Jiří Novák a Vladimír Havlíček
Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, Praha 4 vlhavlic@biomed.cas.cz
Došlo 12.1.20, přijato 13.2.20.
Klíčová slova: fragmentace, mechanismus, pravidlo, isoto- pová obálka, interpretační postup, nomenklatura iontů, jemná isotopová struktura
Obsah 1. Úvod
2. Lineární peptid 3. Cyklický peptid
4. Lineární peptid s postranním řetězcem 5. Cyklický peptid s postranním řetězcem 6. Bioinformatická podpora
1. Úvod
V návaznosti na příspěvek1 v předchozím čísle Che- mických listů, uvádíme modelové postupy pro čtyři struk- turně rozdílné peptidy. De novo přístup je korelován s bioinformatickým řešením poskytnutým volně dostup- ným nástrojem CycloBranch, který umožňuje de novo sekvenování lineárních a cyklických neribozomálních pep-
tidů2. Spektrum neznámého lineárního peptidu, jehož sek- vence je řešena v kap. 2, bylo naměřeno s nízkým rozliše- ním. Ostatní příklady pak zahrnují hmotnostní spektra s vysokým rozlišením. Profil kolizního spektra peptidu se odvíjí od procesů zachycených modelem mobilního proto- nu a bazicity příslušných nábojových center3,4. Relativní intenzitu konkrétních fragmentových iontů ovlivňuje na- příklad N-methylace amidového dusíku peptidové vazby.
Zatímco vznik N-koncového bi iontu není u této modifika- ce zásadně ovlivněn (nukleofilní atak kyslíkového atomu karbonylové skupiny předchozí aminokyseliny přes šesti- členný kruh), pravděpodobnost vzniku komplementárního yi iontu je snížena absencí vodíkového atomu, který by se u demethylovaného analogu jinak přenášet mohl5.
2. Lineární peptid Zadání:
Identifikujte lineární peptid, jehož hmotnostní spek- trum je na obr. 1.
Řešení:
– Podle hodnoty m/z protonované molekuly (523) lze soudit, že peptid obsahuje čtyři nebo maximálně pět aminokyselin.
– Imoniové ionty v oblasti nízkých hodnot m/z ukazují na přítomnost Pro (70), Phe (120) a Tyr (136). Fakt, že jiné imoniové ionty nevidíme, může, ale také ne- musí, indikovat vícenásobné zastoupení aminokyseli- ny jednoho druhu.
ŘEŠENÉ PŘÍKLADY INTERPRETACE PRODUKTOVÝCH SPEKTER PEPTIDŮ
Obr. 1. Spektrum lineárního peptidu
– Odečtením hmotností prokazatelně přítomných ami- nokyselin získáváme chybějící stavební jednotku(ky) peptidu: 523 – (97+147+163+19) = 97. Zbývající aminokyselinou je tedy prolin (viz Základy interpreta- ce hmotnostních spekter)1.
– Z dosud identifikovaných aminokyselin víme, jakých teoretických hodnot m/z může nabývat dipeptid b2: 195, 245, 261 nebo 311. Správnou hodnotou je m/z 261 (Pro, Tyr), neboť tato je současně podpořena i existencí a2 iontu (m/z 233). Pokud je naše myšlen- ková konstrukce správná, komplementárním iontem k b2 je ion yn–2 (n je celkový počet aminokyselin v peptidu), který obsahuje dvojici Pro, Phe. Tento ion je opravdu ve spektru přítomen na m/z 263 (Pro+Phe+19).
– Dosud jsme zjistili, že sekvence má tvar (Pro, Tyr)- -(Pro, Phe). Nyní je na řadě určení pořadí jednotlivých aminokyselin, které se získá testováním jednotlivých teoretických variant. Víme, že ion y2 má hodnotu m/z 263. Další člen řady, ion y3, bude buď větší o Tyr (m/z 426) nebo o Pro (360). Pouze druhý z iontů je příto- men, a protože tento je současně o 163 Da menší než protonovaná molekula, musí být N-koncovou amino- kyselinou tyrosin. Naše současná sekvence má tedy tvar H-Tyr-Pro-(Pro, Phe).
