ŽIVOTNÍ CYKLUS X BUNĚČNÝ CYKLUS Alternativní programy

http://www.natur.cuni.cz/~zdenap/members/zdenateaching.htm

ŽIVOTNÍ CYKLUS X BUNĚČNÝ CYKLUS Alternativní programy

EB: Meiosa, sporulace, párování diferenciace

apoptosa

EB: Mitosa

PB: Buněčné dělení PB: Sporulace

diferenciace

“apoptosa-like”

VNĚJŠÍ PROSTŘEDÍ

⇒ Externí signály zdroje živin další buňky teplota atd.

⇒ Konstantní

Cyklická reprodukce buňky Zachování kontinuity jaderné (DNA) i mimojaderné informace Interní signály

Změna v dalším vývoji buňky:

- alternativní programy

- dráhy signální transdukce ROZHODOVÁNÍ:

EB: G1 fáze “START”

mitosa X alt. program PB ? Před iniciací replikace

B.dělení X alt. program

METODY STUDIA BUŇEČNÝCH A ŽIVOTNÍCH CYKLU

“KLASICKÉ METODY”

1. SYNCHRONISOVANÉ KULTURY selekční a indukční metody

a) SELEKČNÍ

- velikost buněk (filtrace) - hustota (gradienty)

- stáří

b) INDUKČNÍ

- složení média (limitace fosfátů, vitaminů etc.) - teplota

- tma/světlo (řasy) - chemické látky

filtr

2. MATEMATICKÉ METODY Generační doba τ

Relativní stáří buňky: a = t / τ , t je doba od posledního dělení

3. MIKROSKOPICKÉ TECHNIKY / BARVENI

4. GENETICKÉ METODY: Mutanty buněčného cyklu + molekulárně biologické (genové manipulace)

+ cytologické

Replikace Cytoskelet B.stěna Organely atd….

X

X

Morfologie - TERMINÁLNÍ FENOTYP

Problém = LETHALITA ⇒ termosensitivní (ts) a chladosensitivní (cs) mutanty (termolabilní protein; reversibilní x ireversibilní)

Analysy ts (cs) mutant:

- terminální fenotyp

- komplementace mutace - knihovna divokého kmene (centromerové vektory)

⇒ isolace genu Analysy genů:

- sekvenční/restrikční/počitačová

- funkce genu v buňkách: amplifikace, modifikace genu (lokalisace), suprese jiných mutací, lokalisace v buňkách za různých podmínek (imunofluorescence etc.)

MUTACE: Zrušení funkce X Změna funkce (např. jiný komplex)

“MODERNÍ METODY”

1. NOVÉ TECHNIKY BARVENÍ / MIKROSKOPIE

- GFP (Green fluorescent protein) - varianty barevné, optimalisace pro organismy

možnost sledování chování proteinů in vivo (kvasinky - genomové GFP fuse)

2. TECHNIKY “GENOMIKY” A “PROTEOMIKY” - sekvenování genomů a) Technika mikroarrays

b) Technika 2d elektroforesy / MALDI analysa etc - proteomika

c) DATABASE

SGD

Stanford Genomic Resources

Published Datasets Stanford

PROTEOME, YPD,

d) PROJEKTY PŔÍPRAVY KMENU

- EUROSCARF, deleční mutanty, kmeny

http://www.rz.uni-frankfurt.de/FB/fb16/mikro/euroscarf/

- TRIPLES database

- GFP-tag kmeny

- lacZ - tag kmeny

BUNĚČNÝ CYKLUS PROKARYOT : E. COLI

Replikace DNA Růstové pochody

(složky biomasy, povrchové struktury)

Gen doba < 60min ⇒ PŘEKRYVNÉ CYKLY Specifika (x EB): E.coli

Generační doba = závisí na kultivačních podmínkách

(E.coli: minimální gen. doba = 20 min = 1/2 doby replikace)

Replikace DNA Interval mezi terminací replikace a dělením buňky Fáze C = 40 min

(analogie S-fáze)

