(bakalářská práce) Clostridium difficile Mikrobiologická diagnostika pseudomembranózní kolitidy způsobené bakterií Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Univerzita Karlova v Praze

Univerzita Karlova v Praze

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

katedra biologických a lékařských věd

Mikrobiologická diagnostika pseudomembranózní kolitidy způsobené bakterií Clostridium difficile

(bakalářská práce)

Hradec Králové, 2009 Kateřina Urbanová

2 Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány.

V Hradci Králové, dne 28. 4. 2009 Kateřina Urbanová

3 Děkuji tímto Mgr. Vejsové, prim. MUDr. Malotové, MUDr. Vágnerové a MVDr. Ziklové za podporu a vstřícnost při vedení mé bakalářské práce.

4

SOUHRN

Kateřina Urbanová

Mikrobiologická diagnostika pseudomembranózní kolitidy způsobené bakterií Clostridium difficile

Bakalářská práce

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotnická bioanalytika

Cíl práce

Hlavním cílem této práce bylo praktické provedení laboratorních metod pro průkaz infekcí způsobených bakterií Clostridium difficile. Testování metod průkazu toxinů A a B a vlastní kultivační vyšetření mělo za cíl najít a otestovat vhodné komerční vyšetřovací sety a kultivační půdy pro lepší záchyt bakterií v laboratorní praxi a zavedení metod do rutinní praxe Laboratoře klinické mikrobiologie ve Šternberku.

Metody

K vyšetření toxinů jsme pouţili soupravu Meridian ImmunoCard® Toxin A a B, kultivační vyšetření jsme provedli na selektivních půdách dle Braziera firmy Oxoid.

Výsledky

Ve studii bylo vyšetřeno 106 vzorků stolice (41 ţen a 65 muţů). Toxiny negativní i kultivace negativní výsledky byly zaznamenány u 31 ţen a 61 muţů, toxiny pozitivní a kultivace negativní u 3 ţen a 1 muţe, toxiny negativní a kultivace pozitivní u 6 ţen a 3 muţů a toxiny pozitivní i kultivace pozitivní u 1 ţeny a ţádného muţe.

Závěr

Na správnosti a přesnosti výsledků se podílí faktory preanalytické i analytické fáze vzorku. Práce poukázala také na nutnost podrobné analýzy a vyzkoušení jiného způsobu transportování vzorků, vývoj nových transportních médií, která by lépe uchovala vzorek stolice a zvýšila tak výtěţnost vyšetření a také nutnost lepší edukace lékařů.

5

SUMMARY

Kateřina Urbanová

Microbiological diagnosis of pseudomembranous colitis caused by Clostridium difficile

Bachelor Thesis

Charles Univerzity in Prague, Faculty Of Pharmacy in Hradec Králové Zdravotnická bioanalytika

Object of thesis

Main goal of this thesis was to perform in practice laboratorial methods for demonstration of infections caused by bacteria Clostridium difficile. A & B toxins detection methods testing and proper cultural examination had the aim in finding and testing suitable commercial examination sets and culture media for better detection of bacteria in laboratorial practice and implementation of those methods into general practice in Laboratoř klinické mikrobiologie in Šternberk.

Methods

For examination of toxins has been used Meridian ImmunoCard® Toxin A & B set, for cultural examination in compliance with Brazier we used Oxoid selective media.

Findings

There have been 106 stool samples examined during the research (41 women and 65 men). Both negative toxins and culture results were recorded for 31 women and 61 men, positive toxins and negative culture for 3 women and 1 man, negative toxins and positive culture for 6 women and 3 men, both positive toxins and culture recorded for 1 woman and none man.

Conclusion

Factors of the pre-analytical and analytical stage of a sample are taking part in the final correctness and accuracy of findings. The research pointed out a need to analyze and test a new way of sample transport methods and transport media, which would be able to retain stool samples more effectively and therefore improve the quality of examination. The research also shows that a better education of doctors is necessary.

6

OBSAH

SOUHRN ... 4

SUMMARY ... 5

OBSAH ... 6

1 TEORETICKÁ ČÁST ... 7

1.1 ÚVOD ... 8

1.2 MORFOLOGIE ... 8

1.3 PATOGENEZE ... 9

1.4 PSEUDOMEMBRANÓZNÍKOLITIDA ... 10

1.5 KLINICKÉPROJEVYINFEKCE ... 10

1.6 RIZIKOVÉFAKTORY ... 11

1.7 LÉČBA ... 11

1.8 PREVENCE ... 13

1.9 EPIDEMIOLOGIE ... 13

1.10 NOVÝEPIDEMICKÝHYPERVIRULENTNÍKMEN ... 14

1.11 KULTIVACE ... 15

1.11.1 Základní, nejběžněji používané tekuté, polotuhé a tuhé půdy ke kultivaci anaerobních bakterií ... 16

1.11.2 Faktory ovlivňující kultivaci bakterií ... 18

1.12 BIOCHEMICKÁIDENTIFIKACEANAEROBNÍCHBAKTERIÍ ... 19

1.12.1 Použití komerčních médií ... 19

1.12.2 Použití médií vyráběných v laboratoři ... 19

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ... 20

2.1 CÍLEPRÁCE ... 21

2.2 VÝBĚRATESTOVÁNÍSOUPRAVPROVYŠETŘENÍTOXINŮ ... 21

2.2.1 Vyšetření toxinu A testem C.difficile toxin A test ... 22

2.2.2 Vyšetření toxinů A a B testem ImmunoCard® Toxin A a B ... 24

2.3 PŘÍPRAVAVZORKUSTOLICEKEKULTIVAČNÍMUVYŠETŘENÍ ... 28

2.3.1 Metoda tepelných šoků ... 28

2.3.2 Metoda alkoholových šoků ... 29

2.4 VLASTNÍKULTIVAČNÍVYŠETŘENÍ ... 30

2.4.1 Materiál a pomůcky ... 30

2.4.2 Pracovní postup ... 31

2.5 VLASTNÍSTUDIE ... 32

2.5.1 Popis a schéma experimentu ... 32

2.5.2 Schéma experimentu ... 32

2.5.3 Vyšetření na přítomnost toxinů A a B ... 33

2.5.4 Kultivační vyšetření stolice ... 33

2.5.5 Mikroskopické vyšetření ... 35

2.5.6 Biochemická identifikace kultury ... 37

3 VÝSLEDKY ... 42

4 DISKUZE ... 44

5 ZÁVĚR ... 48

6 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ... 49

7 PŘÍLOHY... 52

7.1 SEZNAMGRAFŮ ... 52

7.2 SEZNAMTABULEK ... 52

7.3 SEZNAMOBRÁZKŮ ... 52

7

1 TEORETICKÁ ČÁST

8

1.1 ÚVOD

Clostridium difficile je pohyblivá anaerobní tyčinka, která je přítomna ve střevě u 5 % zdravých dospělých, u dětí a kojenců je výskyt vyšší.

Je významným patogenem a často diagnostikovanou příčinou nemocničních onemocnění. Je původcem onemocnění zaţívacího traktu souvisejícího s antimikrobiální léčbou. Svými toxiny můţe vyvolat střevní postiţení, která mohou vyvolat lehká průjmová onemocnění, prudké záněty, pseudomembranózní enterokolitidu nebo ţivot ohroţující megakolon.

Bakterie Clostridium difficile byla objevena a poprvé izolována Hallem a O´Toolem v roce 1935 (Hall, O´Toole, 1935).