– Stejným způsobem určíme C-koncovou sekvenci, a to za použití b-iontové série. Víme, že ion b2 má hodnotu m/z 261. Pokud by byl třetí aminokyselinou od N-konce prolin, b3 ion by měl hodnotu m/z 358.
Pokud by na třetí pozici byl fenylalanin, příslušná hodnota by byla m/z 408. Druhá varianta je správná (vidíme i ion a3 na m/z 380) a potvrzuje ji i existence iontu y1 na m/z 116.
– Kompletní sekvence je tedy H-Tyr-Pro-Phe-Pro-OH.
3. Cyklický peptid Zadání:
Určete strukturu cyklického neribozomálního peptidu, jehož hmotnostní spektrum je na obr. 2. Hodnota m/z pre- kurzoru 608,40178 odpovídá jednou protonované moleku- le [M+H]+.
Nápověda:
U neribozomálních peptidů se často definuje nový stavební blok jako kombinace základní aminokyseliny a určité modifikace. Mezi běžné modifikace patří např.
methylace (Me), kdy dochází k náhradě amidového vodíku za skupinu –CH3 a hmotnost aminokyseliny se tak zvýší o 14 Da. Tato modifikace existuje např. u alaninu (MeAla), prolinu (MePro) nebo valinu (MeVal). Obvyklou modifikací je rovněž deamidace (1 Da), při které se skupi- na –NH2 nahradí skupinou –OH. Například z leucinu o nominální hmotnosti 113 tak získáváme stavební blok o hmotnosti 114 Da (leucic acid, kyselina 2-hydroxy-4- -methylbutanová; La). Hmotnostní rozdíly, které odpoví- dají jiným než základním aminokyselinám, lze dohledat např. v databázi neribozomálních peptidů Norine6. Řešení:
– Při interpretaci spektra cyklického peptidu si musíme uvědomit, že se jedná o superpozici spekter tolika lineárních peptidů, kolik má daný cyklický peptid aminokyselin. Při fragmentaci se totiž nejprve otevře kruh mezi dvěma po sobě následujícími aminokyseli- nami a následný „linearizovaný“ peptid se dále frag- mentuje. V ideálním případě se tak stane pro všechny dvojice po sobě následujících aminokyselin. Výhodou je fakt, že spektrum poskytuje více informací vzhle- dem k tomu, že sekvence jednotlivých linearizova- ných peptidů se překrývají. Nevýhodou je, že interpre- tace spektra je komplikovanější než u lineárního pep- tidu.
Obr. 2. Spektrum cyklického neribozomálního peptidu
– Protože cyklický peptid z principu nemůže mít –OH skupinu navázanou na C-konci, ve spektru nepozoru- jeme píky odpovídající y-iontům (+19 Da). Hodnoty m/z, které ve spektru pozorujeme, běžně odpovídají b-iontům nebo a-iontům. Abychom od sebe odlišili píky odpovídající jednotlivým linearizovaným pepti- dům, aminokyseliny v cyklickém peptidu obvykle číslujeme. Ionty pak označujeme jako x–yb, kde x od- povídá číslu N-koncové aminokyseliny a y pozici C-koncové aminokyseliny linearizovaného peptidu, který vznikne po rozdělení sekvence mezi aminokyse- linami očíslovanými jako x a y.
– Výjimečně můžeme pozorovat hodnoty m/z, které odpovídají součtu hmotností aminokyselin, které v původní sekvenci cyklického peptidu nenavazují hned za sebou. Tento jev označujeme jako
„scrambling“7. Při fragmentaci dojde nejprve k otevření kruhu a odštěpení aminokyseliny. Následně se kruh opět uzavře a znovu otevře na jiném místě, kde fragmentace dále pokračuje.
– S využitím přesné hodnoty m/z prekurzoru 608,40178 nejprve určíme sumární vzorec iontu hledané látky [C31H53N5O7+H]+. Povšimneme si píků, které odpoví- dají neutrálním ztrátám prekurzoru. V našem případě m/z 580 odpovídá ztrátě CO (a-ion) a hodnota 564 ztrátě CO2.
