Bakteriální degradace polyethylenu s prooxidanty
Bc. Andrea ervenková
Diplomová práce
2007
a biodegradace polyethylenu s prooxidanty v prost edí vyzrálého kompostu a p dy.
První sadu vzork tvo ily LDPE a HDPE fólie s prooxidantem na bázi železa a kobaltu, které byly již d íve podrobeny abiotické oxidaci.
Biodegradace byla sledována pomocí stanovení plynných produkt procesu pomocí plynové chromatografie. U t chto vzork byl zaznamenán pouze nízký stupe biodegradace, kdy u LDPE bylo dosaženo cca 1,5 % mineralizace a cca 3,3 % u HDPE po 189 denní inkubaci v p ípad p dních podmínek a asi 3,6 % mineralizace u LDPE a 3,5 % u HDPE po 356 dnech v p ípad kompostovacích podmínek.
Druhou sadu vzork tvo ily LDPE a HDPE fólie s prooxidantem na bázi manganu. Vzorky byly podrobeny abiotické termooxidaci, p i emž se ukázalo, že pouze LDPE fólie se oxiduje o ekávaným zp sobem. P dní a kompostovací testy biodegradability byly provád ny pouze s LDPE fólií, která byla termooxidována p i 70°C po dobu 40 a 80 dní do r zného stupn zoxidování. Po 55 denní inkubaci v prost edí p dy bylo dosaženo 2,7 % mineralizace u LDPE(40) a 3,1 % u LDPE(80). V p ípad kompostovacích podmínek bylo za 69 dní dosaženo 6,3 % mineralizace u LDPE(40) a 7,1 % u LDPE(80), což jsou zajímavé výsledky.
Klí ová slova : polyethylen, prooxidanty, biodegradace.
ABSTRACT
The main goal of the diploma thesis was to monitor processes of abiotic thermo-oxidation and biodegradation of polyethylene with prooxidants in mature compost and soil environments.
The first set of samples consisted of LDPE and HDPE films with iron and cobalt based prooxidants previously subjected to abiotic oxidation.
Biodegradation was followed by gas chromatography determination of gaseous products. The samples showed limited biodegradation only, more
mineralization for LDPE and about 3,5 % for HDPE after 356 days in compost environment.
The second set of samples included LDPE and HDPE films with manganese based prooxidants. The samples were thermo-oxidized first and it was found that only LDPE film underwent oxidation as previously expected. Consequently, soil and compost tests were carried out with the LDPE film, which was during 40 and 80 days thermo-oxidized at 70°C into various degrese of oxidation. In the soil conditions was values of mineralization about 2,7 % for LDPE(40) and 3,1 % for LDPE(80) after 55 days in the soil test and about 6,3 % for LDPE(40) and 7,1 % for LDPE(80) after 69 days in the compost test. Such results could be considered as interesting.
Keywords : polyethylene, prooxidants, biodegradation.
zpracování diplomové práce. Dále d kuji celému kolektivu ÚIOŽP za vytvo ení výborných pracovních podmínek.
ÚVOD ...9
I TEORETICKÁ ÁST ...10
1 DEGRADACE A BIODEGRADACE POLYMER ...11
1.1 DEGRADACE ... 11
1.2 BIODEGRADACE ... 11
1.3 FAKTORY PROST EDÍ OVLIV UJÍCÍ BIODEGRADACI... 13
2 POLYETHYLEN ...14
2.1 VLASTNOSTI POLYETHYLENU ... 14
2.2 SPOT EBA POLYETHYLENU ... 15
2.3 POLYETHYLEN JAKO ODPAD... 15
2.4 DEGRADACE A BIODEGRADACE POLYETHYLENU ... 17
2.5 MODIFIKACE POLYETHYLENU PRODEGRADANTY... 18
3 DEGRADACE POLYETHYLENU S PROOXIDANTY ...20
3.1 ABIOTICKÁ OXIDACE PE S PROOXIDANTY ... 20
3.2 BIODEGRADACE PE S PROOXIDANTY ... 23
4 TESTOVÁNÍ BIODEGRADABILITY POLYMER ...25
4.1 TESTOVÁNÍ BIODEGRADACE V P DNÍM PROST EDÍ ... 25
4.2 TESTOVÁNÍ BIODEGRADABILITY V PROST EDÍ KOMPOSTU... 26
4.3 TESTOVÁNÍ OXO-BIODEGRADABILNÍCH POLYMER ... 27
5 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE...28
II PRAKTICKÁ ÁST ...29
6 EXPERIMENTÁLNÍ ÁST ...30
6.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE, TESTOVANÉ VZORKY A SUBSTRÁTY ... 30
6.1.1 Použité chemikálie a roztoky ...30
6.1.2 Charakteristika testovaných vzork ...32
6.2 POUŽITÉ P ÍSTROJE A VYBAVENÍ ... 33
6.3 PRAKTICKÉ PROVEDENÍ ABIOTICKÉ OXIDACE... 34
6.4 METODY PRO HODNOCENÍ ABIOTICKÉ OXIDACE... 34
6.4.1 Spektroskopie v I oblasti ...34
6.4.2 Mechanická pevnost...35
6.4.3 Identifikace produkt abiotické oxidace pomocí GC-MS ...35
6.5 PRAKTICKÉ PROVEDENÍ AEROBNÍ BIODEGRADACE ... 38
6.5.1 Testovací lahve ...38
6.5.2 Provzduš ovací aparatura ...38
6.5.3 P íprava biodegrada ního testu, doprovodné analýzy a postupy ...39
6.5.7 Monitoring v pr b hu biodegrada ních test ...42
6.6 HODNOCENÍ AEROBNÍ BIODEGRADACE POMOCÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE... 43
6.6.1 Analýza pomocí plynové chromatografie, sestavení kalibra ní závis1osti...43
6.6.2 Zpracování nam ených hodnot ...45
6.7 MIKROSKOPIE VZORK PODROBENÝCH BIODEGRADACI V PROST EDÍ KOMPOSTU... 47
6.8 INTENZITA METABOLISMU BUN K ... 48
6.8.1 Princip m ení ATP ...48
6.8.2 Praktické provedení ...48
7 VÝSLEDKY A DISKUZE ...51
7.1 ABIOTICKÁ OXIDACE... 51
7.1.1 Spektroskopie v I oblasti ...51
7.1.2 Mechanická pevnost...54
7.1.3 Identifikace produkt abiotické oxidace pomocí GC-MS ...59
7.2 AEROBNÍ BIODEGRADACE ... 60
7.2.1 Biodegradace v p dním prost edí ...60
7.2.2 Biodegradace v prost edí kompostu...65
7.2.3 Mikroskopie PE vzork podrobených biodegradaci v prost edí kompostu ...70
7.3 INTENZITA METABOLISMU BUN K ... 71
ZÁV R ...74
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...76
SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOL A ZKRATEK...80
SEZNAM OBRÁZK ...81
SEZNAM TABULEK...83
ÚVOD
V dnešní dob je celý sv t doslova zaplaven odpady z plast . Tato skute nost se stává závažným problémem, nebo syntetické plasty z stávají v p írod nedot eny desítky a možná stovky let. Je to dáno jejich resistencí v i degradaci v prost edí v dob , kdy se plastový výrobek stane odpadem.
Produkty z plast jsou hojn využívány díky jejich výborným mechanickým a fyzikálním vlastnostem a zejména nízkou cenou na trhu. To
dokazuje fakt, že je ro n na celém sv t vyprodukováno n kolik desítek milion tun plastových výrobk . Tato skute nost však s sebou p ináší velkou zát ž v odpadovém hospodá ství, nebo p evážná ást plastových výrobk je ur ena pouze na jedno použití jako obalový materiál. A tak se v tšina plastových výrobk s krátkým cyklem ve spot ebitelské sfé e ocitá na skládkách odpad . Jejich kumulace na skládkách je nežádoucí, nebo zaujímají velké objemy v kontrastu s jejich hmotností. Dalším problémem spojeným s kumulací plastových odpad na skládkách je již zmín ná jejich vysoká odolnost v i degradaci v prost edí. Pokud by tento scéná , to je tedy vysoká produkce plastových výrobk na jedno použití spojená s jejich odolností v prost edí, pokra oval i nadále byli bychom sv dky „poh bívání“ naší planety pod vrstvou plastového odpadu.