Clostridium difficile získalo svůj název podle latinského slova difficilis, coţ znamená obtíţný (Larson et al., 1978). Jeho kultivace byla tedy velmi obtíţná. George et al. při vývoji selektivních médií pro rutinní izolaci Clostridium difficile ze vzorků stolice, doporučili médium s přídavkem fruktózy a ţivného média s přídavkem vaječného ţloutku, s D-cykloserinem a cefoxitinem jako selektivními prostředky pro izolaci Clostridium difficile (George et al., 1979). Pouţíváním těchto selektivních prostředků byla zjištěna inhibice růstu většiny bakterií rodu Enterobacteriacae, také Enterococcus faecalis, stafylokoků, gram-negativních nesporulujících anaerobních bacilů a Clostridium species, které se nachází ve velkém mnoţství ve vzorcích stolice. Zavedením selektivních kultivačních půd se izolace a kultivace Clostridium difficile ze stolice pacientů značně zjednodušila.

Pouţívají se kultivační půdy s obsahem antibiotik, které potlačují růst doprovodné střevní mikroflóry. Brazier zavedl pro kultivaci Clostridium difficile metodu alkoholových šoků, které se vyuţívá taktéţ k potlačení růstu běţné mikroflóry střev.

1.2 MORFOLOGIE

Velikost bakterií je poměrně variabilní. Vegetativní buňky jsou buď drobné (0,6 x 4-6 µm), nebo velké (1,2-1,6 x 6-16 µm) (Votava et al., 2003).

9 Clostridium difficile se řadí do skupiny grampozitivních bakterií.

Grampozitivita či gramnegativita je dána rozdílnou stavbou bakteriálních stěn bakterií, které se diagnosticky barví metodou dle Grama. Při barvení metodou dle Grama se fixovaný preparát bakterií nejprve barví krystalovou violetí, která bakteriální buňky obarví tmavomodře aţ modrofialově. Poté se přidá Lugolův roztok, coţ v obarvených buňkách vede ke vzniku komplexu barviva s jodem.

Následuje působení 96 % etanolu nebo aceton-alkoholu. Na závěr se preparát dobarví kontrastním barvivem, např. zředěným fuchsinem a opláchne vodou (Votava et al., 2001).

Clostridium difficile vytváří spory, které vegetativní buňku lehce vydouvají a jsou uloţené subterminálně, později terminálně. Spory je nutné barvit speciálními barvícími metodami. Vytvářením spor buňka reaguje na určité změny v prostředí, např. na úbytek potřebných ţivin či vysychání. Pokud se spora dostane opět do příznivých podmínek, vyklíčí a vznikne nová vegetativní buňka. Spory jsou vysoce odolné formy bakterií. Bakterie takto mohou přeţívat i stovky let. Zničí je jen autoklávování, tj. působení vodní páry za zvýšeného tlaku, a to minimálně 20 minut při tlaku 0,2 MPa coţ odpovídá 121 °C. Ke kultivaci vyţaduje Clostridium difficile poměrně striktně anaerobní atmosféru.

1.3 PATOGENEZE

Část kmenů bakterie Clostridium difficile vytváří během vegetativního růstu toxiny, které se uvolňují do prostředí rozpadem buněk. Jedná se o toxiny A a B. Některé kmeny tvoří oba toxiny současně. Oba toxiny jsou schopny vyvolat postiţení střeva, které můţe vyústit v pseudomembranózní kolitidu.

Jsou významnými faktory virulence Clostridium difficile.

Toxin A je enterotoxin, který poškozuje buňky střevního epitelu a způsobuje zadrţování a hromadění tekutin ve střevě, coţ má za následek vznik vodnatých průjmů. Poškozuje i buňky imunitního systému a chemotaxe, vyvolává akutní zánětlivou reakci.

Toxin B je cytotoxin, který svými účinky vede k nekróze napadených tkání.

10 Uvedené toxiny způsobují vyplavení protizánětlivých slizničních cytokinů, které ve sliznici tlustého střeva vedou ke vzniku loţisek s exsudací. Tato loţiska se střídají s ostrůvky intaktní sliznice (Limaye et al., 2000).

U asymptomatických jedinců – nosičů bakterie Clostridium difficile - se nacházejí vysoké hladiny protilátek typu IgG proti enterotoxinu. Tito nosiči mají obecně niţší riziko rozvinutí klostridiové infekce ve srovnání s ostatními pacienty (Kyne et al., 2000).

1.4 PSEUDOMEMBRANÓZNÍ KOLITIDA

Postantibiotická pseudomembranózní kolitida je jednou z častých nosokomiálních infekcí.

Dle amerických výzkumů vyvolává Clostridium difficile kolitidu asi u 20 % hospitalizovaných pacientů, kteří uţívají antibiotika (Gerding, Olson, Peterson et al., 1986). Zpočátku byl za etiologické agens povaţován Staphylococcus aureus. Později však byly za příčinu onemocnění označeny toxiny, které produkuje klostridium. Vznik kolitidy byl popsán nejen v souvislosti s pouţíváním téměř všech antibiotik, ale také jako následek uţívání antivirotik a antimykotik. Nejčastěji se však vyskytuje v důsledku uţívání aminopenicilinů ampicilinu a amoxicilinu, cefalosporinů a klindamycinu (Ann Marie Joyce, David L. Burns, 2003).

1.5 KLINICKÉ PROJEVY INFEKCE

Infekce vykazují široké spektrum klinických projevů. Průjmovité onemocnění je charakterizováno třemi aţ čtyřmi řídkými stolicemi za den, obvykle bez systémových příznaků. Kolitida je poté charakterizována bolestí břicha a zvýšenou teplotou, dehydratací, syndromy sepse a toxickým megakolonem. Onemocnění můţe u váţně nemocných neléčených pacientů skončit smrtí. Úmrtnost můţe dosahovat 25 – 30 % (Pepin et al., 2005).

11

1.6 RIZIKOVÉ FAKTORY

V posledních letech se onemocnění objevuje častěji u pacientů, kteří byli dříve povaţováni za málo rizikové skupiny, jako mladé osoby a děti včetně kojenců, osoby z komunity a ţeny kolem porodu (Beneš, Vacek, 1995). Horší prognóza je spojena s věkem nad 60 let, horečkou převyšující 38,3 °C, hypalbuminémií < 25 g/l, leukocytózou (15 000/mm³) a pobytem na JIP (Fernandez, Anand, Fridenberg, 2004).

Fekety et al. definovali pět predisponujících faktorů:

 předchozí průjmové onemocnění vyvolané Clostridium difficile

 nástup choroby v jarním období

 současné uţívání jiných antibiotik

 infekci kmenem Clostridium difficile typu 1 nebo 2

 ţenské pohlaví (Fekety et al., 1997)

1.7 LÉČBA

Kolem 80 % případů průjmu způsobeného Clostridium difficile se vyskytuje u pacientů, kteří jsou na kontinuální antibiotické léčbě, ale zvýšené riziko pro vznik onemocnění přetrvává ještě měsíce po ukončení expozice antibiotikům. Populaci, která je predisponována ke vzniku kolitidy, tvoří zejména starší lidé a pacienti s chorobami tlustého střeva a s jinými těţkými, souběţně se vyskytujícími onemocněními (Reinke, Messick, 1994).

Standardní terapie se skládá z:

 přerušení léčby antibiotikem, pokud to zdravotní stav pacienta umoţňuje

 vyvarování se přípravků, které inhibují střevní motilitu

 perorální podání metronidazolu nebo vankomycinu po dobu 10 – 14 dní

12 Metronidazol je lékem volby. Jak metronidazol, tak perorální vankomycin vykazují vysokou aktivitu vůči Clostridium difficile in vivo. Existuje však obava ze vzniku vankomycin-rezistentnícho kmenů enterokoků s následnou infekcí (Buggy, Fekety, Silva, 1987).

Vankomycin a metronidazol působí proti vegetativním formám Clostridium difficile, nikoli proti jeho sporám (Fekety, 1997).

Účinné se ukázalo postupné sniţování dávky vankomycinu nebo metronidazolu během 4 – 6 týdnů. To potlačuje růst bakterií a současně umoţňuje restituci normální střevní mikroflóry. Alterovaná střevní mikroflóra zvyšuje náchylnost ke vzniku rekurentní infekce, proto je dalším přístupem k terapii uţívání probiotik k obnovení střevních komenzálů (Pochapin, 2000).

