MASARYKOVA UNIVERZITA P ř írodov ě decká fakulta
Ústav experimentální biologie
Odd ě lení genetiky a molekulární biologie
Úloha rodiny TGF-ß v patologické plasticit ě epiteliálních bun ě k
Brno 2011 Kristýna Adamcová
2 Poděkování
Na tomto místě chci poděkovat svému školiteli Mgr. Karlovi Součkovi, PhD. za profesionální přístup ve vedení mé bakalářské práce a cenné připomínky. Dále Mgr. Evě Slabákové za trpělivost a osvětlení dané problematiky.
3 OBSAH
1 Úvod ... 4
2 Historie objevení TGF- ß ... 5
3 Členové rodiny TGF- ß ... 5
4 Struktura podrodiny TGF-ß ... 7
5 Funkce TGF-ß ... 7
5.1 Vliv na apoptózu ... 7
5.2 Vliv na buněčný cyklus a proliferaci ... 8
5.3 Vliv na extracelulární matrix a adhezi ... 9
5.4 Vliv na diferenciaci ... 9
6 Signálová transdukce... 10
6.1 Receptory TGF- ß ... 10
6.2 Efektorové molekuly Smad ... 10
6.3 Buněčná signalizace ... 11
6.3.1 Signalizace závislá na přítomnosti molekul Smad ... 11
6.3.2 Signalizace nezávislá na přítomnosti molekul Smad ... 13
7 Patologická plasticita epiteliálních buněk ... 14
7.1 EMT ... 15
7.1.1 EMT v raném vývoji ... 15
7.1.2 EMT v nádorové progresi ... 17
7.2 Fibróza ... 20
8 Úloha TGF- ß v EMT ... 21
8.1 Těsné spoje ... 21
8.2 Adhezní spoje ... 22
8.3 Desmozomy ... 22
8.4 Přilnavost k basální lamině ... 23
8.5 Úloha rodiny Smad v EMT ... 24
9 Možnosti genové regulace a farmakologické modulace EMT ... 27
10 Závěr ... 29
SEZNAM ZKRATEK ... 30
SEZNAM LITERATURY ... 31
4 1 ÚVOD
Epitel je evolučně nejstarším typem tkáně, který pokrývá vnější a vnitřní povrchy organismů. Je tvořen buňkami, které jsou k sobě těsně přilehlé a nemají mezi sebou téměř žádnou mezibuněčnou hmotu. Při různých fyziologických a patofyziologických procesech může dojít ke změně tvaru a vlastností epiteliálních buněk. Jedním z těchto procesů je epiteliální- mezenchymální přechod (EMT). Během něho epiteliální buňky vlivem různých faktorů mohou změnit svůj epiteliální fenotyp na mezenchymální. Například takto změněné nádorové buňky jsou schopné migrovat do vzdálených tkání a dát za vznik nádorům a metastázím. Tento proces je do určité míry regulovaný multifunkčním cytokinem z rodiny transformujících růstových faktorů ß (TGF-ß). TGF-ß může svými účinky potlačovat, nebo naopak podporovat vznik nádorů a metastází.
Cílem mé práce je shrnout dostupné poznatky o úloze tohoto cytokinu v patologické plasticitě epiteliálních buněk a pokusit se osvětlit mechanismy jejichž prostřednictvím k tomuto procesu dochází. Pochopení těchto mechanismů může přispět k vývoji efektivnější terapie invazivních nádorových onemocnění, které jsou i v dnešní době velmi těžce léčitelná.
5 2 HISTORIE OBJEVENÍ TGF- ß
V roce 1978 byla popsána aktivita růstových faktorů, které jsou produkovány fibroblasty, které byly transfekovány MSV virem (Delarco and Todaro, 1978). Tyto faktory se váží k receptorům epidermálního růstového faktoru - Epidermal growth factor (EGF), ale liší se od dalších faktorů EGF schopností transformovat normální fibroblasty na agarovém médiu v rychle rostoucí buněčné kolonie. Odtud pochází pozdější název TGF-ß - transforming growth factor ß.
Purifikovány a charakterizovány byly tyto faktory o 3 roky později dvěmi vědeckými skupinami, laboratoří Harolda Mosese (Moses et al., 1981) a laboratoři Michael Sporna (Roberts et al., 1981).
V současnosti jsou TGF-ß faktory popsány ve více než 30 000 publikacích (Derynck, 2008).
3 ČLENOVÉ RODINY TGF- ß
TGF-ß rodina pojímá přes 40 strukturně podobných polypeptidových růstových faktorů, které významně participují při regulaci celé škály buněčných procesů (Massague and Gomis, 2006). Mezi ně patří buněčná proliferace, diferenciace, adheze, migrace a apoptóza. Jejich úloha je důležitá při embryonálním vývoji a udržování homeostázy. Tato rodina cytokinů je také spojována s rozvojem nádorového onemocnění.
Rodinu TGF-ß můžeme rozdělit do několika podrodin. Jedná se o TGF-ß podrodinu do níž řadíme cytokiny TGF-ß 1,2, a 3, dále podrodina aktivinů a inhibinů, podrodina kostních morfogenetických proteinů - Bone morphogenetic proteins (BMP), podrodina růstových diferenciačních faktorů - Growth differentiation factors (GDF) a Müllerův inhibiční hormon (AMH/MIS), (Shi and Massague, 2003). V této kapitole se zaměřím na podrodinu TGF-ß a její hlavní biologické funkce.
6
Obr. 1: Fylogenetický strom členů TGF-ß rodiny u lidí (h), myší (m), rodu Xenopus (X) a Drosofily (D), (Thompson et al., 1994).
7 4 STRUKTURA PODRODINY TGF-ß
TGF-ß je sekretovaný protein, který existuje ve třech isoformách, TGF-ß1, TGF-ß2 a TGF-ß3 (Derynck et al., 1988). Tyto peptidy jsou si navzájem strukturně velmi podobné.
Všechny jsou kódovány jako velké proteinové prekurzory. TGF-ß1 obsahuje 390 aminokyselin, TGF-ß2 a TGF-ß3 obsahují každý 412 aminokyselin. Každý z nich má N-terminální signální konec o délce 20-30 aminokyselin, který je nezbytný pro buněčnou sekreci a C-terminální oblast dlouhou 112-114 aminokyselin. TGF-ß má 9 cysteinových zbytků, které jsou zachovány v rámci rodiny (Khalil, 1999). Osm cysteinových zbytků tvoří disulfidické můstky uvnitř molekuly a vytváří cysteinový uzel, který je charakteristický pro všechny členy rodiny TGF-ß . Díky tomuto uzlu jsou hydrofobní řetězce aminokyselin orientovány do vodného prostředí, čímž brání molekule zaujmout její globulární konformaci a následkem toho může molekula tvořit stálé dimery (Sun and Davies, 1995). Dimerní struktura proteinu mu umožňuje interagovat s dvěma páry receptorů, o kterých se zmíním později.
5 FUNKCE TGF-ß
Vzhledem k velikosti TGF-ß rodiny bude následující kapitola zaměřena na podrodinu TGF-ß a její vliv na apoptózu, buněčný cyklus a proliferaci, extracelulární matrix, adhezi a diferenciaci.
5.1 Vliv na apoptózu
Buňky mohou zaniknout dvěma způsoby. Jeden z nich je nekróza, kdy buňka neřízeně umírá z příčin jako je např. mechanický stres, virová infekce atp. Druhým způsobem je programovaná buněčná smrt zvaná apoptóza, kdy buňka řízeně odstraní sebe samu v důsledku
„smrtících signálů“. TGF-ß cytokin indukuje apoptózu v řadě buněčných typů (Sanchez-Capelo, 2005). Může ji však také potlačovat, v závislosti na buněčném typu, stádiu diferenciace a přítomnosti či nepřítomnosti ostatních faktorů.
8
Mechanismy odpovědné za antiapoptické a proapoptické účinky jsou velmi rozmanité.
