Hradec Králové 2014
Univerzita Karlova v Praze
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové
Katedra biochemických věd
Analýza membránových proteinů patogenní bakterie Francisella tularensis
Mgr. Monika Schmidt
dizertační práce
Školitel: Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D.
Školitel-specialita: PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D.
2
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně (pod vedením svého školitele a konzultanta). Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“
V Pardubicích 22.4.2014 Mgr. Monika Schmidt
3
PODĚKOVÁNÍ
Tato práce vznikla za podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy v Praze (GAUK 14010) a Long-term Organization Development Plan 1011 Ministerstva Obrany České republiky.
Na tomto místě bych ráda poděkovala své školitelce Doc. Ing. Barboře Szotákové, Ph.D. a školitelce-specialistce PharmDr. Ivoně Pávkové, Ph.D. za odborné vedení v průběhu mého studia, za cenné rady a návrhy při vypracování této práce.
Poděkování také patří prof. MUDr. Jiřímu Stulíkovi, CSc. za finanční podporu a umožnění vypracovat práci na jeho pracovišti a ostatním spolupracovníkům Ústavu molekulární patologie za ochotu, rady a přátelské prostředí.
Veliký dík patří celé mé rodině za podporu při studiu, nejvíce však děkuji svému manželovi za psychickou podporu nejen v cílové rovince.
4
ABSTRAKT
Univerzita Karlova v Praze
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd
Kandidát:
Školitel:
Školitel-specialista:
Mgr. Monika Schmidt Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D.
PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D.
Název dizertační práce: Analýza membránových proteinů patogenní bakterie Francisella tularensis
Bakterie Francisella tularensis je vysoce nakažlivý fakultativně intracelulární patogen způsobující onemocnění tularemie. Dosud jediná vyvinutá vakcína proti tomuto patogenu nemá ve většině zemí licenci pro humánní použití z důvodu nedostatečné standardizace a účinku proti vysoce virulentním kmenům. Jedním z nedávno popsaných významných faktorů virulence bakterie F. tularensis je
konzervovaný hypotetický lipoprotein s homologií
k thiol/disulfidoxidoreduktázám (DsbA). Odstraněním genu pro tento protein dochází k oslabení bakterie a vývoji imunoprotekce. Sekvence proteinu DsbA obsahuje C-koncovou DsbA_Com_1-like doménu, zahrnující konzervované aktivní místo C-X-X-C a cis-prolinovou smyčku, a N-koncovou peptidyl-prolyl- izomerázovou doménu FKBP typu. V této práci jsme se zaměřili na funkční a substrátovou analýzu proteinu DsbA. Funkční analýza tohoto proteinu prokázala význam jak katalytického aktivního místa a cis-prolinu, tak celé FKBP_N domény pro disulfidoxidoreduktázovou aktivitu proteinu DsbA. Dále tato práce odhalila in vitro chaperonovou funkci proteinu DsbA, která je závislá na DsbA_Com1
5
doméně. Možná funkce FKBP domény jako dimerizačního modulu byla vyvrácena a potvrdil se výskyt proteinu DsbA v bakteriální buňce v monomerním stavu.
Substrátová analýza potenciálních partnerů proteinu DsbA metodou metabolického značení SILAC prokázala 63 proteinů se změněným výskytem v buňkách delečního kmene FSC200∆dsbA v porovnání s kmenem divokým. Lze předpokládat, že některé z těchto proteinů se významně podílí na virulenci F. tularensis.
6
ABSTRACT
Charles University in Prague
Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Department of Biochemical Sciences
Candidate: Mgr. Monika Schmidt
Supervisor: Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D.
Consultant: PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D.
Title of Doctoral Thesis: Analysis of membrane proteins of pathogenic bacterium Francisella tularensis
Bacterium Francisella tularensis is highly infectious pathogen causing disease tularaemia. Due to the lack of standardization and little protection against highly virulent strains, the only vaccine developed against this pathogen is not allowed for clinical usage. Conserved hypothetical lipoprotein homological to thiol/disulfide oxidoreductase (DsbA) was recently described as essential virulence factor of Francisella tularensis. The dsbA gene deletion led to attenuation of the strain and development of immunoprotection. The DsbA protein sequence revealed the presence of carboxy-terminal DsbA_Com1-like domain harbouring the catalytic active site C-X-X-C and cis-proline and domain amino-terminal to FKBP type peptidyl-prolyl isomerase. This work was focused on functional a substrate characterization of DsbA protein. The functional analysis of this protein showed both the importance of the active site, cis-proline and the FKBP_N domain for the thiol/disulphide oxidoreductase activity. Further, this work also revealed the in
7
vitro chaperone activity of DsbA protein fully dependent on DsbA-Com1-like domain. The possibility of dimerization function of FKBP_N domain was refused and the monomeric state of DsbA protein in bacterial cell was confirmed.
Using the SILAC metabolic labelling the substrate analyses of potential DsbA partners showed 63 proteins with significantly altered abundance in the dsbA deletion strain compared with the wild type. One can assume that some of these proteins are important for F. tularensis virulence.
8 POUŽITÉ ZKRATKY
FCP fagozom obsahující franciselu
LVS živý vakcinační kmen (Live Vaccine Strain) CFU kolonie-tvořící jednotky, colony forming units DSB systém pro tvorbu disulfidických vazeb
T3SS sekreční systém typu III T4SS sekreční systém typu IV T6SS sekreční systém typu VI
SPI-1 ostrov patogenity 1 bakterie Salmonella SPI-2 ostrov patogenity 2 bakterie Salmonella PBS pufrovaný fosfátový roztok
MOI multiplicita infekce
s.c. podkožní podání
SDS-PAGE polyakrylamidová elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného
PVDF polyvinylidendifluoridová membrána
BN-PAGE modrá nativní polyakrylamidová elektroforéza O.D. optická denzita
DTT dithiothreitol
CS citrátsyntáza
SILAC stabilní izotopové značení aminokyselin v kultuře FPI ostrov patogenity bakterie Francisella
9
OBSAH
1 ÚVOD 11
2 TEORETICKÝ ÚVOD 13
2.1 Patogenní bakterie Francisella tularensis a tularemie ... 14
2.2 Buněčný cyklus bakterie F. tularensis ... 18
2.3 Tularemická vakcína ... 20
2.4 Systém pro tvorbu disulfidických vazeb ... 22
2.4.1 Thiol/disulfid oxidační cesta bakterie Escherichia coli– proteiny DsbA, DsbB ... 22
2.4.2 Izomerizační cesta – proteiny DsbC, DsbD, DsbG ... 26
2.5 Substráty proteinu DsbA bakterie E. coli ... 30
2.6 DsbA proteiny Gram negativních fakultativně intracelulárních bakterií ... 31
2.6.1 Salmonella enterica... 31
2.6.2 Legionella pneumophila ... 32
2.6.3 Neisseria meningitidis ... 33
2.6.4 Shigella flexneri ... 34
2.6.5 Yersinia pestis ... 35
2.6.6 Francisella tularensis ... 35
3 CÍLE PRÁCE 37 4 Materiál a metody 38 4.1 Chemikálie ... 39
4.2 Bakteriální kmeny, buněčné linie a experimentální zvířata ... 39
4.3 Mutageneze genu dsbA bakterie F. tularensis FSC200 ... 41
4.4 Buněčný model infekce F. tularensis ... 44
4.5 Zvířecí model infekce ... 45
4.6 Příprava rekombinantních proteinů DsbA v E. coli ... 46
4.7 Stanovení dithiol/disulfidoxidoreduktázové aktivity rekombinantních proteinů ... 48
4.8 Stanovení chaperonové aktivity rekombinantních proteinů ... 48
4.9 Polyakrylamidová elektroforéza za neredukujících podmínek ... 49
4.10Nativní gelová elektroforéza ... 50
4.11Izolace frakce obohacené o periplazmatické proteiny ... 51
4.11.1 Metoda s použitím EDTA a lysozymu ... 51
4.11.2 Metoda s použitím MgCl2 a lysozymu ... 51
4.11.3 Metoda s použitím chloroformu ... 52
4.11.4 Metoda s použitím polymyxinu B ... 52
4.11.5 Metoda studeného osmotického šoku ... 52
