily dokonce silněji než známý inhibitor LOX epigallokatechin-gallát⁵⁰ (obr. 4). Vliv polymerace na inhibici 5-LOX byl ukázán u procyanidinů kakaa (Theo- broma cacao L., Sterculiaceae). Kromě ()-epikatechinu byly aktivní dimery, méně pak trimery až pentamery.

Vyšší procyanidiny už byly téměř neaktivní⁵¹.

Výsledky studií s Pycnogenolem^® prokázaly inhibici prooxidačních enzymů křenové peroxidasy, LOX, i NOS a xanthinoxidasy. Inhibice těchto enzymů je pravděpodob- ně nespecifická a je dána vysokou afinitou polyfenolů k proteinům^40,52. Nekompetitivní inhibice enzymů byla popsána také u jiných rostlinných extraktů. Např. pro- cyanidiny vinné révy inhibovaly xanthinoxidasu, proteoly- tické enzymy elastasu a kolagenasu a také B-gluku- ronidasu a hyaluronidasu⁴⁶. Proanthocyanidiny semen révy chrání buňky lidského očního epitelu před oxidačním stre-

sem cestou snížení aktivity NF-κB a proteinové exprese MAPK. Proanthocyanidiny snižují hladinu H2O2

v buňkách s indukovanou apoptózou a snižují také úroveň tvorby ROS (cit.⁴³).

4.4. Peroxidace lipidů

Peroxidace lipidů patří mezi závažné patologické pochody. Tento proces se podílí například na oxidační přeměně LDL (lipoproteiny s nízkou hustotou) a následné tvorbě aterosklerotických lézí⁵³. Bylo zjištěno, že proant- hocyanidiny mohou chránit LDL před oxidací. Je to např.

uváděno u hlavních obsahových látek kakaových zrn, anti- oxidačně účinných katechinů a jejich oligomerů. Jejich schopnost zabraňovat oxidaci LDL klesala v tomto pořadí:

cinnamtannin A-2 ~ procyanidin C-1 > procyanidin B-2 >

(+)-katechin > ()-epikatechin. Míra jejich antioxidačního účinku byla tedy podmíněna velikostí molekuly a počtem hydroxylových skupin⁵⁴.

Obecně se dá říci, že látky, které zabraňují lipidové peroxidaci působí mechanismem zhášení iniciačních radi- kálů (hydroxyl), nebo již vzniklých oxidačních produktů (peroxyl, alkoxyl). Uplatňovat se může i chelatace iontů přechodných kovů.

Mezi kondenzované třísloviny, které inhibují lipido- vou peroxidaci, patří např. trimerní cinnamtannin B-1 (obr. 5). Tato sloučenina byla izolována spolu s dalšími pěti proanthocyanidiny např. z brusinky (Rhodococcum vitis-idaea L., Vaccinaceae); přípravek Avrorin^®) a podro- bena studii, která hodnotila inhibici lipidové peroxidace.

Z celé skupiny proanthocyanidinů byl cinnamtannin B-1 vyhodnocen jako nejúčinnější³⁵.

Zábranu peroxidace lipidů vykázaly na zdravých dob- rovolnících proanthocyanidiny z exokarpu plodů acai (Euterpe oleracea Mart., Arecaceae), jejíž plody jsou vý- znamnou potravinou v Jižní Americe⁵⁵.

Obr. 5. Cinnamtannin B-1, trimerní proanthocyanidin brusi- nek (Rhodococcum vitis-idaea L.)

Řada polyfenolových látek má schopnost zasáhnout do mechanismu antioxidace komplexním způsobem. Patří mezi ně polyfenoly a flavan-3-oly zeleného čaje, které mají silnou antioxidační aktivitu⁵⁶. Tento fakt je velmi významný z hlediska ochrany živočišných tkání využitím vhodných stravovacích návyků.

5. Další biologické účinky

Proanthocyanidiny mají řadu dalších biologických účinků prakticky využitelných, protože jsou tyto látky přítomny v běžných pochutinách a také v různém ovoci.