V posledních letech je snaha o nalezení kompromisu mezi užitnými vlastnostmi a degradabilitou plast . Pro podporu degradability se plasty nejr zn jšími zp soby modifikují, nap . p ídavkem prooxidant i biodegradabilních plniv. Biodegradace takto upravených plast je i p esto pom rn zdlouhavá a není zcela objasn na, a proto je v této oblasti zapot ebí ješt spousta výzkum . Tyto úpravy s sebou p ináší i obavy ve ejnosti, týkajících se zejména obav z jejich p ed asné degradace b hem cyklu ve spot ebitelské sfé e. Další otázkou je zda cena t chto plast nebude natolik vysoká, aby mohly být spole ností akceptovány a tedy i využívány.
I. TEORETICKÁ ÁST
1 DEGRADACE A BIODEGRADACE POLYMER
1.1 Degradace
Degradace je proces, p i kterém dochází k chemickým a/nebo fyzikálním zm nám polymeru. Tyto zm ny mohou být vyvolány vlivy chemickými, fyzikálními, biologickými a nebo jejich kombinacemi [1].
1.2 Biodegradace
Biodegradace je speciální typ degradace, p i níž dochází k rozkladu organických látek p sobením mikroorganism a jejich enzym . Proces biodegradace m že probíhat za podmínek aerobních nebo anaerobních [2].
Tyto podmínky hrají roli p i tvorb kone ných produkt mineralizace organického substrátu, kdy p i aerobní biodegradaci probíhající za p ítomnosti kyslíku je polymer rozkládán na oxid uhli itý, vodu a minerální soli [3], zatímco výsledným produktem mineralizace organického substrátu za podmínek anaerobních, tedy bez p ítomnosti kyslíku, jsou methan, oxid uhli itý, voda a minerální soli [5].
Princip biodegradace polymer je zobrazen na obrázku (Obr. 1.). Pokud je polymer hydrofobního charakteru p edchází vlastní biodegradaci narušení polymerní struktury vlivem fyzikáln -chemických faktor . Biodegradace je poté zahájena extracelulárními enzymy produkovanými mikroorganismy do vn jšího prost edí. Ú inkem t chto enzym na polymerní et zec dojde k jeho rozšt pení na menší fragmenty, které jsou již snáze transportovány do bun k mikroorganism . V mikrobiálních bu kách jsou pak tyto fragmenty úpln mineralizovány [3].
Obr. 1. Princip biodegradace polymer [3].
Na obrázku (Obr. 2.) je znázorn n rozdílný mechanismus degradace hydro-biodegradabilních a oxo-biodegradabilních polymer , kdy polymery s et zcem obsahující vazby uhlík-kyslík nebo uhlík-dusík mají vyšší schopnost podléhat hydrolýze než polymery obsahující vazby uhlík-uhlík [3]. Mezi hydro-biodegradabilní polymery, které velmi snadno podléhají
hydrolýze, pat í nap íklad celulosa, škrob nebo polyestery.
Oxo-biodegradabilní polymery obsahující pouze vazby uhlík-uhlík jsou rozkládány mechanismem oxida ním, který je vyvolán prodegradantními aditivy, více v kapitole 2.4 a 3.1. Mezi oxo-biodegradabilní polymery m žeme za adit nap íklad lignin nebo polyolefiny [4].
Obr. 2. P íklady rozdílného mechanismu degradace hydro-biodegradabilních a oxo-biodegradabilních polymer [7].
1.3 Faktory prost edí ovliv ující biodegradaci
Biodegradace je proces, který je závislý na podmínkách prost edí, nebo n které mikroorganismy podílející se na biodegradaci vyžadují pro svou innost specifické podmínky.
Rychlost biodegradace je ovlivn na zejména p ítomností živin, vlhkostí, teplotou, intenzitou sv tla, pH a koncentrací kyslíku v prost edí [3]. Dostate ný p ísun živin je nezbytný pro r st mikroorganism , p i jejich nedostatku v prost edí m že dojít k poklesu mikrobiální aktivity.
Dalším limitujícím faktorem prost edí je již zmín ná vlhkost, nebo ve velmi suchých podmínkách m že dojít k dehydrataci mikroorganism a tím tedy i ke snížení mikrobiální aktivity a rychlosti degradace polymeru [8].
Vliv teploty, intenzity sv tla, pH a koncentrace kyslíku na rychlost biodegradace je rozli ný v závislosti na prost edí, ve kterém biodegradace probíhá.
2 POLYETHYLEN
2.1 Vlastnosti polyethylenu
Polyethylen je polymerní látka nepolárního charakteru. Vzniká polymerací ethylenu, co by vstupujícího monomeru. Chemismus reakce, p i
níž dochází ke vzniku polyethylenu probíhá podle rovnice (1) [12].
[
−]
−−
→
= 2 2 2 n
2 CH CH CH
CH
n (1)
V závislosti na podmínkách a charakteru polymerace vznikají rozdílné produkty lišící se mechanickými a fyzikálními vlastnostmi, kdy nap . vysokohustotní polyethylen má vyšší mechanickou odolnost, vyšší odolnost v i rozpoušt dl m a vroucí vod než polyethylen nízkohustotní [10]. P i výrobním procesu se k polyethylenu také p idávají tzv. antioxidanty, které zvyšují jeho odolnost v i degradaci (oxidaci) vlivem prost edí [11].
Nízkohustotní polyethylen, dále jen LDPE, vzniká polymerací radikálovou a je používán jako obalová a zem d lská fólie, trubky, lahve, atd.. Vysokohustotní polyethylen, dále jen HDPE, vzniká polymerací iontovou a jeho výrobky našly uplatn ní jako fólie, mikrotenové sá ky, nádoby, trubky, atd. [10]. Podrobn jší charakteristiky LDPE a HDPE jsou uvedeny v tabulce (Tab. I.).
Tab. I. Charakteristiky LDPE a HDPE [10].
Typ PE Polymerace Hustota [g.cm-3]
Krystalinita [%]
Mw
[g.mol-1]
Tn
[°C]
LDPE radikálová 0,915-
0,925 50-70 30.000-
300.000 105-115
HDPE iontová 0,954-
0,970 65-95 100.000-
200.000. 125-136 kde :
Mw molekulová hmotnost [g.mol- 1] Tn teplota tání [°C]
2.2 Spot eba polyethylenu
Výrobky z polyethylenu jsou spot ebiteli velmi žádané nejen kv li jeho výborným mechanickým a fyzikálním vlastnostem, ale také hlavn díky jeho nízké cen na trhu [6]. V tabulce (Tab. II.). je uvedena celosv tová spot eba polyethylenu za rok 2000 (t/rok).
Tab. II. Celková Spot eba PE na sv t za rok 2000 [12].
Typ PE Spot eba [t/rok]
LDPE 17 000 000
HDPE 23 000 000
LLDPE 14 000 000
Celkem PE 54 000 000
Celkem polymer 154 000 000
2.3 Polyethylen jako odpad
Polyethylenové výrobky jsou na sv tových trzích velmi rozší eny, což p edstavuje nemalý problém v odpadovém hospodá ství, nebo v tšina t chto výrobk je ur ena na jedno použití jako obalový materiál. Vývoj produkce plastových odpad je zobrazen na obrázcích (Obr. 3a, Obr. 4.), kdy bylo nap . v USA v roce 1988 vyprodukováno celkem 163 milion tun pevného komunálního odpadu z n hož 8 % (w/w) tvo il odpad plastový [3], v roce 2005 byl zaznamenán již 11,9 % (w/w) podíl plastového odpadu z celkové produkce 245 milión tun pevného komunálního odpadu [13]. Je tedy pozorován rostoucí trend v produkci plastového odpadu, který není z hlediska stálosti polymeru v prost edí žádoucí.
Obr. 3. Procentuelní zastoupení složek pevného odpadu vyprodukovaného v USA v roce 1988, 3a) hmotnostní procenta, 3b) objemová procenta [3].
Obr. 4. Procentuelní hmotnostní podíl
složek pevného odpadu
vyprodukovaného v USA v roce 2005 [13].
Jednou z výhodných vlastností plastových výrobk pro spot ebitele je jejich nízká specifická hmotnost, která však p edstavuje další problém v odpadovém hospodá ství. Jak je znázorn no na obrázku (Obr. 3.) plastový odpad zaujímající pouze 8 % (w/w) podíl z celkového komunálního odpadu zaujímá až cca 20 % (v/v) [3]. A proto je ukládání plastového odpadu na skládky odpad do budoucna nep ijatelné, nebo díky jejich širokému využívání jsou jimi skládky doslova zaplaveny.