V mnoha případech ochranné účinky TGF-ß vedou díky vzájemnému spolupůsobení s proaptotickými účinky k tumorové nekróze (Derynck, 2008).
5.2 Vliv na buněčný cyklus a proliferaci
TGF-ß také hraje zásadní roli v buněčném cyklu (Blobe et al., 2000). Děje se tak prostřednictvím programu cytostatických genových odpovědí. Zastavení buněčného cyklu, jako odpověď na TGF-ß, nastává v restrikčním bodě v pozdní fázi G1. Zde dochází k syntéze proteinů p15 a p21. Zároveň TGF-ß potlačuje expresi c-myc, který se podílí na vývoji buněčného cyklu.
TGF-ß může aktivovat cytostatické genové odpovědi v jakémkoliv stádiu buněčného cyklu avšak opět záleží na buněčném typu. V jiných buněčných typech mohou být účinky zcela protichůdné.
Důležitá role TGF-ß spočívá v inhibici nebo stimulaci buněčné proliferace. Přestože inhibice proliferace byla pozorována u více buněčných druhů, jako jsou endoteliální, epiteliální, hematopoetické a gliální buňky (Siegel and Massague, 2003), nejvíce prozkoumaný mechanismus známe u buněk epiteliálních a u keratinocytů.
Základní mechanismus inhibice proliferace závisí na aktivitě efektorové molekuly Smad3 (Liu et al., 1997; Kretschmer et al., 2003). Obecně platí, že tato reakce je výsledkem indukce exprese CDK inhibitorů p15 a p21 a represe exprese transkripčních faktorů c-Myc, Id1, Id2 a Id3 (Siegel and Massague, 2003). Další mechanismy řídící růstovou inhibici závisejí na transkripční regulaci (Petritsch et al., 2000).
Antiproliferativní účinky TGF-ß u epiteliálních buněk často zastiňují schopnost TGF-ß podporovat proliferaci u jiných buněčných typů. Ukázalo se, že TGF-ß stimuluje proliferaci u chondrocytů, osteoblastů, fibroblastů a při speciálních podmínkách i u buněk epiteliálních (Moses et al., 1990; Lebrin et al., 2004). Nicméně mechanismy odpovědné za indukci proliferace, jsou méně prozkoumané, než ty, které vedou k její inhibici. Předpokládá se, že stimulace proliferace probíhá nezávisle na aktivitě Smad3 a Smad2 (Wilkes et al., 2003).
9 5.3 Vliv na extracelulární matrix a adhezi
Extracelulární matrix (ECM) je komplexní síť proteinů, které obklopují buňky ve tkáních.
TGF-ß reguluje složení ECM a adhezívní spojení mezi buňkami. Díky tomu hraje TGF-ß významnou roli v migraci a invazi buněk, při hojení zranění a fibróze (Derynck, 2008). TGF-ß ovlivňuje složení ECM prostřednictvím druhově specifické regulace exprese proteinů.
V závislosti na různém druhu buněk, indukuje TGF-ß expresi fibronektinu, kolagenu (Ignotz and Massague, 1986) a dalších proteinů ECM, např. osteonektin (Noda and Rodan, 1987). Na druhou stranu TGF-ß indukuje i expresi proteinů, které degradují proteiny ECM. Jedním z nich je např.
kolagenáza 3 (Ravanti et al., 1999).
TGF-ß má také vliv na buněčnou adhezi a interakci buněk s ECM (Kim et al., 2000). Je to způsobeno nejen zvýšenou expresí ECM proteinů a inhibicí ECM degradace, ale také regulací adhezních receptorů, které řídí interakci mezi buňkami s proteiny tvořících ECM.
5.4 Vliv na diferenciaci
Poslední neméně důležitou úlohu zastává TGF-ß v regulaci diferenciace. Exprese diferenciačních znaků je pomocí TGF-ß regulována v mezenchymálních, epiteliálních, endoteliálních, nervových a imunitních buňkách (Derynck, 2008). Děje se tak prostřednictvím mechanismů, kterých se účastní členové z rodiny Smad a Runx/AML (Shi and Stavnezer, 1998).
TGF-ß také řídí diferenciaci buněk svalových vláken, v tomto případě je proces závislý na interakci mezi Smad3 a nukleárním represorem SRF (Nishimura et al., 2006). V jiných buněčných typech inhibuje TGF-ß diferenciaci tím, že blokuje schopnost některých klíčových transkripčních faktorů usměrňovat expresi genů (Choy and Derynck, 2003).
10 6 SIGNÁLOVÁ TRANSDUKCE
K indukci genové exprese využívá TGF-ß dobře prozkoumanou signální kaskádu, která přenáší signál z membrány do jádra. V této kapitole se zaměřím na receptory typické pro rodinu TGF-ß, její efektorové molekuly a průběh buněčné signalizace.
6.1 Receptory TGF- ß
Ligand z rodiny TGF-ß iniciuje přenos signálu vazbou na charakteristické transmembránové receptory z rodiny serin/threonin kináz, známé také jako receptor typu I a II (TßRI a TßRII), (Yamashita et al., 1994). TßRI a TßRII jsou podobné transmembránové glykoproteiny obsahující glykosylovanou extracelulární doménu, krátkou transmembránovou doménu a intracelulární serin/threonin kinázovou doménu(Lin and Moustakas, 1994). TßRI obsahuje navíc GS-doménu (bohatou na glycinové a serinové zbytky), která je důležitá pro následnou aktivaci receptoru a přenos signálu.
Kromě receptorů TßRI a TßRII je v membráně zanořen i TßRIII. Tento receptor tvoří ß-glykan nebo endoglin (Lopezcasillas et al., 1991). Navíc nemá kinázovou doménu, tudíž se neúčastní přímo přenosu signálu, ale významně se na něm podílí. Jeho úkol spočívá v zachycení molekuly TGF-ß a umožnění jejího navázání na receptor (Massague and Gomis, 2006). Samotná signalizace se zahájí vazbou ligandu na TßRII , který následně interaguje s TßRI a vytvoří se heterodimerický komplex (Qin et al., 2002).
6.2 Efektorové molekuly Smad
Rodina Smad proteinů byla identifikována, během genetických studií modelů bezobratlých (Drosophila a Caenorhabtidis elegans), jako komponenta dopravující signály ze serin/threonin receptorů do jádra (Raftery et al., 1995; Sekelsky et al., 1995). Savčí genom čítá 8 členů rodiny Smad, které můžeme rozřadit do 3 kategorií: R-Smad, co-Smad a I-Smad (Padgett et al., 1998; Raftery and Sutherland, 1999). Do R-Smad (The receptor-regulated Smads) se řadí členy Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 a Smad8/9 (Wu et al., 2001).
11
Co-Smad (The common-mediator Smad) má pouze jednoho člena Smad4, který interaguje s R-Smad molekulami a tvoří s nimi komplexy. Tyto komplexy pak přenáší signál do jádra (Shi et al., 1997). I-Smad (The antagonistic or inhibitory Smads) zahrnuje molekuly Smad6 a Smad7, které blokují aktivaci R-Smad a co-Smad molekul (Itoh et al., 2001).
6.3 Buněčná signalizace
TGF-ß využívá různé druhy signalizací v buňce. Tyto druhy se rozlišují podle toho, zda-li jsou nebo nejsou závislé na efektorových molekulách Smad
6.3.1 Signalizace závislá na přítomnosti molekul Smad
Jak už bylo zmíněno dříve, celá signalizace začíná vazbou ligandu TGF-ß na TßRII, který následně katalyzuje fosforylaci TßRI. Takto aktivovaný TßRI poté fosforyluje molekuly R-Smad, které se díky tomu mohou vázat s molekulami Co-Smad. R-Smad/Co-Smad komplexy se akumulují v jádře, kde působí jako transkripční faktory a účastní se regulace cílené exprese genu (Shi and Massague, 2003).
