5.2 Substrátová analýza proteinu DsbA bakterie Francisella tularensis poddruh
5.2.2 Metabolické značení SILAC
85
Nicméně obohacení sledovaných periplazmatických markerů nebylo dostatečné a navíc je stále patrná výrazná kontaminace cytozolickými proteiny. Od dalších analýz bylo z tohoto důvodu upuštěno. Důvodem kontaminací cytozolickými proteiny může být nestálost sféroplastů nebo těsnější propojení vnější a vnitřní membrány. Obdobná pozorování byla učiněna i pro bakterii Pseudomonas aeruginosa, kde aplikace obdobné metodiky vedla k nedostatečnému uvolnění periplazmatických proteinů (Jensch & Fricke, 1997).
86
Pomocí stanovených kritérií pro kvantifikaci (uvedených v části Metodika) bylo identifikováno celkem 63 proteinů s kvantitativně změněným poměrem lehkých a těžkých aminokyselin v porovnání s FSC200∆dsbA kmenem, z nichž bylo 28 proteinů s výskytem vyšším (Tab. 9) a 35 proteinů s nižším ve srovnání s divokým kmenem (Tab. 10). U skupiny proteinů se zvýšeným výskytem by se mohlo jednat
Obr. 18: MS spektra peptide elongačního faktoru Tu adaptační fáze SILAC Na obrázku je ukázána míra inkorporace těžkých aminokyselin v peptidu elongačního faktoru Tu značeného těžkým argininem. Jelikož po třetí pasáži je výskyt lehkých aminokyselin na úrovni šumu, byl tento počet pasáží zvolen za dostatečný pro kultivaci kultury F. tularensis.
87
o potenciální substráty, které se v periplazmatickém prostoru bakterie hromadí vlivem nesprávné disulfidické vazby. Podobně bylo hromadění nesprávně sbalených proteinů pozorováno také u bakterie E. coli po deleci dsbA genu. Skupina proteinů snížených u FSC200ΔdsbA mutanta by mohla reprezentovat proteiny přístupné proteolytickému rozkladu. Předchozí komparativní proteomové analýzy bakterie kmene LVS a LVS∆dsbA pomocí gelového 2D přístupu a negelového přístupu metodou iTRAQ odhalily celkem 7 proteinů se zvýšeným výskytem. Šest z těchto proteinů bylo nalezeno také pomocí SILAC analýzy kmene FSC200. Jednalo se o protein chitinázové rodiny 18 (FTL_1521), D-alanyl-D-alanyl-karboxypeptidázu serinového typu (FTL_1060) a čtyři necharakterizované hypotetické proteiny (FTL_1579, FTL_1532, FTL_1306 a FTL_0661). Jako protein se sníženým výskytem u dsbA delečního kmene byl identifikován hypotetický protein FTS_1068, jehož gen se vyskytuje s genem dsbA ve stejném lokusu. Funkce proteinů identifikovaných jako potenciální substráty proteinu DsbA jsou velice různorodé nebo jde o hypotetické proteiny bez známé funkce a tudíž nebylo možné na základě dosavadních znalostí o těchto proteinech predikovat delecí dsbA genu ovlivnění sekrečního systému, jak tomu bylo možno u jiných bakterií (Jameson-Lee et al., 2011). Dále jsou diskutovány jen proteiny se vztahem k virulenci, vnějším membránovým strukturám či sekreci.
88 Tab. 9: Proteiny zvýšené u FSC200∆dsbA
Název proteinu FTS lokus
Funkce v buňce Extra-cytozolick
ý
Cys Zvýše -ní
Necharakterizovaný protein
1495 ? + 3 37,37
Necharakterizovaný protein
1538 ? + 4 14,52
Protein chitinázové rodiny 18
1485 procesy katabolismu chitinu
+ 7 14,48
Necharakterizovaný protein
1749 hydrolýza O-glykovaných složek
? 11 10,18
Pyruvátfosfátdikináza 0123 fosfátdikinázová aktivita
- 12 6,22
D-alanyl-D-alaninkarboxypeptidáza
1034 D-Ala-D-Ala karboxypeptidázová
aktivita serinového typu
+ 3 5,74
Necharakterizovaný protein
0495 ? + 20 5,11
Necharakterizovaný protein
1279 ? + 4 4,95
Protein biosyntézy sideroforu
1789 biosyntéza sideroforů, transmembránový
transport
- 10 3,22
Glycerofosforyldiesterfosf odiesteráza
1476 metabolismus glycerolu, lipidů
+ 1 2,36
Necharakterizovaný protein
0402 ? ? 6 2,31
Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza/erytróza-4-fosfát dehydrogenáza
1117 metabolismus glukózy
- 3 2,26
89
Kataláza 1471 procesy rozkladu
peroxidu vodíku
+ 0 2,24
Parvulinu podobný peptidyl-prolyl- izomerázovou doménu obsahující protein
1361 skladba proteinů - 2 2,13
Necharakterizovaný protein
0815 ? + 3 2,11
Necharakterizovaný protein
0450 ? 4 2,10
Vazebný protein rodiny FAD
0702
UDP-N-acetylmuramát dehydrogenázová
aktivita
+ 11 2,08
X-prolyl-aminopeptidáza 2
0868 aminopeptidázová aktivita
- 9 1,91
Elongační faktor Tu 1709 translační aktivita elongačního faktoru
- 4 1,80
Necharakterizovaný protein
0659 + 3 1,75
Necharakterizovaný protein
1229 ? 0 1,62
Necharakterizovaný protein
0111/1 139
IglE + 2 1,53
Izochorismathydroláza 0836 hydrolázou aktivita - 3 4,91*
Necharakterizovaný protein
1187 - 1 3,84*
Necharakterizovaný protein
0920 katalytická funkce - 4 3,32*
Necharakterizovaný protein
0676 ? 5 1,98*
Necharakterizovaný protein
0974 ? 7 36,12*
90 GTP-dependentní
vazebný protein nukleových kyselin
0935 GTP vazba - 5 1,60*
V tabulce jsou uvedeny proteiny vyskytující se u mutantího kmene FSC200ΔdsbA ve zvýšené míře v porovnání s mateřským kmenem. Volnější kritéria kvantifikace jsou označena hvězdičkou u poměru zvýšení. Extracytoplazmatická lokalizace byla ověřena programem PSORTb s pozitivním (+) či negativním (-) výsledkem. Výskyt proteinu na cytoplazmatické membráně buňky je označen CM.