Masivní využívání polyethylenu jako obalového materiálu na jedno použití vede k jeho kumulaci na skládkách odpad , kde setrvává n kolik desítek až stovek let prakticky nedot en. Toto znepokojení s sebou p ináší otázku: Jak nejefektivn ji odstranit polyethylenový odpad z prost edí?
Mezi jednu z možností jak redukovat PE odpad je mechanická recyklace [14], což s sebou p ináší další problém týkající se zne išt ní tohoto odpadu nejr zn jšími kontaminanty a tím tedy i následné zvýšení ekonomických náklad na recyklaci [12]. Další možností jak s PE odpadem nakládat je bu spalování a nebo biodegradace [14]. Biodegradace se zdá být do budoucna jako velmi jednoduché a žádané ešení problematiky redukce PE odpadu.
2.4 Degradace a biodegradace polyethylenu
V 30.letech 20.století byl plastový pr mysl koncentrován na dosažení co nejvyšší stability polymeru, nebo samotný polyethylen byl velmi nestálý a podléhal vliv m prost edí. Tato problematika byla vy ešena p ídavkem anti-oxidant a stabilizátor p i výrobním procesu polyethylenu [12].
Již koncem 80.let 20.století dosáhlo využívání syntetických, inertních a bio-resistentních polymer takové míry, že se stal prioritním problémem v odpadovém hospodá ství [12]. Proto je snaha o nalezení kompromisu mezi výbornými užitnými vlastnostmi polyethylenu a jeho biodegradabilitou v prost edí.
Na obrázku (Obr. 5.) je znázorn n rozdíl mezi t žce biodegradovatelnými a naopak široce využívanými polyolefiny a lehce biodegradovatelnými a naopak mén technologicky využívanými polyestery.
Obr. 5. Rozdílné vztahy mezi technologicky využitelnými polyolefiny a naopak snadno biodegradovatelnými polyestery a polysacharidy [6].
Polyethylen je považován za inertní v i degradaci a biodegradaci ze ty d vod : má vysokou molekulovou hmotnost, je hydrofobní, neobsahuje funk ní skupiny napadnutelné enzymovým vybavením mikroorganism [15], obsahuje antioxidanty a stabilizátory, které zabra ují oxidaci PE vlivem ú ink vn jšího prost edí [16-18]. Vysoká molekulová hmotnost a hydrofobní charakter molekul polyethylenu znemož uje jejich p estup do vodného prost edí a tím tedy i do mikrobiální bu ky [18].
V n kterých publikacích je uvedeno, že molekuly obecn nemohou podléhat biodegradaci, pokud je jejich molekulová hmotnost vyšší než 500 g.mol- 1 [4], a proto by m la být p ed vlastní biodegradací polymeru provedena taková úprava, která by vedla k redukci jeho molekulové hmotnosti.
Tato omezení spojená s degradací a biodegradací polyethylenu mohou být eliminována p ídavkem prodegradantních aditiv jako jsou nap . prooxidanty, v jejichž p ítomnosti se polyethylen stane oxo- biodegradabilní [18], více v kapitole 2.5 a 3.1.
2.5 Modifikace polyethylenu prodegradanty
Pro-degradantní aditiva urychlují degradaci polyethylenu a proto jsou velmi žádoucí p i eliminaci plastového odpadu z prost edí biodegrada ní cestou [19]. V sou asnosti existuje n kolik komer n vyráb ných
degradabilních polyethylen vznikajících bu Guillet, Scott-Gilead nebo Griffin mechanismem [6], jejich p ehled je uveden v tabulce (Tab. III.).
Tab. III. P ehled komer ních degradabilních PE [6].
Modifikace PE Komer ní název
modifikovaného PE V len ní karbonylových skupin kopolymerací
Kopolymery ethylenu a oxidu uhelnatého E-CO
Kopolymery ethylenu a vinylketonu Ecolyte (J. E. Guillet) Oxo-biodegradabilní polymery
Plastor
(G. Scott-D. Gilead) P echodné kovy (pro-oxidanty)
TDPA (firma EPI) PE-škrob
Coloroll
Sm s se škrobem (následn s prooxidanty) St. Lawrence Starch (G. J. L. Griffin)
Modifikace PE Guillet mechanismem je založena na kopolymeraci ethylenu s monomery obsahujícími karbonylovou skupinu [20,21].
V len ním karbonylové skupiny do polymerního et zce se PE stane citlivý v i p sobení UV zá ení [22].
Prooxidanty jsou komplexy p echodných kov zvyšující citlivost polymerního et zce v i termo-oxidaci a nebo foto-oxidaci, více v kap.
3.1 [20].
Polyethylen modifikovaný p ídavkem škrobu je náchylný v i ú inku mikroorganism , kdy je škrob mikroorganismy využit jako zdroj uhlíku, p i emž dojde ke zvýšení porozity polyethylenu a pom ru povrch/objem, jehož výsledkem je ztráta integrity materiálu a možnost potenciální biodegradace polymeru [2]. Degradace a následná biodegradace m že být zintensivn na použitím prooxidant spole n se škrobem [19].
3 DEGRADACE POLYETHYLENU S PROOXIDANTY
Degradace polyethylenu s prooxidanty probíhá ve 2 stupních : Abiotická oxidace
Biodegradace
3.1 Abiotická oxidace PE s prooxidanty
P ítomností prooxidant v polymerním et zci se snižuje odolnost polymeru v i abiotickým vliv m prost edí, kdy prooxidanty p sobí jako katalyzátory fotooxidace a/nebo termooxidace polymeru [3].
Na základ aktivace prooxidant sv tlem nebo teplem dojde k produkci volných radikál v polymerním et zci, které dále reagují s kyslíkem za vzniku hydroperoxid [2,6]. Hydroperoxidy jsou primárními produkty abiotické oxidace polyethylenu, které dále podléhají termolýze a/nebo fotolýze dle obrázku (Obr.6.) [23]. Rozkladem hydroperoxid dochází ke vzniku biodegradabilních nízkomolekulárních oxidovaných produkt jako jsou karboxylové kyseliny, alkoholy, aldehydy, ketony atd. [6,24].
Obr. 6. Mechanismus abiotické oxidace polyethylenu [23].
Jako prooxidanty se nej ast ji používají komplexy p echodných kov železa, manganu, zinku, m di a nebo kobaltu [3]. Fotoiniciátory jsou ty prooxidanty, které jsou aktivovány absorpcí UV zá ení. Mezi n m žeme za adit dithiokarbamáty p echodných kov jako je železo i m . Dithiokarbamát železa zp sobuje v nízkých koncentracích velmi rychlou
fotooxidaci polymeru, avšak funguje i jako stabilizátor polyolefinu v i termooxidaci p i jeho výrob [19]. Naopak je tomu u dithiokarbamátu niklu, který p sobí jako stabilizátor a tudíž k oxidaci PE v jeho p ítomnosti nedochází. V publikaci [20] byl studován vliv prooxidantu dithiokarbamátu železa a sm si dithiokarbamátu niklu a železa na abiotickou oxidaci LDPE. U LDPE s dithiokarbamátem železa byla pozorována jeho velmi rychlá oxidace, zatímco u LDPE se sm sí dithiokarbamát se projevil stabiliza ní ú inek dithiokarbamátu niklu, viz obrázek (Obr. 7.). Teprve až po 800h byl pozorován exponenciální r st karbonylového indexu v p ítomnosti Ni-komplex . Karbonylový index vyjad uje míru oxidace polymeru a je vyjád en jako podíl absorbance karbonylového píku p i 1713 cm- 1 a -CH2- píku p i 1465 cm- 1 [17], více v kapitole 3.3.
Obr. 7. Vliv typu prooxidantu na karbonylový index b hem termooxidace p i 95°C, (a) LDPE obsahující dithiokarbamát železa, (b) LDPE obsahující dithiokarbamáty niklu a železa [20].
Dalšími prooxidanty mohou být acetyl-acetonáty p echodných kov , které též podporují fotooxidaci polymeru, a karboxyláty p echodných kov podporující termooxidaci polymeru [20].
