MASARYKOVA UNIVERZITA
PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Sledování elektrické
aktivity kardiomyocytů pomocí
elektrochemického sensoru
Bakalářská práce
Lívia Vidová
Vedoucí práce: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc. Brno 2017
Bibliografický záznam
Autor: Lívia Vidová
Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce: Sledování elektrické aktivity kardiomyocytů pomocí elektrochemického sensoru
Studijný program: Biochemie
Studijní obor: Aplikovaná biochemie
Vedoucí práce: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc Akademický rok: 2016/2017
Počet stran: 53
Klíčová slova: Kardiomyocyty, biosensor, elektrická aktivita, biosenzory na bázi buněk
Bibliografický záznam
Autor: Lívia Vidová
Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochémie
Názov práce: Sledovanie elektrickej aktivity kardiomyocytov pomocou elektrochemického senzora
Študijný program: Biochémia
Študijný odbor: Aplikovaná biochémia
Vedúci práce: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc Akademický rok: 2016/2017
Počet strán: 53
Kľúčové slová: Kardiomyocyty, biosenzor, elektrická aktivita, biosenzory na báze buniek
Bibliographic Entry
Author: Lívia Vidová
Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis: Monitoring of the electric activity of cardiomyocytes using electrochemical sensor
Degree Programme: Biochemistry
Field of Study Applied Biochemistry Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc Academic Year: 2016/2017
Number of Pages: 53
Keywords: Cardiomyocytes, biosensor, electrical activity, cell based biosensors
Abstrakt
Od doby, kdy byly objeveny lidské pluripotentní kmenové buňky a z nich diferencovány kardiomyocyty, se mohou tyto buněčné typy využívat jako model pro testování různých léčiv a také ke sledování jejich fyziologických vlastností. Spojením kardiomyocytů a elektrochemického sensoru můžeme získat analytický přístroj vhodný ke sledování jejich elektrické aktivity. V teoretické části práce se věnuji popisu biosensoru a speciálně jednoho typu převodníku konkrétně elektrochemického převodníku. Také popisuji základní vlastnosti kardiomyocytů, jakož i princip jejich elektrické aktivity. V experimentální části práce jsem se snažila změřit potenciál vznikající v okolí imobilizovaných kardiomyocytů v reálném čase, za použití dvou druhů elektrochemického převodníkového systému. Zaznamenaný signál jsem následně vyhodnocovala, přičemž jsem se snažila zjistit, zda existuje v získaném signálu nějaká periodicita. Také jsem pozorovala vliv modulačních látek na změnu potenciálu či frekvence tlukotu. Hlavním cílem bylo zjistit, jestli je vůbec možné zaznamenávat elektrickou aktivitu produkovanou kardiomyocyty pomocí daných převodníkových systémů a zjistila jsem, že podle mých výsledků to možné je.
Abstrakt
Odkedy boli objavené ľudské pluripotentné kmeňové bunky a z nich diferencované kardiomyocyty, sa môžu tieto bunkové typy využívať ako model na testovanie rôznych liečiv a taktiež na sledovanie ich fyziologických vlastností. V spojení kardiomyocytov spolu s elektrochemickým senzorom môžeme získať analytický prístroj vhodný na sledovanie ich elektrickej aktivity. V teoretickej časti práce sa venujem popisu biosenzora a špeciálne jedného typu prevodníka konkrétne elektrochemického prevodníka. Taktiež popisujem základné vlastnosti kardiomyocytov ako aj princíp ich elektrickej aktivity. V experimentálnej časti práce som sa snažila zmerať potenciál vznikajúci v okolí imobilizovaných kardiomyocytov v reálnom čase, za použitia dvoch druhov elektrochemického prevodového systému. Zaznamenaný signál som následne vyhodnocovala, pričom som sa snažila zistiť či existuje v získanom signáli nejaká periodicita. Tiež som pozorovala vplyv modulačných látok na zmenu potenciálu či frekvenciu tlkotu. Hlavným cieľom bolo zistiť či je vôbec možné zaznamenávať elektrickú aktivitu
produkovanú kardiomyocytmi pomocou daných prevodových systémov a zistila som, že podľa mojich výsledkov to možné je.
Abstract
Ever since human pluripotent stem cells were discovered and from them differentiated cardiomyocytes, these cell types can be used as a model for testing various drugs. They can also be used for monitoring of their physiological features. When we convert cardiomyocytes together with an electrochemical sensor we can get analytical instrument suitable for monitoring their electrical activity. In theoretical part of my thesis I focused on description of biosensor and especially on one type of converter – particularly on electrochemical converter. I also described basic features of cardiomyocytes as well as the principle of electrical activity. In experimental part of my thesis I tried to measure the potential emerging around imobilised cardiomyocytes in real time, while using two types of electrochemical converting system.
I subsequently evaluated the recorded signal and I tried to find out if there was a periodicty in this recorded signal. I also monitored the influence of modulative substances on the change of potential or the frequency of the beating. The main objective was to find out if it is even possible to record electrical activity produced by cardiomyocytes using these converting systems and I found out that based on my results it is possible.
Poďakovanie
Na tomto mieste by som chcela poďakovať hlavne pánovi doc. RNDr. Petrovi Skládalovi CSc, za odborné vedenie, poskytnuté konzultácie a cenné rady pri spracovaní teoretickej časti práce ako aj pri vyhodnocovaní získaných výsledkov. Ďalej by som chcela poďakovať odbornej pracovníčke Mgr. Šárke Jelínkovej za opakované poskytnutie biologického materiálu.
Prehlásenie
Prehlasujem, že som svoju bakalársku prácu vypracovala samostatne s využitím informačných zdrojov, ktoré sú v práci citované.
Brno 09.05.2017 ...
Lívia Vidová
Obsah
ZOZNAM SKRATIEK ...11
1. Úvod...12
TEORETICKÁ ČASŤ ...13
2. Biosenzory ...13
2.1 Definícia biosenzoru ...13
2.2 Elektrochemické prevodové systémy ...14
2.2.1 Potenciometrické bioelektródy... 15
3. Srdce ...16
3.1 Funkcia srdcového svalu ...16
3.2 Elektrická aktivita srdca ...17
3.3 Mechanická aktivita srdca ...20
4. Kardiomyocyty ...22
5. Biosenzory na báze buniek ...23
5.1 Impedančná technológia ...24
5.1.1 Princíp ... 24
5.2 Priame meranie potenciálu kardiomyocytov ...25
6. Ciele bakalárskej práce ...26
EXPERIMENTÁLNA ČASŤ ...27
7. Materiály a inštrumentácia ...27
7.1. Chemikálie a médiá ...27
7.2 Biologický materiál ...27
7.3 Inštrumentácia...27
7.3.1 CC3.W1 senzor ... 27
7.3.2 InterDigitated gold Elctrode (IDE) ... 29
7.3.3 Elektronická jednotka ... 29
7.3.4 Ďalšia použité prístroje ... 31
7.4 Použité programy ...31
8. Metódy ...32
8. 1 Príprava kardiomyocytov ...32
8.2 Príprava senzoru k imobilizácii kardiomyocytov ...32
8.3 Reálne meracie usporiadanie ...33
8.4 Priebeh merania s kardiomyocytmi...33
8.4.1 Prídavok modulačných látok... 35
9. Výsledky a diskusia ...36
9.1 Vyhodnocovanie výsledkov zo senzoru typu CC3.W1 ...36
9.2 Vyhodnocovanie výsledkov zo senzoru typu InterDigitated gold Electrode ...38
9.2.1 Prídavok izoproterenolu ... 46
10. Záver ...51
ZOZNAM LITERATÚRY ...52
ZOZNAM SKRATIEK
AP akčný potenciál, action potential AV Atrioventrikulárny (uzol)
BMP4 kostný morfogenetický proteín 4, bone morphogenetic protein 4 CCTL Center for Cell Therapy line
CMs kardiomyocyty, cardiomyocytes DAQ data acquisition (systém)
EB embryonálne teliesko, embryoid body EtOH etanol, ethanol
hESC ľudská embryonálna kmeňová bunka, human embyroid stem cell
hiPSC ľudské indukované pluripotentné kmeňové bunky, human induced pluripotent stem cell
IDE InterDigitated gold Electrode
ISE iónovo selektívna elektróda, ion selective electrode NCE normálna kalomelová elektróda, normal calomel electrode NCX sodíkovo-vápnikoý výmenník, sodium-calcium exchanger NHE normálna vodíková elektróda, normal hydrogen electrode MEF myšacie embryonálne fibroblasty,
PSC pluripotentná kmeňová bunka, pluripotent stem cell SA sínusoatriálny (uzol)
SCE štandardná (nasýtená) kalomelová elektróda, standard calomel electrode SERCA Sarco/endoplasmic reticulum calcium-ATPase
1. Úvod
Biosenzory na báze buniek využívajú fyziologickú odpoveď celých buniek na detekciu biologicky aktívnych zlúčenín. Tieto druhy biosenzorov sa dajú použiť na testovanie biologických účinkov vo vývoji liekov, v klinickej diagnostike, v základných medicínskych výskumoch a environmentálnom sledovaní rôznych nebezpečných chemikálií. Zároveň umožňujú zavedenie a priebežnú optimalizáciu fenotypového testovania s najnovšími prístupmi zameranými na biologický význam buniek. In vitro biosenzory na báze buniek dokážu promptne a citlivo odrážať rôzne farmakologické účinky liekov.