4.12Dvou dimenzionální elektroforéza (2-D) ... 53
4.13Značení bakteriálních kultur metodou SILAC ... 55
4.13.1 Adaptační fáze ... 57
10
4.13.2 Kultivace bakterií, inkorporace značených aminokyselin ... 58
4.13.3 Příprava frakce obohacené o membránové proteiny ... 58
4.13.4 Analýza hmotnostním spektrometrem ... 58
5 Výsledky a diskuze 60 5.1 Funkční analýzy proteinu DsbA bakterie Francisella tularensis subsp. holarctica kmene FSC200 ... 61
5.1.1 Konstrukce mutantních kmenů F. tularensis AXXA, P286T, ∆FKBP_N a cFSC200 ... 61
5.1.2 Proliferace bakterií F. tularensis v makrofázích ... 64
5.1.3 Přežití BALB/c myší a imunoprotektivita ... 67
5.1.4 SDS-PAGE za neredukujících podmínek ... 71
5.1.5 Modrá nativní elektroforéza rekombinantních proteinů ... 72
5.1.6 Stanovení disulfidoxidoreduktázové aktivity ... 73
5.1.7 Chaperonová aktivita DsbA ... 76
5.2 Substrátová analýza proteinu DsbA bakterie Francisella tularensis poddruh holarctica kmenů FSC200 a LVS ... 79
5.2.1 Analýza periplazmatických proteinů ... 80
5.2.2 Metabolické značení SILAC ... 85
6 Závěr 100 7 Literatura 102 8 Seznam publikovaných prací 119 8.1 Odborné publikace vztahující se k tématu práce ...119
8.2 Ostatní odborné publikace s IF ...119
8.3 Abstrakta z konferencí ...119
9 Přílohy 122
11
1 ÚVOD
Intracelulární Gram-negativní mikrob Francisella tularensis je původce onemocnění tularemie, nákazy s přírodní ohniskovostí. Centrum pro kontrolu chorob a nemocí v USA zařadilo mikroba F. tularensis na seznam vybraných infekčních agens kategorie A, u kterých je možno jejich potenciální zneužití jako biologické zbraně. Pro zařazení F. tularensis do této kategorie lze najít několik důvodů: vysoký stupeň virulence tohoto mikroba spolu s nízkou infekční dávkou nutnou pro vyvolání onemocnění, možnost přenosu vzduchem a aerosolizace a schopnost způsobit velice závažné až letální onemocnění. Onemocnění vysoce virulentním kmenem může vést až k 60% mortalitě, ale včasným zahájením terapie antibiotiky lze úmrtnost snížit až na 2%. Přenos na člověka se děje nejčastěji kousnutím nakaženým hmyzem nebo členovci. Ohroženými skupinami z hlediska přenosu nákazy aerosolem mohou být také lovci a lidé manipulují se zvířecími mršinami. Z tohoto důvodu je velice nezbytný vývoj vakcíny, která by dokázala ochránit nejen proti nákaze získané z prostředí, ale také proti laboratorně přeneseným infekcím. Ačkoli byl v 50. letech 20. století vyvinut oslabený vakcinační kmen (live vaccine strain) F. tularensis, dnes ho není možné používat z důvodu nejasného mechanismu oslabení s možností navrácení virulence a nedostatečné ochrany proti aerosolové expozici kmeny vysoce virulentního typu A.
Proteiny DsbA z rodiny disulfidoxidoreduktáz hrají u mnoha bakterií významnou roli při skládání kvarterních struktur proteinů. Zejména u intracelulárních patogenů je tento protein obvykle důležitý pro správné složení komponent sekrečních systémů, které bakterie využívají v patogenezi. Protein DsbA F. tularensis byl v posledních letech identifikován jako esenciální virulenční faktor.
Odstranění genu kódujícího protein DsbA vede k oslabení kmene F. tularensis a byl prokázán také plný imunoprotektivní účinek při použití tohoto kmene jako vakcinačního.
12
Tato dizertační práce si klade za cíl analýzu funkce a substrátů proteinu DsbA intracelulárního patogena F. tularensis subsp. holarctica.
13
2 TEORETICKÝ ÚVOD
14
2.1 Patogenní bakterie Francisella tularensis a tularemie
Fakultativně intracelulární kokobacil Francisella tularensis, byl prvně izolován v roce 1911 v okresu Tulare ve Spojených Státech z hlodavců, kteří vykazovali známky onemocnění podobající se moru. Podle místa výskytu bylo toto onemocnění označeno jako tularemie (McCoy & Chapin, 1912). Taxonomie rodu Francisella zatím není zcela dořešena. Rod byl původně rozdělen na tři druhy:
F. novicida, F. philomiragia a F. tularensis (Larsson et al., 2009). Ačkoli F. philomiragia a F. novicida jsou méně patogenní druhy způsobující onemocnění u imunokompromitovaných jedinců, druh F. tularensis způsobuje u lidí závažné onemocnění. Nedávné analýzy genomu bakterie Francisella odhalily dvě hlavní genetické větve. První větev zahrnuje druhy F. tularensis, F. novicida a F. hispaniensis, blízce příbuznou k bakterii Wolbachia persica. Druhou větev tvoří druhy F. philomiragia a F. noatuensis (Sjödin et al., 2012) (Tab. 1)
Tab. 1: Nomenklatura a virulence rodu Francisella
Bakterie Poddruh Virulence Člověk LD50 CFU
Myš LD50 CFU Větev
I
F. tularensis tularensis velmi vysoká
< 10 < 10
holarctica vysoká <103 < 1 mediasiatica vysoká neudáno neudáno
F. novicida nízká <103 <103
F. hispaniensis Větev
II
F. philomiragia nízká
F. noatuensis
Nomenklaturní rozlišení druhů a poddruhů rodu Francisella s udanou virulencí a letálními dávkami (LD50) pro člověka a myš. Převzato a upraveno dle Oyston & Quarry, 2005; Larsson et al., 2009 a Sjödin et al., 2012.
15
Druh F. tularensis je možno dále rozdělit na poddruhy (subspecies, subsp.) na základě biochemických vlastností a úrovně virulence pro domestikované králíky. Poddruh tularensis (označován také jako Jellisonův typ A) je pro králíky vysoce patogenní a vyskytuje se převážně v severní Americe, poddruh holarctica (Jellisonův typ B) je spojován s menší virulencí a výskytem v Evropě a severních oblastech Asie. Třetím poddruhem je mediaasiatica, který je virulencí srovnatelný s poddruhem holarctica a vyskytuje se v izolovaných oblastech Kazachstánu, Turkmenistánu a střední Asii (Obr. 1)(shrnuto v Keim et al., 2007). F. tularensis je náročná na kultivační podmínky a pro svůj růst na živných půdách, i v tekutém médiu vyžaduje přítomnost železa a sloučenin s obsahem –SH skupin, např.
cysteinu (Ellis et al., 2002).
Tularemie nebo také zaječí nemoc je primárně zoonotické onemocnění savců s výskytem přírodních ohnisek nákazy. Přírodní spektrum hostitelů bakterie F. tularensis je velice široké a doposud zahrnuje 190 savců, 88 bezobratlých a 23 ptáků (Mörner & Addison, 2001). Nejvnímavější pro nákazu touto bakterií jsou zejména hlodavci a zajícovci. Tato zvířata však nejspíš nejsou přímým rezervoárem této bakterie, neboť i u nich probíhá akutní infekce tularemie.
Přenos bakterie na člověka je možný přímým kontaktem s nakaženým zvířetem, inhalací aerosolu (např. při stahování zajíců či králíků z kůže), požitím kontaminované vody, pobodání hmyzem či krev-sajícím členovcem. Přenos tularemie z člověka na člověka zatím prokázán nebyl. Podle místa vstupu infekce do organismu se rozlišuje několik forem tularemie. Nejběžnější ulceroglandulární forma (až 90% případů) vzniká přenosem přes poškozenou kůži po přímém kontaktu s uhynulými infikovanými zvířaty, častěji však jako důsledek pokousání krev-sajícím hmyzem (Tärnvik et al., 2003). Požití infikovaného masa či vody může vyvolat orofaryngeální nebo gastrointestinální formu tularemie, zanesením bakterií F. tularensis do oka pak vzniká forma okuloglandulární. Nejméně běžnou je plicní forma onemocnění, ke které dochází po vdechnutí bakterií F. tularensis v podobě aerosolu (Oyston, 2008, Dennis et al., 2001).
16
Závažnost onemocnění se odvíjí od infekčního kmene, infekční dávky a místa vstupu infekce do organismu. V případě F. tularensis subsp. tularensis je infekční dávka vpravená do organismu člověka subkutánní cestou menší než 10 bakterií (Saslaw et al., 1961), u aerosolové infekce pak 25 bakterií, a proto patří tato bakterie k jedněm z nejvíce infekčních patogenů, které kdy byly známy. Méně virulentní kmen F. tularensis poddruh holarctica je schopen u člověka vyvolat onemocnění subkutánní cestou v dávce ca. 100 bakterií (Ellis et al., 2002; Oyston &
Quarry, 2005).