Molekuly I-Smad negativně ovlivňují přenos signálů do jádra, tím že interagují s TßRI a podporují jeho ubikvitinaci a degradaci (Massague et al., 2005). Takto deaktivovaný receptor nemůže dále fosforylovat molekuly R-Smad.
Pro opětovnou možnost využití signální dráhy, je třeba vrátit molekuly receptorových komplexů do výchozího nestimulovaného stavu. Proto u každého aktivačního mechanismu existuje mechanismus inaktivační. V našem případě jsou proteiny aktivovány nebo inaktivovány fosforylací. Aktivaci má na starost proteinkináza TßRI, která cílovému proteinu přidává fosforylovanou skupinu a o inaktivaci se postará protein fosfatáza ze SCP rodiny, která štěpí fosfát vzniklý v předchozí reakci a odstraňuje fosforylovanou skupinu z proteinu (Massague and Gomis, 2006).
12
Obr. 2: Signalizace závislá na přítomnosti molekul Smad. Transkripční faktory R-Smad vyžadují fosforylovaný komplex TßRI/TßRII k tvorbě transkripčně regulačních komplexů s faktory Co-Smad. Faktory R-Smad se mohou přesunout do jádra samostatně, ale aby byly přístupny membránovým receptorům, jsou v cytoplasmě svázány s proteiny jako je SARA (Smad kotva pro aktivaci receptoru). Ligandem aktivovaný TßRII fosforyluje domény GS TßRI.
Aktivovaný TßRI katalyzuje fosforylaci faktorů R-Smad. Fosforylace snižuje jejich afinitu pro SARA a zvyšuje afinitu k faktorům Co-Smad. Výsledný komplex se volně pohybuje do jádra a spojuje se s příslušnými koaktivátory nebo korepresory. Faktory Smad se mohou navázat na DNA, ale efektivní vazba na konkrétní gen vzniká za pomocí specifických DNA- vazebných kofaktorů. Faktory R-Smad, které se přesunují do jádra, se mohou vrátit do cytoplasmy.
Nicméně jejich ubikvitinace a degradace v jádře způsobuje ukončení signálové transdukce TGF-ß (Lo and Massague, 1999) - upraveno.
13
6.3.2 Signalizace nezávislá na přítomnosti molekul Smad
Kromě výše popsané signalizační kaskády je možný přenos signálu přes alternativní cesty nevyžadující přítomnost molekul z rodiny Smad. Tyto dráhy jsou stejně jako u signalizace závislé na přítomnosti molekul Smad buněčně specifické a patří mezi ně mimo jiné přenos zprostředkovaný MAP kinázami (mitogenem aktivované proteinkinázy) nebo Rho-like GTPázami (Derynck and Zhang, 2003).
TGF-ß může taktéž modulovat buněčnou odpověď ve spolupráci s jinými signálními molekulami (Yoo et al., 2008). Tato interakce probíhá jak na úrovni cytosolu, tak na úrovni jádra při tvorbě transkripčně aktivních komplexů. Může být buď součinná nebo protichůdná, proto i indukovaná odpověď má různé účinky v závislosti na buněčném typu. Může mít pozitivní nebo negativní vliv na již výše zmíněné procesy, jako je například proliferace a apoptóza (Massague and Gomis, 2006).
Obr. 3: Signalizace nezávislá na přítomnosti molekul Smad. Aktivovaný receptorový komplex aktivuje kromě Smad molekul i další signální dráhy: MAPK, PP2A, RhoA, TAK1/ MEKK1 (Derynck and Zhang, 2003) – upraveno
14
7 PATOLOGICKÁ PLASTICITA EPITELIÁLNÍCH BUNĚK
Epiteliální-mezenchymální přechod (EMT) pochází z anglického překladu Epithelial-mesenchymal transition. EMT byla poprvé pozorována v roce 1982 dvojicí vědců Greenburgem a Hayem, kteří rozrušili kontakty mezi epiteliálními buňkami jejich suspendováním v kolagenových gelech (Greenburg and Hay, 1982). Na základě jejich pozorování byla EMT charakterizována jako dynamický proces změny epiteliálních buněk na mezenchymální, prostřednictvím speciálního transkripčního programu. Ve stejném desetiletí se zjistilo, že EMT přispívá k rozvoji nádorového onemocnění (Thiery et al., 1988). Později byl popsán také opačný proces k EMT, zvaný mezenchymálně-epiteliální přechod (MET), (Hugo et al., 2007). Uplatnění EMT v nádorové problematice umožňuje patologům lépe vysvětlit dobře známé a v různých nádorech běžně pozorované mikroskopické nálezy, jako je současný výskyt epiteliální a mezenchymální nádorové složky (Guarino, 2007)
V průběhu EMT dochází k důležitým změnám ve fenotypu buněk, které spočívají v uvolnění mezibuněčných spojů, ztrátě buněčné polarity a v reorganizaci cytoskeletu (Guarino, 2007; Iwata et al., 2009). Spoje mezi buňkami a ECM zeslábnou a změněné buňky nabývají protáhlého tvaru. Významně též vzrůstá buněčná motilita. Buňky mezenchymálního typu rovněž přispívají k syntéze složek ECM a k tvorbě matrixových metaloproteináz a jsou rovněž bohatým zdrojem signálních proteinů, které působí na epiteliální buňky jako růstové faktory.
EMT je vysoce buněčně specifická a je indukována faktory, které mohou mít odlišné projevy v různých tkáních. Má důležitou roli v mnoha fyziologických a patologických procesech jako je embryogeneze, hojení ran, orgánová fibróza či nádorová progrese (Tsukamoto et al., 2007). V nádorovém procesu tak aktivace EMT programu může vést ke vzniku buněk s vlastnostmi, které jsou podobné buňkám kmenovým ve smyslu indukce jejich sebeobnovy (Mani et al., 2008). Zároveň také takováto populace nádorových kmenových buněk získává nové vlastnosti umožňující jejich zvýšenou migraci a diseminaci.
15 7.1 EMT
7.1.1 EMT v raném vývoji
EMT hraje nepostradatelnou roli během embryogeneze (Moustakas and Heldin, 2007).
Dochází při ní k oddělení buněk neurální lišty od nervové trubice a tvorbě mesodermu. Buňky následně migrují do celého organismu a dávají vznik řadě specializovaných tkání a orgánů.
Většina buněk podstupujících EMT začíná s apikální konstrikcí, která zapříčiní snížení plochy povrchu (Keller et al., 2003). Dále se rozruší těsné spoje se sousedními buňkami a basální oblast buňky je tlačena do cytoplasmy. Díky tomu se změní jejich tvar a může vypuknout jejich migrace.
Buňky podstupující EMT, z primárního jednovrstevného epitelu během embryogeneze, podléhají přísné regulaci (Shook and Keller, 2003). Epitel drží embryonální strukturu pohromadě a je fyziologickou bariérou. Proto je EMT uspořádaná k minimálnímu narušení epiteliální struktury.
Buňky pronikají přes basální laminu buď samostatně, nebo v malém počtu. Mechanismus průchodu většího počtu buněk zatím zůstává neobjasněn (Shook and Keller, 2003). Nicméně je zřejmé, že EMT je buněčně specifická. Aby EMT mohla úspěšně proběhnout, musí se v jednotlivých buňkách aktivovat korespondující signální dráhy. Není-li dráha aktivována v přesném čase a místě, tak buňky nejsou schopny EMT zdárně podstoupit (Ciruna and Rossant, 2001).