Odkedy boli objavené pluripotentné kmeňové bunky (PSCs), ako sú napríklad ľudské embryonálne kmeňové bunky (hESC) a z nich diferencované kardiomyocyty (CMs), stali sa dôležitým modelom na testovanie liečiv aj ochorení. Pokiaľ sú použité kardiomyocyty, ide o model na testovanie liekov a ochorení srdca. Tieto lieky majú však často vedľajšie účinky, ktoré sú veľkým problémom v ich vývoji a hlavným dôvodom ich sťahovania z trhu. Väčšina z týchto liekov ovplyvňuje pohyb iónov cez membránu kardiomyoctov, v dôsledku čoho sa narúša elektrická aktivita srdca. Snahou je lieky podrobiť sérii prísnych „vyšetrení“ na identifikáciu a prípadné odstránenie vedľajších účinkov predtým, ako vstúpia do klinických štúdií a následne na trh. Pre tieto účely sa využívajú už spomínané in vitro testy, ktoré sú určené hlavne na posúdenie interakcie rôznych zlúčenín a liečiv s iónovými kanálmi podieľajúcimi sa na udržovaní akčného potenciálu. Pre tento druh analýzy existujú prístroje, ktoré sú však drahé a rozmerné, preto je snaha získať menšiu, lacnejšiu náhradu, ktorá by vedela účinne zmerať elektrickú aktivitu daných srdcových buniek.
TEORETICKÁ ČASŤ
2. Biosenzory
2.1 Definícia biosenzoru
Biosenzor je analytický prístroj obsahujúci citlivú biologickú zložku, ktorá je v tesnej blízkosti alebo súčasťou fyzikálno-chemického prevodníku. Citlivá biologická zložka sa nazýva biorekogničná časť. Jednotlivé časti biosenzoru môžeme rozdeliť do viacerých skupín.
Biorekogničná časť má dve základné skupiny, a to:
biokatalytická (enzým, organela, bunka, tkanivo, orgán,organizmus) – analyt premieňa v priebehu chemickej reakcie; obvykle vystupuje analyt ako substrát enzýmovej reakcie,
bioafinitná (lektín, protilátka, nukleová kyselina, receptor) – analyt je špecificky viazaný vo vznikajúcom afinitnom komplexe.
Fyzikálno-chemické prevodníky poskytujú signál vhodný k ďalšiemu spracovaniu, môžeme ich rozdeliť do nasledujúcich skupín:
elektrochemické (potenciometria, ampérometria, konduktometria, voltametria) - elektrochemické systémy predstavujú najrozšírenejší typ prevodníka používaného pre konštrukciu katalytických biosenzorov. Na zostavenie elektorchemického meracieho systému sú potrebné najmenej dve elektródy, pracovná (meracia) a referentná. Konštrukčné usporiadanie elektród môže byť veľmi rôznorodé.
optické (fotometria, fluorimetria, luminometria, nelineárna optika) – základom je interakcia svetelného žiarenia s chemickými látkami. Pre konštrukciu katalytických biosenzorov sa využívajú optické techniky ako je absorbancia (pomerne málo), fluorescencia a luminiscencia.
piezoelektrické a akustické – ukázalo sa, že v niektorých anizotropných kryštáloch (kremeň, turmalín, Rochellova soľ) sa pri mechanickom namáhaní generujú orientované dipóly a vzniká elektrické napätie. Tento efekt sa uplatňuje tiež v obrátenom zmysle. Pokiaľ sa na kryštál privedie striedavé elektrické napätie vhodnej (rezonančnej) frekvencie, začne kryštál s rovnakou frekvenciou vibrovať, pritom sa prevažná časť energie uchová v oscilujúcom systéme a nerozptyľuje sa do okolia.
kalorimetrické – využívajú zmeny teploty v priebehu enzýmových reakcií. Pri konštrukcii biosenzorov je to skôr okrajová záležitosť, ale existujú niektoré analyty, pre ktoré môžu byť kalorimetrické prevodníky obzvlášť výhodné (Skládal 2002, 3 - 80).
Obrázok č.1: Zloženie biosenzoru.
2.2 Elektrochemické prevodové systémy
Elektrochemické prevodníky sú najčastejšie používané prevodníky katalytických biosenzorov. Obsahujú vždy najmenej dve elektródy, a to elektródu pracovnú a referenčnú.
Konštrukčné usporiadanie jednotlivých elektród môže byť rôznorodé. Imobilizáciou biorekogničnej vrstvy na pracovnú (mernú) elektródu vzniká bioelektróda.
Referenčné elektródy slúžia ako porovnávací bod pre meranie, respektíve nastavovanie potenciálu pracovných elektród. Ich vlastný potenciál je presne definovaný a pokiaľ možno časovo stály (Skládal 2002, 12). Základné druhy týchto elektród spolu s ich potenciálom sú uvedené v tabuľke dole (tabuľka č. 1):
Tabuľka č. 1: Tabuľka popisujúca základné potenciály základných typov referenčných elektród.
Zdroj: (Skládal: Biosenzory 2002, 13), upravené.
Typ Skratka ENHE (V) (t = 25 °C) ESCE (V) (t = 25 °C) Štandardná vodíková
elektróda
Pt, H2 ǀ H+ (a = 1)
(NHE) 0 - 0,2412
Kalomelové elektródy
Hg ǀ Hg2Cl2 ǀ KCl
Nasýtená (sat.) (SCE) 0,2412 0
Normálna (1 M) (NCE) 0,2801 0,0389
Nasýtená NaCl (sat.) 0,2360 - 0,0052
Argentochloridové elektródy
Ag ǀ AgCl ǀ KCl Nasýtená (sat.) (3 M)
0,197 0,2042
- 0,045 - 0,037 Normálna (1 M)
Ag ǀ AgCl ǀ LiCl (sat. v EtOH)
0,2362 0,140
- 0,005 - 0,101 Merkurosulfátové elektródy
Hg ǀ HgSO4 ǀ K2O4 (sat.) 0,655 0,414
Pracovné elektródy použiteľné pre biosenzory zahŕňajú veľmi širokú škálu materiálov aj konfigurácií; ušľachtilé kovy (Pt, Au), sklený uhlík, grafit a najrôznejšie kompozitné zmesi, vodivé polyméry a organické vodivé soli. Použiteľný rozsah pracovného potenciálu elektródy ide vždy voliť tak, aby nedochádzalo k rozkladu materiálu alebo interferenčným reakciám (rozklad vody alebo iných zložiek pracovného roztoku, redukcia rozpusteného kyslíku) (Skládal 2002, 13).
2.2.1 Potenciometrické bioelektródy
Základom potenciometrie je zmena potenciálu vyvolaná akumuláciou náboja na rozhraní elektródy s roztokom. Historicky veľmi raný typ biosenzoru, prevažne enzýmové elektródy (Skládal 2002, 14). Dochádza tu k meraniu potenciálu pracovnej elektródy oproti referenčnej elektróde. Elektródy nie sú polarizované a meria sa v bezprúdovom stave alebo pri minimálnom prúde blížiacemu sa nule. Vhodnou konštrukciou ide dosiahnuť to, že napätie medzi mernou
a referenčnou elektródou zodpovedá koncentrácii jednej určitej súčasti analyzovaného roztoku, zatiaľ čo ostatné nemajú prakticky žiaden vplyv (merná elektróda je tzv. selektívna) (Martin Vejražka 2008, 5).
Prevodníkom býva iónovo selektívna elektróda (ISE), ide o takú elektródu, ktorá obsahuje membránu priepustnú iba pre určité ióny, vďaka tomu vzniká na membráne potenciálový rozdiel – membránový potenciál. Dochádza tu teda k výmene iónov medzi povrchom elektródy a vzorkou. odozva je logaritmická.
