1
Disertační práce
IMOBILIZACE BIOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK V MATRICI VODOROZPUSTNÉHO
POLYMERU
Immobilization of biologically active compounds in the water-soluble polymer matrix
Autor: Ing. Martina Hrabalíková
Studijní program: P2901 Chemie a technologie potravin Studijní obor: 2901V013 Technologie potravin Školitel: doc. Ing. Pavel Valášek, CSc.
Konzultant: doc. Ing. Vladimír Sedlařík, Ph.D.
Zlín, duben 2015
2
© Martina Hrabalíková
Vydala Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně v edici Doctoral Thesis.
Publikace byla vydána v roce 2015
Klíčová slova: biologicky aktivní látka, vodorozpustný polymer, nisin, kyselina mléčná, polyvinylalkohol, antimikrobiální polymer
Key words: bioactive compound, water-soluble polymer, nisin, lactic acid, polyvinyl alcohol, antimicrobial polymer
Plná verze disertační práce je dostupná v Knihovně UTB ve Zlíně.
3
„Tvořivost je schopnost najít souvislosti tam, kde žádné nejsou.“
Thomas M. Disch
Poděkování
Ráda bych poděkovala především svému školiteli doc. Ing. Pavlu Valáškovi, CSc. a konzultantovi doc. Ing. Vladimíru Sedlaříkovi, Ph.D. za jejich odborné vedení, cenné rady a připomínky, které mi poskytovali po celou dobu doktorského studia.
Tato práce vznikla v rámci řešení následujících projektů:
Centrum polymerních systémů (CZ.1.05/2.1.00/03.0111, poskytovatel:
ERDF, MŠMT)
Výzkum využití syrovátky, jako odpadní látky mlékárenského průmyslu, k produkci antimikrobiálních sloučenin pro modifikace hydrofilních polymerních systémů s využitím v kosmetických a medicinálních aplikacích (QJ1310254, poskytovatel: MZe)
Centrum pro podporu mezinárodní spolupráce v oblasti výzkumu a vývoje v technických oborech (LE12002, poskytovatel: MŠMT)
Projekty Interní grantové agentury UTB ve Zlíně
Zvláštní poděkování patří všem kolegům a hlavně mé rodině, která mě podporovala po celou dobu doktorského studia.
4
OBSAH
OBSAH ... 4
ABSTRAKT ... 6
ABSTRACT ... 7
ÚVOD ... 8
1. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ... 10
1.1 Biologicky aktivní látky ... 10
1.2 BAL z odpadů ... 10
1.3 Syrovátka jako zdroj BAL ... 12
Syrovátkové proteiny ... 13
1.4 Antimikrobiální látky mající původ v syrovátce ... 15
Bakteriociny ... 15
Bakteriociny ze syrovátky ... 16
Bakteriocin z fermentačních produktů syrovátky – nisin ... 16
Kyselina mléčná ... 17
1.5 Polymery a jejich uplatnění v potravinářském průmyslu... 20
Přírodní polymery ... 20
Syntetické polymery ... 21
Vodorozpustné polymery ... 22
Polyvinylalkohol ... 22
1.6 Aplikace polymerů v potravinářském průmyslu ... 26
Antimikrobiální obalové systémy ... 28
1.7 Imobilizace BAL do polymeru ... 29
Kinetika uvolňování BAL z polymerních matric ... 31
Síťování ... 32
Enkapsulace ... 33
1.8 Současné trendy v použití nisinu a kyseliny mléčné v polymerních matricích... 35
SHRNUTÍ SOUČASNÉHO STAVU ... 39
CÍL PRÁCE ... 40
2. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ... 41
5
Statistické zpracování dat ... 42
2.1 Flexibilní polyvinylalkoholové filmy s kyselinou mléčnou: Vliv zbytkových acetátových skupin na mechanické, tepelné a antimikrobiální vlastnosti ... 43
2.2 Imobilizace nisinu do zesíťované struktury polyvinylalkoholu ... 64
2.3 Imobilizace nisinu do mikrosfér na bázi biorozložitelného polyesteru .. ... 96
ZÁVĚR ... 106
PŘÍNOS PRO VĚDU A PRAXI... 107
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ... 108
SEZNAM OBRÁZKŮ ... 132
SEZNAM TABULEK... 135
SEZNAM ZKRATEK... 136
CURRICULUM VITAE ... 138
6
ABSTRAKT
Tato práce se zabývá problematikou imobilizace biologicky aktivních látek majících původ v syrovátce do matrice vodorozpustného polymeru za účelem přípravy antimikrobiálního systému pro potravinářské aplikace.
Studovanými bioaktivními látkami byly bakteriocin nisin a kyselina mléčná v kombinaci s polyvinylalkoholem pro přípravu fólií a mikrosfér.
Mezi stěžejní výstupy patří popis interakce polyvinylalkoholu s kyselinou mléčnou v závislosti na stupni hydrolýzy polymeru, nalezení nového způsobu síťování polyvinylalkoholu netoxickou dikarboxylovou kyselinou a aplikace čtyř forem nisinových modifikátorů pro úpravu hydrofilních polymerních matric.
7
ABSTRACT
This thesis deals with immobilization of biologically active compounds, originating from whey, into matrix of water-soluble polymer for preparation of antimicrobial systems with applicability in food industry. A bacteriocine, nisin and lactic acid in combination with polyvinyl alcohol were studied for preparation of antimicrobial foils and microspheres. The description of polyvinyl alcohol-lactic acid interaction in dependence on hydrolysis degree of the polymer, finding of novel way for polyvinyl alcohol crosslinking by nontoxic dicarboxylic acid, and application of four nisin containing modifiers into hydrophilic polymer matrices belong among key outputs of this thesis.
8
ÚVOD
Biologicky aktivní látky jsou neobyčejně rozsáhlou tematikou. Neustále dochází k objevování nových biologicky aktivních látek nebo se zjišťují nové biologické funkce již známých látek. V současné době se rozvíjí trendy vedoucí k návratu používání přírodních biologicky aktivních látek ve všech oblastech dotýkajících se života. Především se jedná o oblasti potravinářského, kosmetického a farmaceutického průmyslu. Nynější tendence v životním stylu posouvají využívání přírodních biologicky aktivních látek směrem k jejich inkorporaci v polymerních matricích. Progrese polymerů v životě je dána nejen jejich materiálovými vlastnostmi, ale především dostupnými surovinovými zdroji a výrobními postupy, což mělo za následek jejich široké uplatnění v celé řadě odvětví. V případě obalového průmyslu ve značné míře levnější a lehčí polymery postupně vytlačují dříve používaný kov, dřevo či papír [1, 2].
Vývoj polymerních materiálů byl původně zaměřen na dosažení co možná nejlepších vlastností mechanických, chemických a fyzikálních, a tedy i maximální stálosti a odolnosti těchto materiálů v přírodním prostředí. Nicméně se zvyšující se produkcí polymerů se také zvyšují obavy o jejich ekonomické dopady na společnost a vliv na životní prostředí a lidské zdraví [1, 3]. Dnešní životní styl, kdy mají lidé zájem o čerstvé potraviny z různých cizokrajných zemí, rozvíjí potřebu inovovat či vyvíjet nové obalové materiály s výhodnějšími vlastnostmi pro udržení potravin ve zdravotně nezávadném stavu [4].
V posledních letech také narůstá úsilí vyvinout biologicky odbouratelné kompozitní polymerní produkty zahrnující použití takových syntetických polymerních materiálů, které lze za určitých podmínek lehce odbourat, aby byly splněny požadavky na ochranu životního prostředí, multifunkční využívání přírodních zdrojů a aby bylo vyhověno zvýšenému tlaku souvisejícímu se zpřísněním zákonů [5].
Polymerní obalový materiál v potravinářském průmyslu musí být proto volen tak, aby neobsahoval zdraví škodlivé látky, které by se z něj mohly uvolňovat a ani látky, se kterými by potravinářský produkt mohl jakýmkoliv způsobem reagovat. V podstatě musí obal zajišťovat základní funkce, a to ochranu proti mechanickému poškození, ochranu proti chemickým změnám a mikrobiálnímu kažení, kontrolu kvality, podávání informací o produktu, transfer produktu, bezpečnost, propagaci, ekonomičnost a tím vazbu na životní prostředí [4, 6].
Před nedávnem se proto technologie obalového materiálu používaného v potravinářství zaměřila na polymery, které zprostředkovávají jiné funkce, než mají konvenční obaly. Takovým příkladem mohou být aktivní obaly. Jedná se o jeden z inovativních konceptů balení potravin, jakožto odezva na narůstající zájem spotřebitelů a poptávku trhu [7].