Kondenzované třísloviny jsou známé také díky svým protinádorovým vlastnostem. Mechanismus tohoto půso- bení však není stále uspokojivě vysvětlen. Uplatňovat se může už zmíněná antioxidační aktivita. Třísloviny mohou potlačit oxidační stres, který je významný v patogenezi zhoubného bujení a ovlivňuje apoptózu buněk. Tato induk- ce apoptózy a antitumorová aktivita oligomerních proant- hocyanidinů byla prokázána např. u buněčné linie SNU-C4 kolorektálního karcinomu⁵⁷. Proanthocyanidiny z kůry Pinus caribea Morelet (Pinaceae) získané vodnou extrakcí mají silnou inhibiční aktivitu na linie neoplastických bu- něk HL-60, BGC-823 (lidský adenokarcinom žaludku) a BEL-7402 (lidský hepatocelulární karcinom), nejsou však účinné na buňky A549 (lidský plicní karcinom). Pou- žije-li se však k extrakci ethanol, pak je proanthocyanidi- nová frakce účinná⁵⁸ jen na buňky HL-60 a BGC-823.

Procyanidiny z plodů Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach indukují apoptózu v liniích Caco-2 (lidský karcinom tračníku) zásahem do polymerace DNA⁵⁹. Při sledování vlivu polohy esterifikace proanthocyanidinu B2 na androgen dependentní buňky karcinomu lidské prostaty LNCaP se ukázalo, že esterifikace galoylem v poloze C-3’

je z hlediska tlumení růstu nádorových buněk účinnější než galoyl-diester v poloze C-3 (cit.⁶⁰).

Třísloviny jsou považovány za látky nemutagenní, naopak u některých byla uvedena antimutagenní aktivita.

Ta byla popsána např. u inhibice pyridinem indukované mutagenity u proanthocyanidinů kakaa⁶¹.

Mezi významné vlastnosti proanthocyanidinů se řadí i jejich protizánětlivý účinek. Mechanismus tohoto půso- bení ale také není úplně objasněn. Je to dáno komplexní povahou zánětlivých procesů a tím i mnoha možnostmi jejich ovlivnění. Řada prací, které se zabývaly protizánětli- vým účinkem tříslovin, se zaměřila na jejich antioxidační aktivitu a ovlivnění NF-κB, který je důležitým regulátorem genové exprese a podporuje transkripci mnoha zánětlivých mediátorů. Z kondenzovaných tříslovin byla inhibice NF- κB a snížení produkce NO prokázány např. u dimerních procyanidinů, zatímco trimerní procyanidin C-2 působil opačně. Tento výsledek ukazuje také na důležitost vlivu struktury a polymerace na aktivitu uvedených sloučenin⁶². Komerčně využívaná směs proanthocyanidinů a jejich monomerních jednotek – Pycnogenol^® – působí také proti- zánětlivě⁶³. U experimentálního zánětu slinivky, sledova- ného na potkanu se ukázalo, že proanthocyanidiny tlumí

tvorbu prozánětlivých cytokinů (TNF-; tumor nekrotizu- jící faktor a IL-1; interleukin 1)⁶⁴ a mohly by se tak příznivě uplatnit jako doplňkový prostředek při ovlivňová- ní této choroby. Extrakt ze semen vinné révy má výrazné antinociceptivní účinky (myš); nebylo však prokázáno, že by ovlivňoval opioidergní systém⁶⁵. Bylo také zjištěno, že procyanidiny B1 a B2 disponují protizánětlivou aktivitou in vitro a mohou fungovat jako inhibitory exprese prozánět- livých genů na základě ovlivnění transkripčních procesů⁶⁶.

Kardioprotektivní působení proanthocyanidinů nastá- vá v důsledku jejich antioxidačních vlastností, schopnosti vasorelaxace, inhibice agregace trombocytů a ochraně proti ischemicko-reperfuzním poškozením^67,68. Proantho- cyanidiny z potravy a nápojů mohou účinně chránit funkč- nost vaskulárního endotelu, protože tlumí produkci endote- linu-1 a brání tak rozvoji aterosklerózy⁶⁹. Těmto účinkům, které jsou spojeny nejen s antioxidačním, ale také např.

protizánětlivým působením, byly věnovány různé přehle- dové studie⁷⁰.

Proanthocyanidiny mohou také inhibovat systém re- nin-angiotensin-aldosteron působením na ACE, nebo anta- gonismem na angiotensinovém receptoru. Inhibice ACE oligomerními proanthocyanidiny je úzce spojena s jejich strukturou a zvyšovala se s počtem podjednotek a mírou jejich hydroxylace, které podmiňují schopnost adsorbce na povrch proteinu. K nejaktivnějším inhibitorům patřily tetramery a hexamery⁷¹.

Proanthocyanidiny působí preventivně proti vývoji inzulinové rezistence, metabolickému syndromu a mohou příznivě ovlivnit průběh diabetes mellitus 2. typu⁷².