– V dalším kroku anotujeme b-ionty. Hledáme tedy takové hodnoty m/z, které odpovídají součtu hmotnos- tí zbytků (residues) jednotlivých aminokyselin zvýše- nému o 1 Da. Tímto způsobem přiřadíme následující hodnoty m/z: 199 b2 (Lxx, MeAla), 225 b2 (Lxx, MePro), 226 b2 (La, MePro), 271 b3 (Ala, MeAla, La), 297 b3 (Ala, MePro, La), 339 b3 (Lxx, MePro, La), 382.23366 b4 (Ala, MeAla, MePro, La), 410 b4 (Lxx, Ala, MePro, La), 452 b4 (Lxx, Lxx, MePro, La), 495 b5 (Ala, MeAla, Lxx, MePro, La), 523 b5 (Ala, Lxx, Lxx, MePro, La). Lxx znamená, že daná aminokyseli- na odpovídá leucinu, N-methylvalinu, allo-isoleucinu, isoleucinu, atd. (isobarické aminokyseliny).
– Z hodnot b-iontů 226, 297, 382 a 495 vypozorujeme sekvenci (La, MePro)-Ala-MeAla-Lxx. Z rozdílu m/z hodnoty prekurzoru a iontu 495 vidíme, že sekvence musí obsahovat ještě další stavební blok Lxx (608–
495=113). Celkem tedy obsahuje 6 stavebních bloků.
S využitím hodnot 452 a 523 dále určíme, že sekvence peptidu odpovídá cyklo((La, MePro)-Ala-MeAla-Lxx- -Lxx), protože na koncovou část sekvence Lxx-Lxx navazuje její začátek (La, MePro) resp. (La, MePro)- -Ala. Výsledek potvrzují i hodnoty 199, 339 a 410, protože odpovídají b-iontům, které mohou vzniknout fragmentací doposud určeného peptidu. Zbývá ještě stanovit pořadí bloků (La, MePro), k čemuž nám pomohou ionty 225 a 271. Vidíme totiž, že na blok Lxx navazuje MePro, a že na La navazuje posloup- nost bloků Ala-MeAla. Dosavadní sekvence je tedy cyklo(MePro-La-Ala-MeAla-Lxx-Lxx). Jelikož se jedná o cyklický peptid, nemůžeme na základě pozo- rovaných hodnot b-iontů rozhodnout o orientaci N-konce a C-konce v molekule. Musíme tedy ještě
uvažovat opačnou sekvenci peptidu cyklo(Lxx-Lxx- -MeAla-Ala-La-MePro).
– Naše pozorování můžeme ještě doplnit tím, že anotu- jeme a-ionty a píky odpovídající ztrátě vody: 208 b2-H2O (La, MePro), 269 a3 (Ala, MePro, La), 293 a3-H2O (Lxx, MePro, La), 354 a4 (Ala, MeAla, MePro, La), 366 b4-H2O (Ala, MeAla, Lxx, La), 382.27000 a4 (Ala, Lxx, MePro, La), 392 b4-H2O (Ala, Lxx, MePro, La), 451 a5-H2O (Ala, MeAla, Lxx, Lxx, La), 467 a5 (Ala, MeAla, Lxx, MePro, La), 479 b5-H2O (Ala, MeAla, Lxx, Lxx, La). V našem příkla- du pro hodnotu m/z 366 b4-H2O nepozorujeme ve spektru příslušný pík 384 b4. Pro hodnotu 451 a5-H2O pozorujeme 479 b5-H2O, nevidíme však odpovídající píky 469 a5 a 497 b5. To může nastat v případě, že intenzita chybějících píků je příliš nízká a píky tedy nelze odlišit od šumu. Někdy může nejprve dojít k dehydrataci iontu a jeho následné fragmentaci, což rovněž způsobí, že odpovídající píky nevidíme. Za- tímco u lineárního peptidu by nám a-ionty pomohly určit pozici N-konce a C-konce v peptidové sekvenci, v případě cyklického peptidu nám a-ionty k jejich stanovení nepomohou.