Fáze D = 20 min

(analogie G2+M fází) Interval před

zahájením

replikace DNA (pouze je-li

gen doba > 60min)

Fáze B

Gen doba < 60min ⇒ PŘEKRYVNÉ CYKLY

C D

Inic. Termin. Dělení

τ = 60 min

τ = 50 min

τ = 40 min

τ = 30 min

BUNĚČNÝ CYKLUS E.COLI Exponenciální balancovaný růst:

Dělení:

• stejná velikost buněk (pouze při balancovaném růstu x variabilní gen.doba)

• iniciace replikace ve stejném věku buňky

• tvorba septa v centru

• tvorba septa závislá na terminaci replikace

• pravidelná distribuce nukleoidů do dceř. buněk Interní signály

• Chemické (regulační proteiny; ionty - např. Ca

- myosin-like molekuly;

cAMP, cGMP etc…)

• Mechanické - stérické zábrany (např. při septaci)

• Redundantní regulace I. REPLIKACE

1963 (Jacob, Brenner, Cuzin) - role membrány - iniciační místa na membráně

- separace nukleoidů

INICIACE REPLIKACE 1 x za buněčný cyklus

DnaA - ATP DnaA - ADP Poměrně

stabilní

ATP ADP

DnaA

FOSFOLIPIDY = hlavně fosfolipidy s nenasycenými mastnými kyselinami

ROLE MEMBRÁNY:

DnaA - ATP = aktivní DnaA = neaktivní DnaA - ADP = neaktivní

MONOMERY - vazba na oriC 1.

2. _DnaA + fosfolipidy = neaktivní komplex (agregát)

- nadprodukce DnaA - isolována směs: aktivní monomery

neaktivní agregát DnaA+fosfolip.

⇓

Aktivace fosfolipasami (DnaK) Membrána udržuje část DnaA v neaktivnim stavu (neváže oriC)

DnaA protein “iniciátor replikace” (koncentrace v b.cyklu stabilní, konzerv.) oriC sekvence - 4 vazebná místa pro DnaA protein, vazba cca 20-40ti

monomerů DnaA ⇒ “otevření” oriC pro replikační aparát

I.

II. INTERAKCE oriC S MEMBRÁNOU oriC sekvence: 11 kopii GATC

Methylace Dam methyltransferasou (dam) Po iniciaci replikace - methylován jen rodičovský řetězec

HEMIMETHYLOVANÁ DNA

- blok reiniciace replikace - ? “posun” vazby na vnější membránu (? Represorový protein)

τ = 25-30 min ⇒ hemimethyl. DNA cca 8-10 min MODEL

1) Iniciace replikace na vnitřní membráně.

- role fosfolipidů - vhodné množství monomeru DnaA-ATP INICIACE - inaktivace nenavázaného DnaA-ATP - agregace

BLOK REINICIACE

2) Hemimethyl. oriC DNA - posun z vnitřní membrány na inhibitor na vnější membráně, dokud není DnaA-ATP inaktivován

X dam

kmeny

SEGREGACE NUKLEOIDU

- terminace replikace (FtsA exprese - ? signál pro buněčné dělení) - separace nukleoidů - posun 1/4 a 3/4

- septace

1963 Jacob - model - růst membrány

X - Inhibice syntézy proteinů - nukleoidy zůstanou centrálně

obnovení syntézy proteinů - posun nukleoidů bez viditelného růstu membrány

inhibitory tvorby septa neovlivní umístění

Růst membrány ⇒ nemá vliv na “odtažení” nukleoidů

MODEL SEPTACE

Filamenta - ? Vazba na stěnu (membránu)

“ENZOSKELETON”

- membrána - DNA - “cytoskelet”

- ? Regulace Ca

, protein- fosforylace)

- role i při adaptaci na různé prostředí

FtsZ protein = prokaryotický homolog tubulinu MukB protein = ? Motorový protein

- mutanty mukB - nukleoid zůstává v centru - in vitro vazba s mikrotubuly

- interakce s FtsZ proteinem

- vazba k DNA C-koncovou doménou - homologie s kinesinem a myosinem - Komplex s MukE a MukF