U některých proanthocyanidinů z ovoce (a také antho- cyanů) byla zjištěna schopnost inhibovat aktivitu monoa- minoxidas A a B (cit.⁷³). Do jaké míry se mohou tyto látky reálně uplatnit v inhibici aktivity těchto enzymů a ovlivňo- vat tak etiologii deprese, strachu a neurodegenerativní onemocnění, není prozatím známo.

Řadou studií bylo prokázáno, že kondenzované tříslo- viny z různých rostlinných zdrojů inhibují aktivitu steroid- ní 5-reduktasy, která hraje významnou roli v benigní hyperplazii prostaty⁷⁴. Používání těchto proanthocyanidinů (které mají většinou protizánětlivé účinky) jako doplňko- vého prostředku k běžné terapii může velmi výrazně zlep- šit stav pacienta.

6. Závěr

Kondenzované třísloviny (proanthocyanidiny) jako přírodní polyfenolové sloučeniny obsažené v mnoha potra- vinách (např. ovoce, čaj, čokoláda) přinášejí po konzumaci těchto potravin a pochutin velmi příznivý zdravotní efekt.

Jsou ve většině případů účinnými antioxidanty (zasahují do metabolismu různých reaktivních forem kyslíku a dusí- ku) a mohou tak působit preventivně (a do jisté míry i terapeuticky) při ovlivňování zánětlivých procesů, vzniku a vývoji zhoubného bujení, poškození kardiovaskulárního systému a jiných civilizačních chorob.

Práce vznikla za podpory grantu Univerzity Karlovy č. 17/2012/UNCE.

LITERATURA

1. Bravo L.: Nutr. Rev. 56, 317 (1998).

2. Youdim K. A., Shukitt-Hale B., Joseph J. A.: Free Radical Biol. Med. 37, 1683 (2004).

3. Quideau S., Deffieux D., Douat-Casassus C., Pouy- sege L.: Angew. Chem. 50, 586 (2011).

4. Lachman J., Hamouz K., Orsák M.: Chem. Listy 99, 474 (2005).

5. Palíková I., Valentová K., Rohel J., Kaprálová S., Šimánek V., Ulrichová J.: Chem. Listy 104, 378 (2010).

6. Holasová M., Fiedlerová V.: Chem. Listy 105, 766 (2011).

7. Čopíková J.: Chem. Listy 95, 610 (2001).

8. Hara Y.: Green Tea. Health Benefits and Applicati- ons. Marcel Dekker, New York-Basel 2001.

9. Nádaský P., Šmogrovičová D.: Chem. Listy 104, 838 (2010).

10. Réblová Z.: Chem. Listy 105, 667 (2011).

11. Zámostný P., Kurc L.: Chem. Listy 105, 458 (2011).

12. Bate-Smith E. C., Swain T., v knize: Comparative Biochemistry (Mason H. S., Florkin A. M., ed.), sv. 3, str. 764. Academic Press, New York 1957.

13. Ferreira D., Slade D.: Nat. Prod. Rep. 19, 517 (2002).

14. De Bruyne T., Hermans N., Apers S., Berghe D. V., Vlietinck A. J.: Curr. Med. Chem. 11, 1345 (2004).

15. Xie D. Y., Dixon R. A.: Phytochemistry 66, 2127 (2005).

16. Scalbert A., Williamson G.: J. Nutr. 130, 2073 (2000).

17. Ross J. A., Kasum Ch. M.: Annu. Rev. Nutr. 22, 19 (2002).

18. Deprez S., Mila I., Huneau J. F., Tome D., Scalbert A.: Antioxid. Redox. Sign. 3, 957 (2001).

19. Neilson A. P., Ferruzi M. G.: Annu. Rev. Food Sci.

Technol. 2011, 125.

20. Appeldoorn M. M., Vincken J. P., Gruppen H., Holl- man P. C. H.: J. Nutr. 139, 1469 (2009).

21. Spencer J. P. E., Chaudry F., Pannala A. S., Srai S. K., Debnam E., Rice-Evans C.: Biochem. Biophys. Res.

Commun. 272, 236 (2000).

22. Rios L. Y., Bennett R. N., Lazarus S. A., Remesy C., Scalbert A., Williamson G.: Am. J. Clin. Nutr. 76, 1106 (2002).

23. Spencer J. P. E., Schroeter H., Shenoy B., Srai S. K.

S., Debnam E. S., Rice-Evans C.: Biochem. Biophys.