Obr. 1: Světové rozšíření tularemie (případy v letech 1952-2006)
Čtverečkovaná oblast v severní Americe určuje hranice výskytu tularemie typu A a B – F. tularensis subsp. tularensis a F. tularensis subsp. holarctica. Šedá barva na území Evropy a severních oblastí Asie ohraničuje výskyt tularemie typu B – F. tularensis subsp. holarctica. Trojúhelníky vyznačují řídký výskyt F. novicida a hvězdičky ukazují geograficky ohraničené izolace F. tularensis subsp. mediasiatica. Geografická distribuce zahrnuje případy v letech 1952- 2006. Převzato a upraveno dle Keim et al., 2007
17
Inkubační doba je 3-5 dní, po kterých se vyvine chřipce podobné onemocnění.
Symptomy onemocnění jsou různé a závisí na virulenci kmene. Infekce vysoce virulentním kmenem subsp. tularensis vede k závažnějšímu průběhu onemocnění a pokud nedojde k včasnému zahájení léčby, může úmrtnost dosahovat až 60 % (Saslaw et al., 1961b). Terapií antibiotiky může být však snížena až na 2 % (Dennis et al., 2001). Onemocnění vyvolané F. tularensis subsp. holarctica má méně závažný průběh a úmrtnost v případě neléčení se udává v rozmezí 1-10%, při terapii antibiotiky je pak prakticky nulová. Pro terapii tularemie jsou nejčastěji používány aminoglykosidy (streptomycin, gentamicin), lze aplikovat i tetracyklin či fluorochinolony (Enderlin et al., 1994). Především pro vysoký stupeň virulence, nízkou infekční dávku, možnost snadného přenosu vzduchem a schopnost způsobit závažné až letální onemocnění, hrozí potenciální zneužití F. tularensis jako biologické zbraně. Proto byla tato bakterie Centrem pro kontrolu a prevenci chorob ve Spojených státech zařazena mezi vybrané infekční agens kategorie A (Oyston et al., 2004).
18
2.2 Buněčný cyklus bakterie F. tularensis
Rozvoj tularemie je spojen s infekcí a replikací uvnitř hostitelských buněk.
Nedávné výzkumy ale poukazují také na extracelulární fázi, kdy je F. tularensis schopna přežívat mimo buňky, ačkoli toto množení zatím nebylo prokázáno (Forestal et al., 2007). U savců dochází primárně k infekci a množení bakterie v makrofázích. F. tularensis je však schopna infikovat i další typy buněk jak fagocytujících (neutrofily, dendritické buňky, B-lymfocyty) tak i nefagocytujících (např. buňky plicního epitelu, hepatocyty) (McCaffrey & Allen, 2006; Clemens &
Horwitz, 2007; Rasmussen et al., 2006).
Vstup bakterie F. tularensis do hostitelské buňky makrofágu je zprostředkován celou řadou receptorů v závislosti na opsonizaci. F. tularensis opsonizovaná sérem nejčastěji vstupuje do buněk prostřednictvím komplementového receptoru CR3 (Clemens et al., 2005); využít může i scavengerový receptor typu I nebo II, receptor Fcγ (Pierini, 2006; Balagopal et al., 2006). V případě neopsonizovaných bakterií se na vstupu do hostitelské buňky podílí manózový receptor nebo povrchový nukleolin (Schulert & Allen, 2006; Barel et al., 2008a). Bakterie navázaná na makrofág je pohlcena tzv. „looping“ fagocytózou (Obr. 2). Pro vstup do prostředí makrofágu bakterie vyžaduje také intaktní na cholesterol bohaté lipidové rafty (Tamilselvam & Daefler, 2008). Na procesu vstupu bakterie do makrofágu se podílejí asymetrické pseudopodiální smyčky, které bakterii obklopí a po spojení s plazmatickou membránou uzavřou do prostorného kompartmentu. Vzniklá membránová vakuola, která může obsahovat jednu nebo více bakterií, se v několika málo minutách dramaticky zmenší a putuje do středu buňky (Anthony et al., 1991; Clemens & Horwitz, 2007).
19
Krátce nato získává tento fagozóm znaky časných endozómů a následně pozdních endozómů (EEA1, Rab7, Lamp 1/2, CD63). Ke kolokalizaci s lysozomálními markery (katepsin D) a fúzi s lysozomem však již nedochází a bakterie uniká z fagozomu do cytosolu, kde následuje mohutná replikace (shrnuto v Celli & Zahrt, 2013). Celý tento proces je velmi rychlý a bakterie se v cytosolu vyskytují již 15-30 minut po vstupu do buňky. Jakými mechanismy bakterie z fagozomu uniká, se však doposud nepodařilo odhalit (Santic et al., 2008). Svou roli by v tomto procesu
Obr. 2: Schematický model buněčného cyklu bakterie F. tularensis
Intracelulární bakterie F. tularensis vstupuje do hostitelské buňky (myší nebo lidský makrofág) tzv. looping fagocytózou do tzv. franciselu obsahujícího fagozomu (FCP). Tento fagozom interaguje s časnými (EE) a pozdními endozomy (LE). Ke spojení fagozomu s lysozomy (Lys) však nedochází a bakterie uniká do cytosolu hostitelské buňky. Zde probíhá její mohutná multiplikace, kterou následuje smrt hostitelské buňky a následná infekce buněk okolních. Převzato a upraveno dle Celli & Zhart, 2013
20
mohly hrát produkty genů ostrova patogenity, které tvoří sekreční systém typu VI (Nano et al., 2004; Chong et al., 2008; Wehrly et al., 2009).
V cytozolu hostitelské buňky dochází k pomnožení bakterie do vysokých hodnot a teprve za 18 až 24 hodin po infekci k indukci apoptózy a pyroptózy (Lai et al., 2001). Rozrušením membrány hostitelské buňky dojde k uvolnění francisel a následné sekundární infekci okolních buněk. U některých bakterií byl v pozdních fázích infekce pozorován opětovný vstup do vakuoly složené z dvojité membrány procesem autofagie. Význam tohoto procesu zatím není zcela objasněn. Podle některých dřívějších studií, jsou kmeny F. tularensis s narušenou replikací z buňky odstraňovány právě autofagií, zatímco normálně množící se kmeny jsou schopné tento proces eliminovat a tím zajistit svoje přežití a proliferaci v buňce (Chong et al., 2012). Podle novějších analýz je pak F. tularensis schopná ovlivňovat a dokonce i využívat proces autofagie k zajištění replikace uvnitř hostitelské buňky (Steele et al., 2013; Case et al., 2013).
2.3 Tularemická vakcína
Tularemie patří mezi jednu z nejčastějších laboratorně získaných infekcí na světě (Shapiro & Schwartz, 2002). První případy nákazy tularemie v laboratoři popsal již Edward Francis v roce 1922, kdy došlo k onemocnění 6 laboratorních pracovníků včetně samotného Francise. Laboratorní manipulace s F. tularensis se proto řadí mezi práce s vyšším stupněm rizika. Pro práci s poddruhem holarctica jsou vyžadovány podmínky biologické ochrany úrovně 2, kdežto poddruh tularensis již vyžaduje biologickou ochranu třetího stupně (Tärnvik, 1989). První pokusy o ochranu laboratorního a vědeckého personálu americké armády při práci s tularemií vedly již ve 40. letech k vyvinutí Foshayho vakcíny, což byla Francisella usmrcená fenolem či její acetonový extrakt. Ačkoli aplikace této vakcíny vedla ke snížení výskytu ulceroglandulární a tyfoidální formy tularemie, u mnoha pracovníků se vyvinula závážná infekce tularemie jako následek expozice vysoce
21
virulentním kmenem tohoto patogena (Conlan & Oyston, 2007). Pokusy o vývoj živé atenuované vakcíny v zemích bývalého Sovětského Svazu začaly již v 30. letech 20. století, kde byly oslabené kmeny získávány opakovanými pasážemi plně virulentního kmene F. tularensis subsp. holarctica na médiích obsahující antiserum nebo vysušením kmenů v inkubátoru (Tigertt, 1962). Některé takto vzniklé kmeny (pojmenované Moscow, kmen 15 nebo kmen 155) prokazovaly sníženou virulenci v morčeti. V bývalém Sovětském Svazu bylo v oblastech s výskytem tularemie očkováno kmenem 15 přes 60 milionů lidí, i přes to, že tento kmen byl stále virulentní pro myš (Sjöstedt et al., 1996). V dalších letech došlo k dalšímu oslabení kmene 15 a snížení virulence pro myš a spolu s kmenem 155 byl v roce 1956 převezen do USA (Sandström, 1994). U obou vakcinačních kmenů došlo k izolaci dvou typů kolonií – šedých a modrých, přičemž modrý typ kolonie vykazoval vyšší virulenci a imunogenicitu u malých zvířat. Pětinásobnou pasáží modrých kolonií přes myš byl vytvořen živý vakcinační kmen (live vaccine strain, LVS), vakcína chránící jak myš, tak morče proti sekundární infekci virulentním kmenem F. tularensis SchuS4. Dobrovolníci vakcinovaní kmenem LVS byli chráněni před následnou infekcí kmenem SchuS4 (při podání 2000 CFU) nebo u nich došlo k rozvoji mírnějších symptomů onemocnění (při podání 20 000 CFU) v porovnání s nevakcinovanými dobrovolníky (Eigelsbach et al., 1967).