9
Tématika doktorského studia přímo navazuje na řešení projektu Ministerstva zemědělství ČR č. QJ1310254 – Výzkum využití syrovátky, jako odpadní látky mlékárenského průmyslu, k produkci antimikrobiálních sloučenin pro modifikace hydrofilních polymerních systémů s využitím v kosmetických a medicinálních aplikacích. Na základě této rozvíjející se oblasti se disertační práce zabývá problematikou inkorporace biologicky aktivních látek získaných ve formě fermentačních produktů syrovátky do polymerní matrice.
10
1. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
1.1 Biologicky aktivní látky
Biologicky aktivní látky (BAL) jsou látky přírodního nebo syntetického původu, které specificky působí na živé organismy. Jejich hlavním znakem je schopnost účinku již při nízkých koncentracích [8]. Předpokládá se pozitivní účinek BAL v podobě jak přímého působení (např. látky mající pozitivní vliv na metabolismus člověka) [9, 10], tak nepřímého působení (např. látky s bakteriocidním účinkem pro ochranu před patogenními mikroorganismy) [11].
Biologicky aktivní látky lze dělit podle jejich aplikace do několika skupin.
Nejčastěji nachází uplatnění v následujících odvětvích:
a) potravinářský průmysl (konzervační činidla, nutriční doplňkové látky, látky upravující organoleptické vlastnosti) [9-13];
b) zemědělství (hnojiva, pesticidy) [14, 15];
c) zdravotnictví (léčiva) [16-19].
V současnosti se do popředí zájmů dostávají BAL přírodního původu, které vznikají primárně v rostlinných, ale i živočišných organismech. Proto se tato práce dále zabývá antimikrobiálními BAL, které se vyskytují v přírodních zdrojích.
BAL se mohou v přírodě vyskytovat také jako sekundární metabolity rostlin, mikroorganismů či živočichů. Jejich účinky jsou široké, avšak za zmínku stojí jejich efekt antimikrobiální, antioxidační či analgetický. Nicméně nevýhodou takových BAL je problém s jejich čistotou a nutností standardizace. V mnoha případech se lze setkat s nekompatibilitou se zpracovatelskými technikami v průmyslu. Především se jedná o nízkou tepelnou stabilitu. Druhou skupinou přírodních biologicky aktivních látek jsou minerální látky, především stopové prvky, které lze většinou bez problémů v průmyslu zpracovat, aniž by byla nějak ovlivněna jejich účinnost. Mezi anorganické BAL patří i látky používané pro hnojiva a sloučeniny vápníků (především fosforečnany), které nachází svá uplatnění v medicíně [14, 20].
1.2 BAL z odpadů
V potravinářském průmyslu a zemědělství jsou významným artiklem pro získávání BAL zbytkové materiály zůstávající po primární produkci, které se
11
mnohdy stávají nezhodnocenými odpady. Z rostlinných výrob to mohou být např. zbytky částí rostlin, z živočišných se jedná především o využití vedlejších produktů z mlékárenské produkce.
BAL z odpadů rostlinného původu
Sloučeniny s antimikrobiálními a často mnoha dalšími biologickými účinky se syntetizují a akumulují v rostlinných pletivech, jakožto reakce na vnější podnět. Odtud se dále obecně získávají extrakcí [21]. Antimikrobiální aktivitu v potravinářsky významných rostlinách vykazují chemicky rozdílné látky.
Hlavními skupinami jsou fenolové sloučeniny, terpenoidní látky, deriváty acetylenu, dusíkaté heterocyklické sloučeniny a mnohé další. Antimikrobiální účinek mají také některé sloučeniny řazené mezi aromatické látky (např.
jednoduché fenoly, které jsou složkami silic, kouřová aromata používaná k uzení potravin) [22]. Příklady BAL z produkce rostlinného původu, odkud je lze získat a jejich možná aplikace je uvedena v tabulce 1.
Tabulka 1: Výčet základních skupin BAL z rostlinné produkce
Skupina látek Původ Aplikace Zdroj
Alkaloidy Semena, listy, kůra a kořeny rostlin
Léčiva [18, 22]
Flavonoidy Lipový květ, nať pohanky, květ černého bezu, hloh
Léčiva [23, 24]
Glykosidy Semena hořčice, listy šafránu, stévie
Léčiva, Sladidlo [16, 19, 25, 26]
Fenolické sloučeniny
Pivovarnická produkce Antioxidační a antimikrobiální aplikace
[27]
Terpenové uhlovodíky
Nadzemní části bylin Léčiva, aromata, antimikrobiální obalový materiál
[28-30]
BAL z odpadů živočišného původu
Odpady z živočišné produkce, jako jsou kosti, srst či kůže, nejsou příliš rozšířeným materiálem pro získávání antimikrobiálně působících BAL. Výjímku takových BAL z odpadů živočišného původu tvoří mlékárenský průmysl s významnou nadprodukcí syrovátky. Tato práce se dále zabývá BAL, které lze získat dalším zpracováním syrovátky – odpadu po výrobě sýrů, tvarohů či kaseinů.
12 1.3 Syrovátka jako zdroj BAL
Syrovátka je žlutozelená kapalina vznikající jako vedlejší produkt, který zůstává po vysrážení mléka při výrobě sýrů, včetně tvarohů a kaseinů [31-33].
Syrovátka obsahuje mimo řady hodnotných proteinů také laktózu, lipidy, vitamíny (zeleno-nažloutlé zbarvení je způsobeno přítomností riboflavinu) a minerální látky (především NaCl, KCl a vápenaté soli) pocházející z mléka, avšak přesné složení závisí na metodách výroby a čištění. Rozdíly mezi zastoupením látek sladké a kyselé syrovátky jsou zřejmé z tabulky 2. Typické složení syrovátky je uvedeno v tabulce 3 [34, 35].
Tabulka 2: Typické chemické složení sladké a kyselé syrovátky (uvedeno v g/l syrovátky) [37, 38]
Syrovátka Proteiny Laktóza Minerální látky
Sladká 6–10 46–52 2,5–4,7
Kyselá 6–8 44–46 4,3–7,2
Tabulka 3: Procentuální zastoupení látek v syrovátce [39, 40]
Složka Koncentrace [%]
Voda 93–94
Proteiny 0,9
Laktóza 4,7
Vitamíny (B, C, E) a
minerální látky (Ca, Fe, K, P, Mg, Zn) 0,6 Kyselina mléčná, kyselina citronová, 0,3
rozvětvené řetězce aminokyselin a lipidy
I přes významnou nutriční hodnotu syrovátky je zde problém její nadprodukce. V roce 2012 se jen v Evropské unii vyprodukovalo zhruba 83 mil.
tun [36]. Z původně hodnotné suroviny se tak stává potenciální hrozba pro životní prostředí, která se promítá i do zvýšených ekonomických nákladů jejich producentů.
Z mnoha studií vyplývá, že zmiňované proteiny obsažené v syrovátce vykazují biologickou aktivitu. Především díky obsahu těchto významných látek a vysoké produkci se hledají nová uplatnění syrovátky včetně těch s přidanou hodnotou. Mimo potravinářství lze nacházet uplatnění také ve zdravotnictví,
13
farmaceutickém a kosmetickém průmyslu [34, 35]. Pro vysoký obsah vody má syrovátka omezenou trvanlivost, proto se ve velké míře zpracovává na zahuštěný syrovátkový koncentrát a sušenou syrovátku. Uvedené výrobky se kromě použití při výrobě krmiv využívají v potravinářském i farmaceutickém průmyslu, jako aditiva v pekárenství a při výrobě dietických výrobků.
Ze syrovátky se izolují bílkoviny albumin, globulin a rozkladné produkty kaseinu. Těžištěm průmyslového zpracování syrovátky je pak získávání laktózy, která se využívá ve výrobě dětské výživy, galaktózy a laktulózy, v cukrovarnickém průmyslu, či jako plnivo do tablet. V posledních několika letech značně vzrostla poptávka po syrovátce, ať už jako surovině pro potravinové doplňky obohacené proteiny anebo prekurzoru pro výrobu bioplynu. Z ekonomického i ekologického hlediska je tedy zřejmé, že syrovátku nelze pouze přímo vypouštět do odpadních vod bez adekvátního zužitkování, jakým může být např. její fermentace [33, 41-43].