– Struktura přírodního cyklického peptidu (roseotoxin A8) je zobrazena na obr. 3. Povšimněme si však, že daný peptid ve skutečnosti obsahuje β-alanin místo alaninu, a že jedna aminokyselina Lxx sice odpovídá isoleucinu, druhá však N-methyl-valinu, který je iso- merem Lxx. Struktura rovněž obsahuje 3-methyl- prolin. Místo, na kterém je připojena methylová sku- pina v prolinu, však z kolizního spektra rovněž neroz- poznáme. Správná sekvence peptidu je tedy cyklo(La- -MePro-Ile-MeVal-MeAla-βAla). Odlišení isobaric- kých aminokyselinových zbytků je možno dosáhnout například charakteristickou fragmentací příslušných imoniových iontů9 nebo z retenčního času v analýze těkavého derivátu příslušné aminokyseliny po hydro- lýze peptidu. Technikou plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie je možno případně určit i chiralitu příslušné aminokyseliny10.
Obr. 3. Řešení struktury cyklického peptidu
– Pro úplnost uveďme ještě značení jednotlivých b-iontů, pokud stavební bloky očíslujeme podle obr. 3:
199 4-3b2, 225 2-1b2, 226 1-6b2, 271 5-4b3, 297 6-5b3, 339
1-6b3, 382.23366 5-4b4, 410 6-5b4, 452 1-6b4, 495 5-4b5
nebo 4-3b5, 523 6-5b5.
4. Lineární peptid s postranním řetězcem Zadání:
Identifikujte lineární peptid s postranním řetězcem (m/z 758), jehož hmotnostní spektrum jedenkrát protono- vané molekuly [M+H]+ je na obr. 4.
Nápověda:
Ornithin (Orn) je aminokyselina, jejíž stavební blok má sumární vzorec C5H10N2O a nominální hmotnost 114.
Acetylace (Ac) je běžná N-koncová modifikace, která má sumární vzorec C2H2O a hmotnost 42. Například aminoky- seliny AcLeu nebo AcIle tak odpovídají vzorci C8H13NO2
s nominální hmotností 113+42=155.
Řešení:
– Ve spektru nejprve přiřadíme píky odpovídající kom- binacím základních aminokyselin. Vidíme, že hodnota m/z 211 odpovídá dvojici (Pro, Lxx), tedy iontu b2. Dále pozorujeme ion b3 na m/z 324, čímž získáme částečnou sekvenci (Pro, Lxx)-Lxx, protože rozdíl 324 –211=113.
– V dalším kroku se pokusíme přiřadit rozdíly hmotnos- tí mezi m/z píků nestandardním aminokyselinám.
Z hmotností 324 a 438 určíme, že další aminokyseli- nou je Orn. Známe tedy ion b4 a sekvenci (Pro, Lxx)- Lxx-Orn. Dále si všimneme, že rozdíl hodnot 585 a 438 odpovídá Phe, a že rozdíl mezi 593 a 438 odpo- vídá AcLxx. Pozorujeme tedy dva různé ionty b5 a b5’ odpovídající sekvencím aminokyselin (Pro, Lxx)-Lxx- Orn-Phe a (Pro, Lxx)-Lxx-Orn-AcLxx. Rovněž pozo- rujme ion a5’ na m/z 565. Z rozdílu mezi m/z prekur- zoru 758 ([C39H63N7O8+H]+) a m/z iontů b5 a b5’ určí-
me dvě sekvence (Pro, Lxx)-Lxx-Orn-Phe-AcLxx a (Pro, Lxx)-Lxx-Orn-AcLxx-Phe (m/z prekurzoru vypočteme v tomto případě stejně jako u lineárního peptidu tj. součet hmotností zbytků aminokyselin zvý- šený o 19 Da). Z přítomnosti dvou různých iontů typu b5 však vidíme, že sekvence peptidu nemůže být line- ární a dochází tedy k rozvětvení na Orn, ke kterému jsou připojeny obě dvě aminokyseliny Phe i AcLxx.