Vakcinační kmen LVS zůstává dodnes jedinou vyvinutou vakcínou, kterou lze ve výjimečných případech použít k vakcinaci ohrožených osob skarifikací.
Z důvodu problémů standardizace, dosud nejasného molekulárního mechanismu protektivity a atenuace tohoto kmene, a zbytkové virulence nemá tato vakcína v USA a většině dalších zemí licenci pro humánní použití. Nezbytnost vytvoření účinné a při tom bezpečné vakcíny je v dnešní době umocněna hrozbou zneužití F. tularensis jako biologické zbraně.
22
2.4 Systém pro tvorbu disulfidických vazeb
Disulfidická vazba (disulfidický můstek či -SS- vazba), kovalentní vazba mezi dvěma atomy síry, vzniká oxidací páru cysteinů a je nezbytnou součástí terciární struktury mnoha extracytoplazmatických proteinů. Tvorba disulfidické vazby je jedním ze zásadních kroků při sbalování proteinů v periplazmě Gram-negativních bakterií a zajišťuje stabilitu a aktivitu mnoha membránových a secernovaných proteinů. Tento proces přeměny thiolu na disulfidy katalyzují enzymy thiol/disulfidoxidoreduktázy (EC 1.8.4.7), které jsou charakterizovány přítomností terciární thioredoxinové struktury a katalytickým aktivním místem C-X1-X2-C.
V tomto vysoce konzervovaném motivu jsou dva cysteiny odděleny dvěma aminokyselinami a přímo se podílí na tvorbě disulfidické vazby. Enzymovou aktivitu enzymů tvořících disulfidickou vazbu lze rozdělit do dvou různých cest:
disulfidoxidoreduktázovou, ve které dochází k tvorbě disulfidické vazby oxidací cysteinů a disulfidizomerázovou, ve které dochází k přeskupení nesprávně utvořených disulfidických vazeb. Mezi těmito proteiny hraje zásadní roli protein DsbA. U bakterií s chybějícím genem dsbA dochází zjevně k narušení správného sbalování mnoha extracytosolických proteinů a to má za následek snížení virulence těchto kmenů (Kadokura et al., 2003).
2.4.1 Thiol/disulfid oxidační cesta bakterie Escherichia coli– proteiny DsbA, DsbB
Složení a funkce proteinů Dsb v Dsb systému je nejlépe prozkoumána u bakterie Escherichia coli (E.coli), v jejímž genomu byly identifikovány geny proteinů DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, DsbG a u uropatogenní E. coli také dvojice DsbL a DsbI. Jedná se o zatím nejpodrobněji prostudovaný bakteriální Dsb systém, a proto je běžně uváděn jako systém modelový (Kadokura & Beckwith, 2010)
23
Oxidační proces vedoucí ke vzniku disulfidické vazby u E. coli zajišťují proteiny DsbA a DsbB (EcDsbA a EcDsbB). Protein DsbA je monomerní solubilní periplazmatický protein o velikosti 21kDa, mající ve svém katalytickém aktivním místě sekvenci Cys30-Pro31-His32-Cys33 (Bardwell et al., 1991). Cysteiny v oxidovaném stavu tvoří disulfidickou vazbu, která je u EcDsbA velice nestabilní a je rychle přenášena na nesbalené proteiny nacházející se v periplazmatickém prostoru. V prvním kroku vzniku nové disulfidické vazby dochází k ataku cysteinu v pozici 30 u DsbA jedním z cysteinů substrátového proteinu. Vysoká reaktivita
Obr. 3: Oxidační cesta vzniku disulfidické vazby bakterie E.coli
Oxidace proteinů v bakteriální periplazmě závislá na DSB systému. DsbA spojuje po sobě jdoucí cysteiny peptidového řetězce disulfidickou vazbu a je zpět redukován proteinem DsbB vázaným na vnitřní membráně buňky.
24
a povrchová expozice Cys30 umožňuje vznik proteinového komplexu s intermolekulární disulfidickou vazbou. DsbA-substrátový komplex je však nestabilní a dochází k jeho rozpadu atakem druhého cysteinu substrátového proteinu. Touto reakcí vzniká oxidovaný substrát s vytvořenou disulfidickou vazbou za současné redukce proteinu DsbA (Zapun et al., 1993). Protein DsbA obsahuje kromě thioredoxinové struktury (aminokyseliny 1-59 a aminokyseliny 137-189) také druhou, vloženou helikální doménu (aminokyseliny 60-136) (Martin et al., 1993).
Kromě katalytického aktivního místa -C-X-X-C-, což je motiv společný pro všechny proteiny nadrodiny thioredoxinů (thioredoxin, glutaredoxin, protein disulfidoxidoreduktázy, disulfidizomerázy), obsahuje protein DsbA ještě další konzervovanou strukturu tzv. cis-prolinovou smyčku (Tab. 2). Ústřední aminokyselinou této smyčky je prolin (P151) v konfiguraci cis, který je v primární sekvenci aminokyselin sice velmi vzdálený od katalytického aktivního místa, avšak v rámci trojrozměrné struktury DsbA je naopak v těsné blízkosti cysteinu 30 (Martin et al., 1993). Analýza peptidů komplexu DsbA-substrát prokázala, že cis- konformace prolinu je jednak zásadní pro stabilizaci komplexu DsbA-substrát (Paxman et al., 2009), ale samotná cis-prolinová smyčka je pravděpodobně také místem vazby substrátů včetně DsbB (Martin, 1995). Význam cis-prolinu ve vazbě proteinů byl potvrzen jeho záměnou za threonin, která vedla ke zpomalení rozpadu intermolekulární disulfidické vazby mezi DsbA a substrátem a tím k akumulaci DsbA-substrátových komplexů. Záměnou cis-prolinu za serin pak dochází k zabránění elektronového přenosu mezi DsbA a DsbB a tím k akumulaci komplexů DsbA-DsbB (Kadokura et al., 2004).
25
V cis-prolinové smyčce je kromě prolinu dalším vysoce konzervovaným místem aminokyselina nacházející se před prolinem (cis-prolin minus 1). Tato aminokyselina u thioredoxinů a příbuzných proteinů ovlivňuje jejich redoxní vlastnosti a schopnost interagovat se svými substráty. U thioredoxinu je touto aminokyselinou izoleucin, prokaryotické disulfidizomerázy mají v této pozici threonin a u DsbA a glutaredoxinů se pak vyskytuje na této pozici valin (Tab. 2).
Experimenty prokázaly, že záměnou aminokyseliny na pozici cis-prolin minus 1 za aminokyselinu z jiné podskupiny dochází k příslušné změně redoxních vlastností (Ren et al., 2009). Modifikací redoxního potenciálu a změnou reaktivity cysteinů aktivního místa je aminokyselina předcházející prolinu v cis-prolinové smyčce schopná kontrolovat aktivitu DsbA proteinů a je proto zřejmě klíčová pro správnou funkci těchto proteinů. Dalším kritickým ukazatelem oxidačně- redukčních vlastností proteinů příbuzných thioredoxinu jsou aminokyseliny dipeptidu nacházejícího se mezi cysteiny aktivního místa (Tab. 2). Složení tohoto dipeptidu je charakteristické pro jednotlivé členy thioredoxinové superrodiny (Mössner et al., 1998).