Abiotickou oxidací polyethylenu s prooxidanty dochází ke vzniku polárních skupin v polymerním et zci, v jejichž p ítomnosti ztrácí
polymer hydrofobní charakter [20]. Produkty abiotické oxidace pak tedy mohou p estupovat do vodného prost edí a tím i do bun k mikroorganism [2,16]. Abiotickou oxidací dále dochází k redukci molekulové hmotnosti [3], ztrátám mechanických vlastností [6,25] a k zv tšení aktivního povrchu polymeru [3].
Rychlost abiotické oxidace polyethylenu s prooxidanty je ovlivn na faktory prost edí jako jsou teplota a intenzita sv tla [2,20]. Vliv teploty na rychlost abiotické oxidace byl zkoumán v publikaci [16] a [14]. V první studii byl abiotické oxidaci podroben PE obsahující prooxidant stearát manganu a v druhé PE obsahující prooxidant TDPA (Totally Degradable Plastic Additives) od firmy EPI (Environmental Products) [26]. Ve studii [16] byla termooxidace provedena p i t ech r zných teplotách, které se b žn vyskytují v prost edí kompostu, a to p i 50°C, 60°C a 70°C. Bylo pozorováno, že p i 70°C došlo k poklesu molekulové hmotnosti Mw pod 5000 g.mol- 1 již za 2 týdny, zatímco p i 50°C byl tento pokles zaznamenán až po 70 dnech, viz obrázek (Obr. 8.). V publikaci [14] byl pozorován obdobný vliv teploty na rychlost abiotické oxidace, kdy byla termooxidace provedena p i 55°C a 70°C. Rychlost abiotické oxidace byla vyšší s vyšší teplotou, viz obrázek (Obr. 9 a, b). Po 25-denní oxidaci p i 70°C byl pozorován nár st karbonylového indexu CI z 0,22 na 4,57 a pokles molekulové hmotnosti z 147,7 kg.mol- 1 na 4,5 kg.mol- 1.
Obr. 8. Vliv teploty na rychlost abiotické oxidace PE obsahujícího prooxidant stearát manganu [16].
Obr. 9. Vliv teploty na rychlost abiotické oxidace PE s prooxidantem TDPA, 9a) termooxidace p i 55°C, 9b) termooxidace p i 70°C [14].
Vliv koncentrace kyslíku na abiotickou oxidaci je zanedbatelný. Ve studii [16] byl tento vliv studován a v rozmezí koncentrace kyslíku mezi 5-10 % nebyl pozorován žádný významný vliv na rychlost abiotické oxidace. Avšak jako velmi d ležitým parametrem ovliv ujícím rychlost abiotické oxidace se ukázalo být množství použitého prooxidantu v polymeru [16,18]. Bylo pozorováno, že PE obsahující dvakrát vyšší množství prooxidantu byl rychleji degradován, nebo byl zaznamenán pokles molekulové hmotnosti Mw na 10 kg.mol- 1 již za 11 dní, zatímco u PE s nižším obsahem prooxidantu došlo k tomuto poklesu až za 18 dní [16].
Rychlost a stupe abiotické oxidace polyethylenu je dále také ovlivn n strukturou polyethylenu. Nap íklad v tvení u LDPE je slabým místem v et zci, ve kterém m že velmi snadno docházet k oxidaci, a tudíž m že být LDPE rychleji oxidován než HDPE i LLDPE [14].
3.2 Biodegradace PE s prooxidanty
Biodegradace polyethylenu m že nastat až po jeho zoxidování, kdy abiotickou oxidací dojde k redukci jeho molekulové hmotnosti a ke snížení hydrofobního charakteru v d sledku vzniku polárních skupin [20].
Oxidované produkty abiotické oxidace jsou pak již snáze rozpoznatelné enzymovým vybavením mikroorganism a m že tedy dojít k jeho další degradaci. Biodegradací pak dochází k mineralizaci oxidovaných produkt
na oxid uhli itý, vodu a minerální soli za aerobních podmínek [27].
Biodegradace oxidovaného polyethylenu byla zkoumána již v n kolika publikacích, kdy se v tšinou jednalo o simulované biodegrada ní testy v prost edí kompostu nebo p dy.
V publikaci [16] byl podroben oxidovaný PE obsahující prooxidant stearát manganu biodegradaci v p dním prost edí, které bylo složeno z 90% rašeliny a 10% vyzrálého kompostu, inkubace byla provedena p i konstantní teplot 60°C. Za 180 dní bylo dosaženo 60% mineralizace PE.
Obdobných výsledk bylo dosaženo i v publikaci [15], kdy byl testován oxidovaný LDPE s prooxidantem TDPA. V p dním prost edí bylo dosaženo 50-60 % mineralizace za 18 m síc a v prost edí vyzrálého kompostu bylo dosaženo 27,8 % mineralizace za 426 dn inkubace [15].
4 TESTOVÁNÍ BIODEGRADABILITY POLYMER
Testy pro ur ení biodegradability polymer v r zných prost edí jsou již v dnešní dob normovány. Na tvorb norem se v této oblasti podílí ada institucí [28] :
American Society for Testing and Materials (ASTM), International Standards Organisation (ISO),
European Standardization Committee (CEN), Institute for Standards Research (ISR),
Organic Reclamation and Composting Association (ORCA).
Testování rychlosti biodegradace polymer je velmi rozdílné v závislosti na r zných prost edích. Biodegrada ní testy mohou být provád ny jak v p irozeném tak v simulovaném prost edí. Testy probíhající v simulovaném prost edí mohou probíhat zcela odlišn jako v prost edí p irozeném, nebo v simulovaném prost edí se nepo ítá s p írodními výkyvy teplot, vlhkosti i intenzitou zá ení. Rozdíly v rychlosti biodegradace polymeru nejsou ovliv ovány jen prost edím, ale také rozdílnou tlouš kou a stupn m zoxidování testovaných polymer . D ležité je i zhodnocení produkt biodegradace polymeru, které by nem ly kontaminovat prost edí a nebo být toxické pro živé organismy [29].
Testování biodegradability polymer m že být realizováno v prost edí kompostu i p dy, anaerobním prost edí, sladké, mo ské nebo odpadní vod [28].
4.1 Testování biodegradace v p dním prost edí
Podle ASTM jsou definovány dv standardní metody pro testování biodegradace polymer v p dním prost edí a to Soil Contact Test a Soil Burial Test [15, 28, 30]. Jedná se o statické testy, p i kterých je využito p dy co by vhodného prost edí pro biodegradaci. P dní substrát je zdrojem mezofilních a psychrofilních bakterií, které degradují polymer až na oxid uhli itý. Testy jsou realizovány za pokojové teploty ve tm [15].
Rychle biodegradabilní materiál m že být podle této normy odstran n za 30 až 60 dní. Pokud tento test poskytuje negativní výsledky pak by m ly být potvrzeny testem v prost edí kompostu za termofilních podmínek, viz kapitola 4.2 [30].
4.2 Testování biodegradability v prost edí kompostu
Kompostování je ízený aerobní proces biologického rozkladu biodegradabilního materiálu na oxid uhli itý, vodu, minerály a humus.
Jedná se o p irozený proces vedoucí ke stabilizaci sm si rozložitelného organického materiálu [30].
ASTM D5338 je norma pro testování biodegradability polymer v prost edí kompostu. Tato metoda je založena na sledování biodegradace polymerních materiál za podmínek ízeného kompostování. Polymer je
smíchán s vyzrálým kompostem a inkubován v teplotním cyklu 35-58-50-35°C ve tm . V pr b hu testu je monitorována produkce oxidu
uhli itého a je zaznamenávána úm rn k slepým kontrolám (obsahující pouze vyzrálý kompost). Procento biodegradace je pak ur eno dle rovnic uvedených v kapitole 6.6.2. Za pozitivní výsledky se podle této normy ozna ují ty, p i nichž bylo dosaženo 60 % mineralizace polymeru za 6 m síc [28].
Další normou v oblasti testování biodegradability v prost edí kompostu je ISO 14855, která je realizována obdobným zp sobem jako norma ASTM D5338 avšak s tím rozdílem, že inkubace je zde provád na p i konstantní teplot 58°C [28].
Rychlost biodegradace v prost edí kompostu je ovlivn na zejména p ítomností živin, vlhkostí a koncentrací kyslíku [8]. P i nedostatku živin dojde k snížení rychlosti biodegradace, nebo živiny jsou d ležité pro r st a množení mikroorganism p ítomných v prost edí kompostu. D ležitým faktorem prost edí je i vlhkost, nebo p íliš mnoho vlhkosti vytvá í anaerobní podmínky a naopak sucho vede k dehydrataci mikroorganism . Vzhledem k tomu, že je kompostování aerobní proces je dostate ný p ísun kyslíku nezbytný.