Res. Commun. 285, 588 (2001).

24. Baba S., Osakabe N., Natsume M., Terao J.: Free Ra- dical Biol. Med. 33, 142 (2002).

25. Deprez S., Brezillon C., Rabot S., Philippe C., Mila I., Lapierre C., Scalbert A.: J. Nutr. 130, 2733 (2000).

26. Riedl K. M., Hagerman A. E.: J. Agric. Food Chem.

49, 4917 (2001).

27. Appeldoorn M. M., Vincken J. L., Aura A. M., Holl- man P. C. H., Gruppen H.: J. Agric. Food Chem. 57, 1084 (2009).

28. Saura-Calixto F., Perez-Jimenez J., Tourino S., Serra- no J., Fuguet E., Torres J. L., Goni I.: Mol. Nutr. Food Res. 54, 939 (2010).

29. Monagas M., Urpi-Sarda M., Sanchez-Patan F., Llo- rach R., Garrido I., Gomez-Cordovez C., Andreas- Lacueva C., Bartolome B.: Food Funct. 1, 233 (2010).

30. Jiao R., Zhang Z., Yu H., Huang Y., Che Z. Y.: J.

Nutr. Biochem. 21, 1134 (2010).

31. Storz P.: Front. Biosci. 10, 1881 (2005).

32. Miller N. J., Rice-Evans C. A.: Redox Rep. 2, 161 (1996).

33. Cai Y. Z., Sun M., Xing J., Luo Q., Corke H.: Life Sci. 78, 2872 (2006).

34. Plumb G. W., De Pascual-Teresa S., Santos-Buelga C., Cheynier V., Williamson G.: Free Radical Res. 29, 351 (1998).

35. Ho K. Y., Huang J. S., Tsai C. C., Lin T. C., Hsu Y.

F., Lin C. C.: J. Pharm. Pharmacol. 51, 1075 (1999).

36. Bors W., Michel C.: Free Radical Biol. Med. 27, 1413 (1999).

37. Goncalves C., Dinis, T., Batista M. T.: Phytochemis- try 66, 89 (2005).

38. Soobratteea M. A., Neergheen V. S., Luximon- Ramma A., Aruoma O. I., Bahorun T.: Mutat. Res., Fundam. Mol. Mech. Mutagen. 579, 200 (2005).

39. Bors W., Michel C., Stettmaier K.: Arch. Biochem.

Biophys. 374, 347 (2000).

40. Packer L., Rimbach G., Virgili F.: Free Radical Biol.

Med. 27, 704 (1999).

41. Saito A., Mizushina Y., Tanaka A., Nakajima N.:

Tetrahedron 65, 7422 (2009).

42. Nakano T.: PCT Int. Appl., WO 2009020192 (2009).

43. Jia Z., Song Z., Zhao Y., Wang X., Liu P.: Mol. Visi- on 2011, 210.

44. Moran J. F., Klucas R. V., Grayer R. J., Abian J., Be- cana, M.: Free Radical Biol. Med. 22, 861 (1997).

45. Grinberg L. N., Newmark H., Kitrossky N., Rahamim E., Chevion M., Rachmilewitz E. A.: Biochem. Phar- macol. 54, 973 (1997).

46. Maffei-Facino R., Carini M., Aldini G., Bombardelli E., Morazzoni P., Morelli R.: Arzneimittelforsch. 44, 592 (1994).

47. Yoneda S., Nakatsubo F.: J. Wood Chem. Technol.

18, 193 (1998).

48. Zhang J., Wang X. F., Lu Z. B., Liu N. Q., Zhao B.

L.: Free Radical Biol. Med. 37, 1037 (2004).

49. Stevens J. F., Miranda C. L., Wolthers K. R., Schi- merlik M., Deinzer M. L., Buhler D. R.: J. Agric. Fo- od Chem. 50, 3435 (2002).

50. Shibata T., Nagayama K., Tanaka R., Yamaguchi K., Nakamura T.: J. Appl. Phycol. 15, 61 (2003).

51. Schewe T, Kuhn H., Sies H.: J. Nutr. 132, 1825 (2002).

52. Moini H., Guo Q., Packer L.: J. Agric. Food Chem.

48, 5630 (2000).