Referenčná elektróda je často integrovanou súčasťou mernej, v núdzovom prípade ju ide zhotoviť v laboratórnych podmienkach (Skládal 2002, 14).
3. Srdce
Srdcový sval je dutý priečne pruhovaný sval, pozostávajúci z dvoch predsiení a dvoch komôr. Srdcový sval tvorí podstatnú zložku srdca ako pumpy, ktorej úlohou je prečerpávanie krvi pretekajúcej z venózneho do arteriálneho systému (Gvozdják, Gvozdjáková 1980, 11).
Bunky srdcového svalu sú podstatne menšie ako bunky kostrového svalstva. Jednotlivé bunky sú navzájom poprepájané interkalárnymi diskami, ktoré zahŕňajú kombináciu mechanického a elektrického prepojenia, čo sú vlastne dve základné funkcie srdca – mechanická a elektrická aktivita. Najväčšie množstvo buniek je prispôsobené mechanickej funkcii, t. j. kontrakcii a relaxácii, teda schopnosti vykonávať mechanickú prácu. Druhá skupina buniek je svojím zložením prispôsobená elektrickej aktivite srdca, t. j. tvorbe a vedeniu vzruchov (Gvozdják, Gvozdjáková 1980, 12). Okrem týchto buniek plniacich funkciu srdca sa v myokarde nachádza spojivové tkanivo, ktoré pozostáva prevažne z kolagénových vláken a z fibroblastov.
3.1 Funkcia srdcového svalu
Hlavnou úlohou srdca je prečerpávanie krvi, udržiavanie minútového objemu, ktorým sa zaisťuje prívod dostatočného množstva kyslíka a živín k orgánom a tkanivám. Touto činnosťou srdce v organizme vykonáva funkciu pumpy (Gvozdják, Gvozdjáková 1980, 55).
Srdce je schopné kontrakcií, ktoré sú strojcom mechanickej práce, táto práca je potrebná práve na prečerpávanie krvi z venózneho do arteriálneho systému. Všetky tieto činnosti
regulujú nervové, hormonálne a humorálne faktory, ktoré veľmi citlivo reagujú na rôzne fyziologické a patologické pomery.
Z tohto hľadiska sú najdôležitejšie tieto dve základné vlastnosti srdcového svalu:
1. excitabilita – schopnosť utvárať a šíriť vzruchy, ktoré dráždia svalové vlákna,
2. kontraktilita – schopnosť skracovania sa myokardiálnych vláken a vykonávanie mechanickej práce (Gvozdják, Gvozdjáková 1980, 55).
3.2 Elektrická aktivita srdca
Bunky plniace elektrickú aktivitu srdca majú schopnosť excitácie a generovania akčného potenciálu. Tieto akčné potenciály iniciujú kontrakcie a tým určujú pulz.
3.2.1 Pokojový membránový potenciál
Za normálnych okolností majú bunky srdca – kardiomyocyty istý pokojový membránový potenciál. Tento pokojový membránový potenciál zabezpečujú hlavne ióny Na+, K+, Ca2+, Cl- a záporne nabité proteíny, ktoré neprechádzajú von z bunky. Koncentrácia jednotlivých iónov na opačných stranách membrány je rozdielna. Vo vnútri bunky je za pokojového stavu vyššia koncentrácia K+ iónov, zatiaľ čo mimo nej je vyššia koncentrácia Na+ iónov. O tento rozdiel koncentrácií sa stará Na/K pumpa, ktorá pumpuje 3 sodné katióny von z bunky a 2 draselné ióny dovnútra bunky. Ďalej má na tejto nerovnováhe podiel membrána, ktorá má za pokojového stavu uzavreté Na kanály, a teda je veľmi zle priepustná pre Na+ ióny.
To vedie k tomu, že sodné katióny sú tlačené do vnútra bunky elektrickou silou, lebo v bunke je záporný náboj; a silou chemickou – koncentračným gradientom, lebo koncentrácia Na+ je intracelulárne podstatne nižšia ako extracelulárne. Napriek tomuto nie sú ióny Na+ vpúšťané do bunky. Pre K+ platí, že jeho koncentračná nerovnováha je vyvážená elektrickými silami (je kladný a vnútrajšok bunky je záporný) a celkom dobre membránou prechádza (Vácha 2013, 12). Čo sa týka iónov Cl-, je ich priepustnosť cez membránu vysoká a ich rovnováha sa teda pasívne prispôsobuje danému stavu. Z toho vyplýva, že koncentrácia Cl- iónov bude vyššia v extracelulárnom priestore. Za pokojového stavu je membrána takmer úplne nepriepustná pre Ca2+ ióny. Avšak aj minimálna zmena priepustnosti membrány dosiahne mohutných tokov vedúcich k zmenám jeho koncentrácie, ktoré často nesú informáciu a ako cytoplazmatické
signály sa podieľajú na riadení bunkových signálov (Vácha 2013, 12). Zmena priepustnosti kanálov na membráne vedie k vzniku akčného potenciálu.
Obrázok č. 2: Rozdiel obsahu jednotlivých iónov v intracelulárnom a extracelulárnom priestore.
Autor: Gibbs-donnan-en.svg: Biezl, derivative work: Looie496. [cit. 2017-04-02], dostupné na www:
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=8969169
3.2.2 Akčný potenciál
V rôznych srdcových bunkách existujú rôzne typy akčného potenciálu, z toho dva typy sú najhlavnejšie. Jeden typ, rýchlej odpovede, sa vyskytuje v normálnych atriálnych a ventrikulárnych kardiomyocytoch a v špecializovaných vodivých vláknach (srdcových Purkyňovych vláknach, iba v patologických stavoch) a je rozdelený do piatich fáz (Koeppen, Stanton 2010, 292). Ako prvé dochádza k rýchlemu nárastu akčného potenciálu, čo je fáza 0.
Je to fáza depolarizácie (Blahút 2012). Pri podráždení od susednej bunky dochádza k uzavretiu draslíkových (K) kanálov a otvoreniu sodných (Na) kanálov, čo vedie k veľkému vstupu Na+ iónov do vnútra bunky.Výsledok je rýchla zmena polarity membrány. Elektrický potenciál sa zmení z -90 mV na +30 mV. Vnútro bunky sa zmenilo na kladné – transpolarizácia (Blahút 2012). Po tejto fáze nasleduje krátky úsek čiastočnej, skorej repolarizácie (fáza 1), je to spôsobené krátkym otvorením K kanálov a výtokom draselných iónov z bunky. Medzitým sa otvoria vápnikové (Ca) kanály, čo zabezpečí pomalý vstup Ca2+ iónov do kardiomyocytu a fáza repolarizácie sa začne pomaly predlžovať, vzniká stav plató (fáza 2), tento stav pretrváva asi
sarkoplazmatického retikula, čím je koncentrácia vápenatých iónov vo vnútri bunky ešte vyššia.
Membrána sa potom postupne repolarizuje (fáza 3), Ca kanály sa uzavrú a K+ ióny postupne vytekajú von z bunky po elektrochemickom gradiente. Vo fáze 4 má kardiomyocyt pokojový membránový potenciál -90 mV. Povrch je elektropozitívny a vnútro je elektronegatívne.
A kardiomyocyt srdca opäť čaká na depolarizačnú vlnu od susednej bunky. Intracelulárne je vysoká koncentrácia K+, extracelulárne je vysoká koncentrácia Na+ a Ca2+ (Blahút 2012).Konečná repolarizácia (fáza 3) sa vyvíja pomalšie ako depolarizácia (fáza 0) (Koeppen, Stanton 2010, 292).
Obrázok č.3: Priebeh akčného potenciálu kardiomyocytu..
Autor:Icewalker. [cit. 2017-04-01], dostupné na www:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Srde%C4%8Dn%C3%AD_potenci%C3%A1ly.svg, upravené
Druhý typ akčného potenciálu, pomalej odpovede, prebieha v sinoatriálnom (SA) uzle, ktorý je prirodzený pacemaker a v atrioventrikulárnom (AV) uzle. SA uzol sa dokáže spontánne depolarizovať a tým udáva frekvenciu depolarizácie, a to tak, že SA uzol vyšle depolarizačnú vlnu a tá sa šíri do ostatných častí srdca – tie preberajú túto vlnu, lebo sa nestíhajú samé spontánne depolarizovať. Tento druh akčného potenciálu nemá skorú repolarizačnú fázu (fázu 1). Pokojový membránový potenciál (fáza 4) buniek s rýchlou odpoveďou je značne negatívnejší ako buniek s pomalou odpoveďou. Vo fáze 4 na konci repolarizácie, keď membrána dosiahne polarizovaný stav -60 mV sa spontánne otvoria pomalé Na kanály a Na+ začne vtekať pomaly do bunky. Bunka sa tak začne depolarizovať, čiže v bunke začne stúpať pozitívny elektrický náboj (z -60 mV na -50 mV). Pri dosiahnutí hodnoty membrány -50 mV sa otvoria dočasné Ca kanály. Ca2+ začne vtekať do bunky po chemickom gradiente, čo prispeje k depolarizácii bunky na hodnotu -40 mV a otvoria sa ďalšie pomalé Ca kanály. Tak vteká do
bunky ešte viac Ca+ s pozitívnym nábojom a bunka sa ďalej depolarizuje (Blahút 2012). Vo fáze 0 začína depolarizácia vstupom Na+ iónov ako aj vstupom vápenatých iónov do bunky.