4.3 Testování oxo-biodegradabilních polymer
ASTM D6954 je nová technická norma týkající abiotické oxidace materiálu a jeho následné biodegradace v biotickém prost edí. Jako první z norem na biodegradabilitu polymer zd raz uje význam abiotické oxidace. Na rozdíl od normy ASTM D5338, kde jsou za pozitivní výsledky uznávány pouze ty, které dosáhly 60% mineralizace materiálu za 6 m síc , je norma ASTM D6954 v tomto mírn jší. Zde musí též polymery dosáhnout 60% mineralizace, avšak za dobu neomezenou [31].
5 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE
Cílem diplomové práce je studium abiotické oxidace a biodegradace oxidovaného polyethylenu s prooxidanty. Abiotická oxidace byla sledována pomocí FTIR spekter a m ením mechanické pevnosti oxidovaného PE s prooxidanty. Biodegradace oxidovaného PE s prooxidanty byla realizována v prost edí p dy a vyzrálého kompostu. Míra biodegradace PE s prooxidanty byla sledována analýzou oxidu uhli itého pomocí plynové chromatografie.
II. PRAKTICKÁ ÁST
6 EXPERIMENTÁLNÍ ÁST
6.1 Použité chemikálie, testované vzorky a substráty
6.1.1 Použité chemikálie a roztoky
P i laboratorních pokusech byly použity chemikálie istoty p.a. od firmy Penta, Lachema, Fluka a PARK : difosfore nan sodný dekahydrát, formaldehyd, glutaraldehyd, hexan, roztok chloridu rtu natého, chlorid sodný, kyselina chlorovodíková, methanol, uhli itan draselný, minerální olej.
Filtra ní papír od firmy Papírna Pernštejn s.r.o.
Souprava inidel pro stanovení ATP od firmy BioThema AB.
Nosný plyn He o istot 4.6 od firmy Linde Technoplyn a.s.
Sm sný syntetický plyn od firmy Linde Gas a.s. :
(1) obsahující CH4 (4,04 obj.%), CO2 (0,818 obj.%) a N2
(95,142 obj.%)
(2) obsahující CH4 (4,07 obj.%), CO2 (0,815 obj.%) a N2
(95,115 obj.%).
Minerální médium
Zásobní roztoky pro p ípravu minerálního média byly p ipraveny rozpušt ním níže uvedených složek v 1 l destilované vody.
A. 9,078 g KH2PO4 dihydrogenfosfore nan draselný B. 23,9028 g Na2HPO4.12H2O hydrogenfosfore nan sodný
dodekahydrát
C. 10 g MgSO4.7H2O síran ho e natý heptahydrát
D. 3 g Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O síran železnatoamonný hexahydrát E. 1g CaCl2.2H2O chlorid vápenatý dihydrát
F. 50 g NaCl chlorid vápenatý
G. 30 g NH4Cl chlorid amonný H. roztok stopových prvk
0,043 g MnSO4.5H2O síran manganatý tetrahydrát 0,057 g H3BO3 kyselina boritá
0,043 g ZnSO4.7H2O síran zine natý heptahydrát 0,037 g (NH4)6Mo7O2 4.4H2O molybdenan amonný tetrahydrát 0,025 g Co(NO3)2.6H2O dusi nan kobaltnatý hexahydrát 0,040 g CuSO4.5H2O síran m natý pentahydrát
Roztok minerálního média byl p ipraven z výše uvedených zásobních roztok . Pro p ípravu 100 ml minerálního média byly dávkovány následující objemy zásobních roztok : 4 ml A; 16 ml B; 0,2 ml C; po 1 ml roztoku D, E, F, G a 0,1 ml roztoku stopových prvk H. Vzniklý roztok byl dopln n destilovanou vodou na celkový objem 100 ml a vše bylo d kladn promícháno. Jako kontrola správnosti p ípravy bylo provedeno m ení pH, jehož hodnota byla 7,3.
Suspenda ní roztok
Suspenda ní roztok se využívá k p evedení p dních bakterií do roztoku.
Pro p ípravu 100 ml suspenda ního roztoku bylo dávkováno : A. 0,4 g Na4P2O7.10H2O difosfore nan sodný dekahydrát B. 0,15 g TWEEN 80
Výše uvedené složky A a B byly naváženy do láhve, poté bylo p idáno 100 ml minerálního média a 2-3 sklen né kuli ky. Nakonec byl vzniklý roztok d kladn promíchán a vysterilizován v autoklávu po dobu 20 minut p i 120°C.
Fyziologický roztok (8,5 g.l-1)
Pro p ípravu 50 ml fyziologického roztoku o koncentraci 8,5 g.l- 1 bylo do 50 ml odm rné ba ky diferen n naváženo 0,43 g NaCl s p esností
± 0,01 g a p idáno cca 25 ml destilované vody. Po rozpušt ní NaCl byl roztok dopln n destilovanou vodou po rysku a d kladn promíchán.
Fixa ní roztok
Fixa ní roztok sloužil k zafixování bakterií a plísní na povrchu vzork PE fólií, které byly odebrány z biodegrada ního testu v prost edí kom- postu.
Pro p ípravu 50 ml fixa ního roztoku bylo dávkováno : A. 5,5 ml 36 - 38 % roztok HCOH formaldehyd B. 1 ml 50 % roztok C5H8O2 glutaraldehyd
Složky A a B byly dávkovány v takových objemech, aby výsledný fixa ní roztok obsahoval 4 % formaldehydu a 1 % glutaraldehydu. Roztok byl tedy p ipraven nadávkováním složek A a B do 50 ml odm rné ba ky a dopln ním fyziologickým roztokem (8,5 g.l- 1) po rysku. Vzniklý roztok byl nakonec d kladn promíchán.
6.1.2 Charakteristika testovaných vzork
LDPE1
LDPE transparentní fólie o tlouš ce 60 m obsahující prooxidant na bázi železa a kobaltu [32]. Vzorek byl již v minulosti podroben abiotické oxidaci, viz publikace [32], která byla provedena po dobu 3 letních m síc ( erven - srpen) tak, že byl vzorek vystaven p sobení slune ního zá ení a pov trnostním vliv m v klimatických podmínkách jižní Francie.
HDPE1
HDPE transparentní fólie o tlouš ce 20 m obsahující stejný typ prooxidantu jako vzorek LDPE1 [32]. Vzorek HDPE1 byl též v minulosti
vystaven abiotické oxidaci stejným zp sobem jako vzorek LDPE1. LDPE2
LDPE transparentní fólie od firmy Granitol a.s. o tlouš ce 50-55 m, obsahující prooxidant na bázi manganu Addiflex HE (5 %) a 15 % plniva Omydlen 2021 P (mikromletý vápenec).
LDPE2(40)
Vzorek LDPE2 abioticky oxidovaný p i 70°C po dobu 40 dní.
LDPE2(80)
Vzorek LDPE2 abioticky oxidovaný p i 70°C po dobu 80 dní.
HDPE2
HDPE transparentní fólie od firmy Granitol a.s. o tlouš ce 17 m obsahující prooxidant na bázi manganu Addiflex HE (5 %) a 5 % plniva Omydlen 2021 P (mikromletý vápenec).
LDPE3
LDPE transparentní fólie od firmy Granitol a.s. o tlouš ce 50-55 m bez p ídavku prooxidantu a plniva.
HDPE3
HDPE transparentní fólie od firmy Granitol a.s. o tlouš ce 17 m bez p ídavku prooxidantu a plniva.
6.2 Použité p ístroje a vybavení
Analyzátor uhlíku 5000 A, Shimadzu Corp., Japonsko.
Plynový chromatograf CHROM 5, Laboratorní p ístroje Praha.
Integrátor Hewlett&Packard HP 3396A.
Plynot sné injek ní st íka ky Hamilton o objemech 250 m a 1 ml.
Tedlar v vak o objemu 0,6 l.
Plynový chromatograf s hmotnostním detektorem Shimadzu GC-MS QP2010, Japonsko.
Tensometer 2000, Alpha Technologies.
FTIR spektrometr Mattson 3000, UNICAM, Velká Británie.
Centrifuga MR23i, Jouan, Francie.