– Naše tvrzení podpoříme ještě analýzou y-iontové sé- rie. Pozorujeme ion y2 (Phe, Orn) na m/z 280, y3 na m/z 435 obsahující aminokyseliny (Phe, Orn, Ac-Lxx) a rovněž ztrátu acetylu z iontu y3 na m/z 393. Dále vidíme ion y4 (Phe, Orn, AcLxx)-Lxx na m/z 548 a ion y5 (Phe, Orn, Lxx, Lxx, Pro) na m/z 603.
– Dále můžeme pozorovat píky odpovídající interním fragmentům: (AcLxx, Orn) na m/z 270, (AcLxx, Orn, Lxx) na m/z 383 a po následné ztrátě vody rovněž na m/z 365.
– Pořadí aminokyselin (Pro, Lxx) už dále nelze jedno- značně určit, protože spektrum neobsahuje ion b1 na m/z 98 ani ion y5’ (Phe, Orn, Ac-Lxx)-Lxx-Lxx na m/z 661. Rovněž nelze jednoznačně určit, zda-li peptid obsahuje Leu nebo Ile, viz předchozí příklad. Struktu-
Obr. 4. Spektrum lineárního peptidu s postranním řetězcem
Obr. 5. Řešení struktury lineárního peptidu s postranním řetězcem
ra odpovídající spektru (linearizovaná forma pseuda- cyclinu A2) je zobrazena na obr. 5. Povšimněme si, že daný peptid má dva N-konce a jeden C-konec.
5. Cyklický peptid s postranním řetězcem Zadání:
Určete strukturu cyklického peptidu s postranním řetězcem, jehož hmotnostní spektrum jednou protonované molekuly [M+H]+ je na obr. 6.
Řešení:
– Vzhledem k tomu, že známe přesnou hodnotu m/z prekurzoru, můžeme určit sumární vzorec hledané látky [C39H61N7O7+H]+. Rovněž určíme píky s hodnotou m/z 722 (ztráta H2O), 712 (ztráta CO, a-ion) a 695 (ztráta CO a NH3).
– Ve spektru nejprve anotujeme b-ionty: 211 b2 (Pro, Lxx), 245 b2 (Phe, Pro), 270 b2 (AcLxx, Orn), 324 b3
(Lxx, Lxx, Pro), 358 b3 (Phe, Pro, Lxx), 375 b3 (Phe, Orn, Lxx), 383 b3 (AcLxx, Orn, Lxx), 417 b3 (AcLxx, Orn, Phe), 438 b4 (Orn, Lxx, Lxx, Pro), 471 b4 (Lxx, Lxx, Pro, Phe), 530 b4 (AcLxx, Orn, Phe, Lxx), 585 b5
(Lxx, Lxx, Pro, Phe, Orn), 593 b5 (Lxx, Lxx, Pro, Orn, AcLxx), 627 b5 (Lxx, Pro, Phe, Orn, AcLxx).
Dále můžeme pozorovat hodnoty 451 a4-NH3 (Lxx, Lxx, Orn, AcLxx) a 598 a5-NH3 (Lxx, Lxx, Orn, AcLxx, Phe). Podobně jako v oddílu 3 však nevidíme odpovídající píky 468 a4, 479 b4-NH3, 496 b4, ani 615 a5, 626 b5-NH3 a 643 b5, protože jejich intenzita je zřejmě nižší než hladina šumu. Zbývající píky ve spektru odpovídají ztrátám CO, H2O, NH3 a jejich kombinacím z výše uvedených b-iontů.
– Z m/z hodnot iontů typu b5 a prekurzoru vypočteme, že se struktura skládá ze 6 stavebních bloků (Orn, Phe, Pro, Lxx, Lxx, AcLxx). Protože pozorujeme více překrývajících se sérií b-iontů a zároveň nepozoruje- me žádné y-ionty, předpokládáme, že analyzovaná struktura je cyklická.
– Nyní se pokusíme sestavit sekvenci peptidu. Z m/z hodnot 211, 324, 438 a 585 určíme sekvenci (Pro, Lxx)-Lxx-Orn-Phe. Mohli bychom se tedy domnívat, že sekvence peptidu odpovídá cyklo((Pro, Lxx)-Lxx- Orn-Phe-AcLxx). Tato úvaha je však v rozporu s hodnotou m/z 245, která nám říká, že Phe a Pro musí být v sekvenci za sebou, což v tomto případě není splněno kvůli přítomnosti AcLxx. Dojdeme tedy k závěru, že struktura obsahuje cyklo(Pro-Lxx-Lxx- -Orn-Phe), kde bloky Phe a Pro navazují.