Replication machinery

kondensované domény chromatinu dekondensované domény chromatinu

SeqAvazba na hemimethylovanou DNA

vedle replikační mašinerie a replikační vidličky, SeqAudržuje replikující se nukleoid v

rozbaleném stavu

-po remethylaci SeqA disociuje a MukB obnoví kondensovaný stav

Oddělování nukleoidů probíhá paralelně s replikací - replikované domény se rovnou posunují na správné místo

Replikace a oddělení nukleoidů v PB jsou paralelní procesy (X EB)

MukB - ovlivňuje superhelicitu nukleoidu - ? Síla nutná pro kondenzaci a oddělení dceřiných nukleoidů

MukB - udržuje nukleoidy stacionárních buněk v kondensovaném stavu

- změny hydrodynamických vlastností nukleoidů – rozbalení bakteriálního chromosomu mukB

BAKTERIÁLNÍ CYTOSKELET

Bakteriální actin-like cytoskeletální proteiny - homologní k aktinu

Možné role: 1 - regulace tvaru tyčovitých bakterií prostřednictvím organizace biosyntetických enzymů mureinu do helikální struktury podél dlouhé osy buňky - „vzorec“ syntézy mureinu, který je zodpovědný za tyčovitý tvar buňky

Murein (peptidoglykan) = primární determinanta tvaru bakteriální buňky, tvoří exoskeleton vně plasmatické membrány

MreB a MreB homology

- MreB protein Thermotoga maritima self-assembly in vitro - dlouhá filamenta

- MreB využívá in vitro buď ATP nebo GTP pro tvorbu filament, filamenta pevnější než aktinová (podobnější intermediálním filamentům - poskytuje buňkám „pevnost“)

- role v řadě buněčných funkcí (e.g. Regulace buněčného tvaru, segregace chromosomu, buněčná polarita..)

- Proteiny uspořádány do helikálních filamentárních struktur - na vnitřní straně membrány

MreB

E.coli Caulobacter crescentus

X není jasné, zda MreB hraje nějakou roli v cytokinesi

Filamenta B. subtilis – dynamické struktury, změny v průběhu b.cyklu

2. participace na určení buněčné polarity - ? Lokalisace specifických proteinů do jednoho nebo obou pólů buňky

Např. C.crescentus - diferenciační cyklus - řada proteinů specificky cílena do jednoho nebo obou pólů (např. membránové histidine kinasy). MreB je pro lokalisaci nezbytný. Není-li přítomen, proteiny difusně rozloženy uvnitř buňky.

Dále - polární lokalisace proteinů participujících na chemotaxi, pohybu, virulenci ….

? Mechanismus ?

3. Segregace chromosomů

- poškozená není-li MreB – nukleoidy nesprávně distribuované v cytoplasmě, buňky bez nukleoidů nebo nukleoidy poškozeny septem

-Mechanismus pohybu nukleoidu není znám, ? Interakce (přímá nebo nepřímá) oriC oblasti s MreB cytoskeletem – pohyb podél helikální MreB struktury ?

MamK aktinový homolog

- subcelulární organizace membrán magnetosomů

= další role pro aktin-like cytoskelet = umístění organel v bakteriální buňce Magnetosomy - na membránu vázané organely Magnetospirillum magneticum obsahující krystaly železa. Membrány magnetosomů = invaginace cytoplasmatické membrány - podél dlouhé osy buňky.

- ohraničeny filamentárními MamK strukturami (MamK-GFP), Vazba MamJ

- ΔmamK - nejsou filamenta ani uspořádané řetízky magnetosomů.

Magnetosomy - role při orientaci bakterií podle magnetického pole, magnetotaktické bakterie - ? Role při nalezení optimálního prostředí pro existenci – rozhraní mezi kyslíkovým a anoxickým prostředím v půdě (mikroaerofilní bakerie)

FtsA - komponenta mašinérie buněčného dělení

- interakce s C-koncem FtsZ - Lokalizuje do FtsZ ringu - esenciální protein

FtsA - in vitro tvoří polymerní strukturu - Váže ATP

Funkce?