16
Obr. 4: Model mesodermálního přechodu pro epiblast. Ve fázi 1 jsou organely relokalizovány k apikální části buňky a objevuje se basální rozšíření. Ve fázi dvě dochází ke ztrátě cytoplasmatické polarity a nastává apikální oddělení buněk procházejících mesodermálním přechodem. Fáze 2 také zahrnuje lokální degradaci ECM
dostupné z (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6334/figure/A41132/?report=objectonly)-upraveno
17 7.1.2 EMT v nádorové progresi
V nádorech se uplatňuje EMT při invazi a metastazování, kdy se projeví základní vlastnosti transformovaných buněk mezenchymálního fenotypu, jako schopnost oddělovat se od okolních buněk, migrovat do hostitelské tkáně a prostupovat do cév (Huber et al., 2005).
Mechanismus tvorby metastáz můžeme rozčlenit do tří po sobě jdoucích kroků. První krok se nazývá lokální invaze, při němž se tumorové buňky oddělí od původního nádoru a migrují do sousední tkáně (Pantel and Brakenhoff, 2004). V druhém kroku dochází k intravazaci. Tj. Migrující buňky se dostávají skrz basální membránu do krevního oběhu, nebo lymfatických uzlin. Zde cirkulují do doby, než narazí na další orgán, který procesem extravazace osídlí. Tj. analogicky k druhému kroku, buňky projdou přes basální membránu z krevního oběhu do cílového orgánu. Před započetím invazivního procesu, mohou tedy tumorové buňky reaktivovat EMT program k iniciování prvních kroků lokální invaze (viz. Obr. 4) a následné invaze do cílových orgánů (Pantel et al., 2008).
Přestože z molekulárního hlediska není mechanismus EMT zcela vysvětlen, bylo již zjištěno několik signálních molekul a korespondujících signálních drah (Wnt, TGF-ß, Hedgehog, Notch a nukleární faktor-κB (NF-κB)), které jsou zásadní v zahájení EMT (Thiery and Sleeman, 2006; Guarino, 2007). Všechny tyto cesty se koncentrují a způsobují prostřednictvím transkripčních proteinů (Snail, Slug, Twist, ZEB apod.) snížení exprese E-kadherinu. Přičemž se zvýší hladiny matrix-degradujících proteáz a mezenchymálních markerů jako jsou vimentin a N-kadherin. Nedávno byl také popsán silný regulační účinek miRNA v EMT (Cano and Nieto, 2008). Tento efekt může také vést za pomoci transkripčních faktorů ZEB k represi E-kadherinu.
V procesu EMT je patrná souvislost molekulárních a morfologických změn, která byla detailněji studována zejména ve vřetenobuněčných dlaždicových karcinomech. Byla v nich prokázána snížená exprese E-kadherinu a ß-kateninu, eventuelně zvýšená exprese Snail-1 (Zidar et al., 2008; Iwata et al., 2009).
Důležitou roli v EMT rovněž hrají i faktory působící na nádorové stroma. Mezi ně patří růstové faktory s jejich receptory (tyrozinové nebo serin/threoninové receptory) a proteiny tvořící ECM (kolageny, integriny, matrix-degradující proteázy), (Guarino, 2007).
18
Rozpad bazální membrány zprostředkovaný matrix-degradujícími proteázami vede k přímému kontaktu mezi buňkami karcinomu a stromálním mikroprostředím. Exprese kolagenů stromálního typu, se kterými by epiteliální buňky nikdy za normálních podmínek nepřišly do styku, může taktéž iniciovat EMT (Guarino, 1995; Shintani et al., 2006).
K lepší orientaci můžeme zavést 3 funkční kritéria definující EMT fenotyp v lidských karcinomech (Klymkowsky and Savagner, 2009). Prvním kriteriem je stádium buněčné polarizace, druhé je stádium buněčné přilnavosti a třetím je stav exprese proteinů. Na základě těchto kritérií byly definovány následující 4 EMT fenotypy: Fenotypem 0 popisujeme tumorové buňky se zachovalou epiteliální strukturou a buněčnou polaritou. U fenotypu 1 většina buněk ztrácí svoji polaritu, ale ještě si ponechává mezibuněčné kontakty a expresi keratinu. Fenotyp 2 se vyznačuje ztrátou mezibuněčných kontaktů již u většiny tumorových buněk, ale i zde buňky pořád exprimují keratin a u posledního fenotypu 3 je exprese keratinu zcela potlačena a nahrazena expresí vimentinu.
Většina lidských karcinomů je histologicky heterogenní. Klymkowsky ve svých studiích naznačuje, že jen malé procento nádorových buněk projde úplnou EMT, která koresponduje s fenotypem typu 3 (Klymkowsky and Savagner, 2009). A právě tyto buňky jsou patrně zdrojem metastáz (Brabletz et al., 2005).
Jak jsem již zmínila v úvodu této kapitoly, EMT je často následována opačným procesem MET. MET byla pozorována v mnoha mezenchymálních tumorech ve formě ložiskové epiteliální diferenciace (Ludvikova et al., 2009). Předpokládá se, že je vyvolána derepresí promotoru genu pro E-kadherin, což vede k následné expresi E-kadherinu a k přechodu do epitelového fenotypu. MET se uplatňuje i v metastatických nádorových buňkách karcinomu, které tímto procesem nabývají opět vzhled primárního tumoru. Existuje tak značná buněčná plasticita, která umožňuje nádorovým buňkám podléhat EMT a následně MET v procesu mikrometastazování.
19
Obr. 5: Cyklus plasticity epiteliálních buněk. Diagram ukazuje cyklus událostí během nichž epiteliální buňky změní svůj fenotyp na mezenchymální. Rozdílná stádia EMT a opačného procesu MET jsou regulována efektory EMT a MET, které se ovlivňují navzájem. Markery charakteristické pro EMT a MET jsou vyznačeny v oranžových tabulkách. E-kadherin- epiteliální kadherin, ECM- extracelulární matrix, FGFR2- receptor typu II pro růstový faktor fibroblastů, FSP1- fibroblastový specifický protein 1, MFs- mikrofilamenty (Thiery and Sleeman, 2006) – upraveno
20 7.2 Fibróza
V této podkapitole bude povrchově probrána fibróza, aby se zmínilo patologické působení TGF-ß i na jiný typ buněk než jsou buňky epiteliální.
Fibróza je hlavním rysem většiny degenerativních onemocnění. Má za následek zjizvení, ztrátu architektury a funkce tkáně. Degenerace funkčních typů buněk a hromadění mezenchymálních buněk a ECM se vyvíjí v průběhu několika let (Derynck, 2008).
Fibróza bez ohledu na její rozmanitou etiologii a anatomickou polohu sdílí společné rysy, které zapříčiňují vznik chorobných změn v organismu. Patří mezi ně: nadměrná sekrece a aktivace profibrotických cytokinů, příliv buněk způsobujících zánět, ztráta diferencovaných epiteliálních buněk, expanze a aktivace fibroblastů a syntéza a organizace ECM (Friedman, 2003). Protože se tyto rysy vyskytují i v průběhu normálního hojení, bylo řečeno, že fibróza může být definována jako „ hojení bez konce“ nebo „ odvrácená strana tkáňové opravy“ (Border and Noble, 1994).
TGF-ß se výrazně podílí na patogenezi fibrózy. Kupříkladu jeho úloha v rozvoji plicní a pleurální fibrózy byla popsána podrobně v roce 2007 (Gauldie et al., 2007). TGF-ß stimuluje syntézu kolagenu v mezotelových buňkách, je přítomen v pleurální tekutině u fibrotizujících forem pleurálního poškození a při intrapleurálním podání vyvolává fibrózu. Podíl mezotelových buněk a jejich exprese TGF-ß v pleurální fibrogenezi byly dále zkoumány pomocí nového modelu, v němž je mezotel potkanů transfektován TGF-ß1 za použití adenovirového vektoru (Decologne et al., 2007). Bylo prokázáno, že nadměrná exprese TGF-ß1 v mezotelových buňkách vyvolává fibrózu v plicích. Autoři uvádějí, že by tyto nálezy mohly vysvětlovat patogenezi typu pleurální a periferní plicní fibrózy, která se vyskytuje u řady plicních onemocnění, například u fibrózy spojené s plicními infekcemi, léky a radiačním poškozením (Idell, 2008)
Na druhou stranu je TGF-ß velmi důležitý i při hojení zranění. Spolu se složkami mezibuněčné hmoty se podílí na chemotaxi a angiogenezi a ukončuje zánětlivou fázi, čímž umožňuje opravu tkáně a úpravnou fibrózu
(dostupné na: http://www.anamneza.cz/moduly/clanek.php3?id=10&sekce=1).