Vtekanie Ca2+ a Na+ do bunky je pomalé, tak depolarizačná krivka fázy 0 nemá strmý až kolmý priebeh. Keby tieto pozitívne ióny prešli do bunky obrovskou rýchlosťou, tak vnútro bunky by sa depolarizovalo na cca 10 mV takmer okamžite a krivka fázy 0 by bola takmer kolmá. Ale to nechceme, lebo srdce by išlo 200 úderov za min. v pokoji (Blahút 2012). Pri fáze 3 sa uzatvárajú Ca kanály a otvárajú sa K kanály vtedy K+ ióny začnú vytekať po chemickom gradiente z bunky. V tejto fáze je v bunke stále prevaha pozitívnych katiónov Ca2+, Na+, K+ oproti pokojovému stavu (Blahút 2012). Pri vytekaní K+ z bunky sa bunka repolarizuje, pretože sa znižuje intracelulárny pozitívny náboj.
Obázok č. 4: Priebeh pacemakerovvého potenciálu sínusového uzlu.
Autor:Icewalker. [cit. 2017-04-01], dostupné na www:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Srde%C4%8Dn%C3%AD_potenci%C3%A1ly.svg, upravené
3.3 Mechanická aktivita srdca
Elektrický signál generovaný na membránach srdcových buniek je pretlmočený na povel k mechanickej odpovedi špecializovaných kontraktilných organel kaskádou dejov, v ktorých nositeľom informácie je vápnik (Šteiner 2010, 23). Akčný potenciál je šírený do bezprostrednej blízkosti myofibríl. Počas akčného potenciálu sa pomalým prúdom dostáva do bunky vápnik.
Rovnovážnu bilanciu zvláda udržať odstraňovanie Ca2+ z bunky sodíkovo-vápnikovým výmenníkom (NCX). Okrem extracelulárneho vápniku sa začína do bunky uvoľňovať aj vápnik z vnútra bunky, a to zo sarkoplazmatického retikula. Pri excitácii sa vápnik uvoľní
transport sprostredkúva Ca-Mg-ATP-áza (SERCA). SERCA spolu s NCX udržiavajú pokojovú cytoplazmatickú koncentráciu vápenatých iónov, ktorá je podstatne nižšia ako koncentrácia extracelulárna. Počas depolarizácie je teda Ca2+ vháňaný do bunky, počas repolarizácie von z bunky. Vápenaté ióny sa vo vnútri bunky následne viažu na myozín, čo vedie k vzniku kontrakcie.
Základom mechanickej aktivity srdca je schopnosť kontrakcie dvoch základných proteínov srdcového svalu, a to aktínu a myozínu. Tieto dva proteíny tvoria pri vzniku kontrakcie komplex aktomyozínu.
„Kontrakčný proces pozostáva zo štyroch za sebou nasledujúcich fáz:
1. pokojové štádium: aktín+ myozín-ATP (ATP - adenozíntrifosfát, adenosine triphosphate)
V tomto štádiu sú aktín a myozín oddelené. Ich zlúčeniu zabraňuje vysoká koncentrácia K+. Na myozín je naviazaný ATP. Keďže v tomto štádiu enzýmová aktivita myozínu (ATP-ázová aktivita) sa ešte neprejavuje, ATP sa neštiepi;
2. excitačné štádium: aktomyozín-ATP.
Pri podráždení svalového vlákna sa zvýši permeabilita bunkovej membrány, následkom čoho časť iónov K+ emigruje z myokardiálnej bunky do extracelulárneho priestoru.
Týmto poklesom koncentrácie intracelulárneho draslíka sa zníži odpudzujúca sila, ktorá udržiavala aktín a myozín v disociovanom stave. Následkom toho sa aktín a myozín spoja – utvorí sa aktinomyozínový komplex. Aj v tomto komplexe je na myozín naviazaný ATP v nerozštiepenej forme;
3. kontrakčné štádium: aktomyozín-ATP + Pi.
Ihneď po excitácii sa svalové vlákna kontrahujú. V tejto fáze myozín nadobúda enzýmové vlastnosti ATP-ázy, následkom čoho posledná makroergická fosfátová väzba v ATP sa odštiepi a uvoľnená chemická energia sa spotrebuje na mechanickú prácu – skrátenie svalového vlákna.
4. relaxačné štádium: aktín + myozín-ATP.
V tomto štádiu kontrakcie myokardiálneho vlákna prebiehajú opačné procesy ako v štádiu excitácie: Na+ vystupuje z bunky a jeho miesto zaujíma K+. Zvýšením koncentrácie intracelulárneho K+ sa zvyšujú repulzívne sily, ktoré disociujú aktomyozín na voľný aktín a myozín (Gvozdják, Gvozdjáková 1980, 57).“ Na konci relaxácie sú koncentrácie jednotlivých iónov vo vnútri a mimo kardiomyocytov totožné s koncentráciami v pokojovom stave.
4. Kardiomyocyty
Kardiomyocyty sú bunky srdcovej svaloviny, tieto bunky majú tvar písmena Y a sú 100-150 μm dlhé a 10–15 μm široké. Kardiomyoycyty obsahujú na rozdiel od buniek kostrovej svaloviny medzibunkové spoje – interkalárne disky. Tie sú tvorené komplexom špecializovaných medzibunkových kontaktov, ktoré zabezpečujú kohéziu buniek a tiež šírenie vzruchu medzi jednotlivými bunkami. Tieto bunky majú priečne pruhované myofibrily, ktroré sa skladajú z kontraktilných proteínov – myofilamentov – aktínu a myozínu. Bunky majú oválne pretiahnuté jadro, uložené uprostred bunky. Na povrchu kardiomyocytov je plazmatická membrána – sarkoléma (Šteiner 2010, 20). Tá sa vchlipuje dovnútra bunky, kde vytvára trasnverzálne T-tubuly. Ich funkciou je prenášať do myocytu elektrický impulz, ktorý spúšťa uvoľnenie vápnika zo sarktoplazamtického retikula a navodí tak kontrakciu.
Asi 40 % objemu bunky tvoria mitochondrie, ďalej sa tu vyskytuje Golgiho aparát, ktorý ma na povrchu granulá obsahujúce prekurzor atriálneho natriuretického peptidu – hormón zvyšujúci vylučovanie sodíku, draslíku a vody obličkami, redukuje objem telesných tekutín a znižuje krvný tlak (Kardiomyocyt [cit. 2017-04-08] - online). Prítomné sú tiež kvapôčky lipidov, častice glykogénu, lyzozómy a zrnká pigmentu lipofuscinu. Kardiomyocyty predsiení sú menšie ako kardiomyoycyty komôr (Šteiner 2010, 20).
Obrázok. č. 5: Bunky srdcovej svaloviny s interkalárnymi diskami.
Autor: neznámy.[cit. 2017-04-08], dostupné na www: http://histologie.lf3.cuni.cz/atlas/demo/4/ipage00002.htm
Obrázok č. 6: Stavba buniek srdcového vlákna.
Autor: OpenStax. [cit. 2017-04-08], dostupné na www:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:1020_Cardiac_Muscle.jpg upravené
5. Biosenzory na báze buniek
Biosenzory na báze buniek predstavujú nový nástroj k porozumeniu a liečeniu rôznych ľudských ochorení vrátane ochorení srdca. Srdcové ochorenia sú najčastejšou príčinou smrti v rozvinutých krajinách. Väčšina z nich má skryté príčiny, na bunkovej a genetickej úrovni, ktoré nie sú ľahko prístupné diagnostike, ako je srdcová biopsia, čo je invazívna procedúra so značným rizikom.
Od objavu pluripotentných kmeňových buniek (PSCs) ako sú napríklad ľudské embryonálne kmeňové bunky (hESC) a hlavne ľudské indukované pluripotentné kmeňové bunky (hiPSC) a z nich diferencované kardiomyocyty (CMs), prezentujú tieto bunkové typy dôležitý model v skríningu liečiv a ochorení.