– Podobně s pomocí hodnot 245, 358, 471 a 585 určíme sekvenci (Phe, Pro)-Lxx-Lxx-Orn. Zde bychom se mohli domnívat, že sekvence peptidu odpovídá cyklo ((Phe, Pro)-Lxx-Lxx-Orn-AcLxx). Dostaneme se však do rozporu s hodnotou 375, která definuje sousedící bloky Phe, Orn a Lxx. Analogicky nám tedy po vy- jmutí bloku AcLxx vychází sekvence cyklo(Phe-Pro- -Lxx-Lxx-Orn), kde již bloky Phe, Orn a Lxx navazu- jí, a která po rotaci bloků odpovídá předchozímu vý- sledku cyklo(Pro-Lxx-Lxx-Orn-Phe).
Obr. 6. Spektrum cyklického peptidu s postranním řetězcem
Obr. 7. Řešení struktury cyklického peptidu s postranním řetězcem
– Oba rozpory se nám podaří úspěšně vyřešit, pokud předpokládáme, že struktura peptidu odpovídá cyklo (Pro-Lxx-Lxx-Orn-Phe), kde chybějící stavební blok AcLxx navážeme na Orn. Naše tvrzení podporuje pík s hodnotou m/z 585 a relativní intenzitou 100 %, který je charakteristický při oddělení postranního řetězce od cyklické části peptidu. Při hlubším studiu literatury můžeme rovněž zjistit, že aminokyseliny jako ornithin nebo lysin se vzhledem ke své struktuře často vysky- tují jako stavební bloky, které umožňují větvení pepti- dů. V hmotnostním spektru můžeme pozorovat ještě b-ionty 270, 383, 417, 530 a 627, které potvrzují sou- sednost jim odpovídajících bloků v navržené struktu- ře. Výsledná struktura peptidu (pseudacyclin A11) je zobrazena na obr. 7.
6. Bioinformatická podpora
Protože manuální anotace fragmentů neribozomálních peptidů je poměrně náročná – zejména pak v případě cyk- lických struktur – a navíc často nemáme k dispozici infor- maci o jednotlivých stavebních blocích, ze kterých může být daný peptid složen, můžeme pro výpočet použít volně dostupnou aplikaci CycloBranch2. CycloBranch využívá pro de novo sekvenování databázi stavebních bloků např.
20 základních aminokyselin nebo 287 bloků (521 včetně
isomerů) získaných z databáze Norine6. Databázi staveb- ních kamenů si lze však nadefinovat libovolně. Algoritmus pro de novo sekvenování peptidů nejprve mapuje hmotnos- ti jednotlivých stavebních bloků z databáze na rozdíly hodnot m/z mezi libovolnou dvojicí píků ve spektru.
Vznikne tak graf, jehož uzly odpovídají hodnotám m/z a hrany rozdílům mezi těmito hodnotami. Algoritmus poté hledá všechny cesty z hypotetického startovního bodu (ion b0 s hodnotou m/z 1) do cílového bodu (m/z prekurzoru).
V případě lineárního peptidu lze rovněž využít i startovní bod y0 s hodnotou m/z 19 Da.
Nalezené cesty odpovídají sekvencím peptidů (kandidátům), ze kterých je potřeba vybrat správnou sek- venci, a proto CycloBranch pro každého kandidáta vyge- neruje jeho teoretické hmotnostní spektrum. U lineárních peptidů se standardně vygenerují píky požadovaných sérií iontů (např. y, b, a). V případě cyklických peptidů Cyclo- Branch pro každého kandidáta vygeneruje teoretické hmotnostní spektrum, které obsahuje píky všech jeho li- nearizovaných peptidů. Teoretická spektra jednotlivých kandidátů jsou následně porovnána s experimentálním spektrem a seřazena podle skóre (počet anotovaných píků, součet intenzit anotovaných píků, apod.).