FtsA aktinový homolog

ParM a AlfA proteiny

- Role při segregaci plasmidů (low copy number)

- Kódované plasmidy – E.coli ParRMC (parR a parM geny), parS lokus s repeticemi kam se váže ParR

AlfA – B.subtilis, segregace

plasmidů, tvoří vlákno mezi póly b.

Par - E.coli

Bakteriální tubulin-like cytoskeletální proteiny - homologní k tubulinu

2 typy = FtsZ a BtubA/BtubB proteiny (Prosthecobacter dejongeii), GTPasy FtsZ protein - vytváří transientní dynamickou helikální strukturu podél dlouhé

osy buňky a tzv. Z-ring uprostřed buňky

Bacillus subtilis

Lokalisace (FtsZ-GFP) Dynamická lokalizace v průběhu cyklu

⇒ Assembly ve středu buňky, zůstává alespon polovinu BC než nastává invaginace

⇒ Během septace: Z-ring shluknutí na konci invaginace

⇒ half-life méně než minuta, prodloužení u FTsZ mutants s redukovanou GTPasovou aktivitou

⇒ Assembly FtsZ - vytvoří se aktivní místo pro GTP hydrolysu mezi asociovanými monomery, k hydrolyse docházi asi hned po assembly

- FtsZ konservativní, pravděpodobně u všech prokaryot - GTP-vazebný protein, GTPasová aktivita

- in vitro - polymerace do uspořádané struktury - dynamické vlastnosti, růst z nukleačního místa

Interaguje s mnoha proteiny

Bakteriální homology intermediálních filament

Crescentin - homolog intermediálních filament EB - cca 25 % identita a 40 % similarita s IF EB.

- zodpovědný za „prohnutý“ tvar Caulobacter crescentus - creS mutanty = změna tvaru na „tyčovitý“

Filamenta crescentinu

CfpA a Scc proteiny

- u Spirochet – cytoplasmatická filamenta- průměr 5-7 nm (EB IF = 8-10) -4-6 filament pod membránou, podél dlouhé osy buňky (helikální), vazba na membránu prostřednictvím proteinů

AglZ protein u Myxococcus xanthus

- hraje roli v sociální motilitě, interaguje s malými GTPasami - tvoří filamenta in vitro

Další bakteriální cytoskeletární proteiny, které nemají homology v EB

MinD/ParA třída bakteriálních cytoskeletárních proteinů MinD skupina: umístění bakteriálních míst dělení

ParA skupina: oddělování DNA

MinD skupina: tvoří dynamickou helikální strukturu pod cytoplasmatickou membránou

In vitro tvorba svazků MinD filament bundles v přítomnosti MinE, ATP, a phospholipidových vesiklů.

ParA skupina: „plasmid partitioning proteins“ kódované plasmidy

- zodpovědné za distribuci nízkokopiových plasmidů do dceřiných buněk

In vitro tvorba svazků ParF filament v přítomnosti ParG a ATP.

In vivo - ParA proteiny tvoří helikální filamenta – osciují podél nukleoidů (podobné „min“)

BUNĚČNÉ DĚLENÍ - TVORBA SEPTA

PSA - vnitřní membrána těsně spojena s peptidoglykanem a vnější membránou - definuje oblast membrány, kde vznikne septum

Fluorescenčně značené proteiny - do periplasmatického prostoru

- oblasti PSA resp. PA - není volná komunikace se zbytkem periplasmatic.

prostoru

Periseptal annuli (PSA) Polar annuli (PA)

Vnitřní membrána Vnější membrána

Peptidoglykan Elektronová

mikroskopie 1983

⇒ Komponenty pro tvorbu septa nedifundují, jsou lokalisovány

CYKLUS SEPTACE:

I. Tvorba nových PSA

II. Změna lokalisace nových PSA

+ maturace PSA

Zastavení v 1/4 resp. 3/4 délky

III. Morfogenese septa

Septum - invaginace všech tří vrstev

IV. Modifikace PA

PA odvozen od původního PSA = obsahuje elementy pro buněčné dělení

ts MUTANTY =

fts

Předp. fenotyp = filamenta bez PSA

(původní PSA dorozdělená)

Nebyly identifikovány: ? tvorba PSA nezbytná pro růst b. (např. signál pro inkorporaci nového materiálu) = letálni Předp. fenotyp = filamenta s nekomplet.