Často je študovaný elektrofyziologický fenotyp jednotlivých srdcových buniek, nakoľko poskytuje informáciu o pacemakeroch alebo o schopnosti šíriť vzruch. Tieto metódy zväčša sledujú akčný potenciál, vodivosť z bunky do bunky alebo elektrický odpor medzi bunkou a substrátom. Elektrofyziologické dáta však nemôžu byť úplne separované od vplyvov mechanickej aktivity, preto je táto metóda nevhodná pre veľkú skupinu ochorení súvisiacich s excitačno – kontrakčnými procesmi. Napriek tomu použitie biosenzorov na sledovanie kardiomyotickej kontrakcie a relaxácie prezentuje nevyhnutný krok pre in vitro modelovanie ochorení. Nepriame metódy merania kontrakcií ako napríklad optické metódy založené na
deformácii optického vlákna a analýze obrazu majú limitovaný potenciál, hlavne v prípade in vitro diferencovaných kardiomyoycytov , ktoré nie úplne zodpovedajú tvaru izolovaných kardiomyoycytov a často vyžadujú disosiáciu syncýtia a analýzu jednotlivých buniek. Preto to vyzerá, že najsľubnejšia štruktúra na študovanie kontrakčných vlastností ľudského srdcového syncýtia by mohli byť rovnako veľké klastre diferencovaných kardiomyoycytov vo forme embryonálnych teliesok (embryoid bodies – EB) odvodených z PSCs. Preto je vhodné použiť priamy prístup k posúdeniu mechanických vlastností EBs srdcového syncýtia v reálnom čase a so striedajúcimi sa biofyzikálnymi a biochemickými podmienkami (Pesl et al. 2016).
5.1 Impedančná technológia
Je mimoriadne dôležité testovať predbežných kandidátov na lieky na srdcové ochorenia skôr ako prídu na trh. Za týmto účelom sa prevádzajú in vitro aj in vivo testy. In vitro testy sú predovšetkým určené na posúdenie interakcie daných kandidátov na lieky s hlavnými iónovými kanálmi, o ktorých vieme, že sa podieľajú na vzniku a udržiavaní akčného potenciálu. Je odhadované, že existuje viac ako 70 druhov iónových kanálov, ktoré sú súčasťou kardiomyocytov a podieľajú sa na celkovej elektrickej aktivite srdca.
Na tento účel sú vyvinuté prístroje na báze generovania impedančného signálu, ktoré sú schopné merať kontraktilitu kardiomyocytov. Je tu využívaný impedančný výstup na priebežné monitorovanie tlkotu kardiomyocytov. Takýto systém je schopný citlivo a kvantitatívne detegovať efekt iónových kanálov ako aj neiónových kanálových modulátorov funkcie srdca v reálnom čase. Taktiež je možné monitorovať periodicitu tlkotu počas dlhších časových intervalov, čo umožňuje detekciu ako krátkotrvajúcej, tak aj dlhotrvajúcej odpovede.
5.1.1 Princíp
Je využívaný impedančný výstup na neinvazívne kvantifikovanie stavu kardiomyocytov v reálnom čase. Prítomná je zlatá mikroelektróda, na nej prichytené kardiomyocyty a médium.
Aplikáciou nízkeho napätia (menej ako 20 mV) vzniká signál striedavého prúdu, ktorý vedie ku generácii elektrického poľa medzi elektródami, ten reaguje s iónovým prostredím obsiahnutého média. Táto interakcia spomaľuje alebo obmedzuje vzniknutý prúd medzi elektródami a generuje impedančný signál. Vplyv na danú interakciu má počet buniek
pokrývajúcich elektródy, morfológia daných buniek a aj sila, akou sú bunky prichytené na podložku – elektródu. Impedančná technológia môže byť použitá na dynamické monitorovanie kardiomyocytových kontrakcií a tlkotu, čo je najvyšším funkčným prejavom srdca. Detekcia kardiomyocytového signálu je založená na rytmických zmenách adhézie buniek a ich morfológie v závislosti na tom, či je kardiomyoycyt v kontrakčnej alebo relaxačnej fáze.
Výsledkom je adekvátny impedančný signál.
Celkovo s prihliadnutím na citlivosť, zber dát v reálnom čase, meranie periodicity tlkotu v kratších aj dlhších časových intervaloch a výkon možno povedať, že táto metóda je vhodná na testovane vplyvu kandidátov liekov na funkciu srdca (Xi et al. 2011).
5.2 Priame meranie potenciálu kardiomyocytov
Táto technika je zameraná na zmenu transmembránového potenciálu (hlavne srdcového akčného potenciálu, AP) kardiomyocytov. Alternatívou k intracelulárnemu zaznamenávaniu akčných potenciálov je zaznamenávať lokálne extracelulárne potenciálové pole z vonkajšieho priestoru buniek s pevnou kovovou elektródou v priamom kontakte s excitovateľnými bunkami.Mikroelektródy umožňujú analýzu celých bunkových sietí z viacerých záznamových miest v jednej vrstve, vo viacerých vrstvách alebo agregátoch v bunkových kultúrach.
Používanie extracelulárnej fyziológie je kľúčovým prístupom na dosiahnutie vysokovýkonného fenotypového skríningu. Taktiež to poskytuje informáciu o existencii špecifických iónových kanálov, analyzovaním vlastností potenciálového poľa, ktoré je úzko prepojené s akčným potenciálom. Umiestnením kardiomyocytov vo forme embryonálnych teliesok na elektródu umožňuje teda priame sledovanie zmien potenciálu vyvolaných akčným potenciálom a potenciálovým poľom v okolí bunky (Pesl, Pribyl, Caluori 2016). Môže tak ísť o testovací systém v oblasti srdcovej toxicity a bezpečnostného farmakologického výskumu.
6. Ciele bakalárskej práce
1. Získať náhradu za drahé a rozmerné zariadenie, ktorá by slúžila na pozorovanie vplyvu rôznych liečiv na srdcové ochorenia.
2. Zistiť či je možné merať a sledovať elektrickú aktivitu kardiomyocytov pomocou biosenzora typu „interdigitated“ elektróda.
3. Optimalizovať podmienky merania na daných biosenzoroch.
EXPERIMENTÁLNA ČASŤ 7. Materiály a inštrumentácia
7.1. Chemikálie a médiá
Acetón – Penta
Adrenalín – 5,5 mM (injekčný roztok Zentiva) Betaloc = metoprolol - 1,46 mM
Isoproterenol – 10 mM vo vode
MEF médium - zloženie: Knockout DMEM (Invitrogen) 86 % objemu, FBS tepelne inaktivované (Invitrogen) 10 % objemu, L-Glutamin (Invitrogen) 1 % objemu, neesenciálne aminokyseliny (Invitrogen) 1 % objemu, Penicilín/Streptomycín (Invitrogen) 1 % objemu, 2-Merkaptoetanol (Sigma Aldrich) 1 % objemu.
7.2 Biologický materiál
Konkrétne ide o kardiomyocyty, ktoré boli diferencované z ľudských embryonálnych kmeňových buniek (hESC) línie CCTL14 (Center for Cell Teraphy Line 14).
7.3 Inštrumentácia
K experimentálnej časti práce boli využité ako fyzikálno – chemický prevodník dva rôzne druhy senzorov. Obidva druhy prevodníkov boli typu „interdigitated“ elektróda.
7.3.1 CC3.W1 senzor
CC3.W1 senzor je senzor od spoločnosti BVT Technologies, a.s.. Ide o senzor, ktorý je vyrobený z tvrdej korundovej keramickej podložky. Na povrchu sa nachádzajú dve štruktúry typu „interdigitated“ elektróda. Tieto elektródy sú vyrobené zo zliatiny zlata. Na konci senzoru sa nachádza kontakt, ktorý je spojený s aktívnou časťou pomocou zlatej vodivej cestičky, tá je pokrytá polymérnou dielektrickou ochrannou vrstvou. Senzor sa dá využiť na základné
elektrochemické a bio-elektrochemické techniky, analýzu vodivosti ako aj analýzu diferenciálnej vodivosti (Conductometric sensor substrates type: CC3.W* (*) [cit. 2017-04-28]
– online) .
Tabuľka č. 2: Popis jednotlivých fyzikálnych parametrov CC3.W1 senzoru.
Autor: neznámy. [cit. 2017-04-28] dostupné na www: http://www.bvt.cz/_ftp/Senzory/CC3.pdf, upravené
Fyzikálne parametre Hmotnosť 0,4 g
Dĺžka 25,40 mm
Šírka 7,26 mm
Hrúbka 0,63 mm
Obrázok č. 7: detail „interdigitated“ elektródy – prstovej štruktúry.