Objeví-li se u pacienta průjem po ukončení léčby, existuje vysoká pravděpodobnost relapsu onemocnění. Před opakováním léčby by však měla být vyšetřena stolice na přítomnost toxinů.

Experimentálně se jeví jako účinná v prevenci dalších relapsů „fekální terapie“. Jedná se o transplantaci stolice od zdravých příbuzenských dárců, která vede k rychlé restituci normální střevní mikroflóry. Dárce je nejprve vyšetřen na přítomnost střevních patogenních bakterií a parazitů, HIV a virů hepatitid. Po předchozí několikadenní přípravě pacienta perorálním vankomycinem a očistném klyzmatu se aplikuje nálev zředěné dárcovské stolice. Fekální transplantace byla dosud popsána u jednotlivých případů, neexistuje ţádná odpovídající studie, která by umoţnila formulovat doporučení této léčby s jejími zřejmými etickými problémy a patrně i rizikem přenosu jiných infekčních agens.

Pro obnovení fyziologické střevní flóry je doporučováno podávání probiotik. I kdyţ terapeutický efekt probiotik není přesvědčivý a postoj k jejich podávání je zcela neutrální, zastánci této metody ji doporučují pro prevenci relapsů, případně při léčbě lehkých forem klostridiových infekcí. V prevenci relapsů vyvolaných ribotypem 027 se zkouší podávání směsí probiotických kmenů, které se jeví účinnější neţ monoterapie (Dendukuri et al., 2005).

13 Jako probiotické kultury se vyuţívají ţivé laktobacily, např. Lactobacillus species (Hickson et al., 2007) nebo kvasinka Saccharomyces boulardii (Bouza, Cuenca-Estrella et al., 2005)

1.8 PREVENCE

Základní body prevence nákazy:

 včasné stanovení diagnózy a následná léčba

 izolace nemocného v samostatném pokoji se samostatným WC

 účinná desinfekce rukou, u personálu navíc pouţívání ochranných pomůcek – rukavice, pláště, zástěry, roušky

 pečlivý úklid a desinfekce ploch, uţívání sporicidních prostředků

1.9 EPIDEMIOLOGIE

Infekce Clostridium difficile se přenáší fekálně-orální cestou, často rukama nemocničního personálu, dle výzkumů 14-59 % personálu má ruce kontaminované spórami (McFarland et al., 1989, Dubberke et al., 2007).

Pacienti s infekcí tak silně kontaminují prostředí.

Laboratorní testy vykazují zvýšený počet leukocytů s posunem doleva k nezralým formám (Fekety, 1997). Po skončení antibiotické léčby prvotní příznaky ustupují, ale po určité době se mohou objevit znovu.

14

1.10 NOVÝ EPIDEMICKÝ HYPERVIRULENTNÍ KMEN

V posledních sedmi aţ osmi letech došlo v Americe k dramatickému nárůstu počtu infekcí vyvolaných Clostridium difficile a zvýšil se počet lůţek na jednotkách intenzivních péčí aţ na 500.

Tento nárůst počtu nemocných s průkazem klostridiové infekce byl impulzem k podrobným laboratorním testům.

Byl objeven hypervirulentní kmen Clostridium difficile a to v Pittsburghu, USA, v letech 2002-2003 (Brazier, 2008).

Kmen byl označen NAP/027, coţ vyplývá z identifikačních mikrobiologických metod:

 pomocí PCR ribotypizace byl kmen charakterizován jako ribotyp 027

 na základě pulzní gelové elektroforézy jako NAP1 (North American Pulsed-Field Type 1)

 pomocí PCR-REA (restriction enzym analysis) jsou kmeny 027/NAP1 řazeny do skupiny BI (McDonald et al., 2005)

 kmeny BI/NAP/027 obsahují mutaci nukleotidu v pozici 117 na TcdC genu, který kóduje protein C (Matamouros et al., 2007). Tento protein působí supresi genů pro toxiny A a B. Kmeny produkují 16krát více toxinu A a 23krát více toxinu B. Kmen 027 produkuje navíc tzv. binary toxin, jehoţ patogenita dosud nebyla jasně prokázána (Brazier et al., 2005)

 nejčastějším ribotypem v Evropě je 027. Nové epidemické kmeny se obecně vyznačují niţší citlivostí k antibiotikům, např. rezistence na fluorochinolony. U mnohých kmenů dochází k postupnému sniţování citlivosti k metronidazolu, coţ lze prokázat rostoucí hodnotou MIC (minimální inhibiční koncentrace)

15 Ve Velké Británii byla v roce 2004 dokumentována epidemie ribotypem 027, postihující 150 pacientů, z nichţ 12 zemřelo. Británie dosud zaznamenala nejvyšší výskyt tohoto onemocnění v Evropě. Výskyt hypervirulentního ribotypu 027 byl sporadicky zjištěn i v dalších evropských zemích – omezeně v Belgii, Holansku a Francii (Nyč et al., 2006).

V České republice byla zřízena národní referenční laboratoř pro Clostridium difficile v Praze.

1.11 KULTIVACE

Společnou vlastností anaerobních bakterií je neschopnost růstu za přítomnosti kyslíku. Pro bakterie striktně anaerobní je kyslík toxický a hubí je nejen při kultivaci, ale i při jejich přechovávání a transportu.

Pro kultivaci anaerobních bakterií je nutno zajistit prostředí bez kyslíku nebo s nízkým oxidoredukčním potenciálem. Oxidoredukční potenciál odráţí poměr mezi oxidovanými a redukovanými látkami v prostředí. Anaeroby tedy vyţadují hodnoty kolem 0 mV aţ negativní čili redukované prostředí (Votava, 2000). Tekuté půdy se zbaví kyslíku povařením, průnik atmosférického kyslíku se potlačí přidáním malého mnoţství agaru nebo zalitím půdy parafinovým olejem.

Pro úspěšnou práci s anaerobními mikroorganismy se pouţívají boxy, ve kterých je stále udrţováno anaerobní prostředí. Materiál se vkládá dovnitř i vyjímá ven přes speciální komory. Toto zařízení dovolí denně pracovat s materiálem i kulturami tak, ţe nejsou vystaveny účinkům kyslíku a záchytnost anaerobů z klinického materiálu je tak daleko vyšší.

Starším typem přístroje pro práci s anaeroby jsou anaerostaty. Jsou to vzduchotěsně uzavíratelné nádoby, do nichţ lze naskládat cca 10 Petriho misek. Dovnitř se umístí generátor plynů. Bývá to většinou plastikový sáček obsahující směs chemikálií. Před pouţitím se přidává výrobcem určené mnoţství vody. Anaerostat s takto aktivovaným generátorem se rychle uzavře.

16 Vlivem vody se z generátoru plynů uvolňuje vodík a ze směsi hydrogenuhličitanu sodného s kyselinou citronovou nebo vinnou vzniká oxid uhličitý. Pod víkem anaerostatu je obvykle umístěn katalyzátor. Na povrchu katalyzátoru se pak za vzniku tepla a vzniku vodní páry slučuje vodík s kyslíkem z atmosféry uzavřené v anaerostatu. Výsledkem je dokonale anaerobní prostředí ve směsi dusíku, vodíku, oxidu uhličitého a vodní páry (Votava et al., 2001).

Historická metoda, která se dnes jiţ v praxi běţně nepouţívá, je metoda Fortnerova. Na krevní agar nalitý ve vysoké vrstvě se naočkuje na polovinu vyšetřovaný materiál, na druhou polovinu masivně bakterie, která je schopna svým metabolismem vyčerpat kyslík – např. Serratia marcescens. Miska se neprodyšně uzavře. Serratia marcescens spotřebuje kyslík a umoţní tak růst anaerobním bakteriím ve vyšetřovaném vzorku.