Luminometer 20-20n , BioThema AB, Švédsko.
Mikrodávkova e (1-5 ml, 100-1000 l, 20-200 l), Biohit, Finsko.
Mikroskop CX 41 s fotoaparátem, Olympus.
B žné laboratorní sklo a vybavení.
6.3 Praktické provedení abiotické oxidace
Abiotické oxidaci byly podrobeny vzorky LDPE2, HDPE2, LDPE3 a HDPE3, charakteristiky vzork jsou uvedeny v kapitole 6.1.2. P ed zahájením testu byly vzorky nast íhány na kousky o velikosti 10 x 2 cm a umíst ny do hliníkové krabi ky s víkem. Oxidace takto p ipravených vzork PE fólií byla provedena v sušárn p i teplotách 60, 70 a 80°C.
V p edem stanovených asových intervalech byly ze sušárny odebírány vždy 4 vzorky PE fólie vedle sebe a byly uskladn ny v chladící místnosti p i 5°C. Vzorky byly poté podrobeny spektroskopii v I oblasti a zkouškám mechanické pevnosti.
6.4 Metody pro hodnocení abiotické oxidace
6.4.1 Spektroskopie v I oblasti
Spektroskopii v I oblasti byly podrobeny termooxidované vzorky PE fólií LDPE2, HDPE2, LDPE3 a HDPE3. I spektra byla m ena pomocí p ístroje Mattson 3000. U každého vzorku bylo spektrum prom eno v oblasti od 400-4000 cm- 1 vždy 2x vedle sebe. P i vlno tu 1713 cm- 1 byl detekován karbonylový pík a p i vlno tu 1465 cm- 1 -CH2- pík [17], podílem
jejich absorbancí dle rovnice (2) byl vypo ten karbonylový index, který je mírou oxidace testovaných polymer [17]. Z vypo tených hodnot byla sestavena závislost karbonylového indexu na ase, po který byly vzorky vystaveny termooxidaci p i 60, 70 a 80°C.
1465 1713
A
CI= A (2)
kde :
CI karbonylový index [1]
A1713 absorbance p i 1713 cm- 1 [1]
A1465 absorbance p i 1465 cm- 1 [1]
6.4.2 Mechanická pevnost
Vzorky LDPE2, HDPE2, LDPE3 a HDPE3 byly po termooxidaci dále podrobeny tahovým zkouškám na p ístroji Tensometer 2000 s nastavenou rychlostí posunu 100 mm.min- 1. Z nam ených hodnot byla vynesena závislost parametru prodloužení p i p etrhnutí na ase, po který byly vzorky PE fólií vystaveny termooxidaci p i 60, 70 a 80°C.
P ístroj nebyl dostate n citlivý u vzork , které byly v pokro ilém stupni zoxidování. Tyto vzorky byly p íliš k ehké a tudíž nem itelné, proto byl v tomto p ípad výsledek m eného parametru prodloužení p i p etrhnutí považován za nulový.
6.4.3 Identifikace produkt abiotické oxidace pomocí GC-MS
Se vzorky LDPE1 a HDPE1 bylo provedeno stanovení extrahovatelných produkt abiotické oxidace pomocí plynové chromatografie s hmotnostním detektorem. Vzorky PE byly nejprve podrobeny extrakci rozpoušt dlem, viz postup extrakce, a poté byla provedena analýza extrahovatelných slou enin pomocí p ístroje Shimadzu GC-MS QP2010. Analýza byla provedena na kolon Supelco SLB – 5ms, o rozm rech 30 m x 0,25 mm x 0,25 m, podmínky, za kterých bylo stanovení provedeno jsou uvedeny v tabulce (Tab. IV.).
Tab. IV. Parametry m ení na Shimadzu GC-MS QP2010.
Parametr Nastavení parametru
Teplota 250°C
Regulace pr toku Lineární pr toková rychlost Pr tok kolonou 0,93 ml.min- 1
Pr toková rychlost 35 cm.s- 1 Injektor
Split pom r 50
Kolona Teplotní program 50°C/5min; 15°C/min, 250°C/12min
Interface teplota 250°C Teplota iontového
zdroje 200°C
Detektor
ionizace 70 eV
Chromatogramy byly vyhodnoceny srovnáním hmotnostních spekter detekovaných slou enin s databází spekter. Identifikace slou enin tímto zp sobem byla vždy s n jakým pravd podobnostním procentem, a proto tyto výsledky nebyly brány za stoprocentní. Vyhodnocovány byly pouze ty píky, které byly subjektivn zhodnoceny za dostate n významné.
Postup extrakce
P ed vlastní extrakcí byly vzorky LDPE1 a HDPE1 „propasírovány“ p es síto o pr m ru otvor 2 mm.
Se vzorky LDPE1 a HDPE1 byly provedeny vždy dv extrakce : Extrakce v metanolu.
Tento zp sob extrakce byl volen tak, aby došlo k p evedení karboxylových kyselin, které jsou jedním z p edpokládaných produkt abiotické oxidace, na p íslušné methylestery. Vzniklé methylestery jsou pak na rozdíl od karboxylových kyselin pomocí GC-MS analyzovatelné.
Extrakt byl prakticky p ipraven diferen ním navážením 50 mg vzorku s p esností ±0,0001 g na analytických vahách do sklen né
vialky o objemu 20 ml, do které byly poté nadávkovány 2 ml metanolu a vše bylo nakonec okyseleno 1 kapkou 0,01M methanolické kyseliny chlorovodíkové. Vialka byla uzav ena zátkou opat enou teflonovým septem a byla 24 h t epána na t epa ce p i 25°C a poté dalších 24h p i 55°C. Obsah vialky byl po 48 h t epání chemicky vysušen p ídavkem 50 mg uhli itanu draselného a p efiltrován p es skelnou vatu do sklen né vialky o objemu 1,5 ml. Vzhledem k tomu, že uhli itan draselný je v metanolu rozpustný stal se extrakt zásaditým. Na základ tohoto zjišt ní byl 1 ml zásaditého extraktu p eveden do vialky o objemu 4 ml a z ed n p ídavkem 1 ml destilované vody. Dále byl p idán 1 ml hexanu, který byl dávkován za ú elem p evedení methylovaných produkt abiotické oxidace do hexanové vrstvy, a vše bylo ponecháno 24 h t epat na t epa ce p i 25°C. Po 24 h t epání byla odd lena hexanová vrstva, která byla dále chemicky vysušena p ídavkem síranu sodného bezvodého a p efiltrována p es skelnou vatu do sklen né vialky o objemu 1,5 ml. Vialka byla uzav ena zátkou s teflonovým septem a podrobena stanovení extrahovatelných produkt abiotické oxidace pomocí GC-MS.
Extrakce v minerálním médiu a hexanu.
Na analytických vahách bylo naváženo 50 mg vzorku s p esností
±0,0001 g, který byl poté diferen n p eveden do sklen né vialky o objemu 20 ml. Ke vzorku byly nadávkovány 2 ml minerálního média a vialka uzav ená zátkou s teflonovým septem byla 24h t epána na t epa ce t epat p i 25°C. Po 24 h t epání byl obsah vialky obohacen o p ídavek 2 ml hexanu a okyselen 1 kapkou koncentrované kyseliny chlorovodíkové za ú elem p evedení p ípadných vyextrahovaných karboxylových kyselin na své protonované formy, které pak mohou p ejít do hexanové fáze. Uzav ená vialka byla op t 24 h t epána p i 25°C. Poté byla hexanová vrstva odd lena a p evedena do isté vialky o objemu 20ml, kde byla dále obohacena o p ídavek 0,2 ml metanolu a 1 kapky 0,01M methanolické kyseliny chlorovodíkové pro esterifikaci p ípadných karboxylových kyselin. Vialka byla op t uzav ena zátkou s
teflonovým septem a 24 h byla t epána na t epa ce p i 55°C. Obsah vialky byl poté chemicky vysušen p ídavkem 50 mg uhli itanu draselného a následn p efiltrován p es skelnou vatu do sklen né vialky o objemu 1,5 ml. Vialka byla op t uzav ena zátkou s teflonovým septem a podrobena stanovení extrahovatelných produkt abiotické oxidace pomocí GC-MS.