Tab. 10: Proteiny snížené u FSC200∆dsbA Popis proteinu FTS
lokus
Funkce v buňce Extra-cytozolický
Počet Cys
Snížení
Necharakterizovaný protein
0200 ? 2 2,04
Necharakterizovaný protein
1068 skladba proteinů + 1 2,50
Regulační protein RecX
0012 regulace oprav DNA, inhibitor proteinu
RecA
- 3 2,70
Protein rodiny cukerných nosičů
0580 specifická transmembránová
transportérová aktivita
CM 7 3,07
Protein rodiny glykozyltransferáz
1397 transferázová aktivita
CM 6 3,20
Protein obsahující doménu von Willebrandova faktoru typu A
0199 CM 0 1,51
GTPáza HflX 0890 syntéza proteinů, biogeneze ribozomů
- 4 1,52
Pilus typu IV 0381 pili zprostředkovaná adheze
fimbrie 2 1,53
91 Popis proteinu FTS
lokus
Funkce v buňce Extra-cytozolický
Počet Cys
Snížení
ATP syntáza, gamma řetězec
1752 komplex ATP syntézy transportující
protony
+ 5 1,54
Acyltransferáza mastných kyselin lipopolysacharidu
0175 přenos acylové skupiny
CM 3 1,57
Acyltransferáza 0079 přenos acylové skupiny
CM 6 1,60
Ribonukleáza HII 1158 RNA katabolické procesy
- 1 1,63
ATP vazebný protein ABC transportér
1402 vazba ATP CM 3 1,65
Necharakterizovaný protein
0137 ? 3 1,68
ATP syntáza, beta podjednotka
1751 přenos protonu, ATP syntázová aktivita
+ 1 1,68
ATP syntáza, podjednotka C
1756 transmembránová transportní aktivita
vodíkových iontů
CM 0 1,69
Protein rodiny Drug:H+ antiporter-1 (DHA1)
1582 transporterová aktivita
CM 8 1,70
Protein A systému UvrABC
1439 ATP-vazebná kazeta (ABC), exonukleázová ABC
aktivita
- 14 1,71
Necharakterizovaný protein
0202 + 2 1,72
Protein rodiny NUP, nukleosidpermeáza
1620 nukleosid:sodík symportová aktivita
+ 5 1,77
O-antigen flipáza 0602 procesy biosyntézy + 8 1,77
92 Popis proteinu FTS
lokus
Funkce v buňce Extra-cytozolický
Počet Cys
Snížení
polysacharidu ATP syntáza,
podjednotka delta
1754 přenos protonu, ATP syntázová aktivita
+ 1 1,78
ATP syntáza,
podjednotka epsilon
1750 přenos protonu, ATP syntázová aktivita
+ 0 1,83
ATP vazebný protein ABC transportér
1882 vazba ATP ? 6 1,92
ATP-dependentní RNA helikáza
1226 ATP dependentní helikázová aktivita,
vazba nukleových kyselin
? 2 1,93
ATP syntáza, podjednotka alfa
1753 přenos protonu, ATP syntázová aktivita
+ 4 1,97
Transportér aminokyselin
0799 transportérová aktivita
CM 4 1,98
RNA
methyltransferáza s dvojitou
specificitou
1004 Metylace RNA bazí - 6 1,51*
Necharakterizovaný protein
0367 ? 2 1,59*
Membránový protein/O-antigen protein
0597 CM 7 1,65*
Dehydratáza delta-amino-levulové kyseliny
1562 biosyntéza porfyrinu - 5 1,89*
Glykosyláza uracilu DNA
0533 N-glykosylázová aktivita uracilu DNA
- 4 3,03*
Protein skupiny 1 glykosyltransferáz
1396 transferázová aktivita
- 3 3,06*
93 Popis proteinu FTS
lokus
Funkce v buňce Extra-cytozolický
Počet Cys
Snížení
Acyltransferáza 0078 přenos acylové skupiny
? 8 1,59*
Necharakterizovaný protein
0197 - 2 1,80*
V tabulce jsou uvedeny proteiny vyskytující se u mutantího kmne FSC200ΔdsbA ve snížené míře v porovnání s mateřským kmenem. Volnější kritéria kvantifikace jsou označena hvězdičkou u poměru snížení. Extracytoplazmatická lokalizace byla ověřena programem PSORTb s pozitivním (+) či negativním (-) výsledkem. Výskyt proteinu na cytoplazmatické membráně buňky je označen CM.