Syrovátkové proteiny
Syrovátkové proteiny jsou globulární molekuly, které zůstávají v séru mléka po vysrážení kaseinu. Tvoří zhruba 17–20 % z celkových proteinů kravského mléka (tabulka 4) a obsahují pět hlavních proteinových frakcí, u kterých je dokázána biologická aktivita:
a) β-laktoglobulin (β-Lg) – I když je převažujícím proteinem syrovátky (tvoří 57 % proteinů syrovátky; molární hmotnost 18,3 kDa), není nejvíce biologicky aktivním proteinem ve srovnání s dalšími menšími proteiny, jakými jsou imunoglobuliny a laktoferin. Nicméně β-Lg je bohatým zdrojem esenciálních aminokyselin. Kromě toho má potenciál modulovat lymfatické odpovědi, tedy hraje důležitou roli v obranných imunitních funkcích těla proti infekcím a šíření nádorů.
b) α-laktalbumin (α-La) – Druhý nejvíce převládající protein syrovátky (19 % ze všech syrovátkových proteinů; molární hmotnost 14 kDa) je bohatým zdrojem tryptofanu. Bylo prokázáno, že zlepšuje kvalitu spánku a kognitivní výkon při stresu prostřednictvím tvorby neurotransmiteru serotoninu. α-La může také usnadnit vstřebávání minerálů a vyvíjet antibakteriální a imunomodulační účinky. Klinické studie prokázaly při jeho užívání významné snížení deprese a zlepšení vizuální paměti. α-La je bohatý na esenciální a semiesenciální aminokyseliny a je dominantní protein mateřského mléka. Vysoký obsah cysteinu posiluje imunitní systém a podporuje hojení ran.
c) glykomakropeptid (GMP) – Jedná se o hydrofilní peptid κ-kaseinu, který se uvolňuje ze syrovátky při výrobě sýrů působením chymozinu. GMP tvoří asi
14
15 % z proteinů syrovátky. GMP má několik zajímavých technicko-funkčních vlastností, jako je široký rozsah pH rozpustnosti, emulgační vlastnosti, pěnící schopnosti, které jsou prokazatelně slibné pro použití v potravinářském průmyslu a výživě, dále hraje roli při detekci syrovátky při falšování mléka a mléčných výrobků. Rovněž je unikátní tím, že neobsahuje fenylalanin, tryptofan a tyrosin, ale naopak má vysoký obsah větvených aminokyselin, včetně leucinu, isoleucinu a valinu.
d) proteozo-peptony – Jedná se o tepelně stabilní proteinové frakce rozpustné v kyselinách. Jejich podíl v kravském mléce představuje přibližně 10 % z celkových syrovátkových proteinů.
e) imunoglobuliny – Imunoglobuliny podporují aktivitu imunitního systému a předpokládá se, že také podporují zdravé a efektivní funkce střev [37, 39, 44-48].
Tabulka 4: Průměrné složení biologicky aktivních látek syrovátky [37, 45, 49, 50]
Složka syrovátky Koncentrace [mg/l]
β-Laktoglobulin 3,2
α-Laktalbumin 1,2
Glykomakropeptid 1,2
Proteozo-peptonová frakce 1,1
Imunoglobulin G 0,7
Bovinní sérum albumin 0,4
Laktoferin 0,06
Imunoglobulin A 0,04
Imunoglobulin M 0,04
Laktoperoxidáza 0,03
Lysozym 0,0004
Mezi další méně zastoupené, avšak neméně významné složky syrovátky patří bovinní sérum albumin, laktoferin, laktoperoxidáza a jiné neproteinové frakce, jako je laktóza, minerální látky, vitamíny a stopové množství mléčného tuku.
Hlavními komponenty kaseinu v mléce jsou α-kasein (α-S1 a α-S2), β-kasein a κ-kasein. Hlavní proteiny syrovátky, α-LA a β-Lg, se zdají být zodpovědné za funkční vlastnosti syrovátky, jako je pěnění a tvorba gelu [39, 51].
Syrovátkové proteiny mají mnoho výhod vzhledem ke své vysoké nutriční hodnotě a tedy jejich možných aplikací v potravinářských výrobcích.
Nevýhodou syrovátkových proteinů je jejich nestabilita při tepelném zpracování nad 50 °C [51, 52].
15 Formy syrovátkových proteinů
V závislosti na požadovaném použití a účinku, syrovátka může být použita ve formě čerstvé, pasterované tekuté, nebo ve formě kondenzovaných produktů (syrovátkový proteinový koncentrát – WPC, syrovátkový proteinový izolát – WPI, nízkolaktózová syrovátka, hydrolyzované syrovátkové bílkoviny a demineralizovaná syrovátka). Kondenzované formy zachovávají žádoucí složky, jako je obsah bílkovin, a obsahují snížené množství zbytkových složek, jako jsou laktóza a tuk [39].
WPC a WPI jsou vyráběny ze syrovátky pomocí ultrafiltrace, sušením, rozprašováním a odpařováním [53]. WPC se skládá z přibližně 34–85 % bílkovin a malého množství laktózy, lipidů a minerálních látek. WPI se skládá z 90 % proteinů a malého nebo žádného množstvím laktózy [39, 43, 54].
1.4 Antimikrobiální látky mající původ v syrovátce
V posledních letech jsou si spotřebitelé vědomi zdravotních problémů týkajících se potravinářských přídatných látek a zdravotních přínosů
„přirozených“ a „tradičních“ potravin zpracovaných bez přídavku chemických konzervačních činidel. Jednou z alternativ ke splnění tohoto požadavku jsou bakteriociny, které jsou antimikrobiální peptidy produkované spektrem specifických bakterií. Někdy působí proti určité skupině konkurenčních organismů, jindy jejich široké spektrum aktivity působí jako obecnější obranný mechanismus [55, 56]. Druhou alternativou se jeví jednoduché organické kyseliny.
Bakteriociny
Bakteriocin je definován jako látka bílkovinného charakteru, která má baktericidní účinky proti limitované skupině organismů. Bakteriociny se v potravinách běžně vyskytují díky jejich produkci bakteriemi mléčného kvašení, například fermentací mléčných produktů [4, 57, 58]. Drider et al. [59]
rozdělil bakteriociny do tří hlavních skupin podle jejich genetické a biochemické charakteristiky:
a) třída I – lantibiotika (zastoupená nisinem) shromažďuje tepelně stálé peptidy s velmi nízkou molární hmotností (< 5 kDa). Tyto bakteriociny jsou charakterizovány přítomností lanthioninu.
b) třída II se skládá z malých termostabilních peptidů (< 10 kDa) a je dále rozdělena do tří podtříd: IIa (pediocin a enterocin), IIb (lactocin G) a IIc (lactocin B).
16
c) třída III je reprezentována termolabilními peptidy s vysokou molární hmotností (> 30 kDa), jako je helveticin J [55, 60].
Bakteriociny ze syrovátky
V syrovátce se přirozeně vyskytují bakteriociny, které do ní přechází z mléka při výrobě sýrů, tvarohů či kaseinů. Významným zástupcem je globulární glykoprotein laktoferin s molární hmotností 80 kDa nebo jemu podobný transferin. Prostřednictvím proteolytického štěpení laktoferinu mohou vznikat peptidy, u kterých byly zjištěny baktericidní účinky především proti grampozitivním bakteriím. Jedná se především o laktofericin B, který vykazuje antimikrobiální aktivitu proti zástupcům grampozitivních i gramnegativních bakterií. Dále se jedná o laktofericin C a laktofericin M, u kterých byl zjištěn vliv i na E. coli [51]. Dalším významným zástupcem je laktoperoxidáza, která se v syrovátce vyskytuje v koncentraci až 0,03 mg/l [37].
Bakteriocin z fermentačních produktů syrovátky – nisin
Nisin (obr. 1) objevený v roce 1928 je antimikrobiální peptid nejčastěji testovaný ve filmech buď jako jediná antimikrobiální látka [52, 61-64] nebo ve spojení s jinými antimikrobiálními biologicky aktivními látkami [65-69].
Jedná se o ve vodě rozpustný polycyklický antimikrobiální peptid produkovaný především bakterií Lactococcus lactis subsp. lactis a působí proti grampozitivním mikroorganismům. Je tvořen v pěti přírodních variantách: A, Z, Q, F (produkovány L. lactis) a U (produkovaný Streptococcus uberis). Tyto varianty se od sebe liší změnou několika aminokyselin v základní struktuře řetězce [56, 70-74].
Obr. 1: Struktura nisinu A (Dha – dehydroalanin; Dhb – dehydrobutyrin; S – thioéterový můstek) [75]
Nisin je jedním z prvních popsaných bakteriocinů a v roce 1968 byl uznaný za bezpečný biologický konzervační činitel potravin Organizací pro výživu
17
a zemědělství FAO (Food and Agriculture Organization) a Světovou zdravotnickou organizací WHO (World Health Organization). O dvacet let později byl Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv FDA (Food and Drug Administration) označen za „generally recognized as safe – GRAS“ (všeobecně považován za bezpečný) [4, 57, 58, 76].