Obrázok č. 8: ukážka senzoru CC3.W1 Obrázok č. 9: fotografia senzoru.
spolu so znázornenými fyzikálnymi
rozmermi.
Autor:neznámy. [cit. 2017-04-28]
7.3.2 InterDigitated gold Elctrode (IDE)
InterDigitated gold Electrode je senzor vyrábaný spoločnosťou DropSens. Ide o senzor, ktorý obsahuje dve „interdigitated“ elektródy na sklenej podložke. Obe elektródy sú vyrobené zo zlata a majú dve spojovacie dráhy.
„Interdigitated“ konfigurácia zvyčajne zvyšuje citlivosť a detekčné limity. Tieto elektródy sú vhodné na decentralizované testovanie, na vývoj špecifických (bio)senzorov a na iné elektrochemické analýzy (InterDigitated gold Electrodes [cit. 2017-04-28] – online).
Obrázok č. 10: IDE senzor spolu s rozmermi.
7.3.3 Elektronická jednotka
Ako elektronická jednotka bol použitý prístroj s názvom e-corder 410 od spoločnosti eDAQ.
Ide o vysokovýkonný štvorkanálový systém na zaznamenávania a analýzu dát. Je schopný zaznamenávať analógový signál zo širokej škály prevodníkov a nástrojov. Obsahuje štyri programovateľné diferenciálne vstupné zosilňovače a môže zaznamenávať 24 bitové rozlíšenie priamo do počítača. Zabudovaný software kontroluje analógový výstup, poskytuje základný pulz a generáciu tvaru vlny.
E-corder je ideálny na nahrávanie a analýzu experimentálnych signálov vo fyzikálnych vedách. Nie je nutné absolútne žiadne programovanie, vďaka funkcii on-line a off-line analýzy môžeme rýchlo získať výsledky zo zaznamenaných údajov. Tento systém môže byť použitý ako náhrada za záznamové zariadenia na báze záznamu na papier či DAQ (data acquisition) systémov, čo sú systémy na zhromažďovanie dáť. Môže byť aplikovaný v rôznych oblastiach ako je elektrochémia, kinetika, chromatografia, akustika, optika, testovanie materiálov,
inžinierstvo a termálna analýza (eDAQ e-corder 410 (Model ED410) [cit. 2017-04-27] – online).
Obrázok č. 11: Vzhľad elektronickej jednotky e-corder 410 spredu spolu s popisom jednotlivých súčastí, kde úplne vľavo sa nachádzajú kontrolné svetlá (indicator lights); napravo od nich je spúšťač, BNC konektor (trigger, BNC connector); v červenom rámčeku je analógový výstup, BNC konektory (analog outpus, BNC connectors). Ďalej môžeme vidieť vpravo hore štyri za sebou idúce vstupné kanály s BNC konektormi (input channels BNC connectors) a pod nimi taktiež štyri vstupné kanály s DIN konektormi (input channels DIN connectors).
Autor:neznámy, [cit. 2017-04-27] dostupné na www: https://www.edaq.com/product_sheets/hardware/ED410_e- corder_410.pdf
Obrázok č. 12: Vzhľad elektronickej jednotky e-corder 410 zozadu spolu s popisom jednotlivých súčastí, úplne vľavo dole sa nachádza FC port s DB-9 konektorom (FC port, DB-9 connector); napravo od neho sa nachádza USB port; vpravo dole sa nachádza zapínač/vypínač (power on/off); vedľa zásuvka na prívod do elektriny (power socket); hore sprava doľava požiadavky na napájanie (power requirements), pomocný uzemňovač so 4 mm koncovkou (auxiliary ground, 4 mm terminal post) a digitálne (TTL) I/O porty s DB-15 pin konektorom (digital (TTL) I/O ports, DB-15 pin connector). Autor:neznámy, [cit. 2017-04-27]
dostupné na www:https://www.edaq.com/product_sheets/hardware/ED410_e-corder_410.pdf
7.3.4 Ďalšia použité prístroje
Inkubátor - HERP NURSERY II, Lucky Reptile Digitálny Mikroskop - Dino-Lite, Taiwan
USB mikroskop – INTRACO MICRO spol s.r.o. Tachlovice, ČR, Irradiator OGL-1 - 2 Gy/min, VF a.s. Černá Hora, ČR
7.4 Použité programy
Chart™ v5.5.22 (eDAQ) program na zaznamenávanie výstupného signálu z elektronickej jednotky e-corder 410,
Origin 6.1 (OriginLab; USA) program na spracovávanie vedeckých dát a ich analýzu.
8. Metódy
8. 1 Príprava kardiomyocytov
Difrenciáciou hESC môžeme získať kardiomyocyty. Za bežných okolností sa hESC kultivujú na kultivačných miskách, ktoré podporujú priľnavosť buniek. Pokiaľ sú kultivované na kultivačných miskách, ktoré nepodporujú priľnavosť buniek, vytvárajú sa trojrozmerné štruktúry nazývané embryonálne telieska (embryoid bodies, EB). EB sú ďalej diferencované pomocou indukčných metód do kardiomyocytov.
Narastené kolónie hESC línie CCTL14 na kultivačnej miske boli zoškriabané plameňom upravenou Pasteurovou pipetou a premiestnené do centrifugačnej skúmavky s 10 ml kultivačného média pre hESC. Po centrifugácii 100 g / 5 minút / 4 °C bol odstránený supernatant a sediment bol rozsuspendovaný v 1 ml média. Suspenzia bola premiestnená do 5 ml MEF média s pridaným BMP4 na bakteriologickú misku, ktorá bola umiestnená do hypoxického boxu, kde sa tvoria EB a dochádza k ďalšej diferenciácii. Médiá boli následne menené podľa optimalizovaného protokolu. V priebehu 14 dní dochádzalo k pôsobeniu rôznych cytokínov obsiahnutých v médiu, tiež boli menené podmienky kultivácie pre diferenciáciu EB do kardiomyocytov (Jelínková 2014, 33 -34).
Tento proces diferenciácie hESC do kardiomyocytov nebol prevádzaný mnou, vzniknuté EB kardiomyocytov som dostala vopred pripravené od školenej odbornej pracovníčky.
8.2 Príprava senzoru k imobilizácii kardiomyocytov
Obidva senzory typu CC3.W1 aj InterDigitated gold Electrodes (IDEs) boli najskôr vyčistené a odmastené, a to ponorením do acetónu na 30 minút. Potom sa nechali uschnúť. Po vyschnutí boli vložené do meracích ciel a sterilizované iradiáciou v iradiátore na 100 Gy.
K úprave adherencie povrchu pol použitý oxid kremičitý. Takto pripravený povrch senzoru bol pokrytý želatínovým povlakom na 20 až 60 minút pri 37 °C. Prebytok želatíny sa potom odstránil. Potom boli umiestnené samotné embryonálne telieska kardiomyocytov na elektródovú oblasť senzorov a pridaných 0,5 ml MEF média. Nakoniec boli senzory spolu s EB umiestnené do sterilného inkubačného boxu na 12 hodín pri 37 °C, to zabezpečilo dostatočnú adherenciu k povrchu elektród.
8.3 Reálne meracie usporiadanie
K samotnému zaznamenávaniu elektrickej aktivity kardiomyocytov som použila nasledujúce meracie usporiadanie, v ktorom biosenzory spolu s kardiomyocytmi boli pripojené k elektronickej jednotke a tá poskytovala výstupný signál, ktorý som ďalej vyhodnocovala.
Obrázok č. 13: Použité meracie usporiadanie od biosenzoru až po výstupný signál.
8.4 Priebeh merania s kardiomyocytmi 1
Postup merania bol pri oboch senzoroch rovnaký. Na elektródy boli imobilizované embryonálne telieska kardiomyocytov podľa postupu uvedeného vyššie. Senzory boli umiestené do inkubátora, v ktorom bola udržiavaná stála teplota 37 °C. Tiež bolo potrebné dodržiavať určitú vlhkosť, aby kardiomyocyty na elektródach nevyschli. Tá bola zabezpečovaná priebežným dodávaním MEF média, v ktorom boli senzory ponorené, ale iba v prípade, že sa s nimi práve nemeralo. Ak sa so senzormi meralo, bola udržiavaná stála vlhkosť iba v tej oblasti elektród, kde sa nachádzali kardiomyocyty. Samotný senzor musí byť v priebehu merania suchý v tej časti, kde dochádza ku kontaktu s elektronickou jednotkou.