5.2.2.1 Proteiny související s virulencí bakterie F. tularensis
Jedním z proteinů, jehož tvorba byla na základě SILAC analýzy nejvíce zvýšena (14,48x) u bakterií bez funkčního DsbA, byl protein chitinázové rodiny 18 z rodiny glykosylhydroláz. Tyto hydrolytické enzymy se účastní katabolismu chitinu štěpením β-1,4 glykosidické vazby. Homology těchto proteinů se vyskytují především u hub (Bowman & Free, 2006). Analýza výskytu genů pro chitinázu prokázala přítomnost alespoň jednoho z genů pro chitinázy u všech kmenů rodu Francisella. Delecí genu chiA u vysoce virulentního kmene SchuS4 však nedošlo k oslabení kmene v myším modelu infekce (Kadzhaev et al., 2009). Protein ChiA byl až dvacetinásobně zvýšený u kultur kmene FSC033 F. tularensis typu A izolovaných z myších slezin oproti bakteriím rostoucích in vitro v tekutém médiu (Twine et al., 2006). U bakterie Francisella novicida je protein ChiA secernován v průběhu exponenciální fáze růstu na bohatých médiích (Hager et al., 2006). Secernované chitinázy jsou nezbytné také pro infekci malarickým parazitem Plasmodium falciparum (Vinetz et al., 1999). U Legionella pneumophila je funkční gen chiA nutný pro optimální přežívání bakterie v plicním epitelu myši; jeho inaktivace však neovlivňuje intracelulární infekci (DebRoy et al., 2006).
Další protein (zvýšen 5,74 x) byl identifikován jako karboxypeptidáza serinového typu (DacD) patřící do skupiny penicilin-vázajících proteinů (PBP, penicillin
94
binding protein) u bakteriálních buněk. Inaktivace genu dacD spolu s dalšími geny pro karboxypeptidázy nemá vliv na morfologii kolonií ani na růst bakterie E. coli (Baquero et al., 1996) U intracelulárního patogena Brucella abortus, mutantní kmen projevil sníženou rezistenci k oxidu dusnatému, oslabení jak v buněčném tak i v myším modelu infekce (Kikuchi et al., 2006). Funkce proteinu DacD u bakterie F. tularensis zatím nebyla popsána.
Protein FTS_1279 (zvýšený 4,95x) je v databázích anotován jako necharakterizovaný protein s přítomností Sel1-like motivu. Homolog tohoto proteinu označovaný jako DipA (deficient in intracellular replication A) je u bakterie F. tularensis subsp. tularensis SchuS4 významným faktorem virulence.
Tento protein se prokazatelně vyskytuje na povrchu bakteriální buňky a ve své sekvenci obsahuje Sel1-like opakující se motivy, které slouží jako podpůrná struktura (scaffold) pro protein-proteinové interakce. Druhý sekvenční motiv, tzv.
coiled-coil motiv, slouží k ukotvení proteinu na povrchu bakteriální buňky (Chong et al., 2013). Deleční mutagenezí došlo k oslabení kmene jak v primárních kostně dřeňových makrofázích, tak při in vivo infekci BALB/c myší (Wehrly et al., 2009).
Pozdější studie pak prokázala částečný imunoprotektivní účinek delečního kmene dipA (Rockx-Brouwer et al., 2012). Imunoprecipitací se podařilo pro DipA nalézt pouze jediného interakčního partnera, protein FopA. Interakce DipA s DsbA homologem F. tularensis subsp. tularensis SchuS4 kmene (FTT1103) tímto přístupem jednoznačně nebyla prokázána (Chong et al., 2013). Ačkoli má protein FTS_1279 ve své sekvenci 4 cysteiny, bioinformatická predikce neprokázala přítomnost disulfidické vazby. Protein FTS_1279 by však mohl být substrátovým proteinem DsbA z hlediska jeho chaperonové aktivity.
Kataláza (katG, FTS_1471, zvýšená 2,24x) se vyskytuje u všech subsp. rodu Francisella jako konzervovaný protein a účastní se detoxifikace H2O2. Deleční mutanti kmenů LVS a vysoce virulentního SchuS4 nevykazovaly změny
95
v proliferaci v buněčném modelu infekce a oslabení v in vivo modelu bylo prokázáno pouze u LVS∆katG (Lindgren et al., 2007).
Elongační faktor Tu (FTS_1709, zvýšený 1,8 x), který je v cytoplasmě zapojen do translačního procesu, byl detekován pomocí fluorescenční mikroskopie na povrchu bakteriální buňky. Experimentálně byla také prokázána interakce mezi EF-Tu bakterie a povrchově exprimovaným nukleolinem makrofágů, které slouží mimo jiné jako receptory hostitelských buněk potřebné pro invazi bakterií Francisella. EF-Tu by tedy mohl hrát roli v procesu adheze bakterií či jejich vstupu do nitra hostitelské buňky (Barel et al., 2008b).
Homolog proteinu FTS_0450 (zvýšený 2,1x) byl u bakterie F. novicida popsán jako transkripční regulátor FevR, který kontroluje přepis virulentních genů a je nezbytný pro intracelulární růst a patogenezi bakterie (Brotcke & Monack, 2008).
Transkripční analýzou intracelulárního osudu F. tularensis SchuS4 v buňkách primárních kostně-dřeňových makrofágů byl zjištěn zvýšený přepis genu pro homolog FTS_0450. Deleční mutagenezí bylo zjištěno oslabení v intracelulárním růstu a myším modelu infekce (Wehrly et al., 2009). Protein FevR (označen jako PigR) interaguje také v komplexu s regulátory exprese MglA-SspA a společně hrají roli v regulaci přepisů genů virulence F. tularensis (Charity et al., 2009).