Důvodem rostoucího zájmu o nisin, jakožto antimikrobiálního činidla ve filmech, je jeho relativně ustálený regulační status potravinářské přídatné látky. Avšak cíl inhibovat nežádoucí mikroorganismy v potravinách k tomuto pravděpodobně také přispívá [77].
Vyhláška č. 235/2010 Sb. povoluje použití nisinu do potravin jako přídatnou látku pod označením E 234 [78]. Komerčně je využíván při výrobě sýrů.
Navzdory velkému počtu experimentálních studií použití nisinu v obalovém materiálu existuje jen malé komerční využití v této oblasti. Je to z důvodu ztráty jeho aktivity při běžné zpracovatelské technologii polymerů a vysoké ceně [4].
Obecně se nisin vyrábí pomocí fermentace média (např. mléka nebo syrovátky) pomocí bakteriálních kmenů (např. Lactococcus lactis subsp. lactis).
Získaná fermentační půda se potom zahustí a oddělí, suší rozprašováním a mele za vzniku malých částic. Konečný produkt obecně obsahuje převahu pevných látek sestávajících z mléčných bílkovin a soli: 74,4 % NaCl, 23,8 % sacharidy, 2,5 % nisinu a 1,7 % vlhkosti [56, 79]. Proto testované antimikrobiální povlaky mohou uvolňovat mimo nisinu i další zmíněné látky, avšak jejich případný vliv na inhibici mikroorganismů nebyl studován a předpokládá se, že je jen zcela minimální či žádný. Nisin může být vmíchán do obalového polymeru anebo být aplikován ve formě prášku či povlaku na povrch. V Evropě je široce používán, a přestože má schválení FDA jako přídatná látka pro přímé použití do potravin, není v USA ve velké míře používán. Pro lepší antimikrobiální účinnost nisinu je potřeba jeho mísení s dalšími látkami. Výzkumy jsou nuceny se pohybovat ve směru vysoce účinných kombinací antimikrobiálních látek a jejich cenové efektivnosti. Pokud se antimikrobiálním filmům nepodaří odstranit vysoký počet nežádoucích mikroorganismů, musí působit další, post-zpracovatelská bezpečnostní opatření [80].
Kyselina mléčná
Kyselina mléčná (2-hydroxypropanová kyselina) je bezbarvá nebo nažloutlá kapalina téměř bez zápachu s kyselou chutí. Sestává ze směsi kyseliny mléčné (C3H6O3) a jejího laktonu (C6H10O5). Kyselina mléčná je hygroskopická a při koncentrování varem kondenzuje a tvoří lakton kyseliny mléčné, který zředěním a zahřátím hydrolyzuje zpět na kyselinu mléčnou [81, 82].
18
Kyselina mléčná hraje významnou roli v mnoha biochemických procesech. Je to nejjednodušší hydroxylová kyselina s jedním asymetrickým uhlíkem, proto vytváří dva optické isomery D a L (obr. 2). Kyselina mléčná vzniká fermentací sacharidů bakteriemi mléčného kvašení. Některé kmeny bakterií (např.
Lactobacillus amylophilus, L. bavaricus a L. casei) přednostně produkují L-isomery, naopak např. L. delbrueckii a L. acidophilus produkují D-isomer anebo jejich směs [38, 82-84].
Obr. 2: a) L-, b) D-stereoisomery kyseliny mléčné [83]
Kyselina mléčná byla objevena v roce 1780 v kyselém mléce a v roce 1881 byla získána pomocí procesu fermentace, což mělo za následek možnost jejího průmyslového využití. Kyselina mléčná je vyráběna v průmyslovém měřítku od konce devatenáctého století. Roční světová produkce v roce 2012 dosáhla kolem 259 tis. tun [85]. Může být připravena chemickou syntézou nebo fermentací mimo jiné syrovátkových sacharidů; okolo 90 % světové produkce je vedena druhým způsobem [81, 83]. Podmínky pro fermentaci jsou různé pro každou průmyslovou metodu, ale jsou obvykle v rozmezí od 45–60 °C a pH 5,0–6,5 pro Lactobacillus delbrueckii a 43 °C s pH 6,0–7,0 pro Lactobacillus bulgaricus. Syntetizovaná kyselina se neutralizuje hydroxidem vápenatým nebo uhličitanem vápenatým. Fermentace trvá za optimálních laboratorních podmínek 1 až 2 dny. Výtěžek kyseliny mléčné po fázi fermentace je 90–95 hm. % (vztaženo na počáteční koncentraci sacharidů). Rychlost fermentace závisí především na parametrech jako je pH, teplota, počáteční koncentrace substrátu a koncentrace dusíkatých živin. Běžný postup pro fermentační výrobu kyseliny mléčné zahrnuje purifikační kroky, které jsou nezbytné pro dosažení čisté kyseliny mléčné. Alternativy k tomuto průmyslovému postupu jsou studovány.
Byly provedeny četné studie na čištění kyseliny mléčné pomocí několika různých technik separace zahrnujících iontovou výměnu, extrakce, membránové technologie, destilace či elektrodialýzu. Schematicky je tento proces výroby znázorněn na obrázku 3 [86, 87].
19
Obr. 3: Schematické znázornění průmyslové výroby kyseliny mléčné [86]
Kyselina mléčná je především používána v potravinářském průmyslu pod označením E 270 jakožto např. regulátor kyselosti. Hraje úlohu při výrobě jogurtů a sýrů. Při přípravě jogurtů je hlavním produktem kofermentace Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus. V závislosti na požadovaných senzorických vlastnostech konečného produktu se využívá přímé okyselení kyselinou mléčnou, aby se zabránilo nebezpečí šíření nežádoucích mikroorganismů [85]. Pokud jde o výživu zvířat, řízená mléčná fermentace zvyšuje trvanlivost, chutnost a nutriční hodnotu siláže. Laktát amonný je vynikající neproteinový zdroj dusíku.
V kosmetickém průmyslu se používá při výrobě hygienických a estetických produktů, vzhledem k její hydrataci, antimikrobiálním a omlazujícím účinkům na kůži. Ve farmaceutickém průmyslu se používá jako doplněk při syntéze dermatologických léčiv a proti osteoporóze [85].
Kyselina mléčná je také důležitým prekurzorem pro syntézu polylaktidu – biologicky rozložitelného polyesteru, který je využíván jednak pro výrobu kompostovatelných obalů, ale i vysoce komplexních výrobků s využitím ve zdravotnictví a farmaceutickém průmyslu [83, 85, 88, 89].
20
1.5 Polymery a jejich uplatnění v potravinářském průmyslu
Obecně se termínu polymer používá pro makromolekulární látky, které jsou charakterizovány specifickými vlastnostmi, příslušejícími molekulám s dlouhou řetězcovou strukturou. Prekurzory polymerů jsou monomery. Výrobky připravené z polymerů se nachází převážně v tuhém stavu, ale v určitém stádiu zpracování ve stavu kapalném, což umožňuje udělit budoucímu výrobku finální tvar [80, 90]. Podle původu lze polymery obecně rozdělit do dvou skupin, a to na přírodní a syntetické.
Přírodní polymery
Přírodní polymery jsou produkovány přirozenými procesy, jedná se tedy o organický materiál v převážné míře tvořící hmotu organismu [91]. Podle chemického složení je lze rozdělit do tří základních skupin:
a) polysacharidy, které jsou tvořeny monosacharidovými jednotkami spojenými glykosidickou vazbou mezi hemiacetalem a hydroxylovou skupinou (např. celulóza, škrob, glykogen, pektin, chitin);
b) proteiny, které se skládají z aminokyselin spojených peptidovou vazbou mezi aminovou a karboxylovou skupinou (např. kolagen, myozin, hedvábí, vlna, apoenzymy, hormony);
c) mikrobiální polyestery, které jsou makromolekulárními látkami produkovanými za určitých okolností mikroorganismy jako zásobní látky (např. polyhydroxyalkanoáty) [91].