Kultivace by měla být optimálně prováděna vţdy nebo alespoň u toxin pozitivních vzorků nebo u vzorků pacientů s těţkými projevy střevní infekce včetně toxin negativních stolic (Mundy et al., 1995).

1.11.1 Základní, nejběţněji pouţívané tekuté, polotuhé a tuhé půdy ke kultivaci anaerobních bakterií

VF-bujon

Dříve hojně uţívaný bujon se řadí mezi tzv. trávené bujony. Připravoval se natrávením směsi hovězího masa a jater pepsinem. Následovala úprava pH, převaření, filtrace a znovu úprava pH. Slouţil jako základ k přípravě bujonů nebo agarových půd ke kultivaci striktních a fakultativně anaerobních mikrobů (Votava, 2000).

VL bujon

Obsahuje ve svém základu mj. enzymatický kaseinový hydrolyzát, hovězí odvar a kvasničný autolyzát a je dále obohacen glukózou a L-cysteinem.

17 Slouţí ke kultivaci sporulujících a nesporulujících anaerobních mikrobů.

VL-bujon lze obohatit 10 % ovčí krve (Votava, 2000).

Zesílený klostridiový bujon

Jedná se o výţivné polotuhé médium obsahující kaseinový enzymatický hydrolyzát a masový výtaţek, obohacené kvasničným extraktem, 0,5 % glukózy, octanem sodným, škrobem a cysteinem. Umoţňuje růst klostridií i z minimálního inokula. Pouţívá se ke kultivaci a stanovení počtu anaerobů např. z potravin (Votava, 2000).

Diferenciální zesílený klostridiový bujon

Bujon má bohatý ţivný základ z tryptózy a masového výtaţku obohacený kvasničným extraktem, škrobem, octanem sodným a 0,1 % glukózy.

Jako diagnostický substrát se přidává siřičitan sodný a jako indikátor citrát ţelezitý. Mikroby redukují siřičitan a vytváří sirovodík, který reaguje se solemi ţeleza za vzniku černého sulfidu (Votava, 2000).

Schaedlerův bujon

Toto pomnoţovací médium pro anaeroby je výbornou základní půdou k přípravě obohacených a selektivních půd. Pouţívá se k pěstování klinicky významných anaerobů i ke stanovení jejich citlivosti vůči antimikrobiálním látkám metodou minimální inhibiční koncentrace (Votava, 2000).

Krevní agary pro anaeroby

Mívají za základ VF nebo VL-bujon, dále obsahují defibrilovanou krev, a to aţ 10 %, kvasničný extrakt, cystein, vitamín K a hemin. Nejuţívanější je anaerobní krevní agar CDC (Votava, 2000).

18 Schaedlerův agar

Od stejnojmenného bujonu se liší pouze přítomností 1,5 % agaru. Lze jej obohatit i přídavkem vitamínu K či 5 % krve nebo přídavkem antibiotik (Votava, 2000).

Clostridium difficile agar (CCFA)

Selektivní půda slouţící ke kultivaci Clostridium difficile zejména ze stolice. Pouţití řady inhibitorů spolehlivě potlačuje růst neţádoucích mikrobů včetně jiných klostridií a umoţňuje tím růst i citlivějších kmenů Clostridium difficile.

1.11.2 Faktory ovlivňující kultivaci bakterií

 voda – většina bakterií vyţaduje ve svém prostředí vodu. Sníţení mnoţství dostupné vody pod optimum v extrémních případech způsobí smrt bakterie vyschnutím. Výjimkou je lyofilizace, coţ je sušení zmraţených bakterií ve vakuu.

 teplota – kaţdá bakterie je schopna mnoţit se v určitém teplotním rozmezí. Pro patogenní bakterie pro člověka se pohybuje v rozmezí 35 aţ 37 °C. Zvyšování teploty vede k rychlému zpomalení růstu a mnoţení mikroba.

Podle optimální růstové teploty lze mikroby rozdělit na tři skupiny:

 psychrofily – rostoucí při nízkých teplotách (0 aţ 20 °C)

 mesofily – optimálně rostoucí při běţných teplotách (20 aţ 40 °C)

 termofily – mnoţící se při vysokých teplotách (nad 40 °C)

(Votava, 2001).

 osmotický tlak – mikroby se většinou nalézají v prostředí hypotonickém, v němţ koncentrace rozpuštěných látek je niţší neţ v buněčné cytoplazmě.

19

 koncentrace vodíkových iontů – většině mikrobů se nejlépe daří při hodnotách pH blízkých neutralitě, tedy mezi pH 6 aţ 8 a lze je označit za neutrofily.

 oxidoredukční potenciál – běţné kultivační půdy vystavené vlivu kyslíku mají potenciál kolem 200 mV.

 záření – pro většinu bakterií je záření, zejména ultrafialové a ionizační, příčinou poškození biologicky důleţitých molekul. Nejškodlivější je ultrafialové záření.

1.12 BIOCHEMICKÁ IDENTIFIKACE ANAEROBNÍCH BAKTERIÍ

1.12.1 Pouţití komerčních médií

Pouţití komerčních biochemických testů pro určení druhů bakterií je dnes hojně rozšířeno. Testy jsou dodávány ve formě plastových jamek s lyofilizovanou půdou. Suspenze bakterie ve fyziologickém roztoku se inokuluje do jamek a kultivuje 18-24 hod při 37 °C. Některé testy poté vyţadují přidání indikátorů. Většina půd v testu obsahuje cukerné sloţky a bakterie dělí podle zkvašování či nezkvašování příslušného cukru. Dalšími testy jsou např. štěpení močoviny, redukce nitrátů, hydrolýza hippurátu, schopnost deaminovat fenylalanin, schopnost dekarboxylace aminokyselin a jiné. Způsob přípravy suspenze, inokulace a inkubace se liší v závislosti na výrobci.

1.12.2 Pouţití médií vyráběných v laboratoři

Princip testů je stejný, laboratoř si dané kultivační půdy vyrábí sama ve formě tzv. pestrých řad.

20

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

21

2.1 CÍLE PRÁCE

Experimentální část práce se zabývá laboratorní diagnostikou Clostridium difficile - průkazem toxinů a kultivačním vyšetřením ze vzorků stolice.

V mikrobiologických laboratořích se většinou rutinně stanovují pouze toxiny. S nárůstem multirezistentních kmenů Clostridium difficile však vzrostla potřeba kultivace bakterie, neboť pro diagnostiku ribotypu 027 metodou PCR je nutná vypěstovaná kultura bakterie jako zdroj DNA.

Protoţe je v literatuře popsáno více předkultivačních a kultivačních postupů, pokusíme se je srovnat a vybrat vhodnou metodu pro zavedení do praxe v naší laboratoři.

2.2 VÝBĚR A TESTOVÁNÍ SOUPRAV PRO VYŠETŘENÍ TOXINŮ

Pro srovnání komerčních souprav pro vyšetření toxinů ze vzorků stolice byly pouţity sety firem Oxoid a Meridian.

Souprava firmy Oxoid C.difficile toxin A test je rychlým, imunologickým testem pro kvalitativní stanovení toxinu A Clostridium difficile ve vzorcích stolice. Testem se prokazuje přítomnost toxinu A Clostridium difficile , který je v přímé souvislosti s klinickým obrazem pseudomembranózní kolitidy. Toxin A (antigen) reaguje s monoklonální protilátkou značenou latexem za vyuţití pevné fáze sendvičové reakce. V Laboratoři klinické mikrobiologie byla souprava pouţívána v rutinní praxi.

Souprava firmy Meridian ImmunoCard® Toxin A a B je rychlým, kvalitativním, enzymatickým imunologickým testem určeným k detekci toxinů A a B Clostridium difficile v lidské stolici.