Tab. 2: Aminokyseliny aktivního místa a cis-prolinové smyčky
Bakterie Aktivní místo Cis-prolinová smyčka
E.coli DsbA C-P-H-C Val-cis-Pro
E.coli DsbC C-G-T-C Thr-cis-Pro
E.coli DsbG C-P-Y-C Thr-cis-Pro
E.coli thioredoxin C-G-P-C Ile-cis-Pro
F.t.t. SchuS4 DsbA C-M-Y-C Thr-cis-Pro
F.t.h. FSC200 DsbA C-M-Y-C Ala-cis-Pro
Aminokyselinové složení dipeptidu katalytického aktivního místa a cis- prolinové smyčky vybraných členů thioredoxinové rodiny proteinů. Převzato a upraveno dle Missiakas & Raina, 1997
26
Aby byl v buňce zachován aktivní oxidovaný stav proteinu DsbA, musí být zredukovaný DsbA protein následně zpětně zoxidován. Redoxním partnerem proteinu DsbA je v tomto kroku protein DsbB. Bylo prokázáno, že delece genu pro protein DsbB vede totiž v buňce k akumulaci proteinu DsbA v redukované formě (Bardwell et al., 1993). Protein DsbB je 20 kDa velký transmembránový protein skládající se ze čtyř trans-membránových úseků a dvou periplazmatických smyček. Každá z těchto smyček nese jednu dvojici katalytických cysteinů (Cys41, Cys44 a Cys104, Cys130), které jsou nezbytné pro správnou funkci proteinu DsbB (Jander et al., 1994). V rámci tohoto procesu DsbA předá elektrony proteinu DsbB, který je dále přenese na konečný akceptor. V aerobních podmínkách proudí tento elektronový tok přes ubichinon ke komplexu cytochrom oxidázy a elektrony jsou v konečné fázi přeneseny na molekulární kyslík. V anaerobních podmínkách je alternativním akceptorem elektronů menachinon, který je přenáší na nitrát či fumarát (Bader et al., 1999).
2.4.2 Izomerizační cesta – proteiny DsbC, DsbD, DsbG
Disulfidizomeráza DsbC bakterie E. coli je homodimerní protein s uspořádáním do tvaru písmene V, který se skládá ze dvou 23,5 kDa podjednotek. Každý monomer se skládá ze dvou domén, jejichž N-konce se podílejí na dimerizaci. C- koncová doména obsahuje thioredoxinovou strukturu a motiv Cys98-Gly-Tyr- Cys101 s katalyticky aktivními cysteiny, které jsou zodpovědné za disulfidizomerázovou aktivitu. Tato aktivní místa jsou ve struktuře proteinu DsbC umístěna naproti sobě. Další cysteiny na pozicích Cys141 a Cys163 jsou částečně povrchově vystavené a tvoří strukturní disulfidickou vazbu (McCarthy et al., 2000). Hlavní funkcí proteinu DsbC v periplazmě bakterie E. coli je přeskupování nesprávně složených disulfidických vazeb v proteinech, které obsahují více cysteinů (Obr. 4). Disulfidické vazby se v proteinu tvoří postupně z jednoho konce polypeptidového řetězce na druhý. Pokud protein obsahuje disulfidickou vazbu mezi cysteiny, které v sekvenci po sobě nenásledují, při postupné tvorbě disulfidických vazeb proteinem DsbA může snadno dojít
27
ke vzniku nesprávně zformované disulfidické vazby (Berkmen et al., 2005). Cystein v pozici 98 ve svém redukovaném stavu atakuje nesprávně složenou disulfidickou vazbu za vzniku intermolekulární vazby a k rozdělení tohoto komplexu a přeskupení původní disulfidické vazby dojde působením Cys101 (Rietsch et al., 1997).
Obr. 4: Izomerizační cesta vzniku disulfidické vazby bakterie E.coli
Nesprávně složené disulfidické vazby proteinem DsbA jsou zaměněny proteinem DsbC/DsbG. Tyto disulfidizomerázy jsou v periplazmě bakterie udržovány v redukovaném stavu proteinem Dsb, který je ukotven do vnitřní membrány. Tento protein je redukován cytoplazmatickým thioredoxinem.
Převzato a upraveno dle de Marco, 2009 .
28
U proteinu DsbC byla také prokázána in vitro chaperonová aktivita, která však není závislá na aktivitě disulfidizomerázové. Protein DsbC byl totiž schopen zabránit denaturaci a zpětně reaktivovat D-glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu, která neobsahuje žádný cystein (Chen et al., 1999). Pro in vitro chaperonovou jsou nezbytné cysteiny 141 a 163 tvořící strukturní disulfidickou vazbu (Liu & Wang, 2001). Pro katalýzu disulfidizomerázové aktivity je však dostačující přítomnost pouze jedné katalytické domény a aktivního místa a inaktivace jednoho z cysteinů aktivního místa ani odstranění jedné katalytické domény proteinu DsbC nemělo na disulfidizomerázovou aktivitu žádný vliv. Přítomnost obou katalytických domén v proteinu DsbC je však potřebná proto, aby nedocházelo k oxidaci proteinu DsbC proteinem DsbB (Arredondo et al., 2009).
Homologem proteinu DsbC u bakterie E. coli je protein DsbG, ačkoli jejich sekvence jsou identické pouze z 24 %. Stejně jako DsbC, i protein DsbG tvoří homodimer ve tvaru V. Hmotnost jednotlivých monomerů je 25,7 kDa. Katalytické cysteiny Cys109 a Cys112 jsou uskupeny do motivu C-X-X-C (Bessette et al., 1999) a protein DsbG také vykazuje in vitro chaperonovou aktivitu (Shao et al., 2000). Ačkoli je protein DsbG za normálních podmínek exprimován na nižší úrovni než protein DsbC, analýza krystalové struktury proteinu DsbG ukázala strukturní rozdíly mezi těmito dvěma proteiny naznačující rozdílnou substrátovou specifitu těchto proteinů (Heras et al., 2004).
Stejně jako protein DsbB je redukčním partnerem pro protein DsbA, tak pro proteiny DsbC a DsbG je tímto partnerem protein DsbD. DsbD se skládá ze tří domén: N-koncové a C-koncové domény umístěné v periplazmatickém prostoru a transmembránové domény, složené z osmi transmembránových oblastí zakotvených do vnitřní membrány buňky. Každá z těchto tří domén obsahuje jeden pár vysoce konzervovaných cysteinů, které jsou zodpovědné za redukci disulfidizomeráz DsbC a DsbG (Stewart et al., 1999; Bessette et al., 1999). Redukce cysteinů proteinu DsbC proteinem DsbD zahrnuje redukci proteinu DsbC a
29
následný elektronový přenos mezi cytoplazmatickým thioredoxinem a thioredoxinreduktázou (Rietsch et al., 1997) (Obr. 4).
Dalším členem skupiny Dsb proteinů v bakterii E. coli je DsbE (také označovaný jako CcmG). Tento membránově vázaný protein je zapojen do maturace cytochromu c v prostředí periplazmy a delecí genu dsbE došlo ke kompletnímu vymizení všech cytochromů typu c (Fabianek et al., 1998).
Uropatogenní bakterie E. coli kóduje ve svém genomu kromě redoxního páru DsbA/B také druhý pár, proteiny DsbL a DsbI. Tyto proteiny sdílí s DsbA/B párem 19 resp. 24% sekvenční identitu. Protein DsbL je protein o velikosti 21,7 kDa s charakteristickým C-X-X-C motivem. Jeho redoxním partnerem je protein DsbI, který ve své sekvenci obsahuje dva cysteinové páry a predikované transmembránové smyčky, které jsou charakteristické pro protein DsbB. Třetím genem náležícím do stejného operonu jako dsbL a dsbI je gen assT, který kóduje periplazmatickou arylsulfátsulfotransferázu (AssT). Tento gen je jedním z genů specifických pro uropatogenní kmeny E. coli. Ačkoli je dsbL schopen částečně funkčně komplementovat deleci dsbA in vivo, jeho redoxní partner DsbI není schopen nahradit DsbB (Grimshaw et al., 2008). Bylo prokázáno, že periplazmatická arylsulfátsulfotransferáza, která ve své sekvenci obsahuje dva cysteiny tvořící disulfidickou vazbu nezbytnou pro její aktivitu, je in vivo substrátem pro DsbL (Grimshaw et al., 2008).
30
2.5 Substráty proteinu DsbA bakterie E. coli
Do dnešní doby bylo u bakterie E. coli identifikováno na dvě desítky substrátů proteinu DsbA. Tyto proteiny zajišťují pro bakterii celou řadu důležitých funkcí.