Dnes mohou být v potravinářském průmyslu používány přírodní polymery na bázi proteinů získaných ze sóje a kukuřice, želatina vyráběná z kolagenu, kasein a syrovátkové proteiny z kravského mléka. Želatina se dnes nejvíce používá pro enkapsulaci léků, ale i pro nejrůznější biomedicínské aplikace [2, 83]. Aplikace syrovátkového proteinu jsou možné ve formě mikroenkapsulace tuků, jedlých povlaků, např. pro pražené burské oříšky, mražená kuřata a ryby či nosiče antioxidantů při zpracování lososů. Běžně se také pro balení potravin používají regenerovaná celulóza nebo acetát celulózy [31]. Doposud však tyto biomateriály nebyly schopny zcela nahradit syntetické polymery [80]. Na rozdíl od syntetických polymerů jsou biopolymery, jako je škrob, celulóza, proteiny, chitosan, navíc šetrné k životnímu prostředí a biologicky odbouratelné.
21 Syntetické polymery
Hlavní surovinou pro chemickou syntézu těchto polymerů je v současné době ropa [31]. Tato skupina polymerů se rozděluje do dvou základních skupin na elastomery a plasty. Plasty se dále dělí na podskupinu termoplastů a reaktoplastů (obrázek 4).
Obr. 4: Rozdělení syntetických polymerů
Elastomery jsou vysoce elastické polymery, které se dají za běžných podmínek vratně deformovat (např. kaučuky, prekurzory pryží). Naproti tomu plasty, které jsou za běžných podmínek tuhé, tvrdé a často také křehké, lze za zvýšené teploty tvarovat vratně – termoplasty (např. polyolefiny, polyestery, polyamidy) nebo nevratně – reaktoplasty (např. fenoplasty, epoxidové pryskyřice) [31]. Mohou být tedy tvářeny do jakéhokoliv tvaru, mají nízkou hustotu a nízký koeficient tření.
Syntetické polymery lze připravit třemi základními chemickými reakcemi:
a) polymerací – řetězová chemická reakce velkého počtu monomerů, při níž nedochází k vytváření vedlejšího produktu;
b) polykondenzací – reakce, při níž vzniká ze dvou nízkomolekulárních látek polymer a jiná nízkomolekulární látka – nejčastěji voda;
c) polyadicí – reakce mezi molekulami s násobnými vazbami nebo kruhovými molekulami a sloučeninami s vhodnými funkčními skupinami [31].
Syntetické polymerní materiály jsou dnes nejběžněji používanými materiály pro obaly v potravinářském průmyslu, přičemž nejvíce jsou zde zastoupeny polyolefiny (polyetylen, polypropylen), polyestery (polyetylentereftalát), polyamidy (polyamid 6 a 66). V menší míře pak polykarbonáty a polyuretany [4].
22
Polymery jsou zřídka použity samostatně v jejich surové formě. Jsou do nich začleňovány přísady pro zlepšení vzhledu, mechanických vlastností a tím změněny vlastnosti podle jejich konečného užití [80]. S možnostmi použití přídatných látek pro žádoucí zlepšení vlastností polymerů se otevřely předpoklady pro nové a inovativní způsoby přípravy nových polymerních materiálů. Některé přísady poskytují lepší zpracování a optimalizaci výrobních postupů, zatímco jiné umožňují vytvořit polymery s přidanou hodnotou.
Syntetické polymery jsou snadno získatelné a mají obvykle nízké produkční náklady. Za účelem zvýšení užitečnosti těchto polymerů je v posledních letech trend přídavku aktivní látky pro zvýšení mikrobiální bezpečnosti a jakosti potravin [92].
Vodorozpustné polymery
Ve vodě rozpustné polymery, které vykonávají různé užitečné funkce, jako je zahušťování, vytváření gelů apod., se používají pro celou řadu aplikací, včetně zpracování potravin, při úpravě vody, papíru, zušlechtění olejů a využití zemního plynu, v čisticích prostředcích a výrobcích pro osobní péči, léčivech, nátěrových hmotách i při těžbě ropy [93].
Ve vodě rozpustné polymery mohou být rozděleny do následujících tří skupin:
a) syntetické, které se vyrábějí polymerací monomerů syntetizovaných z ropy nebo zemního plynu;
b) polosyntetické, které se vyrábí chemickou derivatizací přírodních organických materiálů (např. celulóza);
c) přírodní zahrnující mikrobiální metabolity a materiály živočišného původu [93].
60 % ve vodě rozpustných polymerů používaných v roce 2013 byly syntetického původu, 25 % byly přírodní, a 15 % bylo polosyntetických [93].
Tato práce se dále zabývá hydrofilními polymerními matricemi, které mají potenciální uplatnění v potravinářském průmyslu. Polyvinylalkohol se jeví jako vhodná a perspektivní polymerní matrice pro takové aplikace.
Polyvinylalkohol
V posledních letech četná průmyslová odvětví hledají možnosti snižování své závislosti na látkách na bázi ropy, mimo jiné i z důvodu zvyšujícího se zájmu o ochranu životní prostředí. To vede ke zkoumání nových materiálů, šetrnějších
23
k životnímu prostředí a jejich používání namísto konvenčních, těžce odbouratelných polymerů. Obrovský nárůst výroby a použití syntetických polymerů v našem životě má za následek generování velkého objemu plastových odpadů. Díky problémům s jejich likvidací, jakož i přísnější legislativní předpisy, řídí se velká část vědeckých výzkumů směrem k eko-kompozitním materiálům. Ve snaze vyřešit problémy způsobené plastovými odpady je vynaloženo mnoho úsilí získat materiály šetrné k životnímu prostředí. Mnozí vědci pracují na substituci plastů z ropy za biodegradovatelné materiály s podobnými vlastnostmi a nízkými produkčními náklady [94].
Některé syntetické polymery z neobnovitelných zdrojů, jako je například polyvinylalkohol (PVOH), jsou také biologicky odbouratelné. Proto před nedávnem začal přitahovat PVOH velkou pozornost díky své vynikající flexibilitě, transparentnosti, houževnatosti a relativně nízké ceně, a to zejména v době vysokých cen ropy [94, 95].
Podle Směrnice Komise EU 2010/67/EU je PVOH pod označením E 1203 definován jako syntetická pryskyřice připravená polymerací vinylacetátu, po níž následuje částečná hydrolýza vzniklého esteru v přítomnosti alkalického katalyzátoru [96].
PVOH je hydrofilní polymer s vynikajícími filmotvornými, emulgačními a adhezními vlastnostmi. To také dodává dobrou pevnost v tahu a biologickou rozložitelnost vzniklým kompozitům. PVOH byl také schválen pro použití jakožto obalový materiál masa a drůbežích produktů podle USDA – United States Department of Agriculture (Americké ministerstvo zemědělství). PVOH se jeví velmi přijatelným syntetickým polymerem, protože je vysoce polární a kontrolovatelně rozpustný ve vodě a vodných roztocích. Mimo to je také biokompatibilní a krystalický polymer s vysokou pevností v tahu, mající vynikající bariérové vlastnosti pro plyny. Jedná se o polymer s jednoduchými C-C hlavními řetězci a polárními postranními –OH a –OCOCH3 skupinami (obr. 5) [1-3, 94]. Z hlediska mechanických vlastností je pevnost v tahu 35–50 MPa a dá se několikanásobným dloužením zvýšit ve směru orientace až na 400 MPa [97]. Bezvodý PVOH netaje a do 140 °C celkem nemění své vlastnosti. Při vyšší teplotě měkne a při teplotách nad 200 °C se rozkládá a uhelnatí. Teplota skelného přechodu pro částečně hydrolyzovaný PVOH je kolem 60 °C a pro plně hydrolyzovaný cca 85 °C. Teplota tání částečně hydrolyzovaného PVOH je kolem 190 °C a se zvyšujícím se stupněm hydrolýzy roste až ke 230 °C. Teplota zpracování je 120–150 °C, je však nezbytné použití změkčovadel [97, 98].
24
Obr. 5: Chemická struktura a) částečně hydrolyzovaného, b) plně hydrolyzovaného polyvinylalkoholu [99]
PVOH nemůže být připraven přímou polymerací z monomeru vinylalkoholu (přechází ve stabilnější formu – acetaldehyd), proto je synteticky připravován radikálovou polymerizací vinylacetátu na polyvinylacetát a následně hydrolyzován na polyvinylalkohol [2, 91, 97, 99]. PVOH se získává ve formě bílého prášku. Podle stupně hydrolýzy lze získat produkty obsahující jen alkoholické skupiny. Při neúplné hydrolýze se však získají výrobky s různými fyzikálními vlastnostmi (viz obr. 6). PVOH má silné polární vazby a makromolekuly mezi sebou tvoří vodíkové můstky. Obsahují část hmoty v krystalickém stavu a jeho obsah se s rostoucím stupněm hydrolýzy zvyšuje [1, 2, 97].