Je však potřeba mít na paměti, že neribozomální pep- tidy mohou být složeny z různých bloků, z nichž mnoho tvoří isomery. Navíc fragmentace často není dokonalá a v naměřeném spektru tak nemusí být přítomny všechny
Obr. 8. Seznam kandidátních sekvencí peptidů
teoretické píky. Běžně je proto potřeba mapovat na rozdíly hodnot m/z nejen hmotnosti jednotlivých stavebních kame- nů, ale i jejich kombinace – dvojice, trojice, čtveřice, atd.
CycloBranch umožňuje podrobné nastavení maximálního počtu bloků v jedné kombinaci dokonce s využitím tří parametrů p1/p2/p3 (první parametr p1 udává maximální počet bloků mezi m/z b0 (resp. y0) a jinou hodnotou ve spektru, poslední parametr p3 mezi m/z prekurzoru a jinou hodnotou ve spektru a prostřední parametr p2 mezi libovol- nou jinou dvojicí hodnot m/z). Motivací pro tento způsob nastavování je fakt, že série (např. b-iontů) bývají obvykle více kompletní „uprostřed“ spektra než na jeho „začátku“
a „konci“. Např. konfigurací 3/1/3 povolíme kombinace maximálně tří bloků na „začátku“ a „konci“ spektra, za- tímco „uprostřed“ spektra je zakážeme. Kombinace sta- vebních bloků však přesto mezi sebou tvoří mnoho isome- rů a nepříjemným důsledkem je často fakt, že pro jedno experimentální hmotnostní spektrum můžeme získat mno- ho kandidátních sekvencí, které mají shodné nejlepší nebo velmi dobré skóre, a přesto takový výsledek nemusí být nutně správný. Řešením může být syntéza a měření pepti- dového standardu, či využití alternativní analytické techni- ky (jaderná magnetická rezonance nebo rentgenová difrak- ce)12.
Výpis kandidátních sekvencí peptidů pro spektrum roseotoxinu A je na obr. 8. Po rozkliknutí řádku daného kandidáta je možné zobrazit detail porovnání jeho teoretic-
kého spektra s experimentálním spektrem (obr. 9). Aplika- ce umožňuje kromě de novo sekvenování i přímé porovná- ní experimentálního spektra s teoretickým spektrem vyge- nerovaným ze sekvence peptidu, a rovněž porovnání expe- rimentálního spektra s databází peptidových sekvencí.
Ve všech případech je potřeba mít k dispozici databá- zi stavebních bloků (obr. 10). Pro každý stavební blok definujeme jeho název, unikátní zkratku, sumární vzorec residua. Volitelně pak můžeme definovat seznam neutrál- ních ztrát oddělených středníkem a referenci do externí databáze např. ChemSpider (https://
www.chemspider.com/) nebo PubChem (https://
pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Například reference
„CSID: 969“ (ChemSpider ID) slouží k linkování zkratky
„Phe“ na stránku obsahující informace o fenylalaninu.
Alternativně bychom mohli napsat „CID:
6140“ (Compound ID) pro odkaz do databáze PubChem.
Monoisotopická hmotnost je vypočtena vždy automaticky ze sumárního vzorce. Pokud má nějaký stavební blok iso- mery, je vhodné je seskupit do jednoho řádku. Ve sloup- cích název, zkratka a reference je pak nutné pro oddělení isomerů nutné použít symbol „/“.
Příklad databáze sekvencí neribozomálních peptidů je na obr. 11. Pro každý peptid definujeme jeho typ: lineární (linear), lineární s jednou větví (branched), cyklický (cyclic) a cyklický s jednou větví (branch-cyclic). Dále definujeme název peptidu, sumární vzorec neutrální mole-
Obr. 9. Detail porovnání teoretického a experimentálního spektra
kuly a sekvenci stavebních bloků. Monoisotopická hmot- nost se opět vypočítává automaticky ze sumárního vzorce.
Podobně jako v předchozím případě je možné vkládat refe- rence do externích databází ChemSpider, PubChem, apod.