6.5 Praktické provedení aerobní biodegradace
6.5.1 Testovací lahve
Pro testování biodegradace polymer v prost edí p dy a vyzrálého kompostu byly použity 500 ml lahve o celkovém objemu 620 ml. Lahve byly opat eny 3-ventilovým uzáv rem, viz obrázek (Obr. 10.). Jeden otvor byl vybaven patronou se septem, který sloužil k odb ru vzorku plynné fáze z testovací lahve pro stanovení obsahu CO2 a O2 pomocí plynové chromatografie. Další dva otvory sloužily k provzduš ování obsahu lahve, které bylo nezbytné pro dodržení optimální koncentrace kyslíku v lahvi.
Obr. 10. Schéma testovací lahve.
6.5.2 Provzduš ovací aparatura
Vzhledem k tomu, že biodegrada ní testy m ly být provád ny za aerobních podmínek, bylo nezbytné provzduš ování testovacích lahví. Pro provzduš ování bylo zvoleno sériové zapojení lahví pomocí silikonových hadi ek. Vzduch byl do lahví vhán n pomocí erpadla p es 5M-NaOH, který zajistil vychytání vzdušného oxidu uhli itého. Dále byl vzduch
zbavený vzdušného CO2 veden p es promýva ku s destilovanou vodou, která vstupující vzduch zvlh ovala a tím tedy nedocházelo k vysoušení testované sm si. Takto vy išt ný a zvlh ený vzduch byl veden p es jehlu na dno lahve, viz obrázek (Obr. 10.), a výstupem pokra oval do lahve další. Efekt provzduš ování byl zintenzívn n ru ním prot epáváním obsahu lahví. Doba provzduš ování byla stanovena na základ experimentálního stanovení obsahu CO2 v plynné fázi pomocí plynové chromatografie.
6.5.3 P íprava biodegrada ního testu, doprovodné analýzy a postupy
Použité substráty pro biodegrada ní prost edí
P dní substrát
Pro testování biodegradace v p dním prost edí byla použita lesní p da ze smíšeného lesa z oblasti Zlínského kraje. Odb r zeminy byl proveden z hloubky cca 5 cm po odstran ní svrchní vrstvy (listí) z povrchu.
Substrát vyzrálého kompostu
Pro testování biodegradace v prost edí vyzrálého kompostu byl použit komer n vyráb ný kompost od firmy AGRO CS. Vyzrálý kompost byl získán po cca 5 týdenní inkubaci v podmínkách 58°C, 50 % vlhkosti a za stálého provzduš ování.
Stanovení sušiny p dy/vyzrálého kompostu
P ed zahájením testu bylo provedeno stanovení sušiny p dy a vyzrálého kompostu. Do p edem zvážených petriho misek bylo naváženo 10 g p dy nebo vyzrálého kompostu s p esností ±0,0001 g. Stanovení bylo provedeno 3x vedle sebe vysušením 10 g substrátu do konstantní hmotnosti p i 105°C.
Po zchladnutí v exsikátoru na pokojovou teplotu byly misky zváženy na analytických vahách s p esností ±0,0001 g. Sušina p dního a kompostového substrátu byla vyjád ena v procentech.
Inertní materiál k ed ní substrátu
K ed ní substrát byl použit perlit s obchodním názvem Agroperlit od firmy AGRO CS. Jedná se o chemicky inertní materiál, který zajiš uje kyprost a pórovitost substrátu, zadržuje vodu a v ní rozpušt né živiny.
P ed vlastním použitím byl perlit 3x promyt v destilované vod a poté vysušen p i 150°C.
P dní i kompostový substrát byl na ed n perlitem v pom ru 1:4, tj. 2,5 g sušiny p dy na 10 g perlitu.
Stanovení celkového uhlíku (TC) na analyzátoru uhlíku
Stanovení byly podrobeny vzorky LDPE1, HDPE1, LDPE2 a referen ní látky (1), (2) (celulosa, minerální olej). Výsledky jsou uvedeny v tabulce (Tab. V.).
Principem stanovení celkového uhlíku (TC) je oxidace uhlíku obsaženého ve vzorku ve spalovací trubici s platinovým katalyzátorem p i 670°C v proudu kyslíku. Vzniklý CO2 je unášen do NDIR detektoru (Non-Disperse Infrared Detector). Signál je vyhodnocen jako plocha píku, která je p ímo úm rná koncentraci TC ve vzorku [33].
Tab. V. Obsah uhlíku ve vzorcích.
Vzorek TC [%]
LDPE1 70,67
HDPE1 61,10
LDPE2 67,77
Referen ní látka (1)
(celulosa) 35,61 Referen ní látka (2)
(minerální olej) 92,17 6.5.4 Aerobní biodegradace v p dním prost edí
Aerobní biodegradaci v p dním prost edí byly podrobeny vzorky LDPE1, HDPE1, LDPE2(40) a LDPE2(80). Celkem byly provedeny 2 biodegrada ní testy. V testu . 1 byly zkoušeny vzorky LDPE1 a HDPE1 a v testu . 2 vzorky LDPE2(40) a LDPE2(80). Vzorky PE fólií byly testovány vždy 3 x vedle sebe, slepé pokusy 4 x vedle sebe a referen ní
látka (1), (2) pouze 1 x.
Pro testy v p dním prost edí byl použit p dní substrát na ed ný perlitem, viz kapitola 6.5.3. Vzorky PE fólií byly p ed zahájením pokusu
„propasírovány“ p es síto o pr m ru otvor 2 mm. Testy se vzorky byly provedeny nadávkováním 1,5 g vzorku PE, který byl diferen n navážen s p esností ±0,0001 g, k ed nému p dnímu substrátu do testovací lahve.
Koncentrace vzorku v láhvi poté inila 0,6 g PE / g sušiny. Slepé pokusy byly realizovány pouze s ed ným p dním substrátem.
Jako referen ní látka byl použit filtra ní papír (referen ní látka (1)) a minerální olej (referen ní látka (2)), které byly do testovací láhve dávkovány v množství 0,30 g (0,12 g/g) s p esností ±0,01 g. V p dním testu . 1 byla použita jako pozitivní kontrola referen ní látka (1) i (2), zatímco v p dním testu . 2 byla testována pouze referen ní látka (1).
Takto p ipravené sm si na ed né p dy a vzorku nebo referen ní látky byly nakonec zvlh eny 10 ml minerálního média. Inkubace byla provedena p i 25°C ve tm .
6.5.5 Aerobní biodegradace v prost edí vyzrálého kompostu
Aerobní biodegradaci v prost edí vyzrálého kompostu byly podrobeny vzorky LDPE1, HDPE1, LDPE2(40) a LDPE2(80). Celkem byly provedeny 2 biodegrada ní testy, kdy v kompostovacím testu . 1 byly zkoušeny vzorky LDPE1 a HDPE1 a v testu . 2 vzorky LDPE2(40) a LDPE2(80). PE vzorky byly vždy testovány 3 x vedle sebe, slepé pokusy 4 x vedle sebe, referen ní látka (1) byla v testu . 1 testována 2 x vedle sebe a v testu . 2 pouze 1x.
Pro testy v prost edí kompostu byl použit vyzrálý kompost na ed ný perlitem, viz kapitola 6.5.3. Vzorky byly p ed zahájením testu
„propasírovány“ stejným zp sobem jako v kapitole 6.5.4. a byly vždy testovány v koncentraci 0,6 g PE / g sušiny. V kompostovacím testu . 1 byla referen ní látka (1) dávkována v koncentraci 0,6 g / g sušiny a v testu . 2 byla testována v koncentraci 0,12 g / g sušiny. Slepé pokusy byly realizovány pouze s ed ným vyzrálým kompostem.
Obsahy všech lahví byly nakonec zvlh eny 10 ml minerálního média o složení viz kapitola 6.1.1. Inkubace byla provedena p i 58 ± 2°C ve tm . 6.5.6 Abiotická kontrola
Abiotická kontrola sloužila pro vylou ení sou innosti abiotických pochod na degradaci vzork , tj. na produkci CO2 ze vzork LDPE1 a HDPE1. Celkem byly nasazeny 4 abiotické kontroly, kdy byl 2x vedle sebe testován vzorek LDPE1 a 2x vedle sebe vzorek HDPE1. U tohoto testu byly do lahví diferen n naváženy pouze vzorky polyethylenu, kdy dávkované množství vzork op t inilo 1,5 g. Ke vzork m byly p idány vždy 2 ml minerálního média, které jsme obohatili 40 l HgCl2 o koncentraci 10 g.l- 1. P ídavkem HgCl2 jsme zajistili abiotické prost edí v testovací lahvi.