22

2.2.1 Vyšetření toxinu A testem C.difficile toxin A test

2.2.1.1 Obsah soupravy testovací kartičky

pozitivní kontrola (Positive Control reagent) – připravena k pouţití roztok pro ředění vzorku (Sample diluent) – připraven k pouţití plastové tyčinky pro aplikaci

2.2.1.2 Ostatní materiál a pomůcky

vzorky lidské stolice filtrační systém Oxoid špejle

sterilní jednorázové Pasteurovy pipety jednorázové latexové rukavice

časovač, stopky

2.2.1.3 Pracovní postup

Před provedením testu jsme celou soupravu vytemperovali. Vzorek stolice jsme nejprve upravili filtrováním a poté detekovali samotný toxin.

Úprava vzorku stolice filtrováním

Do spodní části plastikového filtračního systému – nádobka s ryskou - jsme napipetovali 1 ml diluentu a přidali 100 µl tekutého vzorku stolice, v případě tuhé nebo polotuhé stolice vzorek o průměru 5 mm. Směs diluentu a stolice jsme důkladně promíchali tak, aby se vytvořila suspenze. Na spodní část plastikového filtračního systému jsme nasadili horní část - tělo filtračního systému s vlastním filtrem - tak, aby hladina vzorku byla přibliţně 2 mm od samotného filtru, a ponechali ustát 1 minutu.

23 Poté jsme tělo zamáčkli hlouběji aţ se hladina vzorku s diluentem dotýkala filtru. Otočením filtračního systému jsme docílili přefiltrování směsi.

Detekce toxinu

Připravili jsme si testovací destičku vytaţením z foliového obalu a to těsně před samotnou aplikací vzorku. Pomocí kapátkové části filtračního systému jsme aplikovali 6 kapek supernatantu do okénka pro vzorek testovací destičky. Inkubovali jsme 30 minut při 20-26 °C.

2.2.1.4 Interpretace výsledků

Pozitivní výsledek testu – modrá barva v reakčních políčkách TEST a KONTROLA.

Negativní výsledek testu – modrá barva se objeví jen v políčku KONTROLA. Reakční políčko TEST je bezbarvé. Negativní výsledek indikuje nepřítomnost toxinu A Clostridium difficile nebo jeho přítomnost pod detekční limit testu.

Neplatné výsledky testu – nedetekovatelné modré zbarvení v reakčním políčku KONTROLA. Při získání neplatných výsledků je nutné opakovat test s novými testovacími kartami a znovu naředěným vzorkem.

2.2.1.5 Specifické charakteristiky testu – dle výrobce

Citlivost testu je 90,4 %, specifita testu je 97.8 %.

Pokud vzorek není testován do 3 hodin po odběru, musí být skladován v lednici při teplotě 2-8 °C a testován během 3 dnů.

Vzorek a souprava musí být před provedením testu vytemperovány nejméně 30 minut.

24

2.2.2 Vyšetření toxinů A a B testem ImmunoCard® Toxin A a B

2.2.2.1 Obsah soupravy

imunoCard Toxiny A a B testovací karty, jednotlivě balené

roztok pro ředění vzorku v plastové lahvičce s kapátkem – připraveno k pouţití

pozitivní kontrola v plastové lahvičce s kapátkem – připraveno k pouţití promývací činidlo v plastové lahvičce s kapátkem – připraveno k pouţití substrát v plastové lahvičce s kapátkem – připraveno k pouţití

enzymový konjugát v plastové lahvičce s kapátkem – připraveno k pouţití plastové pipety s vyznačeným dávkováním 25 a 150 µl

2.2.2.2 Podrobný popis pouţitých reagencií

Testovací karty – membrána upevněná v plastovém rámu a uzavřená v sáčku s vysušovačem. Destička nese imobilizované monoklonální protilátky proti toxinu A a kozí polyklonální protilátky proti toxinu B v políčku TEST a toxin Clostridium difficile v políčku KONTROLA. Karty skladujeme při teplotě 2-8 °C.

Roztok pro ředění vzorku (Sample Diluent) – pufrovaný proteinový roztok obsahující thimerosal jako konzervační prostředek. Skladovat při teplotě 2-8 °C.

Pozitivní kontrola (Positive Control) – inaktivní nezpracovaný toxin Clostridium difficile v pufrovaném roztoku obsahující thimerosal jako konzervační prostředek. Skladovat při teplotě 2-8 °C.

Enzymový konjugát (Enzyme Conjugate) – směs kozích polyklonálních protilátek proti toxinům A a B konjugovaných peroxidázou křenu selského, suspendovaná v pufrovaném proteinovém roztoku obsahujícím thimerosal.

Skladovat při 2-8 °C.

25 Promývací činidlo (Wash Reagent) – pufrovaný roztok obsahující thimerosal jako konzervační prostředek. Skladovat při teplotě 2-8 °C.

Substrát (Substrate Reagent) – pufrovaný roztok obsahující tetrametyl-benzidin a peroxid. Skladovat v temnu při 2-8 °C.

2.2.2.3 Ostatní materiál a pomůcky

vzorky lidské stolice

jednorázové latexové rukavice vortex RX3 Velp Scintifica

časovač, stopky

plastové tyčinky pro aplikaci

malé, plastové zkumavky – pouţitý rozměr 10 x 75 mm

2.2.2.4 Pracovní postup

Před provedením testu jsme celou soupravu vytemperovali. Temperování můţe dle výrobce trvat aţ 60 minut. Důkladně jsme označili zkumavku pro kaţdý testovaný vzorek pacienta. Přidali jsme 200 µl roztoku pro ředění vzorku do kaţdé zkumavky pomocí kapátka s ryskou a kolmo 3 kapky enzymového konjugátu. Okamţitě jsme přidali vzorek stolice nebo kontrolní vzorek a to 25 µl tuhé/polotuhé stolice nebo kousek tuhé stolice v průměru asi 2 mm. Směs jsme důkladně vortexovali 10 vteřin.

Poznámka: nedostatečné mnoţství vzorku nebo nedostatečné rozmíchání můţe vést k falešně negativním výsledkům. Přílišné mnoţství vzorku zamezí jeho pohybu a test se poté musí opakovat.

Naředěný vzorek jsme nechali stát asi 5 minut při 20-26 °C. Pouţili jsme vţdy jednu testovací kartu pro kaţdý vzorek nebo kontrolu. Před provedením testu jsme připravili testovací destičku, kterou jsme označili číslem pacienta.

26 Opět jsme kaţdý vzorek či kontrolu vortexovali, a to 10 vteřin. Přidali jsme 150 µl naředěného vzorku, případně kontroly, do obou políček pro vzorky v testovací kartě. Inkubace 5 minut při 20-26 °C.

Poznámka: Ke konci inkubace se musí obě reakční políčka jevit vlhká.

Pokud tomu tak není, pouţijeme jinou testovací kartu a postup opakujeme.

Po inkubaci jsme nadávkovali přesně 3 kapky promývacího činidla do kaţdého reakčního políčka. Kdyţ se promývací činidlo úplně absorbovalo, nadávkovali jsme přesně 3 kapky substrátu. Inkubace 5 minut při 20-26 °C, odečtení výsledků testu.

2.2.2.5 Interpretace výsledků

Pozitivní výsledek testu – modrá barva v reakčních políčkách TEST a KONTROLA. Intenzita modré barvy v políčku TEST můţe být nerovnoměrná.

Pozitivní výsledek indikuje, ţe ve vzorku je přítomen toxin A a/nebo toxin B.

Negativní výsledek testu – modrá barva se objeví jen v políčku KONTROLA. Reakční políčko TEST je bezbarvé. Negativní výsledek indikuje nepřítomnost toxinů Clostridium difficile nebo jejich přítomnost pod detekční limit testu.