21 8 ÚLOHA TGF- ß V EMT
EMT je jeden z procesů, které přispívají k rozvoji nádorového onemocnění.
V tumorových buňkách dochází k řadě změn, které se týkají nejrůznějších funkcí.
Bylo prokázáno, že inhibitory TGF-ß (nebo receptorů pro TGF-ß) mohou redukovat metastatické a invazivní vlastnosti různých experimentálních nádorů tím, že brání aktivaci signálních drah indukujících EMT (Dumont and Arteaga, 2003; Ge et al., 2004; Subramanian et al., 2004). Z toho se dá usuzovat, že TGF-ß hraje velmi důležitou roli v EMT nejen při embryogenezi, ale i při rozvoji nádorového onemocnění. A to zejména ve spolupráci s jinými onkogenními dráhami, jako je Ras a Wnt (Derynck et al., 2001; Dumont and Arteaga, 2003;
Roberts and Wakefield, 2003).
Jak je zřejmé z předchozí kapitoly, projevem EMT je desintegrace a rozrušení buněčných spojů. Buněčné spoje podle struktury a lokalizace označujeme jako: těsné spoje, desmozomy, adhezní spoje a vodivé spoje. Tyto spoje řídí buněčnou celistvost, podporují bariérovou funkci a juxtakrinní (dotykovou) signalizaci buněk. V této podkapitole se zaměřím na vliv TGF-ß na zeslabení těchto spojů a s tím související procesy.
8.1 Těsné spoje
Těsné spoje jsou umístěny v apikální části buňky. Proteiny těsného spoje se napojují z každé strany na jednu z membrán, díky čemuž zamezují průchodu látek mezi membránami (Alberts et al., 1998). Molekulární úroveň těsných spojů je zprostředkovaná transmembránovými klaudiny, okludiny a lešeňovými proteiny jako je ZO1 (TJP1). Tyto proteiny jsou spojeny s intracelulárním aktinem, cytoskeletem a účastní se buněčné signalizace.
Během EMT se těsné spoje zeslabí a exprese jejích esenciálních proteinových složek je snížena. Mechanismy rozrušující těsné spoje jsou stimulovány cytokinem TGF-ß (Hurd et al., 2003).
22
Vazebný ligand TGF-ß umožňuje kinásovému receptoru TßRII spojeným s okludinem v těsných spojích fosforylovat Par6. Par6 je klíčová složka regulující shluk těsných spojů (Hurd et al., 2003). Jeho fosforylace je nezávislá na Smad proteinech a umožňuje mu se navázat na Smurf1, což vede k ubikvitinaci a degeneraci RhoA (Ozdamar et al., 2005).
RhoA je člen z rodiny GTPáz. Je zodpovědný za uskupení stresových vláken, řízení apiko-basální polarity a stabilitu spojení (Perez-Moreno et al., 2001). TGF-ß může upravit strukturu proteinových komplexů na buněčném povrchu přímo prostřednictvím svých receptorových komplexů nezávisle na nukleární genové regulaci.
8.2 Adhezní spoje
Adhezní spoje jsou tvořeny E-kadheriny. Tvoří přilehlý pás pod úrovni těsných spojů a díky jejich spojovací funkci drží buňky těsně pospolu (Alberts et al., 1998).
V rámci studií mechanismů desintegrace adhezních spojů byl potvrzen efekt členů rodiny transkripčních represorů Snail/Slug na EMT a s tím spojenou represi E-kadherinu(Carver et al., 2001).
Na úrovni proteinů je rozrušení adhézních spojů zprostředkováno proteolytickým procesem presenilinu-1 (PS-1/g-sekretáza), (Marambaud et al., 2002). V průběhu EMT vyvolané TGF-ß je v lidských keratynocytech rozrušení adhezních spojů blokováno inhibitorem PS-1 (Zavadil et al., 2004).
8.3 Desmozomy
Desmozomy jsou buněčné spoje, pro které je typický výskyt kadherinů a intermediárních filament (Alberts et al., 1998). Tato filamenta mohou mít různou chemickou strukturu, např.
keratinovou či desminovou (Getsios et al., 2004). Jsou napojeny na membrnánu z vnější strany, kde se vyskytují i další proteiny s ukotvující funkcí (plakoglobin, dezmoplakin). K udržení membrán spojených buněk pohromadě slouží kadheriny, které jsou přítomny v prostoru mezi nimi.
23
Rozrušení desmozomů na počátku EMT je regulováno Slug faktory, jež inhibují geny pro desmoplakin a desmoglein, čímž usnadňují vývoj EMT (Savagner et al., 1997).
8.4 Přilnavost k basální lamině
Aby se buňky odloučily od epitelu a mohly migrovat, je potřeba rozpustit i kontakty s basální laminou. Basální lamina je specializovaná struktura ECM složená z kolagenu IV. typu (laminin a nidogen), (Strutz et al., 1995; Li et al., 2003). Remodelace buněčných kontaktů s basální laminou zahrnují spolupráci proteolytických enzymů (např. melaoproteázy MMP2 a MMP9) s cytokiny jako je TGF-ß nebo FGF2.
Zvýšená syntéza a aktivace MMP2 a MMP9 je odpovědí na přítomnost TGF-ß a vede k degradaci složek kolagenu IV. typu (Zeisberg et al., 2001; Cheng and Lovett, 2003).
Je zajímavé, že inhibice exprese kolagenu IV. typu stačí k vyvolání EMT in vitro.
Současně s EMT indukuje TGF-ß expresi proteinu Dab2 (Prunier and Howe, 2005). Dab2 váže integrin ß1 a je potřebný pro jeho aktivaci. Blokováním Dab2 dochází k inhibici integrinové aktivace a přilnavosti. Výsledkem je apoptóza buněk podstupujících EMT a inhibice EMT.
Exprese specifických integrinů, v tomto případě αvβ6, je důsledkem EMT v modelech karcinomu tlustého střeva a umožňuje invazivním buňkám interagovat s intrasticiální matricí a udržovat aktivaci TGF-ß (Bates and Mercurio, 2005). Přítomnost integrinu αvβ6 v karcinomu tlustého střeva je jedním z markerů EMT a zároveň zapříčiňuje rychlejší vývoj tumorových buněk u pacientů s rakovinou.
24 8.5 Úloha rodiny Smad v EMT
V předcházejících kapitolách je zmíněno, že komplexy receptorů TßRI a TßRII vedou k fosforylaci molekul typu Smad2 a Smad3. Tyto molekuly tvoří komplex s molekulami Smad4 a translokují se do jádra, kde řídí transkripci cílových genů. V průběhu EMT je většina cílových genů TGF-ß je kontrolována skrz transkripční regulaci molekuly Smad3 (Yang et al., 2003).
Během experimentální studie EMT in vivo byl použit myší model, u kterého byl proveden genový knockout Smad3. Tato studie prokázala, že nedostatek proteinů Smad3 zmírňuje degeneraci epitelu (Saika et al., 2004b; Saika et al., 2004a). Z tohoto zároveň vyplývá, že v této situaci TGF-ß nedokáže vyvolat EMT a je neschopný indukovat její klíčové transkripční regulátory (Zavadil et al., 2004). Na druhou stranu, hepatocyty izolované z myší, u kterých byl proveden genový knockout Smad2, spontánně přecházely k mezenchymálnímu fenotypu a to i v nepřítomnosti ligandu TGF-ß. Toto pozorování naznačuje, že Smad2 je důležitý pro zachování epiteliálních vlastností, což je v rozporu s funkční úlohou Smad3 (Zavadil and Bottinger, 2005).