Pred začiatkom merania som pozorovala bunky pod mikroskopom, aby som zistila či preukazujú mechanickú aktivitu – tlčú, čo je dôkazom prítomného akčného potenciálu, sú to dva po sebe idúce a vzájomne prepojené deje. Taktiež aby som zistila či sa nachádzajú v oblasti samotnej elektródy a nedošlo k ich posunu mimo nej.
Obrázok č 14: umiestnenie EB (vpravo) na elektróde v prípade senzoru typu CC3.W1.
Obrázok č. 15: umiestnenie EB na elektróde – senzor typu InterDigitated gold Electrode (IDE).
Následne mohlo dôjsť k samotnému meraniu, kedy boli senzory cez svoju koncovú časť pripojené k elektronickej jednotke. Senzory boli umiestnené na držiaku, aby sa udržali vo vodorovnej polohe a nedošlo k premiestneniu buniek mimo elektródu. Počas merania bolo stále pridávané médium kvôli udržiavaniu vlhkosti. Pozorovala som zmenu signálu v priebehu času aj za použitia rôznych digitálnych filtrov.
8.4.1 Prídavok modulačných látok
Počas merania som pridávala modulačné látky, ktoré mali za úlohu stimulovať alebo naopak potláčať frekvenciu a kontrakciu srdca. Boli pridávané látky izoproterenol, adrenalín a betaloc – metoprolol. Ich pracovné koncentrácie boli betaloc – metoprolol (70 μM), adrenalín (10 μM) a izoproterenol (1 μM). Dané látky boli vždy nariedené MEF médiom. Pred prídavkom modulačnej látky bolo vždy odsaté prítomné médium a nahradené roztokom príslušnej látky.
Funkcia jednotlivých modulačných látok je rôzna. Izoproterenol, je látka, ktorá stimuluje ẞ-adrenergné receptory, má pozitívny inotropný účinok – zosilnenie kontrakcie a zvyšuje frekvenciu srdca. Adrenalín je látka s podobným účinkom ako izoproterenol, avšak je menej špecifický.
Betaloc – metoprolol je látka s opačným účinkom ako predchádzajúce dve. Je to hlavne blokácia ẞ-adrenergných reakcií, znižovanie srdcovej frekvencie, sily kontrakcie a schopnosti vedenia vzruchu. Po pridaní jednotlivých modulačných látok som pozorovala zmenu signálu.
9. Výsledky a diskusia
9.1 Vyhodnocovanie výsledkov zo senzoru typu CC3.W1
Prvý záznam
Senzor typu CC3.W1 s imobilizovanými EB bol pripojený na elektronickú jednotku e-corder 410. Najskôr bol pozorovaný signál bez prídavku modulačných látok a taktiež bez použitia filtra. Signál bolo možné pozorovať v reálnom čase. Senzor bol umiestnený v inkubátore, kde bola udržiavaná stála teplota 37 °C. V oblasti kardiomyocytov som udržiavala vlhkosť prídavkom média. Výstupný signál bol zaznamenávaný v programe Chart. Získané dáta boli prevedené do programu Origin, neskôr z nich bol vyhotovený graf závislosti zmeny potenciálu na čase. Získané výsledky sú znázornené pod textom.
Graf č. 1: Graf závislosti potenciálu na čase, v rámčeku je označený úsek zmeraných časových hodnôt pre príslušné maximá potenciálu, oblúčiky pri vrcholoch značia časové odstupy maxím jednotlivých hodnôt
potenciálu.
Tabuľka č. 3 a 4: tabuľky znázorňujúce jednotlivé vlastnosti signálu z grafu č.1.
Priemerný maximálny potenciál (5,0 ± 2,8 mV) Priemerný časový odstup maxím potenciálu (17,0 ± 6,2 s)
Časové odstupy maxím potenciálu pre
senzor typu CC3.W1 (bez
filtra, bez modulačných
látok)
t (s) 95,53 114,74 121,81 134,37 157,62 174,94 199,63 214,22
E (mV)
4,94 3,40 3,51 1,22 3,31 5,89 7,20 10,31
Podľa zobrazených výsledkov pravdepodobne nejde o potenciál generovaný kardiomyocytmi, nakoľko priemerný časový odstup jednotlivých maxím potenciálu je príliš vysoký, a to až 16,95 s. Je to taký časový odstup, aký by sme u kardiomyocytov neočakávali, je príliš veľký. Jednotlivé odstupy sú nepravidelné, a teda nevykazujú ani žiadnu periodicitu.
Môže to byť spôsobné zlým prisadnutím EB na elektródu alebo aj stratou ich funkcie v dôsledku nie celkom priaznivých podmienok na ich prežitie. Príčinou veľkých časových odstupov môže byť aj veľké množstvo menších lokálnych píkov medzi hlavnými maximálnymi. Alebo to môže byť spôsobené nevhodným typom senzoru pre zaznamenávanie dát tohto druhu, nakoľko pri pozorovaní kardiomyocytov pod mikroskopom pred samotným meraním bolo aj voľným okom vidieť, že vykazujú mechanickú aktivitu, a teda aj elektrickú – tĺkli.
Druhý záznam
Podmienky merania boli udržiavané stále také isté, a to teplota 37 °C, dostatok média a vlhkosti. Opäť bol zaznamenávaný signál zo senzoru a cez rovnakú elektronickú jednotku e- corder 410. získané dáta boli prevedené do programu Origin. Na grafe pod textom môžeme vidieť signál, ten však nevykazoval žiadne zmeny počas celej doby merania ani po prídavku izoproterenolu, kedy by sa dala predpokladať zmena frekvencie a zvýšenie potenciálu.
Graf č. 2: Graf závislosti potenciálu na čase, výstupný signál senzoru CC3.W1 s prítomnými kardiomyocytmi.
Nedochádza k žiadnej zmene počas cele dĺžky signálu.
Napriek daným výsledkom kardiomyocyty pod mikroskopom viditeľne prejavovali mechanickú aktivitu sprostredkovanú elektrickou. Taktiež boli ku kardiomyocytom pridávané modulačné látky, ktoré by sa mali prejaviť zmenou signálu, avšak k žiadnej zmene nedošlo, signál bol stále taký istý – nemenný s potenciálom v záporných hodnotách okolo – 39 mV. Dá sa teda povedať, že senzor tohto typu sa nejaví ako píliš vhodný prevodový systém na meranie tohto druhu resp. moje výsledky to nepreukázali.
9.2 Vyhodnocovanie výsledkov zo senzoru typu InterDigitated gold Electrode
Senzor typu InterDigitated gold Electrode (IDE) bol pripojený na elektronickú jednotku, ktorá poskytovala výstupný signál. Daný signál som zazanamenávala pomocou programu Chart, dáta získané z tohto programu som neskôr previedla do programu Origin. Opäť som udržiavala podmienky vyhovujúce kardiomyocytom Získané výsledky sú spracované nižšie.
Low- pass filter, 2 Hz, bez modulačných látok
Graf č. 3: Záznam zo senzoru IDE, použitie low-pass filtra 2 Hz, bez prídavku modulačných látok, výraznejšia
zmena potenciálu v istom úseku grafu.
Graf č. 4: Detail záznamu z predošlého grafu. V rámčeku je označená pozorovateľná zmena potenciálu v pravidelných časových intervaloch, jednotlivé časové odstupy sú znázornené nad oblúkmi vedúcimi od jedného
maxima k druhému. Použitie low-pass filtra, 2 Hz.
Tabuľka č. 5 a 6: tabuľky znázorňujúce jednotlivé vlastnosti signálu z grafu č.3 a 4.
Časové odstupy maxím potenciálu pre senzor typu IDE (low-pass filter 2 Hz, bez modulačných látok)
t (s) E (mV)
39,97 6,48
41,97 6,08
43,64 7,56
45,14 6,91
46,47 6,96
47,91 6,21
49,41 5,88
51,08 5,98
52,19 5,52
53,69 6,10
55,19 6,94
Priemerný maximálny potenciál (6,42 ± 0,60 mV) Priemerný časový odstup maxím potenciálu (1,52 ± 0,23 s) Priemerné trvanie vychýlenia potenciálu k maximu od jedného
minima k druhému – jdného pulzu
(1,57 ± 0,25 s) Priemerná zmena potenciálu jednotlivých píkov (od minima
k maximu)
(1,28 ± 0,55 mV)
Low- pass filter, 1 Hz, bez modulačných látok
Graf č. 5: Záznam zo senzoru IDE, použitie low-pass filtra 1 Hz, bez prídavku modulačných látok, výraznejšia zmena potenciálu vo viacerých úsekoch grafu.