53. Witztum J. L.: Lancet 344, 793 (1994).

54. Osakabe N., Yasuda A., Natsume M., Takizawa T., Terao J., Kondo K.: Exp. Biol. Med. 227, 51 (2002).

55. Schauss A. G., Jensen G. S., Wu X.: Acta Hort. 2009, 97.

56. Molan A. L., De S., Meagher L.: Int. J. Food Sci. Nu- tr. 60, 497 (2009).

57. Kim Y. J., Park H. J., Yoon S. H., Kim M. J., Leem K.

H., Chung J. H., Kim H. K.: World J. Gastroenterol.

11, 4674 (2005).

58. Zhang Z., Du X., Wang F.: Nat. Prod. Res. 23, 696 (2009).

59. Gorlach S., Wagner W., Podsedek A., Szewczyk K., Kozielkiewicz M., Dastych J.: Nutr. Cancer 63, 1348 (2011).

60. Chou S. Ch., Kaur M., Thompson J. A., Agarwal R., Agarwal Ch.: Pharm. Res. 27, 619 (2010).

61. Smith S. H., Tate P. L., Huang G., Magee J. B., Mee- pagala K. M., Wedge D. E., Larcom L. L.: J. Med.

Food 7, 450 (2004).

62. Park Y. C., Rimbach G., Saliou C., Valacchi G., Pac- ker L.: FEBS Lett. 465, 93 (2000).

63. D´Andrea G.: Fitoterapia 81, 724 (2010).

64. Akyuz C., Sehirli A. O., Topaloglu U., Ogunc A V., Cetinel S., Sener G.: Gastroenterol. Res. 2, 20 (2009).

65. Uchida S., Hirai K., Hatanaka J., Hanato J., Umegaki K., Yamada S.: Biol. Pharm. Bull. 31, 240 (2008).

66. Jung M., Triebel S., Anke T., Richling E., Erkel G.:

Mol. Nutr. Food Res. 53, 1263 (2009).

67. Mekhfi H., El Haouari M., Bnouham M., Aziz M., Ziyyat A., Legssyer A.: Phytother. Res. 20, 135 (2006).

68. Makdessi S. A., Sweidan H., Jacob R.: Arzneimittel- forsch. 56, 317 (2006).

69. Caton P. W., Pothecary M. R., Lees D. M., Khan N.

Q., Wood E. G., Shoji T., Kanda R., Rull G., Corder R.: J. Agric. Food Chem. 58, 4008 (2010).

70. Aron P., Kennedy J. A.: Mol. Nutr. Food Res. 52, 79 (2008).

71. Ottaviani J. I., Actis-Goretta L., Villordo J. J., Fraga C. G.: Biochimie 88, 359 (2006).

72. Hanhineva K., Torronen R., Bondia-Pons I., Pekkinen J., Kolehmainen M., Mykkanen H., Poutanen K.: Int.

J. Mol. Sci. 2010, 1365.

73. Dreiseitel A., Korte G., Schreier P., Oehme A., Lo- cher S., Domani M., Hajak G., Sand P. G.: Pharmacol.

Res. 59, 306 (2009).

74. Liu J., Ando R., Shimizu K., Hashida K., Makino R., Ohara S., Kondo R.: J. Wood Sci. 54, 66 (2008).

V. Kolečkář^a,c, Z. Řeháková^a, E. Brojerová^a, K. Kuča^c, D. Jun^c, K. Macáková^a,b, L. Opletal^a,b, P.

Drašar^d, L. Jahodář^a, J. Chlebek^a,b, and L. Cahlíková^a,b (^a Department of Pharmaceutical Botany and Ecology,

b ADINACO Research Group, Faculty of Pharmacy, Charles University in Prague, Hradec Králové, ^c Center of Advanced Studies, Faculty of Military Health Sciences, University of Defence, Hradec Králové, ^d Department of Chemistry of Natural Compounds, Institute of Chemical Technology, Prague): Proanthocyanidins and Their Antioxidation Activity

This review summarizes the current knowledge of condensed tannins (proanthocyanidins), their chemical structure, classification and biological effects. These com- pounds are widely distributed in higher plants and are an important part of the human diet. Recent interest in these substances has been stimulated by their potential health benefits, which are believed to arise mainly from their antioxidant activity. The mechanisms of their antioxidation action, like free radical scavenging activity, chelation of transition metals and inhibition of prooxidative enzymes and lipid peroxidation are discussed. Health prevention properties like anticarcinogenic, cardiovascular system preventing and antiinflammatory effects of proanthocya- nidins are also presented. Their health benefit is promis- ing, but additional research on the mechanism of action and metabolic fate after consumption of proanthocyanidins is required.