Inkubace byla provedena p i 58 ± 2°C ve tm .
6.5.7 Monitoring v pr b hu biodegrada ních test
V pr b hu biodegrada ních test byla sledována produkce CO2 a spot eba O2 pomocí plynové chromatografie. Produkce CO2 sloužila jako kriterium pro ur ení stupn biodegradace daného vzorku, zatímco analýza spot eby O2 sloužila jako doprovodné stanovení pro sledování zachování aerobních podmínek b hem pr b hu testu a pro ur ení asového intervalu provzduš ování obsahu lahve.
V pr b hu biodegrada ních test byla vizuáln sledována vlhkost sm si v testovací láhvi. P i výrazném nedostatku vlhkosti byla sm s zvlh ena p ídavkem destilované vody.
6.6 Hodnocení aerobní biodegradace pomocí plynové chromatografie
6.6.1 Analýza pomocí plynové chromatografie, sestavení kalibra ní závis1osti
Pro stanovení obsahu CO2 a O2 v plynné fázi byl použit plynový chromatograf Chrom 5. Analýza byla provedena pomocí dvou sklen ných nápl ových kolon o délce 3,6 m s vnit ním pr m rem 3 mm. Oxid uhli itý byl analyzován na kolon napln né Porapakem R a obsah O2 na kolon obsahující Molekulové síto 13X. Stanovení bylo realizováno za podmínek
uvedených v tabulce (Tab. VI.). K detekci složek byl využit tepeln -vodivostní detektor (katharometr) a vyhodnocení bylo provedeno
pomocí integrátoru HP 3396A.
Tab. VI. Parametry m ení na Chrom 5.
Parametry Analýza CO2 Analýza O2
Termostat 50 30
Sample 100 20
Teploty [°C]
Detektor 100 100
Žhavení vlákna [mA] 120 100
Katharometr Citlivost 6 5
Pr tok [ml.min- 1] 30
Nosný plyn Typ He
Kalibrace pro stanovení obsahu CO2
Obsah CO2 v plynné fázi lahve byl ur en pomocí kalibra ní k ivky.
Kalibrace byla provedena analýzou 0,2; 0,5; 0,7 a 1 ml sm sného syntetického plynu Linde Technoplyn, viz kapitola 6.1.1, na plynovém chromatografu. Kalibra ní k ivka . 1 pro syntetický plyn (1), viz obrázek (Obr. 11.), byla sestavena vynesením závislosti plochy píku na objemu CO2
obsaženém v dávkovaném objemu sm sného plynu. P i dalších m eních byl vždy ov ován 1 kalibra ní bod.
B hem testu byla provedena vým na syntetického plynu (1), tudíž byla provedena i nová kalibrace stejným zp sobem jako kalibrace p edchozí.
Rovnice kalibra ní p ímky . 2 a hodnota spolehlivosti pro syntetický plyn (2) pak byla y = 205548x - 9898,9, R2 = 0,9997.
Vzhledem k tomu, že m ení biodegrada ních test bylo realizováno dlouhodob , došlo i k vým n nosného plynu. Na základ této skute nosti bylo provedeno op tovné prom ení kalibra ní závislosti pro sm sný syntetický plyn (2), kdy pak rovnice kalibra ní p ímky . 3 byla y = 187453x + 4260,8 a hodnota spolehlivosti R2 = 0,9999.
M ení produkce CO2 v pr b hu test bylo realizováno v experimentáln stanovených asových intervalech.
y = 188900x - 3836,4 R2 = 0,9998
0 400 000 800 000 1 200 000 1 600 000
0 2 4 6 8 10
V CO2 [ l]
Integraní jednotky [1]
Obr. 11. Kalibra ní k ivka . 1 pro stanovení CO2 - syntetický sm sný plyn (1).
Kalibrace pro stanovení obsahu O2
Kalibra ní k ivka pro stanovení O2 byla sestavena z obsahu kyslíku ve vzduchu. Kalibrace byla provedena analýzou 50; 100; 150; 200 a 250 l vzduchu na plynovém chromatografu. Kalibra ní p ímka, viz obrázek (Obr. 12.), byla sestavena vynesením závislosti plochy píku na objemu O2
obsaženém v dávkovaném objemu vzduchu. P i dalších m eních byl vždy ov ován 1 kalibra ní bod, na který byla vždy p epo ítávána aktuální koncentrace O2 v testovací lahvi. Na základ m ení koncentrace O2
v testovaných lahvích v pr b hu test byly stanoveny asové intervaly provzduš ování obsahu lahve.
y = 97699x - 16749 R2 = 0,9999
0 2 000 000 4 000 000 6 000 000
0 10 20 30 40 50 60
V CO2 [ l]
Integraní jednotky [1]
Obr. 12. Kalibra ní k ivka pro stanovení obsahu O2 .
6.6.2 Zpracování nam ených hodnot
A. Teoretická maximální produkce CO2 ze zkoušeného materiálu [34].
c . subst
2 M 100
*TOC m
ThCO = (3)
kde :
ThCO2 teoretická maximální produkce CO2 ze zkoušeného
materiálu [mmol]
ns u b s t . navážka zkoušeného materiálu pro test [mg]
TOC celkový organický uhlík obsažený ve zkoušeném
materiálu [%]
Mc atomární hmotnost uhlíku [g.mol- 1]
B. Denní produkce CO2 [34].
414 , 22
* V
10
* V
* n V
D k 3 l CO2 ) d (
= − (4)
kde :
CO2 ) d
n( množství vyprodukovaného CO2 [mmol]
Vl plynný objem lahve [ml]
Vk objem CO2 vypo tený z kalibra ní k ivky [ l]
VD dávkovaný objem plynné fáze do plynového
chromatografu [ml]
C. Kumulativní produkce CO2 [34].
Kumulativní produkce ≡ denní produkce, pokud není systém pro- vzduš ován.
Pokud je provzduš ováno, pak je kumulativní produkce CO2 : )
2 ( n
) 1 ( n
) 2 (
n(k)CO2 = (k)CO2 + (d)CO2 (5) kde :
) 2 (
n(k)CO2 kumulativní produkce CO2 z aktuálního m ení [mmol]
) 1 (
n(k)CO2 kumulativní produkce CO2 (denní produkce)
systému z p edchozího m ení [mmol]
) 2 (
n(d)CO2 denní produkce CO2 z m ení aktuálního [mmol]
D. Substrátová produkce CO2 [34].
Je kumulativní produkce CO2 ze systém se vzorky snížená o pro- dukci CO2 ze slepých pokus , tj. o produkci CO2 z istého kompostu.
E. Procentuelní odstran ní zkoušeného materiálu z hlediska produkce CO2 [34].
100 ThCO * D n
2 . subst
CO2 = (6)
kde :
CO2
D procento odstran ní substrátu [%]
ns u b s t . substrátová produkce CO2 [mmol]
ThCO2 teoretická maximální produkce CO2
ze zkoušeného materiálu [mmol]
F. Vztah pro výpo et procentuelního obsahu O2 v láhvi [34].
100 V *
10
* V V *
V O
%
l k 3 D
l 2
−
= (7)
kde :
%O2 aktuální procento O2 obsaženého v láhvi [%]
Vl plynný objem lahve [ml]
Vk objem O2 vypo tený z kalibra ní k ivky [ l]
VD dávkovaný objem plynné fáze do plynového
chromatografu [ml]
6.7 Mikroskopie vzork podrobených biodegradaci v prost edí kompostu
Mikroskopické pozorování bylo provedeno se vzorky LDPE1, HDPE1, LDPE2(40) a LDPE2(80), které byly podrobeny biodegrada ní test m v prost edí vyzrálého kompostu. Po ukon ení biodegrada ního testu . 1 v prost edí kompostu bylo z testovacích lahví odebráno n kolik submilimetrových kousk vzork LDPE1 a HDPE1. Vzorky LDPE2(40) a LDPE2(80) byly odebrány v pr b hu biodegrada ního kompostovacího testu . 2 v dob , kdy byly testovací lahve se vzorky provzduš ovány.
Vzorky byly vloženy do ependorfek, k nimž byl poté nadávkován 1 ml fixa ního roztoku (složení viz kap. 6.1.1), poté byly vzorky inkubovány p es noc p i 4°C. P ed mikroskopickým pozorováním byly zafixované