Graf č. 6: Detail záznamu z predošlého grafu V rámčeku je znázornená pozorovateľná zmena potenciálu v pravidelných časových intervaloch, jednotlivé časové odstupy sú znázornené nad oblúkmi vedúcimi od jedného
maxima k druhému. Použitie low-pass filtra, 1 Hz.
Tabuľka č. 7 a 8: tabuľky znázorňujúce jednotlivé vlastnosti signálu z grafu č.5 a 6.
Časové odstupy maxím potenciálu pre
senzor typu IDE (low-pass filter 1 Hz, bez modulačných
látok) (detail č.1)
t (s) 10,88 12,62 14,22 15,67 17,08 18,63 20,28 21,88
E (mV)
6,00 6,57 6,68 7,06 6,76 6,65 6,68 6,57
Priemerné trvanie vychýlenia potenciálu k maximu od jedného minima k druhému – jedného pulzu
(1,64 ± 0,25 s) Priemerný maximálny potenciál ( 6,62 ± 0,30 mV) Priemerný časový odstup maxím potenciálu (1,52 ± 0,23 s) Priemerná zmena potenciálu jednotlivých píkov (od minima
k maximu)
(1,24 ± 0,32 mV)
Graf č. 7: Druhý detail záznamu z grafu na obrázku č. 20. V rámčeku je znázornená poizorovateľná zmena potenciálu v pravidelných časových intervaloch, jednotlivé časové odstupy sú znázornené nad oblúkmi vedúcimi
od jedného maxima k druhému. Použitie low-pass filtra, 1 Hz.
Tabuľka č. 9 a 10: tabuľky znázorňujúce jednotlivé vlastnosti signálu z grafu č.5 a 7.
Časové odstupy maxím potenciálu pre senzor typu IDE (low-pass filter 1
Hz, bez modulačných látok) (detail č.2)
t (s) 70,76 71,36 73,81 75,55 76,96 78,61
E (mV)
6,98 7,66 7,74 7,48 7,59 6,34
Priemerný maximálny potenciál ( 7,30 ± 0,54 mV) Priemerný časový odstup maxím potenciálu ( 1,57 ± 0,67 s) Priemerné trvanie vychýlenia potenciálu k maximu od jedného
minima k druhému – jedného pulzu
(1,56 ± 0,18 s) Priemerná zmena potenciálu jednotlivých píkov (od minima
k maximu)
(1,46 ± 0,60 mV)
Low- pass filter, 10 Hz, bez modulačných látok
Graf č. 8: Záznam zo senzoru IDE, použitie low-pass filtra 10 Hz, bez prídavku modulačných látok.
Graf č. 9: Priblíženie záznamu z predchádzajúceho grafu, low-pass filter 10 Hz,bez prídavku modulačných látok.
Graf č. 10: signál vzniknutý po použití FFT-filtra, ktorý vyhladil pôvodný signál zobrazený na grafe č. 9
Tabuľka č. 11 a 12: tabuľky znázorňujúce jednotlivé vlastnosti signálu z grafu č.10.
Časové odstupy maxím potenciálu pre senzor typu IDE
(FFT filter (10 points), bez modulačných
látok)
t (s) 47,82 48,34 48,85 49,23 50,47 51,74 52,08
E (mV)
4,97 4,37 4,55 4,72 5,18 4,70 4,86
Priemerný maximálny potenciál (4,76 ± 0,27 mV) Priemerný časový odstup maxím potenciálu ( 0,71 ± 0,43 s) Priemerné trvanie vychýlenia potenciálu k maximu od jedného
minima k druhému – jedného pulzu
(0,54 ± 0,21 s) Priemerná zmena potenciálu jednotlivých píkov (od minima
k maximu)
(0,39 ± 0,25 mV)
Na predchádzajúcich grafoch ako aj v tabuľkách môžeme vidieť výsledky získané zo senzoru typu InterDigitated gol Electrode, Boli použité rôzne filtre, ktoré znižovali vplyvy prostredia, a to prepúšťaním frekvencií iba do určitej hodnoty.
Ako prvý je znázornený graf s použitým digitálnym filtrom low-pass, do 2 Hz. Nachádza sa tam viditeľná zmena potenciálu v určitom úseku signálu. Z tohto úseku som vypočítala priemerný maximálny potenciál, ktorý bol 6,42 mV. Ide o taký potenciál, ktorý sú schopné generovať kardiomyocyty. Ďalej som zistila či môžeme medzi jednotlivými časovými odstupmi maxím potenciálu pozorovať určitú periodicitu – opakovanie v pravidelných časových intervaloch s malou odchýlkou. Vypočítala som, že jednotlivé časové odstupy majú hodnotu 1,52 s, takže dochádza k pravidelným zmenám potenciálu na priemernú maximálnu hodnotu 6,42 mV za priemerne 1,52 s. Tieto výsledky sú také, aké by sme u kardiomyocytov očakávali.
Takže sa dá povedať, že za použitia tohto filtra s daným nastavením sa dá pozorovať zmena elektrickej aktivity prítomných kardiomyoycytov.
Ďalej je zobrazený graf za použitia filtra low-pass do 1 Hz. V tomto grafe je pozorovateľná zmena potenciálu v dvoch úsekoch signálu. Oba úseky som vyhodnotila v tabuľkách pod ich priblížením. Získané hodnoty opäť zodpovedajú takým, aké by sa dali u kardiomyocytov očakávať. Je tu prítomná periodicita - opakovanie maximálneho potenciálu v pravidelných časových intervaloch. Filter s týmto nastavením sa zdá byť taktiež vhodný na pozorovanie elektrickej aktivity kardiomyocytov.
Nakoniec som použila low-pass filter až do 10 Hz. Získala som záznam, ktorý je na grafoch č. 8, 9 a 10. Na grafe č.8 a 9 je vidieť, že signál je veľmi hustý a ani pri vyššom priblížení sa nedajú odrátať jednotlivé maximá potenciálu ani časové odstupy, preto som použila v následnom spracovaní výsledného grafu FFT filter, ktorý spôsobil, že došlo k vyhladeniu signálu (obmedzeniu šumu). Na takto získanom signáli už bolo možné odčítať jednotlivé maximá a minimá potenciálu či časové odstupy. Napriek tomu však získané hodnoty, okrem priemerného potenciálu, neboli také, ako by sme u kardiomyocytov očakávali. Časové odstupy
maxím či priemerná zmena potenciálu boli príliš nízke. Napriek tomu môže ísť o kardiomyocyty, ktoré tĺkli veľmi rýchlo a slabo. Skôr však môže ísť o záznam okolitých rušivých vplyvov. Tento filter s daným nastavením sa teda nejaví ako príliš vhodný pre zaznamenávanie tohto druhu.
9.2.1 Prídavok izoproterenolu
Na nasledujúcich grafoch sú zaznamenané signály poskytované senzorom InterDigitated gold Electrode. Bez použitia filtra, pred a po prídavku modulačnej látky, izoproterenolu.
Bez filtra, pred prídavkom izoproterenolu
Graf č. 11: Záznam zo senzoru IDE, bez použitého filtra, bez prídavku modulačných látok, pozorvateľné výraznejšie zmeny potenciálu v istých úsekoch.
Graf č. 12: priblíženie záznamu z predchádzajúceho grafu, bez filtra, pred prídavkom modulačnej látky (izoproterenolu).
Tabuľka č. 13 a 14: tabuľky znázorňujúce jednotlivé vlastnosti signálu z grafu č.11 a 12.
Časové odstupy maxím potenciálu pre
senzor typu IDE (bez filtra,
bez, modulačných
látok)
t (s) 61,60 62,71 64,81 66,50 68,11 69,96 71,66 73,35
E (mV)
5,31 4,90 5,19 5,37 4,08 5,49 6,02 6,00
Priemerné trvanie vychýlenia potenciálu k maximu od jedného minima k druhému – jedného pulzu
(1,68 ± 0,38 s) Priemerný maximálny potenciál (5,55 ± 0,44 mV) Priemerný časový odstup maxím potenciálu ( 1,74 ± 0,37 s) Priemerná zmena potenciálu jednotlivých píkov (od minima
k maximu)
(1,05 ± 0,46 mV)
Bez filtra, po prídavku izoproterenolu
Graf č. 13: Záznam zo senzoru IDE, bez použitého filtra, po prídavku modulačnej látky (izoproterenolu), pozorvateľné výraznejšie zmeny potenciálu.
Graf č. 14: Priblíženie záznamu z predchádzajúceho grafu, bez filtra, po prídavku modulačnej látky (izoproterenolu).