Neplatné výsledky testu – nedetekovatelné modré zbarvení v reakčním políčku KONTROLA. Pozor, vzorky s extrémně vysokými hladinami toxinů mohou vykázat pozitivní TEST ale negativní KONTROLU. Při získání neplatných výsledků je nutné opakovat test s novými testovacími kartami a znovu naředěným vzorkem.

2.2.2.6 Specifické charakteristiky testu – dle výrobce

Souprava nesmí být pouţita po uplynutí doby expirace. Nedodrţování pracovních postupů můţe vést k falešně pozitivním nebo naopak falešně negativním výsledkům.

27 Vzorky měly být testovány co nejdříve po odběru, mohou být skladovány maximálně 4 dny při 2-8 °C. Pokud není moţné vzorky do této doby zpracovat, je nutné je mrazit a skladovat při -20 °C, nejlépe při -70 °C.

Analytická citlivost – dolní limit detekce tímto testem je asi 3 ng toxinu A a 3 ng toxinu B na 1 ml stolice. Neliší se, ať se jedná o tuhé nebo tekuté/polotuhé stolice.

Reprodukovatelnost – byla stanovena pomocí známých negativních (n=2) a pozitivních (n=6), které byly zakódovány a náhodně vybírány. Dva z pozitivních vzorků se blíţila detekčnímu limitu testu. Tři akreditované laboratoře testovaly vzorky tři po sobě následující dny. Vzorky vykázaly očekávané výsledky ve 100 %.

Analytická specifičnost – vzorky stolice naočkované následujícími mikrobiálními agens nereagují s Immunocard Toxiny A a B: Adenovirus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacteroides fragilis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Clostridium butyricum nontoxigenic Clostridium difficile (10 kmenů), Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii kmen 9714, Clostridium sporogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Peptostreptococcus anaerobius, Porhyromonas asaccharolytica, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Rotavirus, Salmonela typhimurium, Serratia liquefaciens, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica.

28

2.3 PŘÍPRAVA VZORKU STOLICE KE KULTIVAČNÍMU VYŠETŘENÍ

Pro lepší záchyt při kultivaci bakterií Clostridium difficile je nejprve nutné odstranit ze vzorku stolice co moţná nejvíce běţné střevní flóry a umoţnit tak lepší nárůst patogenních klostridií. Pro tuto přípravu vzorku jsme vyzkoušeli metody tepelných a alkoholových šoků.

2.3.1 Metoda tepelných šoků

Princip metody tepelných šoků spočívá ve vystavení vzorku stolice, který jsme naředili do tekutého bujonu, zvýšené teplotě. Teplota musí být dostatečně vysoká, aby došlo k usmrcení doprovodné střevní flóry, ale zároveň šetrná ke klostridiím. Metoda vystavení roztoku vzorku plameni kahanu byla shledána jako nevyhovující, neboť rychlý teplotní šok usmrtil prakticky všechny bakterie, tedy i klostridia, a další kultivační vyšetření byla falešně negativní. Pro tento experiment jsme zvolili doporučované teploty 70 °C, 80 °C a 85 °C.

2.3.1.1 Materiál a pomůcky

vzorky lidské stolice

kultura referenčního kmene Clostridium difficile kultura bakterií běţné střevní flóry

VL bujon

plastové inokulační kličky - pouţitý objem 10 µl a 1 µl jednorázové latexové rukavice

časovač, stopky

malé, plastové zkumavky – poţitý rozměr 10 x 75 mm vodní lázeň PBX 18 Jouan

vortex RX3 Velp Scintifica

29 2.3.1.2 Pracovní postup

Vzorek stolice a vzorek referenčního kmene Clostridium difficile smíchaný s kulturou bakterií tvořící běţnou střevní flórou jsme inokulovali do 3 ml převařeného VL bujonu. Pro vzorek stolice jsme pouţili 10 µl plastovou kličku, pro směsný referenční vzorek bakterií 1 µl plastovou kličku. Směs jsme homogenizovali pouţitím vortexu. Poţadované teploty jsme dosáhli pouţitím vodní lázně. Všechny vzorky jsme v lázni inkubovali 20 minut. Po vychladnutí byl vzorek připraven k vlastní kultivaci.

2.3.2 Metoda alkoholových šoků

Princip metody alkoholových šoků vyuţívá 96 % etanol jako selektivní přídavek, který usmrtí bakterie běţné střevní flóry a umoţní takto růst kmene Clostridium difficile.

2.3.2.1 Materiál a pomůcky

vzorky lidské stolice

kultura referenčního kmene Clostridium difficile kultura bakterií běţné střevní flóry

roztok 96% etanolu

plastové inokulační kličky - pouţitý objem 1 µl a 2 µl jednorázové latexové rukavice

časovač, stopky

malé, plastové zkumavky – poţitý rozměr 10 x 75 mm vortex RX3 Velp Scintifica

kalibrované, sterilní, Pasteurovy pipety

30 2.3.2.2 Pracovní postup

Vzorek stolice jsme naředili v poměru 1:1 s roztokem etanolu, tedy 0,5 g vzorku stolice a 0,5 ml roztoku etanolu, pro vzorek referenčního kmene Clostridium difficile smíchaný s kulturou bakterií tvořící běţnou střevní flórou jsme pouţili 1µl kličku kultury a 0,5 ml etanolu. Směs jsme inkubovali 60 minut při laboratorní teplotě, poté byl vzorek připraven k vlastní kultivaci.

2.4 VLASTNÍ KULTIVAČNÍ VYŠETŘENÍ

V další fázi experimentu jsme se zabývali testováním kultivačních půd.

Zvolili jsme Schaedler agar připravený v naší varně půd, dále Schaedler agar komerčně dodaný firmou BioMerieux a selektivní půdy pro Clostridium difficile firem Oxoid a Trios.

Růst referenčního kmene Clostridium difficile byl obecně na všech půdách dobrý, v typických povláčkových koloniích a to jiţ za 24 hodin, proto jsme tento kmen inokulovali jako kontrolu růstu ke kaţdému testovanému vzorku.

2.4.1 Materiál a pomůcky

plastové inokulační kličky - pouţitý objem 2 µl jednorázové latexové rukavice

kultura referenčního kmene Clostridium difficile Schaedler agar připravený v laboratoři

Schaedler agar firmy BioMerieux

Selektivní půda pro Clostridium difficile dle Braziera firmy Oxoid Agar pro kultivaci Clostridium difficile firmy Trios

anaerostat Concept 400 Trigon Plus

31

2.4.2 Pracovní postup

Vzorky jsme upravili metodou alkoholových šoků. Inokulovali jsme kličkou připravený vzorek na povrch jednotlivých kultivačních půd a rozočkovali.

Plotny jsme inkubovali 24-72 hodin při 37 °C v anaerobní atmosféře.

32

2.5 VLASTNÍ STUDIE

Vlastní studie průkazu toxinů a kultivační vyšetření souboru vzorků stolice proběhla v období červenec roku 2007 aţ září roku 2008, samotné vyšetřování vzorků stolice pak v období listopad roku 2007 aţ červenec roku 2008.

Odběry vzorků stolice byly z převáţné většiny provedeny na odděleních Fakultní nemocnice v Olomouci. Vzorky byly shromaţďovány na Ústavu mikrobiologie, sídlícím v areálu nemocnice, a skladovány za standardních podmínek. Odtud byly 3x týdně svozovou sluţbou transportovány do Laboratoře klinické mikrobiologie ve Šternberku, kde proběhla vlastní laboratorní vyšetření.

2.5.1 Popis a schéma experimentu

Experimentální část se obecně zabývá průkazem toxinů a kultivací bakterií Clostridium difficile ze vzorků stolice. Provedli jsme stanovení toxinů A a B ve vzorcích stolice a kultivační vyšetření na selektivních půdách. Při pozitivním nárůstu se kultura hodnotila mikroskopicky a následně se kmen biochemicky dourčil.