U mutantního kmene s delecí dsbA genu tyto proteiny postrádají disulfidickou vazbu a při tvorbě terciární struktury proteinu vytvoří pouze intermediáty, které jsou citlivé vůči působení proteáz. Jejich funkčnost a aktivita je proto výrazně narušena, což se odráží ve fenotypu delečního dsbA kmene. Kmen s vyřazenou tvorbou DsbA se vyznačuje oslabenou virulencí, ztrátou pohyblivosti, tvorbou mukoidních kolonií na minimálním médiu a citlivostí vůči působení kadmia, dithiothreitolu či benzylpenicilinu. Překvapivě však růst tohoto kmene na obohacených půdách zůstává zachován. Možným vysvětlením je přítomnost malých oxidačních molekul (např. jako cystein), které se v obohaceném médiu vyskytují (Bardwell et al., 1993). K nalezeným substrátovým proteinům patří, např.
secernované proteiny alkalická fosfatáza a β-laktamáza nebo vnější membránový protein OmpA (Bardwell et al., 1991). Další substráty se podařilo identifikovat pomocí vychytávání thiolových skupin (Leichert & Jakob, 2004), izolace komplexů DsbA-substrát prostřednictvím záměny prolinu v cis-prolinové smyčce (Kadokura et al., 2004) či komparací dvojrozměrných gelů (Hiniker & Bardwell, 2004).
31
2.6 DsbA proteiny Gram negativních fakultativně intracelulárních bakterií
Homology proteinů, které zprostředkovávají tvorbu nebo přeskupení disulfidické vazby u bakterie E. coli lze nalézt u většiny bakterií. Tyto proteiny se však u patogenních bakterií vyskytují v rozličných uskupeních a u většiny z nich hrají významnou roli ve tvorbě faktorů virulence, ať již v podobě secernovaných či povrchově lokalizovaných proteinů.
2.6.1 Salmonella enterica
Gram-negativní humánní patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium obsahuje na svém chromozomu dva lokusy kódující homologní proteiny k DsbA bakterie E. coli a jeden homologní protein k DsbL bakterie E. coli. Ačkoli tyto DsbA/L paralogy SeDsbA, SeDsbL a SeSrgA vzájemně sdílejí jen nízkou sekvenční homologii (18 až 34 %), všechny obsahují ve své struktuře katalytické aktivní místo C-X-X-C a cis-prolin (Jarrott et al., 2010).
Hybridizační analýza DNA prokázala výskyt genu dsbA u většiny, avšak ne u všech serovarů bakterie Salmonella enterica (Turcot et al., 2001). Gen SedsbA je schopen částečně obnovit funkci DsbA proteinu v E. coli, což prokazuje příslušnost ke stejné skupině proteinů, avšak pouze částečná obnova funkce naznačuje rozdílnou enzymovou specifitu DsbA homologů těchto dvou bakterií (Turcot et al., 2001).
Indukce exprese proteinu SeDsbA je v buňce řízena regulátorem exprese RtsA, který je zodpovědný také za indukci exprese proteinů sekrečního systému třetího typu (T3SS) kódovaného na ostrovu patogenity 1 (Salmonella patogenicity island, SPI-1). Efektorové proteiny SPI-1 jsou zodpovědné za invazi bakterií do buněk střevního epitelu a indukci jejich prozánětlivé odpovědi. Za intracelulární přežití bakterie v makrofázích a systémovou infekci v myši jsou zodpovědné proteiny kódované SPI-2. Význam genu dsbA u bakterie Salmonella serovar Typhimurium byl prokázán jeho delecí, která vedla k nesprávné funkčnosti SPI-1 i SPI-2 proteinů sekrečního systému a tím nejen k neschopnosti bakterie secernovat efektorové
32
proteiny prostřednictvím T3SS do cytosolu hostitelské buňky, ale i přežít uvnitř makrofágu. Delece genu dsbA způsobila také oslabení kmene u myší kmene BALB/c, kdy virulence dsbA mutanta byla snížena až 2000krát oproti divokému kmenu (Ellermeier & Slauch, 2004).
Druhý paralog, oxidoreduktáza SeSrgA, je na rozdíl od SeDsbA součástí virulenčního plazmidu. Podílí se na oxidaci komponent fimbrií kódovaných tímto plazmidem, zejména na oxidaci proteinu PefA. Stejně jako SeDsbA, tak i SeSrgA potřebuje pro svou reoxidaci protein SeDsbB. SeDsbA má na rozdíl od SeSrgA širší substrátovou specifitu, avšak není schopen oxidovat protein PefA (Bouwman et al., 2003).
Geny kódující protein SeDsbL a jeho redoxního partnera SeDsbI (paralog SeDsbB) se nacházejí ve stejném lokusu jako gen pro periplazmatickou arylsulfátsulfotransferázu, jehož produkt je závislý na funkčním disulfidickém systému DsbL/I. Protein SeDsbL tvoří s proteinem SeDsbB jen slabý redoxní pár, zatímco protein SeDsbA ve spojení s SeDsbI je vysoce aktivní (Lin et al., 2009).
2.6.2 Legionella pneumophila
Genom bakterie Legionella pneumophila obsahuje dva ortology genu dsbA. Ortolog genu bakterie E. coli nalezený v genomu L. pneumophila (dsbA1) nevykazuje v porovnání s divokým kmenem rozdíly ve fenotypu, růstu, pohyblivosti nebo v infekčním modelu Acanthamoeba castelanii. Druhým proteinem bakterie L. pneumophila s thioredoxinovou strukturou a katalytickým aktivním místem C-X- X-C spolu s cis-prolinem je 27-kilodaltonový protein vnější membrány označený jako DsbA2 (Hendrix et al., 1993). Fylogenetické analýzy prokázaly, že protein DsbA2 sdílí větší příbuznost s proteiny skupiny Com1_DsbA-like, které byly nalezeny také u bakterií Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Coxiella burnetii nebo Rickettsia sp., než s proteinem DsbA bakterie E. coli (Kpadeh et al.,
33
2013). Ačkoli bylo prokázáno, že periplazmatický protein DsbA2 se vyznačuje disulfidoxidoreduktázovou aktivitou a protein v buňce slouží jako oxidáza (Jameson-Lee et al., 2011), později byl prokázán jeho dimerní stav a disulfidizomerázová aktivita (Kpadeh et al., 2013) naznačující jeho možnou bifunkční roli v bakteriální buňce.
Mutant s delecí genu dsbA2 však není vitální, což svědčí o významu tohoto genu pro zajištění esenciálních funkcí u bakterie L. pneumophila. Záměnou prolinu v cis- prolinové smyčce (P198T) došlo k oslabení fenotypu, nejspíše z důvodu narušeného složení nebo funkce transportního systému Dot/Icm, který je součástí sekreční systému typu IV (T4SS). Tento sekreční systém je nezbytný jak pro hemolýzu, tak pro invazi a multiplikaci bakterie Legionella v hostitelské buňce.
DsbA2 prolinový mutant dále nebyl schopen adherovat a proniknout do epiteliálních buněk buněčné linie HeLa, množit se v amébách a ztratil pohyblivost v důsledku nesprávného složení flagelárního aparátu (Jameson-Lee et al., 2011). Záměna výše zmíněného prolinu za threonin vedla u mutantního kmene k tvorbě stabilních komplexů DsbA2 proteinů se substrátovými proteiny, což umožnilo jejich identifikaci pomocí hmotnostní spektrometrie. Všechny takto identifikované proteiny byly periplazmatické nebo asociované s membránou včetně celé řady známých faktorů virulence. Téměř všechny obsahují ve své aminokyselinové sekvenci cysteinové zbytky. K nejvýznamnějším nalezeným substrátovým proteinům bezesporu patří proteiny ze skupiny Dot/Icm translokačního systému T4SS či invazinů (Jameson-Lee et al., 2011).
2.6.3 Neisseria meningitidis
Další z bakterií, která ve svém genomu obsahuje více paralogů pro DsbA je intracelulární patogen Neisseria. V genomu Neisseria meningitidis se nacházejí tři paralogy (dsbA1, dsbA2 a dsbA3), u N. gonorhoeae dva paralogy (dsbA1 a dsbA3), kdežto u N. flava byl nalezen pouze jeden gen dsbA2 (Sinha et al., 2004). Produkty
34
paralogů dsbA1 a dsbA2 jsou predikované lipoproteiny asociované s vnitřní membránou, zatímco dsbA3 kóduje periplazmatický protein podobný proteinu DsbA bakterie E. coli (Tinsley et al., 2004). Proteiny DsbA1 a DsbA2 jsou nezbytné pro biogenezi pilů typu IV a jimi zprostředkovanou adhezi bakterie na povrch hostitelských buněk. Mutagenezí jednotlivých genů bylo zjištěno, že ačkoli absenci jednoho z DsbA proteinů je bakterie schopna při růstu kompenzovat zbývajícími dvěma enzymy, delecí všech tři genů dochází k zastavení růstu bakterie při 37°C.