Jako protein se sníženým výskytem (2,5 x) byl identifikován hypotetický protein FTS_1068. Tento protein o velikosti 96 aminokyselin obsahuje doménu FKBP_N, která však sdílí s FKBP_N doménou proteinu DsbA pouze 21% identitu. Delecí genu pro FTS_1068 protein v genomu SchuS4 virulentního kmene došlo sice k oslabení kmene v buněčném modelu infekce, oslabení v myším modelu infekce tularemie však prokázáno nebylo (Qin et al., 2011). Nejbližším homologem u jiných bakterií pro protein FTS_1068 je protein MIP (macrophage infectivity potentiator), významný faktor virulence u bakterie Legionella pneumophila, který je nezbytný pro intracelulární přežití bakterie a in vivo virulenci. Tento dimerní enzym patří do rodiny peptidylprolyl-cis/trans-isomeráz a skládá se z N-koncové dimerizační
96
domény a C-koncové FKBP domény se dvěma aktivními centry, které jsou zodpovědné za cis/trans izomerii (Riboldi-Tunnicliffe et al., 2001).
Mezi proteiny jejichž výskyt byl snížený u FSC200ΔdsbA patří dále skupina proteinů z jednoho genového klastru: FTS_0197 (snížený 1,78x), FTS_ 0199 (snížený 1,51x), FTS_0200 (snížený 2,0x) a FTS_0202 (snížený 1,72x). Celý lokus obsahuje celkem o 10 genů a byl nazván moxR podle prvního genu, který kóduje nukleozidtrifosfatázu patřící do podrodiny ATPáz označovaných Mox (methanol-oxidující systém). Analýza transkripce lokusu u F. tularensis LVS prokázala společnou transkripci všech 10 genů, jejichž exprese je kontrolována alternativním sigma faktorem σ32. Ačkoli inzerční mutageneze FTL_0206 (homolog FTS_0202) prokázala pouze mírné oslabení v buněčném modelu infekce, protein FTL_0206 byl nezbytný pro virulenci kmene LVS v myším modelu infekce (Dieppedale et al., 2011). Celý lokus moxR je vysoce konzervovaný v genomech různých poddruhů F. tularensis, část tohoto lokusu je homologní k bat lokusu striktního anaeroba Bacteroides fragilis, kde je tento lokus zodpovědný za aerotoleranci (Tang et al., 1999).
5.2.2.2 Proteiny asociované s vnějšími povrchovými strukturami F. tularensis Protein FTS_0175 (snížený 1,56x) označený v genomu vysoce virulentního kmene SchuS4 jako LpxL je pozdní acyltransferáza s vysokou podobností k proteinu LpxL u bakterie E. coli. Tyto enzymy jsou zapojeny do acylace lipidu A. Delecí FTS_0175 homologa v SchuS4 kmeni došlo ke ztrátě jednoho acylového zbytku lipidu A a tím produkci pouze triacylovaného lipidu A (McLendon et al., 2007)).
Proteiny FTS_0602 (1,78x snížený) a FTS_0597 (1,67x snížený) jsou v databázi NCBI označeny jako O-antigen flipáza a O-antigen polymeráza, homology členů rodiny transportérů polysacharidu Gram-negativních i Gram-pozitivních bakterií.
V genomu Francisella tularensis se nalézá genový klastr O-antigenu, který sdružuje všechny geny nezbytné pro syntézu O-antigenu (Vinogradov et al., 1991).
Translokace a polymerace O-antigenu je možná u bakterií cestou závislou
97
či nezávislou na genu wzy. Bakterie F. tularensis kóduje proteiny s vysokou sekvenční podobností k proteinům Wzy a Wzx a tudíž je translokace a polymerace O-antigenu uskutečňována wzy-závislou cestou (Prior et al., 2003). Charakterizace wzy delečního kmene prokázala funkci proteinu Wzy jako polymerázy O-polysacharidu v procesu biosyntézy lipoO-polysacharidu (Kim et al., 2010). Deleční mutant wzy kmene LVS byl vysoce oslabený v myším modelu infekce se schopností imunoprotekce nejen proti mateřskému kmeni LVS, ale také proti vysoce virulentnímu kmeni SchuS4 (Kim et al., 2012).
Dalším proteinem zapojeným do skladby povrchových struktur F. tularensis je FTS_1396 (snížený 3,0x), glykosyltransferáza podílející se na syntéze kapsuli podobného komplexu (kapsule-like complex). Kapsulový komplex není u kmene LVS nutný pro intracelulární růst, avšak současnou delecí genů FTL_1422 a FTL_1423 došlo k oslabení kmene v myším modelu infekce i k imunoprotektivnímu účinku (Bandara et al., 2011).
5.2.2.3 Proteiny secernované bakterií F. tularensis
Protein IglE (FTS_0111/1139, zvýšený 1,53) je součástí ostrova patogenity (FPI, Francisella patogenicity island), který je u bakterie F. tularensis zodpovědný za její intracelulární osud a virulenci. Tento 33-kb velký ostrov kóduje 16-19 genů, které jsou pravděpodobně součástí sekrečního systému typu VI (T6SS). FPI je u všech patogenních kmenů F. tularensis duplikován, v jedné kopii je přítomen pouze u F. novicida a F. philomiragia (shrnuto v Bröms et al., 2010). Protein IglE byl identifikován jako substrát pro T6SS a byla potvrzena i jeho sekrece v průběhu intramakrofágové infekce LVS (Bröms et al., 2012)
Protein PilA (FTS_0381, snížený 1,54x) je nezbytný pro sekreci a správné složení pilů typu IV. Pro bakterii F. tularensis subsp. holarctica FSC200 je PilA nezbytný pro virulenci v myším modelu infekce (Forslund et al., 2006). Odstranění genu pilA kmene SchuS4 překvapivě nevedlo k signifikantnímu oslabení kmene v myším modelu infekce (Forslund et al., 2010)). Gen kódující protein PilA se v genomu
98
kmene LVS nenalézá, ale zavedení genu pro tento protein do genomu LVS vedlo k významnému zvýšení virulence na úroveň virulentních izolátů subsp. holarctica (Salomonsson et al., 2009).