Podstatná úloha molekul typu Smad2 a Smad3 byla prokázaná i u patologické EMT (Oft et al., 2002). Jejich zvýšená exprese způsobuje progresi EMT v epiteliálních buňkách prsní tkáně (Valcourt et al., 2005). Redukce funkcí molekul Smad2 a Smad3 nebo zvýšení exprese mutantního receptoru TßRI bez schopnosti vázat komplex Smad2/3, ale se schopností aktivace na Smad nezávislé signální dráhy, byla sice spojena se zvýšenou progresí primárních tumorů, ale také se sníženým metastatickým potenciálem (Tian et al., 2003; Tian et al., 2004). Tyto studie poukazují na vliv molekul Smad2 a Smad3 na rozvoj nádorového onemocnění během procesu EMT. Přestože molekuly Smad mohou vyvolat prostřednictvím EMT indukované TGF-ß karcinogenezi, tak i další signální dráhy (na Smad nezávislé) přispívají ke vzniku patologické EMT.
25
Důkazy in vitro a in vivo poukazují na důležitou roli TGF-ß jako induktora EMT v nejméně 3 odlišných fyziologických procesech.
Za prvé, TGF-ß2 a TGF-ß3 izoformy zprostředkovávají specializované formy EMT v srdečním vývoji (Camenisch et al., 2002). Přestože toto pozorování naznačuje souvislost interakcí Wnt a TGF-ß signálních cest se specializovanými vývojovými EMT procesy, detaily těchto signálních mechanismů ještě nebyly zcela objasněny.
Za druhé, i když se zdá být velice pravděpodobné, že EMT odpovídá za epiteliální degeneraci a fibrogenezi, existují pouze omezené důkazy podporující tohle vznikající paradigma (Iwano et al., 2002). Není známo jak EMT přispívá k epiteliální degeneraci a fibrogenezi v reakci na epiteliální zranění. Na druhou stranu, in vitro důkazy jasně prokazují, že TGF-ß může snadno vyvolat EMT v epiteliálních kulturách buněk z ledvin, jater a plic (Kalluri and Neilson, 2003). Navíc TGF-ß1 je typicky exprimován na místech epiteliální degenerace a při fibrogenezi in vivo. A inhibice TGF-ß1 nebo TGF-ß signalizace (viz. Smad3 knockout) typicky chrání tkáně a zabraňuje zjizvení (Zavadil et al., 2004). Proto koncept EMT indukované TGF-ß, který je základem chronických degenerativních onemocnění a fibrotických poruch, vyžaduje více experimentů na modelech in vivo před tím, než bude uznávaný jako fakt.
Za třetí, existují pádné důkazy, in vitro a in vivo, demonstrující, že buňky které prošly EMT mají motilní a proteolytické vlastnosti, které jsou nutné pro tumorovou invazivitu, která je předpokladem pro vznik metastáz (Derynck et al., 2001; Gotzmann et al., 2004)
V tomto kontextu je autokrinní aktivita TGF-ß nezbytná pro nepřetržitou signalizaci spolupracující s ostatními onkogenními signálními dráhami zejména s aktivovanou Ras signalizací (Derynck et al., 2001). Toto slouží k přetvoření v mezenchymální fenotyp a k začátku invazivity u tumorových buněk. Tento mechanismus by mohl vysvětlit proč několik studií zjistilo koleraci mezi expresí TGF-ß a invazivním potenciálem u lidských nádorů. Nové přístupy ve farmakologické inhibici funkcí TGF-ß a jeho receptorů, které by mohly eliminovat tyto onkogenní aktivity a být prevencí pro tumorovou progresi a tvorby metastáz, jsou důsledně zkoumány.
26
Obr. 6: Různorodé signální dráhy TGF-ß podporující transkripci během EMT. TGF-ß stimuluje epitelové buňky navázáním se na receptorový komplex TßRI a TßRII. Aktivovaný komplex fosforyluje a aktivuje Smad2/3. Jakmile je Smad2/3 aktivován naváže se na Smad4 a společně se translokují se do jádra, kde za pomoci dalších transkripčních faktorů (Snail, TWIST, ZEB1, Stat3) regulují genovou expresi EMT. Tento proces podporuje indukci EMT a za pomoci metylace DNA snižuje expresi E-kadherinu, HNF-4α a ER-α.- levý panel. Na pravém panelu jsou vidět nekanonické signální dráhy TGF-ß (MAPk , GTPázy, PI3K/AKT, NF-κB), které také za pomoci dalších transkripčních faktorů indukují EMT. Propojení kanonických a nekanonických signálních drah TGF-ß vede k různé genové expresi, která přispívá ke změně normálních epiteliálních buněk na jejich maligní protějšky (Wendt et al., 2009)- upraveno
27
9 MOŽNOSTI GENOVÉ REGULACE A FARMAKOLOGICKÉ MODULACE EMT
Invaze a tvorba metastází jsou nejvíce smrtící vlastností všech lidských nádorů. TGF-ß je silný nádorový supresor karcinogeneze díky svým schopnostem potlačovat proliferaci. Během rozvoje nádorového onemocnění TGF-ß často přejde z potlačování proliferace k její stimulaci, což naopak vede k zesílení invazivity a tvorby metastáz (Wakefield et al., 2001; Benson, 2004)
Nicméně to, jak TGF-ß potlačuje či podporuje karcinogenezi, zůstává otevřenou otázkou.
Její zodpovězení by dalo vědě a medicíně schopnost se efektivně zaměřit na TGF-ß signální systém při léčbě lidských malignit (Schiemann, 2007). Rozluštění tohoto paradoxu zůstává nejdůležitější otázkou týkající se biologických a patologických akcí tohoto multifunkčního cytokinu.
V dnešní době existuje mnoho léků, které se zaměřují na signální dráhy TGF-ß (Akhurst, 2006). Některé z nich se již ukázaly býti efektivními v potlačování tumorové invaze a tvorby metastáz (Uhl et al., 2004). Mezi cíle terapie patří schopnost detekovat supresivní a podpůrný vliv TGF-ß na EMT. Toho by mohlo být dosaženo v kombinaci s terapiemi, které inhibují dráhy součinné se signalizací TGF-ß indukující EMT. Částečných výsledků již bylo dosaženo s konvenčními léčivy, které selektivně blokují EMT a zároveň potlačují aktivitu TGF-ß.
Např. chemoterapeutikum Doxorubicinin aktivuje signální transdukci TGF-ß v lidských buňkách karcinomu prsu (Bandyopadhyay et al., 2010). Doxorubicinin, který je používán jako léčivo proti metastázujícímu karcinomu prsu, je sám o sobě pro organismus toxický a imunosupresivní. Proto v kombinaci s léčbou TGF-ß by mohlo být možné snížit dávky Doxorubicininu a s tím spojené nežádoucí toxické účinky a zároveň podpořit jeho terapeutickou účinnost v léčbě metastázujícího karcinomu prsu.
Dalším příkladem farmakologické modulace by mohla být blokáda signální dráhy TGF-ß účinky SD-208 (Mohammad et al., 2010). Díky působení SD-208 bylo zabráněno rozvoji metastáz melanomu kostí u myších modelů.
28
Nad očekávání dobré výsledky se mohou také vyskytnout při inhibici EMT v rámci terapií, které se zaměřují na adenoviry v průběhu rakoviny (Galanis et al., 2005). Adenovirový receptor, stejně jako E-kadherin, je endogenní molekula buněčného povrchu, která způsobuje interakce mezi buňkami a její exprese je také snížena během EMT (Lacher et al., 2006).
Nedávné studie ukázaly, že molekulární inhibitory receptorů TGF-ß zvyšují expresi adenovirových receptorů CAR, což má za následek zvýšení rizika infekce adenoviry v lidských karcinomech in vitro.