Sekvence lineárního a cyklického peptidu se zapisují ve
formátu „[A]-[B]-[C]-[D]-[E]”, kde A až E označují zkrat- ky stavebních bloků. V případě cyklického peptidu se au- tomaticky předpokládá, že na stavební blok E navazuje blok A. Sekvence lineárního i cyklického peptidu s větví se zapisují ve formátu „[A]\([B]-[C]\)[D]-[E]”, kde staveb- Obr. 10. Příklad databáze stavebních bloků neribozomálních peptidů
Obr. 11. Příklad databáze sekvencí neribozomálních peptidů
ní blok B způsobuje rozvětvení (např. ornithin) a blok C označuje konec větve. U cyklického peptidu s větví opět předpokládáme, že na blok E navazuje blok A. Pro definici sekvencí peptidů je možné použít i vestavěný grafický editor. Pro lineární peptid můžeme dále definovat N-koncovou a C-koncovou modifikaci, pro lineární peptid s větví pak můžeme navíc definovat i koncovou modifika- ci větve (příslušné sloupce nejsou na obr. 11 zobrazeny).
Pro cyklický peptid se koncové modifikace nedefinují. Pro cyklický peptid s větví ale můžeme definovat koncovou modifikaci větve. K tomuto účelu se analogicky využívá editor modifikací (obr. 12). Ukázkové příklady konfigura- ce programu pro různé režimy vyhledávání a různé typy peptidů jsou součástí instalačního balíčku aplikace Cyclo- Branch, která je volně k dispozici na https://
ms.biomed.cas.cz/cyclobranch.
Práce byla podpořena Ministerstvem školství, mláde- že a tělovýchovy České republiky (LO1509) a Grantovou agenturou České republiky (19-10907S).
LITERATURA
1. Škultéty L., Novák J., Havlíček V.: Chem. Listy 114, 145 (2020).
2. Novák J., Lemr K., Schug K.A., Havlíček V.: J. Am.
Soc. Mass Spectrom. 26, 1780 (2015).
3. Wright P., Alex A., Pullen F.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 30, 1163 (2016).
4. Cautereels J., Blockhuys F.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 28, 1227 (2017).
5. Vaisar T., Urban J.: J. Mass Spectrom. 33, 505 (1998).
6. Caboche S., Pupin M., Leclère V., Fontaine A., Jacques P., Kucherov G.: Nucleic Acids Res. 36, D326 (2008).
7. Bleiholder C., Osburn S., Williams T. D., Suhai S., Van Stipdonk M., Harrison A. G., Paizs B.: J. Am.
Chem. Soc. 130, 17774 (2008).
8. Jegorov A., Paizs B., Žabka M., Kuzma M., Havlíček V., Giannakopulos A. E., Derrick P. J.: Eur. J. Mass Spectrom. 9, 105 (2003).
9. Havlíček V., Jegorov A., Sedmera P., Wagnerredeker W., Ryska M.: J. Mass Spectrom. 30, 940 (1995).
10. Zahradníčková H., Hartvich P., Šimek P., Hušek P.:
Amino Acids 35, 445 (2008).
11. Pavlásková K. a 13 spoluautorů: J. Nat. Prod. 73, 1027 (2010).
12. Přichystal J., Schug K. A., Lemr K., Novák J., Havlí- ček V.: Anal. Chem. 88, 10338 (2016).
J. Novák and V. Havlíček (Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Repub- lic): Interpretation of Peptide Product Ion Mass Spec- tra: Examples
The fragmentation of four peptide types, i.e. linear, cyclic, branched and branched-cyclic peptides, is de- scribed in four tutorial examples. The possible de novo sequencing approaches are supported by an open tool called CycloBranch. This tutorial represents a practical extension of our preceding article Fundamentals of Mass Spectra Interpretation published in the previous Chemicke listy issue (2/2020) and can serve the newcomers for the basic orientation in the peptidomics field.
Keywords: fragmentation, mechanism, rule, isotope clus- ter, interpretation approach, ion nomenclature, fine isotope structure
Acknowledgements
This work was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (LO1509) and Czech Science Foundation (19-10907S).
Obr. 12. Příklad definice koncových modifikací