5.2.2.4 Hypotetické proteiny se zatím neodhalenou funkcí
Protein FTS_1538 (zvýšený 14,5x) byl identifikován jako necharakterizovaný hypotetický protein bez známé homologie k proteinům jiných bakterií. U tohoto proteinu byl v sekvenci programem PSORTb nalezen signální peptid poukazující buď na jeho asociaci s membránou bakteriální buňky či extracelulární lokalizaci.
Dostupné informace z databáze NCBI predikují u proteinu FTS_1538 DUF2147 doménu (pfam PF09917) bez známé funkce. Protein FTT0484, homolog proteinu FTS_1538 u vysoce virulentního kmene SchuS4, byl identifikován v rámci proteomové analýzy filtrátů kultury kmene SchuS4 jako potenciálně secernovaný protein. V supernatantech kultury kmene LVS však tento protein nalezen nebyl (Konecna et al., 2010). Proteomovou analýzou bakterií kmene LVS kultivovaných v médiu s limitovaným obsahem železa vykazoval homolog proteinu FTS_1538 snížený výskyt. Jelikož je železo nezbytný prvek enzymů některých metabolických drah, může se jeho nedostatek u buněk projevit sníženou tvorbou některých proteinů. Vlivem nedostatku železa tak může docházet u bakterií i k přestavbě povrchových struktur buňky (Lenco et al., 2007). Zvýšený výskyt proteinu FTS_1538 byl naopak prokázán u bakterií kmene FSC200 izolovaných z buněk myší makrofágové linie J774.2 (Pávková et al., 2013). V rámci této studie byly de novo tvořené proteiny bakterií kultivovaných v makrofázích metabolicky značeny radioaktivním 35S-methioninem a 35S-cysteinem v různých časových intervalech od začátku infekce. Tvorba eukaryotických proteinů byla zároveň inhibována přídavkem cykloheximidu. Studie odhalila statisticky významný rozdíl ve výskytu u 64 proteinů, v porovnání s bakteriemi kultivovanými za stejných podmínek ale extracelulárně (v definovaném Chamberlainově médiu). Z funkčního hlediska se jednalo převážně o proteiny účastnící se translačních procesů, stresové odpovědi, metabolických pochodů či remodelaci povrchu bakterií. Snížená tvorba
99
N-acyltransferázy lipidu A svědčí o možné remodelaci bakteriální buněčné membrány jako odpověď na intramakrofágový růst. Proteinový profil bakterie získaný touto analýzou svědčí o komplexnosti procesu adaptace bakterie na prostředí cytoplazmy hostitelské buňky. Na druhou stranu však z relativně nízkého počtu a z míry změněných proteinů je zřejmé, že bakterie je schopná přežívat a replikovat se uvnitř hostitelských buněk bez výraznějších změn v proteomu (Pávková et al., 2013).
Ačkoli se protein FTS_1538 vyskytoval v mnoha studiích např. zabývajících se proteiny se změněným výskytem v prostředí stresu z nedostatku železa, secernovanými proteiny či změněnými bakteriálními proteiny v prostředí makrofágů, funkce proteinu FTS_1538 se dosud nepodařilo odhalit. Další pokrok ve funkčních analýzách tohoto proteinů naráží na skutečnost, že se naší ani jiným spolupracujícím laboratořím nepodařilo připravit kmen s vyřazeným příslušným genem. Tento fakt může naznačovat jeho nezbytnost pro životnost buňky (tzv.
housekeeping gen).
Komparativní proteomovou analýzou pomocí značení SILAC se podařilo získat mnohonásobně vyšší počet proteinů, které by mohly být potenciálními substráty proteinu DsbA. Tyto proteiny by mohly být zodpovědné za oslabený fenotyp delečního kmene. U mnohých z těchto proteinů je skutečně znám jejich vztah k virulenci, zůstává však celá řada proteinů dosud blíže necharakterizovaných.
Tyto proteiny budou předměten dalších studií s cílem odhalit vhodné kandidátní proteiny pro vakcínu.
100
6 ZÁVĚR
Cílem této dizertační práce byla bližší charakterizace disulfidoxidoreduktázy DsbA u intracelulárního patogena Francisella tularensis kmene FSC200. Protein DsbA byl zkoumán jednak z funkčního hlediska pomocí mutageneze vybraných významných reziduí, ale také z hlediska svých substrátů, které u bakterie F. tularensis mohou být faktory virulence.
V rámci funkčních analýz DsbA byla provedena záměna katalytického aktivního místa, prolinu cis-prolinové smyčky a delece N-koncové FKBP domény mutagenezí bakterie F. tularensis subsp. holarctica kmene FSC200. Vliv jednotlivých mutací na fenotyp bakterie byl sledován na buněčném i myším modelu infekce. Zároveň byla také provedena příprava jednotlivých rekombinantních proteinů a jejich charakterizace in vitro.
Bylo zjištěno oslabení kmene F. tularensis jak v buněčném tak i v myším modelu infekce vlivem záměny katalytického aktivního místa, které je zodpovědné za enzymovou aktivitu této disulfidoxidoreduktázy. Tato mutace se navíc ukázala jako plně imunoprotektivní. Příslušný rekombinantní protein se záměnou pak potvrdil ztrátu disulfidoxidoreduktázové aktivity.