Buňky podstupující EMT jsou často resistentní k léčivům (Christiansen and Rajasekaran, 2006; DiMeo et al., 2009; Tsuji et al., 2009). Existuje souvislost EMT s přeměnou raných nádorů na invazivní (Thiery, 2002). Resistentní buňky podstupující EMT často ovlivňují i vznik resistence u nádorových buněk k léčivům konvečních terapií zahrnujících taxol, vinkristin, oxaliplatin winthrop, nebo i terapie zacílené na receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR), (Fuchs et al., 2008; Sabbah et al., 2008).
Data získaná z experimentů in vivo u lidí a zvířat prokazují, že nádorové kmenové buňky (CSCs) a buňky podstupující EMT (EMT buňky) si vytvářejí resistenci a vedou ke vzniku metastáz v rakovině slinivky (Sarkar et al., 2009). Regulace několika signálních drah včetně mHedgehog, Notch, Wnt, PDGF, TGF-β, Akt, NF-κB, a regulace miRNA, podporuje vývoj CSCs a EMT buněk, které si jsou z molekulárního hlediska velmi podobné. Hlubší pochopení molekulárních vlastností CSCs a EMT buněk by mohlo pomoci léčebné strategii tak, aby cílové CSCs a EMT buňky byly citlivější k lékům, které budou potlačovat vývoj nádorů a tvorbu metastáz. Nicméně by bylo potřeba více in vivo experimentů k navržení efektivních terapeutických metod zacílených na CSCs a EMT buňky.
29 10 ZÁVĚR
Rakovina je velmi vážné onemocnění, které postihuje osoby všeho věku a pohlaví.
Pod pojmem rakovina si můžeme představit jakoukoliv nemoc při níž dochází k neřízené buněčné proliferaci. Za projev malignity se obecně považuje stav, kdy nádorové buňky začnou invadovat do vzdálených tkání a vytvářet sekundární nádory - metastáze. Detailní mechanismy řídící a ovlivňující tento proces nejsou doposud známé.
Z tohoto důvodu je tato problematika předmětem intenzivního studia. Řada studií prokázala, že EMT, která je základním fyziologickým procesem v embryogenezi, může přispívat k rozvoji nádorového onemocnění. Přestože její mechanismy nejsou zcela probádané, byl zjištěn vliv faktorů TGF-ß, které jsou schopné EMT vyvolat nebo potlačit.
TGF-ß je multifunkční cytokin, který je mezi odbornou veřejností známý již několik desítek let. Hlavním důvodem, proč by se měl tento faktor studovat, je jeho atraktivita pro klinické využití a možné vylepšení stávajících léčebných metod. Základem efektivní protinádorové léčby je znalost přesných mechanismů kontrolujících její rozvoj. Další výzkum tedy v současnosti směřuje k pochopení mechanismu, jakým způsobem TGF-ß ovlivňuje proces EMT, nebo jakým způsobem TGF-ß indukuje apoptózu tumorových buněk.
Osobně se domnívám, že léčba cílená na molekulu cytokinu TGF-ß a jeho signálovou transdukci může v budoucnu přinést efektivní výsledky v boji s rakovinou. Bude však nutné pokračovat v usilovném výzkumu na vhodných experimentálních modelech (zejména in vivo).
Pouze s detailní znalostí procesu vzniku a rozvoje nádorového onemocnění bude v budoucnu možné vyvinout opravdu účinnou léčbu.
30 SEZNAMZKRATEK
CAR (Coxsackievirus and adenovirus receptor) c-myc (myelocytomatosis viral oncogene)
CSCs nádorové kmenové buňky (cancer stem cells) ECM extracelulární matrix
EGF epidermální růstový faktor (epidermal growth factor)
EMT epiteliální-mezenchymální přechod (epitelial-mesenchymal transition) MAP kinázy mitogenem aktivované kinázy (mitogen activated protein kinase) MET mezenchymální-epiteliální přechod (mesenchymal-epitelial transition) MMP2 (matrix metalloproteinase-2)
MMP9 (matrix metalloproteinase-9)
MSV (Moloney sarcoma virus)
NF-κB nukleární faktor κB
PDGF růstový faktor z destiček (platelet-derived growth factor)
RhoA homologní gen rodiny Ras, člen A (Ras homolog gene family, member A) SARA (smad anchor for receptor activation)
SCP fosfatáza (small C-terminal domain phosphatase) SD-208 (TßRI kinase inhibitor)
SRF (serum response factor)
TGF-ß transformujíci růstový faktor ß (transforming growth factor ß) TßRI TGF-ß receptor typu I
TßRII TGF-ß receptor typu II
ZEB (zinc finger E-box)
ZO1/TJP1 (tight junction protein 1)
31 SEZNAMLITERATURY
Akhurst, R.J. (2006). Large- and small-molecule inhibitors of transforming growth factor-beta signaling.
Curr Opin Investig Drugs 7, 513-521.
Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, J., Roberts, K., and Walter, P. (1998). Základy buněčné biologie. (Ústí nad Labem: Espero publishing).
Bandyopadhyay, A., Wang, L., Agyin, J., Tang, Y., Lin, S., Yeh, I.T., De, K., and Sun, L.Z. (2010).
Doxorubicin in combination with a small TGFbeta inhibitor: a potential novel therapy for metastatic breast cancer in mouse models. PLoS One 5, e10365.
Bates, R.C., and Mercurio, A.M. (2005). The epithelial-mesenchymal transition (EMT) and colorectal cancer progression. Cancer Biol Ther 4, 365-370.
Benson, J.R. (2004). Role of transforming growth factor beta in breast carcinogenesis. Lancet Oncol 5, 229-239.
Blobe, G.C., Schiemann, W.P., and Lodish, H.F. (2000). Mechanisms of disease: Role of transforming growth factor beta in human disease. New England Journal of Medicine 342, 1350-1358.
Border, W.A., and Noble, N.A. (1994). Transforming Growth-Factor-Beta in Tissue Fibrosis. New England Journal of Medicine 331, 1286-1292.
Brabletz, T., Jung, A., Spaderna, S., Hlubek, F., and Kirchner, T. (2005). Opinion: migrating cancer stem cells - an integrated concept of malignant tumour progression. Nat Rev Cancer 5, 744-749.
Camenisch, T.D., Molin, D.G., Person, A., Runyan, R.B., Gittenberger-de Groot, A.C., McDonald, J.A., and Klewer, S.E. (2002). Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Dev Biol 248, 170-181.
Cano, A., and Nieto, M.A. (2008). Non-coding RNAs take centre stage in epithelial-to-mesenchymal transition. Trends Cell Biol 18, 357-359.
Carver, E.A., Jiang, R., Lan, Y., Oram, K.F., and Gridley, T. (2001). The mouse snail gene encodes a key regulator of the epithelial-mesenchymal transition. Mol Cell Biol 21, 8184-8188.
Ciruna, B., and Rossant, J. (2001). FGF signaling regulates mesoderm cell fate specification and morphogenetic movement at the primitive streak. Developmental Cell 1, 37-49.
Decologne, N., Kolb, M., Margetts, P.J., Menetrier, F., Artur, Y., Garrido, C., Gauldie, J., Camus, P., and Bonniaud, P. (2007). TGF-beta1 induces progressive pleural scarring and subpleural fibrosis. J Immunol 179, 6043-6051.
Delarco, J.E., and Todaro, G.J. (1978). Growth-Factors from Murine Sarcoma Virus-Transformed Cells.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75, 4001- 4005.
Derynck, R., and Zhang, Y.E. (2003). Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature 425, 577-584.
Derynck, R., Akhurst, R.J., and Balmain, A. (2001). TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression. Nat Genet 29, 117-129.
Derynck, R., Lindquist, P.B., Lee, A., Wen, D., Tamm, J., Graycar, J.L., Rhee, L., Mason, A.J., Miller, D.A., Coffey, R.J., Moses, H.L., and Chen, E.Y. (1988). A New Type of Transforming Growth Factor- Beta, Tgf-Beta-3. Embo Journal 7, 3737-3743.