Delece genů pro membránově vázané proteiny DsbA1 a DsbA2 má za následek vystupňovanou citlivost bakterie vůči působení redukčních činidel (Tinsley et al., 2004). Vložení genů dsbA1 a dsbA2 do genomu bakterie E. coli postrádající gen dsbA vedlo k obnovení pohyblivosti bakterie a aktivity alkalické fosfatázy. Naopak vložením genu dsbA3 nedošlo k obnovení ani pohyblivosti E. coli, ani aktivity alkalické fosfatázy. Protein DsbA3 má totiž jen mírný oxidační účinek a aktivitou se více podobá proteinu DsbE bakterie E. coli (Sinha et al., 2004). Později bylo prokázáno, že delecí genu dsbA1 a dsbA2 se snižuje množství monomerních i multimerních forem proteinu PilQ, sekretinu vnější membrány s jednou disulfidickou vazbou nezbytnou pro strukturní integritu proteinu. Nadprodukcí proteinu DsbA3 se tento nedostatek nepodařilo vykompenzovat (Sinha et al., 2008).
2.6.4 Shigella flexneri
Humánní patogen Shigella flexneri obsahuje ve svém genomu pouze jeden gen kódující protein ze skupiny disulfidoxidoreduktáz. Narušením genu dsbA S. flexneri došlo ke snížení infekčnosti mutantního kmene o 90% v porovnání s kmenem mateřským, pravděpodobně v důsledku nefunkční sekrece Ipa invazinů, proteinů zodpovědných za vstup bakterie do hostitelské buňky (Watarai et al., 1995).
Disrupce dsbA genu měla také za následek pokles virulence a intraepiteliálního růstu bakterie. Mutantní bakterie navíc nejsou schopny šířit se a infikovat další
35
buňky, protože dochází k jejich vychytání do vakuol ohraničených membránou a jejich následné lýze (Yu, 1998).
2.6.5 Yersinia pestis
Význam oxidoreduktázy DsbA při sekreci virulenčních faktorů byl také studován u humánního patogena Yersinia pestis, původce moru. Transpozonový dsbA mutantní kmen vykazoval sníženou sekreci YopM, YopN a V-antigenu, hlavních faktorů virulence secernovaných pomocí sekrečního systému T3SS. Dále bylo zjištěno snížené množství proteinu YscC, základní komponenty sekrečního aparátu. Multimerní komplex YscC obsahuje čtyři cysteiny tvořící dvě disulfidické vazby a tyto vazby jsou nezbytné pro stabilní konformaci proteinu YscC a jeho rezistenci k periplazmatickým proteázám (Jackson & Plano, 1999).
2.6.6 Francisella tularensis
Bakterie Francisella tularensis kóduje ve svém genomu jeden DsbA homolog (FTT1103 SchuS4 kmene typu A, FTS_1067 kmene FSC200 typu B). Příbuznost k oxidoreduktázám byla potvrzena také stanovením disulfidoxidoreduktázové aktivity rekombinantního proteinu kmene LVS (Straskova et al., 2009). Protein DsbA se skládá ze signálního peptidu (pozice 1-21), amino-koncové domény s homologií k FKBP proteinům (pozice 35-140, pfam 01346) a karboxy-koncové DSBA_Com1-like domény (pozice 145-290, pfam 01323). Signální peptid složený z aminokyselinových zbytků v pozicích 1-21 je podle databáze PROSITE (www.prosite.expasy.org ) součástí profilu označovaného jako místo pro navázání lipidové části membránových lipoproteinů prokaryot. Následující cystein v pozici 22 byl predikován jako potenciální vazebné místo pro lipidovou modifikaci. Tato modifikace může sloužit k uchycení proteinu k membráně bakteriální buňky.
36
Experimentálně byla v předchozích studiích u DsbA F. tularensis potvrzena přítomnost zbytku palmitátu (Straskova et al., 2009). Lipidová modifikace tohoto proteinu byla prokázána jako zodpovědná za stimulaci heterodimeru receptoru TLR2/TLR1. Tyto receptory se vyskytují na povrchu hostitelských buněk a TLR2 receptor zprostředkuje odpovědi buňky na podněty dané mikrobiálními složkami a produkty, především lipidové povahy (Thakran et al., 2008).
U proteinu DsbA F. tularensis byla navíc prokázána O-glykosylace (Balonova et al., 2010). Tato modifikace proteinu však není zásadní pro virulenci kmene F. tularensis v myším modelu infekce tularemie a konečná funkce zůstává zatím neobjasněna (Thomas et al., 2011).
DsbA protein se v posledních letech ukázal být jako významný faktor virulence bakterie Francisella a jeho delecí z genomu jak vysoce virulentního kmene SchuS4, tak méně virulentního kmene FSC200 došlo ke kompletnímu oslabení obou kmenů v buněčném i myším modelu infekce tularemie. Imunizace delečním kmenem navíc poukázala na schopnost částečně (SchuS4) nebo zcela (FSC200) ochránit BALB/c myš proti následné superinfekci mateřským kmenem (Qin et al., 2009; Straskova et al., 2009). Redoxním partnerem proteinu DsbA je DsbB (FTT0107c), jehož delece způsobila oslabení kmene in vivo, avšak nebyla schopna poskytnout ochranu proti následné infekci mateřským kmenem (Qin et al., 2008).
37
3 CÍLE PRÁCE
Pro odhalení funkce proteinu DsbA s následnou analýzou jeho substrátů byly v rámci této dizertační práce stanoveny následující cíle:
1. Zaměnit funkční rezidua kalatytického místa C-X-X-C, prolinu cis-prolinové smyčky a odstranit N-koncovou FKBP doménu proteinu DsbA mikroba F. tularensis subsp. holarctica kmene FSC 200. U takto vytvořených mutantů následně charakterizovat změny projevů virulence v buněčném i myším modelu infekce. U mutantů oslabených v myším modelu infekce zjistit možnou imunoprotektivitu.
2. Připravit rekombinantní proteiny DsbA nesoucí záměny kalatytického místa C-X-X-C, prolinu cis-prolinové smyčky a deleci N-koncové FKBP domény a charakterizovat u těchto rekombinantních proteinů disulfidoxido- reduktázovou aktivitu.
3. Ověřit možnou chaperonovou aktivitu proteinu DsbA a zjistit vliv záměn kalatytického místa C-X-X-C, prolinu cis-prolinové smyčky a delece N- koncové FKBP domény na tuto aktivitu.
4. Analýzou rekombinantních proteinů potvrdit či vyvrátit funkci FKBP domény jako dimerizačního modulu.
5. Zavést metodiku izolace frakcí obohacených o periplazmatické proteiny a identifikovat proteiny rozdílné u mateřského kmene v porovnání s delečním kmenem dsbA.
6. Metabolickým značením SILAC a následnou hmotnostně-spektrometrickou analýzou kultur mateřského a dsbA delečního kmene identifikovat proteiny, u kterých dochází ke změně ve výskytu a mohly by tak být potenciálními substráty proteinu DsbA.
38
4 MATERIÁL A METODY
39
4.1 Chemikálie
Chemikálie a soupravy
Chemikálie pro mutagenezi F. tularensis a E. coli byly získány v čistotě pro molekulární biologii. Běžné chemikálie pro přípravu pufrů a médií byly získány od firmy Sigma (Německo), Penta (ČR) nebo Fermentas (Litva) v nejvyšší dostupné čistotě. Oligonukleotidy byly syntetizovány na zakázku firmou Generi-Biotech, Česká Republika.
Enzymy
Restrikční enzymy NdeI, SacI, XhoI a NcoI (New England Biolabs), PFU polymeráza (Fermentas), T4 DNA ligáza (Invitrogen), benzonáza (Sigma)
Protilátky
Monoklonální anti-His konjugovaná se křenovou peroxidázou (Sigma), monoklonální protilátka anti-DsbA (CAT1.1, Moravian Biotech, Brno)
Oligonukleotidy
Lyofilizované oligonukleotidy byly rozpuštěny a naředěny na koncentraci 10 µM, konečná koncentrace oligonukleotidů v PCR reakcích se pohybovala v rozmezí 0,1- 1,0µM. Všechny použité oligonukleotidy jsou uvedeny v Tab. 3.