25
Obr. 6: Závislost vlastností polyvinylalkoholu na stupni hydrolýzy a molekulové hmotnosti [99]
V amorfním stavu je díky postranním –OH skupinám PVOH rozpustný ve vodě, fenolu a kyselinách. V organických rozpouštědlech není rozpustný.
Rozpustnost ve vodě se dá redukovat nejčastěji působením formaldehydu nebo účinkem kyselin, kdy dochází k zesítění éterovými můstky [1, 94, 97].
Při polymerním síťování dochází k vzájemnému propojení jednotlivých makromolekul dostatečně pevnými vazbami. Zesítěný polymer je nerozpustný, ve vhodném rozpouštědle dochází jen k jeho nabobtnání [91]. Avšak většina doposud používaných síťovacích činidel je nejen pro člověka toxických a tak je jejich potenciální využití pro materiály pro kontakt s potravinami či biomateriály limitováno. K překonání těchto nevýhod jsou zkoumány některé netoxické či méně toxické látky s vhodnými funkčními skupinami a jednoduché techniky modifikace PVOH pro zlepšení mechanických vlastností a odolnosti vůči vlhkosti výsledných polymerních fólií. Jednou ze zkoumaných skupin jsou karboxylové kyseliny. Vzhledem k jejich multi-karboxylové struktuře by se interakce mohly uskutečnit mezi karboxylovými skupinami kyseliny a hydroxylovými skupinami PVOH [94].
Je však obtížné vyrobit PVOH film zpracováním jeho taveniny, protože jeho hodnota teploty tání Tm je příliš blízko k jeho hodnotě teploty rozkladu Td.
26
Navíc má PVOH špatnou odolnost proti vodě. Tyto nedostatky omezují jeho širší uplatnění, zejména v potravinářském průmyslu jako balicí fólie.
Pro vyřešení těchto nedostatků byly zkoumány různé fyzikální nebo chemické modifikace PVOH, včetně míchání s jinými látkami. Tyto metody však nemají plně vyhovující výsledky. Například směsi PVOH s jinými polymery nebyly připraveny pomocí zpracování v tavenině. Způsoby přípravy PVOH filmů pomocí metody odlévání z těchto důvodů vytváří vhodnou alternativu konvenčním metodám zpracování polymerů [95]. Bylo provedeno několik výzkumů zabývajících se mísením PVOH s dalšími biopolymery, jako je například chitosan [92], škrob, celulóza [100] a želatina [101].
PVOH se používá především na výrobu vláken. Svým chováním připomíná želatinu, proto se běžně používá v potravinářském průmyslu pro výrobu želé a jako zahušťující složka a také se z něho vyrábí obalové fólie (čistá PVOH fólie je špatnou bariérou pro vodní páry, avšak výborně zabraňuje průchodu kyslíku a lipidů [102]). Vzhledem k tomu, že PVOH je netoxický (LD50 pro krysu orálně 2000 mg/kg) a biokompatibilní, je tento polymer předmětem rozsáhlého výzkumu, především pro medicinální aplikace (enkapsulace, krytí ran, hydrogely, nové biokompatibilní polymerní matrice). Dále se používá při výrobě lepidel, oděvů, barev, farmaceutických produktů, stavebních materiálů a keramiky, k preparaci papíru [1, 95, 97, 98].
1.6 Aplikace polymerů v potravinářském průmyslu
Přírodní i syntetické polymery mají široké využití v potravinářkém průmyslu.
Příklady použití jak přírodních, tak syntetických polymerů jsou uvedeny v tabulce 5.
Z hlediska objemu zpracovávané suroviny patří do jedné z nejvýznamnějších aplikací použití polymerů pro obalové materiály. V současné době se používá několik typů materiálů pro balení potravinářských produktů. Avšak plasty jsou prozatím tou nejlepší volbou z několika důvodů. Jedná se především o jejich lehkost a nízkou výrobní cenu [80, 103]. Použití polymerů, jak přírodních, tak syntetických, je významně rozšířeno v oblasti obalové techniky potravinářského průmyslu a dochází k jejich neustálému vývoji a optimalizacím.
27
Tabulka 5: Příklady polymerů používaných v potravinářském průmyslu Typ polymeru Původ Aplikace
Celulóza Přírodní
polysacharid
Zahušťující látka, ochranný nátěr, přísada do biorozložitelných obalů
Škrob Přírodní
polysacharid
Adhezivum, přísada
do biorozložitelných obalů
Chitin Přírodní
polysacharid
Adhezivum, pojivo barviv
Kolagen Přírodní
protein
Obalový materiál Polyhydroxyalkanoáty Přírodní
polyester
Biorozložitelné obaly
Polyamid Syntetický Obalový materiál, bariérová vrstva vícevrstvých obalů
Polylaktid Syntetický Biorozložitelný obal
Polyvinylpyrolidon Syntetický Zahušťující látka, absorbent Polyolefiny Syntetický Obalový materiál
Obal je důležitým ochranným faktorem v potravinářském průmyslu a dominují zde polymery získané z ropných produktů. V moderní době byl obalový materiál identifikován jako nedílná součást zpracovatelského postupu v potravinářském průmyslu. Obal obecně funguje jako bariéra mezi obsahem a vnější atmosférou a má primárně tři základní úkoly:
a) ochranná funkce;
b) podávat informace;
c) umožnit či ulehčit přepravu [80].
Nicméně se podstatně zvýšilo množství výzkumů zahrnujících výrobu a charakterizaci biologicky odbouratelných filmů, a to především z důvodu zájmů minimalizovat ekologický dopad způsobený používáním konvenčních syntetických obalových materiálů. Některé biopolymery byly využity pro rozvoj výroby ekologického balení potravinářských surovin [80].
Významná část výzkumů takových filmů byla provedena výrobou s použitím obnovitelných zdrojů, tj. produktů nebo vedlejších produktů získaných ze zemědělství nebo ze zemědělsko-průmyslového odvětví. Takovým příkladem může být celulóza či extraktivní látky ze dřeva nebo látky získatelné z produktů po fermentaci syrovátky. Využití takových polymerů je různorodé: mulčovací fólie, materiály pro „zelenou“ výstavbu rodinných domů, obaly a pomůcky pro transport a přesazování rostlin a v neposlední řadě polymery s antimikrobiálními vlastnostmi, které zlepšují bezpečnost potravin a jejich trvanlivost [80, 104].
28
Hlavními technologiemi aktivních obalů, které již běžně existují a jsou zavedeny v běžném životě, jsou absorbéry kyslíku, regulátory vlhkosti, absorbéry etylenu, emitéry etanolu a oxidu uhličitého, ale také antimikrobiální systémy. Migrace látek z obalu do produktů, které způsobují změnu vůně, pachuť nebo vznik jiných látek v potravině, může představovat riziko, pokud dojde k migraci za podmínek, které mohou působit regulační problémy. Další interakce, které by mohly mít vliv na jakost a/nebo bezpečnost výrobků, je sorpce komponent produktu do obalu. Některé z těchto interakcí mohou nakonec ovlivnit celkovou integritu obalu a tím celý produkt [80].
Antimikrobiální balení je jedním z nejslibnějších typů aktivního obalového systému. Již byla vyvinuta řada antimikrobiálních obalů použitých pro inhibici některých bakterií v potravinách, ale doposud existují překážky k jejich komerčnímu použití [94]. Je to způsobeno především jejich vysokou výrobní cenou a použitím antimikrobiálních aditiv, která nejsou vhodná pro kontakt s potravinou [80]. Také z těchto důvodů dochází k inovacím konvenčních obalů za vzniku aktivních obalů, které reagují na poptávku spotřebitelů po prodloužení trvanlivosti zpracovaných potravin a minimálním přidání konzervačních látek do potravinářských výrobků. To souvisí také s přísnými předpisy pro aditivní látky, které mohou být u potravin použity.
Antimikrobiální obalové systémy
Jednou z výrazných inovací z pohledu přidané hodnoty a bezpečnosti balených potravin představují antimikrobiální obalové systémy. Jedná se o aktivní typ obalovin přinášející prodloužení životnosti, zvýšení bezpečnosti, kvality a senzorických vlastností balených potravin [105]. Vedle toho také probíhá vývoj tzv. inteligentního balení, které představuje pasivní přístup v bezpečnosti a kvalitě potravin [77, 106].
Současně, a na rozdíl od již vyřešeného snížení hmotnosti obalu díky použití polymerů namísto konvenčních materiálů, je také hlavní hnací silou ke zvýšení celkového zastoupení ekologických obalových materiálů v celém potravinovém řetězci vývoj nových ekologicky udržitelných, recyklovatelných a/nebo biologicky odbouratelných obalů [77, 106].