Dalšími rezidui, jejichž záměna ovlivnila virulenci mikroba F. tularensis byly prolin tzv. cis-prolinové smyčky, který je u DsbA proteinů důležitý pro vazbu substrátu, a N-koncová FKBP doména, jejíž funkce zatím nebyla odhalena. Záměna cis-prolinu a delece FKBP domény proteinu DsbA však nevedly k plné imunoprotektivitě. Tyto záměny však vedly ke ztrátě disulfidoxidoreduktázové aktivity, což jasně ukazuje na nezbytnost těchto struktur pro tuto aktivitu.
Analýzou příslušných rekombinantních proteinů byla navíc prokázána in vitro chaperonová aktivita, která se zdá být závislá na celé DsbA_Com1-like doméně.
Delece FKBP domény chaperonovu aktivitu proteinu DsbA zvyšovala, což naznačuje možnou regulační funkci této domény. Predikovaná dimerizační funkce FKBP_N domény byla zkoumána pomocí modré nativní elektroforézy
101
rekombinantních proteinů. Dimerizační funkce však nebyla potvrzena a přesná funkce FKBP domény zůstává i nadále neobjasněna.
Předpokládaným místem působení DsbA je periplazmatický prostor bakterií.
Analýza tohoto kompartmentu by mohla proto odhalit další potenciální substráty DsbA. Frakci dostatečně obohacenou o periplazmatické proteiny F. tularensis se však žádnými dosud popsanými přístupy nepodařilo připravit. Kvantitativní proteomovou analýzou frakcí obohacených o membránové proteiny pomocí metabolického SILAC značení se však podařilo odhalit dalších 63 proteinů se statisticky významně změněným výskytem u kmene s delecí dsbA genu v porovnání s kmenem divokým. U mnohých z těchto proteinů byla již dříve popsána souvislost s virulencí bakterie F. tularensis. Další z těchto proteinů pak mají vztah k povrchovým vnějším strukturám či sekreci. Zvláštní skupinu tvoří necharakterizované proteiny, které nevykazují homologii s žádnými proteiny jiných bakterií a jejich funkce je tak zcela nejasná.
Ačkoli je protein DsbA velice významným faktorem virulence s imunoprotektivním účinkem nejen v méně virulentního kmene FSC200, ale také u vysoce virulentního kmene SchuS4, více než samotný protein jsou virulentními faktory jeho substráty.
Odhalení substrátů tohoto proteinu se zdá být klíčové pro další studium virulence mikroba F. tularensis a nalezené proteiny by mohly sloužit jako kandidátní proteiny pro vývoj vakcíny.
102
7 LITERATURA
Ames, G. F., Prody, C. & Kustu, S. (1984). Simple, rapid, and quantitative release of periplasmic proteins by chloroform. J Bacteriol 160, 1181–1183.
Anthony, L. D., Burke, R. D. & Nano, F. E. (1991). Growth of Francisella spp. in rodent macrophages. Infect Immun 59, 3291–3296.
Arredondo, S. A., Chen, T. F., Riggs, A. F., Gilbert, H. F. & Georgiou, G. (2009).
Role of dimerization in the catalytic properties of the Escherichia coli disulfide isomerase DsbC. J Biol Chem 284, 23972–23979.
Bader, M., Muse, W., Ballou, D. P., Gassner, C. & Bardwell, J. C. (1999).
Oxidative protein folding is driven by the electron transport system. Cell 98, 217–
227.
Balagopal, A., MacFarlane, A. S., Mohapatra, N., Soni, S., Gunn, J. S. &
Schlesinger, L. S. (2006). Characterization of the receptor-ligand pathways important for entry and survival of Francisella tularensis in human macrophages.
Infect Immun 74, 5114–5125.
Balonova, L., Hernychova, L., Mann, B. F., Link, M., Bilkova, Z., Novotny, M. V. &
Stulik, J. (2010). Multimethodological approach to identification of glycoproteins from the proteome of Francisella tularensis, an intracellular microorganism. J Proteome Res 9, 1995–2005.
Bandara, A. B., Champion, A. E., Wang, X., Berg, G., Apicella, M. A., McLendon, M., Azadi, P., Snyder, D. S. & Inzana, T. J. (2011). Isolation and mutagenesis of a capsule-like complex (CLC) from Francisella tularensis, and contribution of the CLC to F. tularensis virulence in mice. PloS One 6, e19003.
Baquero, M. R., Bouzon, M., Quintela, J. C., Ayala, J. A. & Moreno, F. (1996).
dacD, an Escherichia coli gene encoding a novel penicillin-binding protein (PBP6b) with DD-carboxypeptidase activity. J Bacteriol 178, 7106–7111.
103
Bardwell, J. C., McGovern, K. & Beckwith, J. (1991). Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell 67, 581–589.
Bardwell, J. C., Lee, J. O., Jander, G., Martin, N., Belin, D. & Beckwith, J. (1993).
A pathway for disulfide bond formation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 1038–
1042.
Barel, M., Hovanessian, A. G., Meibom, K., Briand, J.-P., Dupuis, M. & Charbit, A.
(2008a). A novel receptor - ligand pathway for entry of Francisella tularensis in monocyte-like THP-1 cells: interaction between surface nucleolin and bacterial elongation factor Tu. BMC Microbiol 8, 145.
Barel, M., Hovanessian, A. G., Meibom, K., Briand, J.-P., Dupuis, M. & Charbit, A.
(2008b). A novel receptor - ligand pathway for entry of Francisella tularensis in monocyte-like THP-1 cells: interaction between surface nucleolin and bacterial elongation factor Tu. BMC Microbiol 8, 145.