4.2 Bakteriální kmeny, buněčné linie a experimentální zvířata
Bakteriální kmeny Francisella tularensis a Escherichia coli
Mateřský kmen F. tularensis LVS 155; deleční kmen LVS155/dsbA, mateřský kmen FSC200; deleční kmen FSC200/dsbA, komplementované kmeny FSC200/dsbA + pKK289-dsbA; FSC200/dsbA + pKK289-dsbA C164A C167A; FSC200/dsbA + pKK289-dsbA∆FKBP_N a FSC200/dsbA + pKK289-dsbA P286T
40
Expresní kmeny E. coli BL-21 (DE3) pET28b+ dsbA, BL-21 (DE3) pET28b+ dsbA- AXXA; BL-21 (DE3) pET28b+ dsbA∆FKBP a BL-21 (DE3) pET28b+ dsbAP286T
Buněčné linie
myší monocyto-makrofágová linie J774.2; buňky izolované z myších kostně dřeňových makrofágů (BMM-bone marrow macrophages)
Experimentální zvířata
myší linie BALB/c (inbrední myši, bez specifických patogenů), Velaz, Česká Republika
41
4.3 Mutageneze genu dsbA bakterie F. tularensis FSC200
Pro mutagenezi genu dsbA bakterie Francisella tularensis byla zvolena metodika komplementace in-trans delečního kmene FSC 200∆dsbA. Gen dsbA (fts_1067) byl amplifikován metodou PCR s použitím PFU polymerázy (Fermentas) s vysokou přesností a párem oligonukleotidů FtdsbA-r a FtdsbA-f. Každý z oligonukleotidů zavedl do sekvence cílové místo pro restrikční endonukleázy NdeI a SacI (Tab. 3).
Získaný fragment byl topoklonováním vložen pomocí volných 3´-A přesahů do sekvenačního pCR4-TOPO vektoru, plazmid byl izolován komerčními kity (QiaPrep Spin Miniprep Kit, Qiagen) a následně osekvenován (Generi Biotech, Česká Republika). Záměna aminokyselin cysteinu v pozici 164 (C164) a cysteinu
Tab. 3: Oligonukleotidy použité při mutagenezi
Oligonukleotid Sekvence Klonování dsbA
FtdsbA_del_A 5´-gctcgagcactgatagcgctcctgtt-3´
FtdsbA_del_B 5´-acttaggtgtagttgtagctacatagaacc-3´
FtdsbA_del_C 5´-agctacaactacacctaagtctgatataaaaaat-3´
FtdsbA_del_D 5´-agagctcccaataccaaaaccaacgac-3´
FtdsbA_trans_R 5´-tgagctcttatttatcatcatcatctttataatcagcttca acactatcatcatc-3´
FtdsbA_trans_F 5´-taaatttcatatgactaagaaaaaactt-3´
EcdsbA_R 5´-cctcgagagcttcaacactatcat-3´
EcdsbA_F 5´-taccatgggcactaagaaaaaactt-3´
Záměny aminokyselin
dsbA_AXXA_R 5´-ctcaggagcaagcttagaagcgtacatagttgataat caagaattcataaacaactacatcagg-3´
dsbA_AXXA_F 5´-cctgatgtagttgtttatgaattctttgattatcaagctat gtaggcttctaagcttgctcctgag-3´
dsbA_P286T_R 5´-agctattactaggaatgacgcgccttggattccaa-3´
dsbA_P286T_F 5´-ttggaatccaaggcgcgtcattcctagtaatagct-3´
Podtržené nukleotidy vyznačují sekvenci restrikčního místa
42
v pozici 167 (C167) za alaniny a prolinu v pozici 286 (P286) za threonin byla provedena místně-specifickou mutagenezí (Quick Change Mutagenesis Kit, Stratagene) pomocí mutagenních oligonukleotidů (Tab. 3) dle návodu výrobce.
Pro přípravu delece N-koncové FKBP domény byl amplifikován úsek 1000 bp před a 1000 bp za oblastí delece se vzájemnými přesahy. První amplifikace byla provedena odděleně pro oba fragmenty, druhou PCR reakcí došlo ke spojení fragmentů již s oblastí delece (Obr. 5).
Konečný produkt byl použit jako templát pro PCR reakci s FtdsbA-r a FtdbsA-f oligonukleotidy, amplikon byl následně vložen pomocí topoklonování do pCR4-
Obr. 5: Schématické znázornění deleční mutageneze F. tularensis
V první fázi dochází ve dvou oddělených PCR reakcích k amplifikaci oblastí o velikosti 1000 párů bazí před (primery A a B) a za oblastí (primery C a D), která má být deletována. Primery B a C zavedou do sekvence komplementární přesahy odpovídající sekvenci druhého fragmentu. V druhé fázi jsou oba fragmenty použity jako templát ve společné PCR s použitím páru primerů A, D a tím dojde k jejich propojení.
43
TOPO vektoru a osekvenován. Správně amplifikované fragmenty byly vyštěpeny restriktázami NdeI a SacI, pomocí T4 DNA ligázy (Invitrogen) vloženy do plazmidu pKK289Km a tato směs byla použita pro transformaci chemokompetentních buněk E. coli XL-1 (Stratagene) za účelem propagace plazmidu. Plazmid obsahující správně vložený úsek byl izolován komerčním kitem a vložen elektroporací do elektrokompetentních buněk delečního kmene F. tularensis FSC200∆dsbA (Rodriguez 2008). Vyrostlé kolonie bakterie F. tularensis s plazmidem pKK289Km nesoucím různé varianty genu dsbA byly ověřeny pomocí PCR na koloniích za použití primerů FtdsbA-f a FtdsbA-r a pozitivní kolonie byly rozmnoženy kultivací na McLeod agarových plotnách s 20 µg/ml kanamycinu. Pro další použití byla kultura uchovávána v pufrovaném fosfátovém pufru s chloridem sodným (PBS) s 10 % glycerolem při -150°C.
44
4.4 Buněčný model infekce F. tularensis
Schopnost geneticky zmanipulovaných bakterií F. tularensis infikovat a proliferovat v buňkách hostitele byla sledována u myší monocyto-makrofágové linie J774.2 a primárních makrofágů izolovaných z kostní dřeně BALB/c myší.
Buňky makrofágové linie J774.2 byly kultivovány v médiu DMEM s Glutamaxem (2mM L-glutamin, Invitrogen) obohaceném o 10% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum (FBS, Gibco) při 37°C v 5% atmosféře CO2. Pro proliferační eseje byly buňky nasazeny do 24 jamkového panelu v množství 5 x 105 buněk na jamku a následně infikovány bakteriálními kmeny F. tularensis FSC200 a výše připravenými mutanty v poměru 500 bakterií na jednu buňku makrofága (multiplicita infekce 500). Pro časovou synchronizaci infekce byly bakterie k buňkám přitočeny (400 x g na 3 minuty, časový interval t=0) a inkubovány po dobu 30 minut při 37°C, v 5 % CO2 atmosféře. Pro odstranění extracelulárních bakterií byly infikované buňky třikrát promyty teplým PBS a po dobu 30 minut kultivovány v kompletním kultivačním médiu s obsahem 50 µg/ml gentamicinu.
Buňky byly opět třikrát promyty teplým PBS a nadále kultivovány v kompletním kultivačním médiu bez antibiotika. Ve stanovených intervalech infekce byly buňky zlyzovány 0,1 % deoxycholátem sodným, příslušně naředěny, vysety na McLeod agarové plotny a inkubovány po dobu 72 hodin při 37°C pro odečet kolonií tvořících jednotek (CFU, colony forming units).
Myší kostně-dřeňové buňky byly izolovány z kostních dření BALB/c myší podle standardního postupu (Celli, 2008) a kultivovány v kompletním DMEM médiu s Glutamaxem obohaceném o 20% médium z buněk L929 (zdroj růstového faktoru stimulujícího diferenciaci makrofágů), 10 % FBS (Gibco) a směsi antibiotik (50 U/ml penicilin a 50 µg/ml streptomycin, Sigma-Aldrich) při 37°C a 5 % CO2
atmosféře. Antibiotika byla k buňkám přidávána pouze po první tři dny kultivace.
Kostně dřeňové makrofágy byly sedmý den po izolaci infikovány F. tularensis FSC200 a odvozenými kmeny v poměru 50 bakterií na jednu buňku (MOI 50). Další postup byl stejným jako u linie J774.2.
45
4.5 Zvířecí model infekce
Pro zvířecí model tularemické infekce byly použity samice myší inbredního kmene BALB/c, které byly prosté specifických patogenů (specific patogen free). Skupiny po pěti myších byly infikovány podkožně (subkutánně, s.c.) testovanými bakteriálními kmeny v množstvích 3 x 101 až 3 x 106 CFU na myš. Přesné množství bakterií bylo stanoveno výsevem příslušně naředěné bakteriální suspenze na McLeod plotny a kultivací při 37°C po dobu 4 dní. Kontrolní skupině myší byl podán pouze sterilní fyziologický roztok. Známky případné infekce a úmrtnost byly u myší sledovány každý den po dobu 21 dní. Přeživší myši byly 21. den po infekci opětovně infikovány mateřským plně virulentním kmenem FSC200 podkožně v dávce 3 x 102 a sledovány po dobu dalších 21 dní.