2.5.2 Schéma experimentu

 vyšetření na přítomnost toxinů → záznam výsledku testu

 kultivační vyšetření (provedeno u všech vzorků bez ohledu na výsledek testu na přítomnost toxinů)

 při negativní kultivaci → proveden záznam, výsledek ukončen

33

 při pozitivní kultivaci → provedena mikroskopie a následné dourčení biochemickým testem → při jednoznačném výsledku proveden záznam, v opačném případě se biochemický test opakoval. Mikroskopii i odečet biochemických testů provedl vysokoškolský pracovník.

2.5.3 Vyšetření na přítomnost toxinů A a B

K vyšetření jsme pouţili soupravu Meridian ImmunoCard® Toxin A a B.

Test se vyuţívá jako jeden ze základních vyšetřovacích technik pro určení a stanovení diagnózy onemocnění způsobených Clostridium difficile.

Z předchozích pokusů jsme zjistili, ţe test je pro naše účely vhodný.

2.5.4 Kultivační vyšetření stolice

Ke kultivaci jsme dle výsledků předchozích pokusů pouţili selektivní půdu pro Clostridium difficile dle Braziera firmy Oxoid.

Clostridium difficile vyrůstá na povrchu půdy v typických šedobílých, matných, plochých koloniích o průměru přibliţně 1,5-3 mm, kulovitých, ale někdy mohou být oválně protaţené ve směru růstu. Při inkubaci delší neţ 48 hodin mohou být kolonie světleji šedé nebo s bílým centrem. V ultrafialovém světle narostlé kolonie ţlutozeleně fluoreskují.

Obrázek 1 Kolonie Clostridium difficile narostlé na selektivní půdě www.msnbc.msn.com/id/24407803/wid/17621070

34 2.5.4.1 Kontrola kvality půd – dle výrobce

Pozitivní kontrola – při kaţdé nové šarţi kontrola růstu s referenčním kmenem Clostridium difficile NCTC11204.

Negativní kontrola – při kaţdé nové šarţi kontrola negativního růstu s referenčním kmenem Escherichia coli ATCC 11775.

(web OXOID)

Tabulka 1 Clostridium difficile selektivní médium dle Braziera, modifikace pro evropské státy.

Sloţení g/l

Pepton 23.0

Chlorid sodný 5.0

Rozpustný škrob 1.0

Agar 12.0

Hydrogenuhličitan sodný 0.4

Glukóza 1.0

Pyruvát sodný 1.0

Cystein 0.5

Hemin 0.01

Vitamín K 0.001

L-arginin 1.0

Rozpustný pyrofosfát 0.25

Sodná sůl 0.5

Cholic acid 1.0

p-hydroxyfenylacetylová kyselina 1.0

D-cykloserin 0.250

Cefoxitin 0.008

Emulze vaječného ţloutku 40.0 ml

Koňské sérum 10.0 ml

Výsledné pH půdy: 7.0 +/- 0.2 při 25°C

35

2.5.5 Mikroskopické vyšetření

Při pozitivním nárůstu na selektivní kultivační půdě jsme provedli mikroskopické vyšetření kultury obarvené metodou dle Grama.

2.5.5.1 Materiál a pomůcky

čistá kultura bakterie na kultivační půdě podloţní sklíčko

popisovač

plastové inokulační kličky - pouţitý objem 2 µl fyziologický roztok

filtrační nádobka

barvící roztoky: krystalová violeť – připravena v laboratoři Lugolův roztok – připraven v laboratoři aceton-alkohol – připraven v laboratoři fuchsin – připraven v laboratoři

destilovaná voda barvící miska

jednorázové latexové rukavice pinzeta

buničina

časovač, stopky plynový kahan

mikroskop optický BX40 Olympus imerzní olej

36 2.5.5.2 Pracovní postup

Čisté podloţní sklíčko jsme označili číslem kultury tak, abychom zamezili záměně pacienta. Na podloţní sklíčko jsme kápli kapku sterilního fyziologického roztoku a k této kapce přidali inokulační kličkou 2–3 kolonie kultury . Směs jsme promíchali, rozetřeli do 2/3 sklíčka a ponechali zaschnout. Fixovali teplem, opakovaným protaţením sklíčka v plameni kahanu.

Fixovaný mikroskopický preparát jsme převrstvili roztokem krystalové violeti ve vysoké vrstvě. Violeť jsme před pouţitím dobře promíchali a vrstvili přes filtrační nálevku, abychom zabránili vzniku krystalů. Violeť jsme nechali působit 30-40 sekund. Přidali jsme Lugolův roztok a nechali působit 20 sekund.

Poté jsme směs pomocí pinzety nechali ze sklíčka odtéct a následně odbarvili roztokem aceton-alkoholu dokud odtékalo barvivo ne však déle neţ 20 sekund.

Opláchli jsme vodou a dobarvili zředěným fuchsinem po dobu 60 sekund. Opět opláchnutí vodou a v šikmé poloze jsme nechali preparát zaschnout.

Poznámka: barvení dle Grama je moţno modifikovat. Některé postupy barvení oplachují roztok violeti vodou a aţ poté přidávají Lugolův roztok, jiné mírně upravují časy barvení v závislosti na pouţitých barvících roztocích.

Obarvený preparát jsme prohlíţeli v mikroskopu imerzním systémem.

2.5.5.3 Interpretace výsledků

Clostridium difficile se barví metodou dle Grama grampozitivně, tedy modře. V zorném poli vidíme modré tyčky se sporami, které jsou uloţeny subterminálně, později terminálně.

Obrázek 2 Clostridium difficile barvené metodou dle Grama (1000x) www.bioinfo.bact.wisc.edu/themicrobialworld/cpercdiff.html

37

2.5.6 Biochemická identifikace kultury

Po pozitivním mikroskopickém nálezu bylo nutné kulturu biochemicky dourčit. V této studii jsme pouţili komerční test firmy Lachema.

2.5.6.1 ANAEROtest 23 (LACHEMA)

Souprava ANAEROtest 23 umoţňuje provést identifikaci kmenů, pomocí 23 biochemických testů. Testy jsou umístěny v jamkách mikrotitrační destičky, vţdy tři řady po osmi jamkách obsahují testy pro identifikaci jednoho kmene.

2.5.6.1.1 Obsah soupravy

10 mikrotitračních destiček (kaţdá pro identifikaci 4 kmenů) se sušidlem 10 PE sáčků pro inkubaci

sáček na uloţení nespotřebované destičky, 1 ks 40 formulářů pro záznam výsledků

rámeček destičky s potištěným víčkem, sterilní

2.5.6.1.2 Ostatní materiál a pomůcky

suspenzní médium pro ANAEROtest 23 činidlo pro test INDOL

činidlo pro test NITRÁTY sterilní parafinový olej

kultivačním média pro kontrolu čistoty suspenze přístroj DensiMat M006230 Biomerieux

automatická mikropipeta 0,15 ml, sterilní špičky anaerostat Concept 400 Trigon Plus

jednorázové latexové rukavice vortex RX3 Velp Scintifica inokulační kličky

38 2.5.6.1.3 Pracovní postup

Připravili jsme si prázdný rámeček s víčkem, otevřeli aluminiový sáček odstřihnutím těsně vedle sváru a vyjmuli destičku. Pomocí skalpelu jsme oddělili příslušný počet řad (stripů) destičky, odpovídající počtu testovaných kmenů a řady umístily do připraveného prázdného rámečku. Z čisté kultury jsme připravili v suspenzním médiu pro ANAEROtest 23 suspenzi, kterou jsme dobře homogenizovali. Zákal suspenze musí odpovídat 3. stupni McFarlandovy zákalové stupnice. Slabší nebo hustší suspenze můţe vést k falešným reakcím.

Pro homogenizaci suspenze jsme pouţili vortex. Pro ověření čistoty inokula jsme provedli kříţový roztěr na kultivační půdu. Čistotu kultury posuzujeme před odečítáním výsledků testů.