Ke kažení potravin dochází mimo jiné z důvodu přítomnosti bakterií, kvasinek a plísní, ale jen určité mikrobiální druhy obvykle napadají určitý typ potravin a to především na jejich povrchu [63, 64]. Aktivní obal je tedy odpovědí na poptávku spotřebitelů po potravinách neobsahujících konzervační činidla. Výrobci a dodavatelé materiálů zaměřili svá úsilí na rozvoj obalových systémů, které jsou více aktivní a agresivní při ochraně potravin proti
29
mikrobiální kontaminaci [104]. Aktivní antimikrobiální technologie balení potravin je založena na antimikrobiálních činidlech, která jsou:
a) začleněna do polymerní struktury;
b) imobilizována na povrchu.
U obou typů se předpokládá, že regulují růst nežádoucích mikroorganismů.
Mezi běžné mikroorganismy, které kontaminují potraviny a nápoje patří např.
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Salmonella, Clostridium perfringens a Bacillus cereus [80].
Jeden z klíčových problémů technologie antimikrobiálních polymerních obalů spočívá v neřízeném uvolňování antimikrobiálního činidla z polymerního nosiče [77]. Uplatnění účinných látek je proto na území EU striktně kontrolováno a regulováno řadou nařízení [107]. Také na území mimo EU existuje řada legislativních regulací. Příkladem může být organizace FDA ve Spojených státech, která upravuje použití antimikrobiálních látek vhodných pro začlenění do obalu pro potraviny. Podle úřadu FFDCA (Federal Food, Drug and Cosmetic Act) organizace FDA zajišťuje, aby tyto antimikrobiální aplikace byly bezpečné s ohledem na jejich příjem konzumentem potravou [80].
1.7 Imobilizace BAL do polymeru
Imobilizace je metoda krátkodobého nebo dlouhodobého ukotvení fyzikálními nebo chemickými postupy. Tato metoda si získala velkou pozornost z hlediska zabudování biologicky aktivních látek pro dlouhodobé použití [108].
Imobilizace BAL do polymerních matric lze principiálně uskutečnit pomocí dvou metod, kdy se látky imobilizují buď na povrch, nebo do celého objemu systému [4, 57, 109].
Povrchová imobilizace BAL může být zprostředkována pomocí nanesení tenké vrstvy obsahující relevantní množství BAL (procesy koextruze, nátěry, máčení), anebo prostřednictvím vazebných či nevazebných interakcí znázorněných na obrázku 7. Hlavní způsoby imobilizace BAL jsou adsorpce na polymer prostřednictvím elektrostatických interakcí, ligand – receptor interakcí (jako je tomu v párování biotin – avidin) a připojení kovalentní vazbou (obr. 7).
Nekovalentní adsorpce je někdy žádoucí, např. v některých aplikacích pro podávání léčiv. Interakce mezi ligandem a receptorem je atraktivní především v povrchových biokonjugacích. Nicméně kovalentní imobilizace nabízejí několik výhod tím, že vznikají nejstabilnější vazby mezi sloučeninou a povrchem polymeru. V případě aktivních aplikací balení potravin kovalentní vazba zajišťuje, že biologicky aktivní sloučenina nebude migrovat nebo se bude uvolňovat postupně do potravin [110].
30
Obr. 7: Imobilizace BAL na polymerní povrch prostřednictvím a) elektrostatických interakcí, b) interakcí mezi ligandem a receptorem,
c) kovaletních vazeb [110]
Polymerní systémy modifikované pomocí imobilizace BAL v celém objemu lze rozdělit na nemigrační bioaktivní systémy a migrační bioaktivní systémy, umožňující mnohdy i kontrolované uvolňování BAL do prostoru mezi obalem a produktem (obr. 8). U polymerního systému s nemigrující látkou je BAL ukotvena fyzikálně nebo pomocí jejich funkčních skupin nebo kovalentních vazeb. Běžnými BAL pro takovéto systémy jsou např. enzymy, peptidy, polysacharidy. Naproti tomu u polymerních systémů s BAL, která se řízeně uvolňuje do prostředí, se používá často biodegradovatelných polymerů pro dosažení postupného uvolňování [111].
Obr. 8: Schéma a) nemigračního bioaktivního systému; b) migračního bioaktivního systému s netěkavou BAL; c) migračního bioaktivního systému
s těkavou BAL [111]
31
Kinetika uvolňování BAL z polymerních matric
Hnací silou uvolňování nízkomolekulárních BAL z polymerní matrice je koncentrační gradient. V tomto případě lze na proces difúze BAL aplikovat zákonitosti popsané tzv. Fickovými zákony [113].
Pro statický systém platí první Fickův zákon (1), který popisuje závislost mezi hustotou difúzního toku a gradientem koncentrace.
𝐽 = −𝐷𝑑𝑐
𝑑𝑥 (1)
kde: J difúzní tok [mol/cm2s] představuje množství difundované BAL za jednotku času skrze plochu kolmou na směr proudění; c koncentrace BAL [mol/cm3]; x vzdálenost [cm] ve směru toku; dc/dx je vyjádření koncentračního gradientu (je roven 0, jestliže rychlost pohybu molekul oběma směry je stejná);
D je mírou mobility BAL v polymerní matrici.
Jedná se o přestup hmoty, a tedy lze aplikovat bilanci difúzního toku skrze tenkou vrstvu polymerního filmu. Dosazením za J z 1. Fickova zákona s předpokladem, že D je konstantní, získáme 2. Fickův zákon (2), který popisuje podmínky za nestabilního stavu [113, 114]:
𝐷𝜕𝑥𝜕2𝑐2 = 𝜕𝑐𝜕𝑡 (2)
kde: D je mírou mobility BAL v polymerní matrici; c koncentrace BAL [mol/cm3]; x vzdálenost [cm] ve směru toku; t čas. V ustáleném stavu je
𝜕𝑐/𝜕𝑡 = 0 a proto nenastává akumulace BAL ve filmu.
Dosažení ustáleného stavu difúze BAL skrze polymerní film je otázkou hodin. To je obvykle zanedbatelné s životností balené potraviny, proto se spíše v praxi sleduje až stav po ustálení rovnováhy [113, 114].
Je-li tedy permeační rychlost za ustáleného stavu Q (3), pak
𝑄 = 𝑃̅
𝐿∙ 𝐴 ∙ ∆𝑝 (3)
kde: L tloušťka vrstvy; 𝑃̅ permeabilita (𝑃̅ = D·S); D je mírou mobility BAL v polymerní matrici; S koeficient rozpustnosti; A plocha.
32
Rovnice pro výpočet Q pak popisuje rychlost permeace jako funkci, jak materiálovou, tak i proměnnou související s okolními podmínkami (teplotou, tlakem, vlhkostí) [113, 114].
V případě, že se materiál skládá z více vrstev, tak se při výpočtu permeability postupuje analogicky s Ohmovým zákonem – sériové zapojení rezistorů (Rt=ƩRi), tedy:
𝐿𝑡
𝑃𝑇 = ∑ 𝑃𝐿𝑖
𝑖
𝑛𝑖=1 (4)
kde: LT celková tloušťka; Li tloušťka vrstvy i; PT celková permeabilita; Pi permeabilita vrstvy i (předpoklad konstantní plochy A).
V případě vodorozpustných polymerů souvisí proces vlastní imobilizace a následně kinetiky uvolňování BAL také s konfigurací a konformací polymerní matrice, kdy výraznou roli hraje přítomnost příčných vazeb, které jsou do systému zaváděny prostřednictvím síťovacích reakcí.
Síťování probíhá díky funkčním skupinám přítomným v polymeru. Síťování se běžně používá pro zlepšení mechanických a tepelných vlastností a snížení rozpustnosti polymeru, čímž se otevírají nové možnosti aplikací pro tento materiál [58, 112].
Síťování
Polymerní síť může vzniknout tehdy, pokud se vytvoří dostatečně velký počet intermolekulárních uzlů sítě. Tato spojení mohou mít charakter chemický či fyzikální. Pokud uzly sítě vznikají chemickou reakcí, označují se jako kovalentně síťované systémy. V případě vzniku uzlů prostřednictvím mezimolekulových interakcí, které nejsou spojeny se vznikem chemických vazeb, se mluví o fyzikálně síťovaných systémech. Existují čtyři mechanismy výstavby takových systémů.
a) polyadice nebo polykondenzační reakce nízkomolekulárních látek – dochází k vytváření sítě prostřednictvím reakcí vícefunkčních reaktantů (např.
epoxidové a fenolové pryskyřice);
b) polymerační řetězová reakce, síťovací polymerace (kopolymerace) – polymerní sítě vznikají prostřednictvím řetězové reakce za přítomnosti ko- monomeru schopného zprostředkovat tvorbu příčných intermolekulárních spojení během reakce (např. kopolymerace styrenu a divinylbenzenu);
33
c) spojování reaktivních konců nízkomolekulárních polymerů – nedochází zde k syntéze dlouhých řetězců nízkomolekulárních látek, jako je tomu u polyadičních či polykondenzačních reakcí (např. reakce vícefunkčních izokyanátů s polyoly);
d) zavedení příčných vazeb do vysokomolekulárních polymerů – příkladem je vulkanizace pryže či radiační síťování polyetylenu [90].