Berkmen, M., Boyd, D. & Beckwith, J. (2005). The nonconsecutive disulfide bond of Escherichia coli phytase (AppA) renders it dependent on the protein-disulfide isomerase, DsbC. J Biol Chem 280, 11387–11394.
Bessette, P. H., Cotto, J. J., Gilbert, H. F. & Georgiou, G. (1999). In vivo and in vitro function of the Escherichia coli periplasmic cysteine oxidoreductase DsbG. J Biol Chem 274, 7784–7792.
Bönquist, L., Lindgren, H., Golovliov, I., Guina, T. & Sjöstedt, A. (2008). MglA and Igl proteins contribute to the modulation of Francisella tularensis live vaccine strain-containing phagosomes in murine macrophages. Infect Immun 76, 3502–
3510.
Bouwman, C. W., Kohli, M., Killoran, A., Touchie, G. A., Kadner, R. J. & Martin, N. L. (2003). Characterization of SrgA, a Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence plasmid-encoded paralogue of the disulfide oxidoreductase DsbA, essential for biogenesis of plasmid-encoded fimbriae. J Bacteriol 185, 991–1000.
104
Bowman, S. M. & Free, S. J. (2006). The structure and synthesis of the fungal cell wall. BioEssays News Rev Mol Cell Dev Biol 28, 799–808.
Bröms, J. E., Sjöstedt, A. & Lavander, M. (2010). The Role of the Francisella Tularensis Pathogenicity Island in Type VI Secretion, Intracellular Survival, and Modulation of Host Cell Signaling. Front Microbiol 1, 136.
Bröms, J. E., Meyer, L., Sun, K., Lavander, M. & Sjöstedt, A. (2012). Unique substrates secreted by the type VI secretion system of Francisella tularensis during intramacrophage infection. PloS One 7, e50473.
Brotcke, A. & Monack, D. M. (2008). Identification of fevR, a novel regulator of virulence gene expression in Francisella novicida. Infect Immun 76, 3473–3480.
Buchner, J., Grallert, H. & Jakob, U. (1998). Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Methods Enzymol 290, 323–338.
Case, E. D. R., Chong, A., Wehrly, T. D., Hansen, B., Child, R., Hwang, S., Virgin, H. W. & Celli, J. (2013). The Francisella O-antigen mediates survival in the macrophage cytosol via autophagy avoidance. Cell Microbiol.
Celli, J. (2008). Intracellular localization of Brucella abortus and Francisella tularensis in primary murine macrophages. Methods Mol Biol Clifton NJ 431, 133–
145.
Celli, J. & Zahrt, T. C. (2013). Mechanisms of Francisella tularensis intracellular pathogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med 3, a010314.
Chamberlain. (1965). Evaluation of live tularemia vaccine prepared in a chemically defined medium. Appl Microbiol 13, 232–235.
Charity, J. C., Blalock, L. T., Costante-Hamm, M. M., Kasper, D. L. & Dove, S. L.
(2009). Small molecule control of virulence gene expression in Francisella tularensis. PLoS Pathog 5, e1000641.
105
Chen, J., Song, J.,Zhang, S., Wang, Y.,Cui, D. F. & Wang, C. C. (1999). Chaperone activity of DsbC. J Biol Chem 274, 19601-19605
Chong, A., Wehrly, T. D., Nair, V., Fischer, E. R., Barker, J. R., Klose, K. E. & Celli, J. (2008). The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun 76, 5488–5499.
Chong, A., Wehrly, T. D., Child, R., Hansen, B., Hwang, S., Virgin, H. W. & Celli, J.
(2012). Cytosolic clearance of replication-deficient mutants reveals Francisella tularensis interactions with the autophagic pathway. Autophagy 8, 1342–1356.
Chong, A., Child, R., Wehrly, T. D., Rockx-Brouwer, D., Qin, A., Mann, B. J. &
Celli, J. (2013). Structure-Function Analysis of DipA, a Francisella tularensis Virulence Factor Required for Intracellular Replication. PloS One 8, e67965.
Clemens, D. L. & Horwitz, M. A. (2007). Uptake and intracellular fate of Francisella tularensis in human macrophages. Ann N Y Acad Sci 1105, 160–186.
Clemens, D. L., Lee, B.-Y. & Horwitz, M. A. (2005). Francisella tularensis enters macrophages via a novel process involving pseudopod loops. Infect Immun 73, 5892–5902.
Copeland, B. R., Richter, R. J. & Furlong, C. E. (1982). Renaturation and identification of periplasmic proteins in two-dimensional gels of Escherichia coli. J Biol Chem 257, 15065–15071.
DebRoy, S., Dao, J., Söderberg, M., Rossier, O. & Cianciotto, N. P. (2006).
Legionella pneumophila type II secretome reveals unique exoproteins and a chitinase that promotes bacterial persistence in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 19146–19151.
Dennis, D. T., Inglesby, T. V., Henderson, D. A., Bartlett, J. G., Ascher, M. S., Eitzen, E., Fine, A. D., Friedlander, A. M., Hauer, J. & other authors. (2001).
106
Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA J Am Med Assoc 285, 2763–2773.
Dieppedale, J., Sobral, D., Dupuis, M., Dubail, I., Klimentova, J., Stulik, J., Postic, G., Frapy, E., Meibom, K. L. & other authors. (2011). Identification of a putative chaperone involved in stress resistance and virulence in Francisella tularensis.
Infect Immun 79, 1428–1439.
Eigelsbach, H. T., Hornick, R. B. & Tulis, J. J. (1967). Recent studies on live tularemia vaccine. Med Ann Dist Columbia 36, 282–286.