Inokulovali jsme 0,15 ml suspenze do všech jamek v příslušných třech řadách destičky. Test IND (jamka H v první řadě – test INDOL) jsme zakapali 2 kapkami parafinového oleje (parafinový olej zabraňuje těkání indolu v případě pozitivní reakce).

Rámeček destičky s naočkovanými řadami jsme vloţili do inkubačního PE sáčku. Test jsme inkubovali v anaerobní atmosféře po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C.

2.5.6.1.4 Specifické charakteristiky testu – dle výrobce

Zbytek nepouţité destičky se sušidlem se vloţí do přiloţeného sáčku na uloţení nezuţitkované destičky a uloţí do chladničky pro další pouţití. Dbáme na to, aby destička byla chráněna před vlhkostí. Po prvém pouţití spotřebovat do 4 týdnů. Test nesmí být pouţit po uplynutí doby expirace.

Při inokulaci dbáme na to, aby nedošlo ke kontaminaci sousedních jamek. V případě přípravy inokula a inokulace ANAEROtestu 23 na vzduchu je třeba pracovat co nejrychleji, aby byla maximálně zkrácena doba, po kterou je kultura vystavena působení vzdušného kyslíku.

39 2.5.6.1.5 Vyhodnocení testu

Po 48 hodinách inkubace vysokoškolský pracovník zhodnotil biochemické reakce. Před odečtem jsme na destičce ANAEROtestu 23 zakapali činidly jamky:

1. řada, jamka H (test indol) – 2 kapky činidla pro IND 2. řada, jamka H (test nitráty) – 1 kapka činidla pro NIT.

Při identifikaci jsme posuzovali kulturu komplexně, s přihlédnutím k morfologickým znakům, informacím o zdroji izolace a výsledkům doplňkových testů.

Tabulka 2 Identifikace biochemických reakcí v destičce v řádku č.1

řádek 1 test zkratka pozitivní

reakce

negativní reakce

H

červená růţová

Naţloutlá

G

hnědofialová

F

hnědofialová

E

hnědofialová

D

hnědofialová

C

hnědofialová

B

A

červená

Ţlutá,světle oranţová

40 Tabulka 3 Identifikace biochemických reakcí v destičce v řádku č.2

řádek 2 test zkratka pozitivní reakce

negativní reakce

H

červená

Bezbarvá, narůţovělá

G

F

hnědofialová

E

D

hnědofialová

C

B

glukosamidáza

NAG Ţlutá bezbarvá

A

Tabulka 4 Identifikace biochemických reakcí v destičce v řádku č.3 řádek 3 test zkratka pozitivní

reakce

negativní reakce

H

hnědá, tmavě šedá

Bezbarvá, světle hnědá, světle šedá

G

hnědofialová

F

E

D

hnědofialová

C

B

A

41 2.5.6.1.6 Výsledky biochemických reakcí kmene Clostridium difficile

Tabulka 5 Výsledky biochemických reakcí v řádku č. 1

H IND

G GLU

F MLT

E FRU

D GAL

C LAC

B MLZ

A URE

- + - + - - (+) -

Tabulka 6 Výsledky biochemických reakcí v řádku č.2

H NIT

G SUC

F SAL

E TRE

D MAN

C RHA

B NAG

A bGL

- - (+) - + - (-) -

Tabulka 7 Výsledky biochemických reakcí v řádku č. 3

H ESL

G MNS

F RAF

E CEL

D XYL

C ARA

B SOR

A CON

+ d - - - - - +

Vysvětlivky:

+

(+)

d

-

(-)

42 2.5.6.1.7 Kontrola kvality testů – dle výrobce

Test se provádí s následujícími kmeny: Lactobacillus rhamnosus CCM 1828, Clostridium sordellii CCM 4611, Propionibacterium acnes CCM 3343.

V této studii jsme pouţili kmen Clostridium sordellii.

(web LACHEMA)

3 VÝSLEDKY

Ve studii bylo vyšetřeno 106 vzorků stolice (41 ţen a 65 muţů). Jedná se o dospělé pacienty, kteří klinickými příznaky odpovídají klostridiové infekci.

Tabulka 8 Výsledky studie jednotlivých testů u ţen

Průkaz

toxinů Kultivační

vyšetření Počet pacientek

Procento (%)

negativní negativní 31 75,61

pozitivní negativní 3 7,32

negativní pozitivní 6 14,63

pozitivní pozitivní 1 2,44

Tabulka 9 Výsledky studie jednotlivých testů u muţů

Průkaz toxinů

Kultivační vyšetření

Počet

pacientů Procento (%)

negativní negativní 61 93,84

pozitivní negativní 1 1,54

negativní pozitivní 3 4,62

pozitivní pozitivní 0 0

43 Graf 1 Výsledky vyšetření přítomnosti toxinů a kultivační vyšetření pro ţeny.

Graf 2 Výsledky vyšetření přítomnosti toxinů a kultivační vyšetření pro muţe.

75,61%

7,32%

14,63%

2,44%

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

80,00%

toxin negativní, kultivace negativní

toxin pozitivní, kultivace negativní

toxin negativní, kultivace pozitivní

toxin pozitivní, kultivace pozitivní

Výsledky vyšetření - ŽENY

93,84%

1,54% 4,62%

0%

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

80,00%

90,00%

100,00%

toxin negativní, kultivace negativní

toxin pozitivní, kultivace negativní

toxin negativní, kultivace pozitivní

toxin pozitivní, kultivace pozitivní

Výsledky vyšetření - MUŽI

44

4 DISKUZE

Studie vykazuje pozitivitu toxinů a pozitivní kultivační vyšetření pouze v jediném případě. Vysoké procento negativních výsledků můţe být, dle mého názoru, výsledkem řady faktorů. Můţe se jednat o chybně stanovenou diagnózu ošetřujícím lékařem. Nemalým faktorem můţe být i preanalytická fáze, tedy doba od samotného odběru vzorku, přes jeho uchování před a také během transportu, aţ po doručení do laboratoře. Zdravotnický personál by měl být seznámen se zásadami správného odběru, ve správný čas a do správné odběrové soupravy. Preanalytická fáze vzorku je důleţitou fází laboratorní diagnostiky, kterou ovšem sama laboratoř těţko ovlivňuje. Kaţdé nedodrţení správného postupu sniţuje správnost vyšetření a zvyšuje falešně negativní výsledky, na coţ nakonec doplácí samotný pacient.

Ve výsledcích studie na případné pochybení v preanalytické fázi poukazují pozitivní vyšetření na toxiny a současná negativní kultivace. Naopak pozitivní kultivační vyšetření a negativní toxiny poukazují na přítomnost netoxických kmenů Clostridium difficile.

Samotná analytická fáze se opět opírá o dodrţování správných laboratorních postupů z hlediska provedení vyšetření. Komerční soupravy i vzorek stolice musí být před pouţitím vytemperované, souprava nesmí být expirovaná či jinak poškozená a samotný test musí být proveden přesně dle návodu výrobce. Pro přesnou a správnou laboratorní diagnostiku je tedy nezbytností dodrţování všech zásad preanalytické i analytické fáze.

Studie ukázala nutnost podrobné analýzy a vyzkoušení jiného způsobu transportování vzorků, vývoj nových transportních médií, která by uchovala vzorek stolice v anaerobní atmosféře po dobu transportu vzorku do laboratoří a zvýšila tak výtěţnost vyšetření.

Vzhledem k stále vyššímu výskytu hypervirulentních kmenů Clostridium difficile by bylo vhodné, zavést kultivační vyšetření jako součást rutinních vyšetření mikrobiologických laboratoří. Vypěstovaná kultura slouţí nejenom ke stanovení citlivosti na antibiotika, ale také jako zdroj DNA pro stanovení ribotypu 027 metodou PCR.