Disertační práce se dále zabývá první uvedenou skupinou, a to reakcemi funkčních skupin. Zesítění chemickými reakcemi je důležitý proces v technologii polymerů. Vysoký stupeň zesítění vede k vytvoření trojrozměrné sítě polymerů nebo prostoru, ve kterém jsou všechny polymerní řetězce spojeny, za vzniku jedné velké molekuly. Při vysokém stupni zesítění polymery získají pevnost, rozměrovou stabilitu a odolnost vůči teplu a rozpouštědlům [34].
Vzhledem k jejich struktuře sítě takové polymery nemohou být rozpuštěné v rozpouštědlech a nemohou být měkčené teplem; silný ohřev pouze způsobí rozklad. Polymery nebo pryskyřice, které jsou transformovány do zesítěného produktu, jsou teplem tvrditelný typ. Zcela běžně se tyto materiály připravují úmyslně jen v částečně polymerizovaném stavu (tzv. prepolymery) tak, že mohou být deformovány do vyhřívané formy a pak vytvrzeny zesítěním [90].
PVOH může být přímo síťován pomocí multifunkčních sloučenin reakcí s hydroxylovými skupinami. Tyto typy reakcí mají průmyslový význam, protože poskytují způsoby, jak získat lepší odolnost proti vlhkosti, nebo k rychlému zvýšení viskozity. Síťovací činidla, která lze použít, zahrnují glyoxal, glutaraldehyd, močovina-formaldehyd, melamin-formaldehyd, trimetylolmelamin, boritan sodný nebo kyselinu boritou a izokyanáty. Většina reakcí je katalyzovaná buď kyselinou anebo bází. PVOH molekuly jsou tedy volně zesítěné, což zabraňuje rozpustnosti, ale umožňuje bobtnání. Účinek vysoké teploty při zpracování PVOH filmu nebo povlaku je obecně postačující k dosažení zesítění, avšak tento způsob není kompatibilní s většinou BAL [98].
Běžně se v průmyslu pro PVOH používá jako síťovací činidlo glyoxal či glutaraldehyd, avšak jedná se o toxické látky [58].
Enkapsulace
Technika enkapsulace byla popsána zejména v procesu, ve kterém jsou malé částice nebo kapičky obklopeny homogenním nebo heterogenním povlakem, a tvoří kuličky nebo kapsle s různými aplikacemi. V tomto smyslu jsou mikročástice, mikrokapsle nebo mikrokuličky definovány jako produkt procesu mikroenkapsulace v závislosti na jejich morfologii a vnitřní struktuře. V prvním případě je BAL zahrnuta v pevné nebo kapalné formě v jádru částice. Zatímco
34
v mikrokuličce je účinná látka rozptýlena a imobilizována v matrici, která tvoří celý objem částice [115].
Enkapsulace tyto látky stabilizuje, chrání proti nutričním ztrátám a v neposlední řadě umožňuje využití jakožto antimikrobiálních látek [115].
Enkapsulace byla také vyvinuta pro zapouzdření aktivní látky do formy částice za účelem ochrany aktivní látky v okolním prostředí nebo kontroly její kinetiky uvolňování do média [116]. Polymerní systémy jsou široce použity pro zapouzdření a dodání účinných látek. Mezi různými typy nosičů jsou polymerní částice jednou z nejatraktivnějších strategií vzhledem k jejich flexibilní a reprodukovatelné výrobě, kontrole velikosti či tvaru polymerních částic. Proto byly částice předmětem mnoha studií pro efektivní zapouzdření a dodávky aktivních látek [116, 117].
Mnoho metod pro přípravu částic zahrnuje dva hlavní kroky. Příprava emulgovaného systému odpovídá prvnímu stupni, zatímco částice jsou tvořeny během druhého stupně. Tento druhý krok se dosáhne buď srážením anebo gelovatěním polymeru nebo polymerací monomerů. Několik jiných metod nevyžaduje přípravu emulze před získáním částic. Tyto metody jsou založeny na principu srážení polymeru v podmínkách spontánní tvorby disperze nebo díky vlastnímu shlukování makromolekul za vzniku nanogelů nebo polyelektrolytových komplexů z roztoku polymeru [118]. Metoda sušení rozprašováním nabízí širokou škálu možností pro zpracování částic. Během procesu však dochází ke změně parametrů BAL díky expozici vůči teplu a jejich následné degradaci. Zmiňované vlivy vedou k omezení aplikace v potravinářském a farmaceutickém průmyslu [117].
Výroba mikro/nanočástic s nestabilními BAL je provázena několika problémy. Zejména omezené použití technologických přísad, jako jsou povrchově aktivní látky nebo stabilizátory, které mohou indukovat např.
denaturaci bílkovin nebo toxické účinky, výtěžnost produktu a možnost efektivního zapouzdření BAL jsou eliminující [60].
Velmi oblíbenou metodou pro inkorporaci BAL je metoda odpaření rozpouštědla. Existuje několik způsobů, jak vyvolat vysrážení polymeru v emulzi odstraněním jeho rozpouštědla. Obecně platí, že tato metoda vede k produkci sfér, pokud jsou prováděny jednoduchou emulzí olej ve vodě [118, 119]. Speciálním typem pro zapouzdření látek touto metodou je vytvoření mnohonásobné emulze, obzvláště tzv. w1/o/w2 (voda/olej/voda). Hydrofilní aktivní látky mohou být tímto způsobem zabudovány přímo z vodné suspenze.
Je známo, že tento postup přípravy emulze je použitelný pro sloučeniny citlivé na teplotu a má lepší kontrolu velikosti částic a tvaru než příprava částic sušením pomocí rozprašování. Kromě toho mohou být vysoká účinnost zapouzdření a nízký obsah zbytkového rozpouštědla přizpůsobeny nastavením parametrů zpracování [117].
35
V potravinářském průmyslu a biotechnologii je možno mikroenkapsulace využít pro docílení začlenění přísad, jako jsou např. peptidy, proteiny a nukleové kyseliny, polyfenoly, těkavé látky, enzymy a probiotické bakterie v malých kapslích nebo částicích [115].
1.8 Současné trendy v použití nisinu a kyseliny mléčné v polymerních matricích
Nisin svou malou velikostí molekuly umožňuje výrobu filmů, které ho uvolňují po kontaktu s potravinami nebo kapalinou. Běžně je nisin začleněn do povlaku spolu s kyselinami a jen občas s jinými sloučeninami. Nisin se často objevuje společně s kyselinou etylendiamintetraoctovou (EDTA), zejména při požadovaném antimikrobiálním účinku proti gramnegativním bakteriím [77,120,121].
Většina studií uvádí snížení log10 pro filmy obsahujících nisin v rozmezí 3 a níže, ale některé studie uvádějí snížení log10 o 6 až 9 řádů. Zejména studie Kim et al. [63] a Lee et al. [66] podávají zprávu o velkém snížení log10 mikrobiálního růstu při použití obalových materiálů s nisinem. Jejich studie byly provedeny s papírem potaženým vrstvou z nisinu a jeho expozici mikroorganismy v živné půdě (mléku a pomerančovém džusu). Je možné, že kapalné médium přispělo k vyššímu antimikrobiálnímu působení, než jakého by bylo možno dosáhnout na relativně pevném povrchu potravin. Dvě jiné studie popisují snížení log10 o cca 6 řádů. Další studie testovala účinek nisinu v celulóze nanesené na povrchu polyetylenové folie proti Listeria monocytogenes na tofu [65] a párcích [122].
Tyto příklady naznačují, že fólie potažené vrstvou obsahující nisin mají také potenciálně značnou účinnost stejně jako v nápojích a tekutých potravinách.
Některé testy byly provedeny pomocí povlaku s nisinem nebo fólií obsahujících nisin na grampozitivních i gramnegativních bakteriích; inhibice koliformních bakterií Escherichia coli nebo Salmonella enterica subsp. serovary byla velmi nízká nebo žádná (viz obr. 9) [77].