Ellermeier, C. D. & Slauch, J. M. (2004). RtsA coordinately regulates DsbA and the Salmonella pathogenicity island 1 type III secretion system. J Bacteriol 186, 68–79.
Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M. & Titball, R. W. (2002). Tularemia. Clin Microbiol Rev 15, 631–646.
Enderlin, G., Morales, L., Jacobs, R. F. & Cross, J. T. (1994). Streptomycin and alternative agents for the treatment of tularemia: review of the literature. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 19, 42–47.
Fabianek, R. A., Hennecke, H. & Thöny-Meyer, L. (1998). The active-site cysteines of the periplasmic thioredoxin-like protein CcmG of Escherichia coli are important but not essential for cytochrome c maturation in vivo. J Bacteriol 180, 1947–1950.
Forestal, C. A., Malik, M., Catlett, S. V., Savitt, A. G., Benach, J. L., Sellati, T. J. &
Furie, M. B. (2007). Francisella tularensis has a significant extracellular phase in infected mice. J Infect Dis 196, 134–137.
Forslund, A.-L., Kuoppa, K., Svensson, K., Salomonsson, E., Johansson, A., Byström, M., Oyston, P. C. F., Michell, S. L., Titball, R. W. & other authors.
(2006). Direct repeat-mediated deletion of a type IV pilin gene results in major virulence attenuation of Francisella tularensis. Mol Microbiol 59, 1818–1830.
107
Forslund, A.-L., Salomonsson, E. N., Golovliov, I., Kuoppa, K., Michell, S., Titball, R., Oyston, P., Noppa, L., Sjöstedt, A. & Forsberg, A. (2010). The type IV pilin, PilA, is required for full virulence of Francisella tularensis subspecies tularensis. BMC Microbiol 10, 227.
Grimshaw, J. P. A., Stirnimann, C. U., Brozzo, M. S., Malojcic, G., Grütter, M. G., Capitani, G. & Glockshuber, R. (2008). DsbL and DsbI form a specific dithiol oxidase system for periplasmic arylsulfate sulfotransferase in uropathogenic Escherichia coli. J Mol Biol 380, 667–680.
Hager, A. J., Bolton, D. L., Pelletier, M. R., Brittnacher, M. J., Gallagher, L. A., Kaul, R., Skerrett, S. J., Miller, S. I. & Guina, T. (2006). Type IV pili-mediated secretion modulates Francisella virulence. Mol Microbiol 62, 227–237.
Hayashi, S. & Wu, H. C. (1990). Lipoproteins in bacteria. J Bioenerg Biomembr 22, 451–471.
Hendrix, L. R., Mallavia, L. P. & Samuel, J. E. (1993). Cloning and sequencing of Coxiella burnetii outer membrane protein gene com1. Infect Immun 61, 470–477.
Heras, B., Edeling, M. A., Schirra, H. J., Raina, S. & Martin, J. L. (2004). Crystal structures of the DsbG disulfide isomerase reveal an unstable disulfide. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 8876–8881.
Heras, B., Totsika, M., Jarrott, R., Shouldice, S. R., Guncar, G., Achard, M. E. S., Wells, T. J., Argente, M. P., McEwan, A. G. & Schembri, M. A. (2010). Structural and functional characterization of three DsbA paralogues from Salmonella enterica serovar typhimurium. J Biol Chem 285, 18423–18432.
Hiniker, A. & Bardwell, J. C. A. (2004). In vivo substrate specificity of periplasmic disulfide oxidoreductases. J Biol Chem 279, 12967–12973.
Hochstrasser, D. F. & Merril, C. R. (1988). ‘Catalysts’ for polyacrylamide gel polymerization and detection of proteins by silver staining. Appl Theor Electrophor Off J Int Electrophor Soc 1, 35–40.
108
Holmgren, A. (1979). Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J Biol Chem 254, 9627–9632.
Jackson, M. W. & Plano, G. V. (1999). DsbA is required for stable expression of outer membrane protein YscC and for efficient Yop secretion in Yersinia pestis. J Bacteriol 181, 5126–5130.
Jameson-Lee, M., Garduño, R. A. & Hoffman, P. S. (2011). DsbA2 (27 kDa Com1-like protein) of Legionella pneumophila catalyses extracytoplasmic disulphide-bond formation in proteins including the Dot/Icm type IV secretion system. Mol Microbiol 80, 835–852.
Jander, G., Martin, N. L. & Beckwith, J. (1994). Two cysteines in each periplasmic domain of the membrane protein DsbB are required for its function in protein disulfide bond formation. EMBO J 13, 5121–5127.
Jarrott, R., Shouldice, S. R., Guncar, G., Totsika, M., Schembri, M. A. & Heras, B.
(2010). Expression and crystallization of SeDsbA, SeDsbL and SeSrgA from Salmonella enterica serovar Typhimurium. Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun 66, 601–604.
Jensch, T. & Fricke, B. (1997). Localization of alanyl aminopeptidase and leucyl aminopeptidase in cells of Pseudomonas aeruginosa by application of different methods for periplasm release. J Basic Microbiol 37, 115–128.
Kadokura, H. & Beckwith, J. (2010). Mechanisms of oxidative protein folding in the bacterial cell envelope. Antioxid Redox Signal 13, 1231–1246.
Kadokura, H., Tian, H., Zander, T., Bardwell, J. C. A. & Beckwith, J. (2004).
Snapshots of DsbA in action: detection of proteins in the process of oxidative folding. Science 303, 534–537.
Kadzhaev, K., Zingmark, C., Golovliov, I., Bolanowski, M., Shen, H., Conlan, W.
& Sjöstedt, A. (2009). Identification of genes contributing to the virulence of