PSA, náhodně rozmístěná

ftsZ₈₄ = nematurovaná PSA náhodně podél filamenta

Předp. fenotyp = filamenta s PSA - různá stádia tvorby septa

ftsA = kompletní PSA ve správných posicích, po přenesení do permi- sivní teploty - dokončení sept - začátek invaginace

ftsQ - ddto envA, cha

Změny permeability k antibiotikům

MINICELL MODEL:

Mutanty “min”

- fenotyp = heterogenní délka buněk v populaci - 1 dělení / buněčný cyklus X 3 možná místa dělení

Analysa min mutant + kmenů nadprodukujících min geny: FENOTYP

- nadbytek minC + minD ⇒ inhibice dělení ⇒ filamenta - nadbytek minE ⇒ dělení ve všech místech ⇒ minicell - delece minC, D, E ⇒ dělení ve všech místech ⇒ minicell

- delece minE ⇒ inhibice dělení ⇒ filamenta

2. ΔminE nebo nadbytek minCD

CD

1. Wild type

CD

E E

3. ΔminCD nebo nadbytek minE

E E

CD

MinC+MinD = inhibitory buněčného dělení ve všech místech MinE = určuje specificitu minCD inhibitoru

FINÁLNÍ FENOTYP určen poměrem množství min produktů

Delece “min” lokusu = MINICELL FENOTYP 3 geny: minC

minD minE

Proč assembly iniciuje na pólu ? MinC je antagonista Z-ring assembly

tato funkce stimulovana MinD

⇒ ?MinD přivede MinC k membráně

(MinC v nepřítomnosti MinD v cytoplasmě) Regulace assembly FtsZ uprostřed buňky:

MinD-ATP

MinD-ADP MinE

MinE stimuluje ATP hydrolysu jen když je MinD-ATP vázán na membránu

⇒ ATP a MinE regulují vazbu MinD na membránu

Min proteiny ⇒ vytváří dynamické struktury

⇒ oscilace mezi 2 polovinami buňky

MinC a MinD mají stejný pattern i periodicitu oscilace ⇒ asi

oscilují v komplexu

(potvrzená interakce MinC a MinD)

MinD-ATP ⇒ vazba na fosfolipidy

Cyklus oscilace cca 50s

FtsZ gen

- overexprese - minicell fenotyp X nejsou prodloužené buňky

- zvýšení frekvence buněčného dělení za buněčný cyklus = dělení v centru zůstává + dělení i na pólech

- nadřazeno inhibici min lokusem (nadprodukce minCD částečně suprimuje) - lokalisace PSA

INHIBITORY BUNĚČNÉHO DĚLENÍ MinC, MinD

SfiA, SfiC: normálně reprimovány

dereprese po SOS indukci

- reversibilní blok septace (čas pro opravy a rekombinace)

Regulace dělení v závislosti na živinách – Bacillus subtilis

UgtP-GFP

Lokalizace UgtP v závislosti na živinách

UgtP

phosphoglucomutasa glucose 1-phosphate

glucose 6-phosphate hodněživin UDP-glucose

lipoteichoic acid komponenta b.stěny

Blok FtsZ assembly

glucosyltransferasa

překryvné cykly

wt

porucha UgtP dráhy hodně glukosy -

vysoká úroveň aktivity glucolipid biosynthesis

pathway

? Udržuje konstantní poměr FtsZ rings vzhledem k buněčné délce a zajišťuje, že buňka dostatečně naroste a dokončí segregaci chromosomů před cytokinesí