Derynck, R., Miyazono,K. (2008). The TGF- beta family. (New York: John Inglis).
DiMeo, T.A., Anderson, K., Phadke, P., Fan, C., Perou, C.M., Naber, S., and Kuperwasser, C. (2009). A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial- mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Res 69, 5364-5373.
Dumont, N., and Arteaga, C.L. (2003). Targeting the TGF beta signaling network in human neoplasia.
Cancer Cell 3, 531-536.
Friedman, S.L. (2003). Liver fibrosis - from bench to bedside. J Hepatol 38, S38-S53.
32
Fuchs, B.C., Fujii, T., Dorfman, J.D., Goodwin, J.M., Zhu, A.X., Lanuti, M., and Tanabe, K.K. (2008).
Epithelial-to-mesenchymal transition and integrin-linked kinase mediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells. Cancer Res 68, 2391-2399.
Galanis, E., Okuno, S.H., Nascimento, A.G., Lewis, B.D., Lee, R.A., Oliveira, A.M., Sloan, J.A., Atherton, P., Edmonson, J.H., Erlichman, C., Randlev, B., Wang, Q., Freeman, S., and Rubin, J. (2005).
Phase I-II trial of ONYX-015 in combination with MAP chemotherapy in patients with advanced sarcomas. Gene Ther 12, 437-445.
Gauldie, J., Bonniaud, P., Sime, P., Ask, K., and Kolb, M. (2007). TGF-beta, Smad3 and the process of progressive fibrosis. Biochem Soc Trans 35, 661-664.
Ge, R., Rajeev, V., Subramanian, G., Reiss, K.A., Liu, D., Higgins, L., Joly, A., Dugar, S., Chakravarty, J., Henson, M., McEnroe, G., Schreiner, G., and Reiss, M. (2004). Selective inhibitors of type I receptor kinase block cellular transforming growth factor-beta signaling. Biochem Pharmacol 68, 41-50.
Getsios, S., Huen, A.C., and Green, K.J. (2004). Working out the strength and flexibility of desmosomes.
Nat Rev Mol Cell Biol 5, 271-281.
Gotzmann, J., Mikula, M., Eger, A., Schulte-Hermann, R., Foisner, R., Beug, H., and Mikulits, W. (2004).
Molecular aspects of epithelial cell plasticity: implications for local tumor invasion and metastasis. Mutat Res 566, 9-20.
Greenburg, G., and Hay, E.D. (1982). Epithelia Suspended in Collagen Gels Can Lose Polarity and Express Characteristics of Migrating Mesenchymal Cells. Journal of Cell Biology 95, 333-339.
Guarino, M. (1995). Epithelial-to-Mesenchymal Change of Differentiation - from Embryogenetic Mechanism to Pathological Patterns. Histology and Histopathology 10, 171-184.
Guarino, M. (2007). Epithelial-mesenchymal transition and tumour invasion. International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39, 2153-2160.
Huber, M.A., Kraut, N., and Beug, H. (2005). Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression. Curr Opin Cell Biol 17, 548-558.
Hugo, H., Ackland, M.L., Blick, T., Lawrence, M.G., Clements, J.A., Williams, E.D., and Thompson, E.W.
(2007). Epithelial--mesenchymal and mesenchymal--epithelial transitions in carcinoma progression. J Cell Physiol 213, 374-383.
Hurd, T.W., Gao, L., Roh, M.H., Macara, I.G., and Margolis, B. (2003). Direct interaction of two polarity complexes implicated in epithelial tight junction assembly. Nat Cell Biol 5, 137-142.
Cheng, S., and Lovett, D.H. (2003). Gelatinase A (MMP-2) is necessary and sufficient for renal tubular cell epithelial-mesenchymal transformation. Am J Pathol 162, 1937-1949.
Choy, L., and Derynck, R. (2003). Transforming growth factor-beta inhibits adipocyte differentiation by Smad3 interacting with CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) and repressing C/EBP transactivation function. Journal of Biological Chemistry 278, 9609-9619.
Christiansen, J.J., and Rajasekaran, A.K. (2006). Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis. Cancer Res 66, 8319-8326.
Idell, S. (2008). The pathogenesis of pleural space loculation and fibrosis. Curr Opin Pulm Med 14, 310- 315.
Ignotz, R.A., and Massague, J. (1986). Transforming Growth-Factor-Beta Stimulates the Expression of Fibronectin and Collagen and Their Incorporation into the Extracellular-Matrix. Journal of Biological Chemistry 261, 4337-4345.
Itoh, F., Asao, H., Sugamura, K., Heldin, C.H., ten Dijke, P., and Itoh, S. (2001). Promoting bone morphogenetic protein signaling through negative regulation of inhibitory Smads. Embo Journal 20, 4132-4142.
Iwano, M., Plieth, D., Danoff, T.M., Xue, C., Okada, H., and Neilson, E.G. (2002). Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis. J Clin Invest 110, 341-350.
Iwata, H., Aoyama, Y., Kamiya, H., Ichiki, Y., and Kitajima, Y. (2009). Spindle cell squamous cell carcinoma showing epithelial-mesenchymal transition. J Eur Acad Dermatol Venereol 23, 214- 215.
33
Kalluri, R., and Neilson, E.G. (2003). Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. J Clin Invest 112, 1776-1784.
Keller, R., Davidson, L.A., and Shook, D.R. (2003). How we are shaped: The biomechanics of gastrulation. Differentiation 71, 171-205.
Khalil, N. (1999). TGF-beta: from latent to active. Microbes and Infection 1, 1255-1263.
Kim, J.E., Kim, E.H., Han, E.H., Park, R.W., Park, I.H., Jun, S.H., Kim, J.C., Young, M.F., and Kim, I.S.
(2000). A TGF-beta-inducible cell adhesion molecule, betaig-h3, is downregulated in melorheostosis and involved in osteogenesis. J Cell Biochem 77, 169-178.
Klymkowsky, M.W., and Savagner, P. (2009). Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe. Am J Pathol 174, 1588-1593.
Kretschmer, A., Moepert, K., Dames, S., Sternberger, M., Kaufmann, J., and Klippel, A. (2003).
Differential regulation of TGF-beta signaling through Smad2, Smad3 and Smad4. Oncogene 22, 6748-6763.
Lacher, M.D., Tiirikainen, M.I., Saunier, E.F., Christian, C., Anders, M., Oft, M., Balmain, A., Akhurst, R.J., and Korn, W.M. (2006). Transforming growth factor-beta receptor inhibition enhances adenoviral infectability of carcinoma cells via up-regulation of Coxsackie and Adenovirus Receptor in conjunction with reversal of epithelial-mesenchymal transition. Cancer Res 66, 1648-1657.
Lebrin, F., Goumans, M.J., Jonker, L., Carvalho, R.L.C., Valdimarsdottir, G., Thorikay, M., Mummery, C., Arthur, H.M., and ten Dijke, P. (2004). Endoglin promotes endothelial cell proliferation and TGF- beta/ALK1 signal transduction. Embo Journal 23, 4018-4028.
Li, Y., Yang, J., Dai, C., Wu, C., and Liu, Y. (2003). Role for integrin-linked kinase in mediating tubular epithelial to mesenchymal transition and renal interstitial fibrogenesis. J Clin Invest 112, 503- 516.
Lin, H.Y., and Moustakas, A. (1994). Tgf-Beta Receptors - Structure and Function. Cellular and Molecular Biology 40, 337-349.
Liu, X.D., Sun, Y., Constantinescu, S.N., Karam, E., Weinberg, R.A., and Lodish, H.F. (1997).
Transforming growth factor beta-induced phosphorylation of Smad3 is required for growth inhibition and transcriptional induction in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 10669-10674.
Lo, R.S., and Massague, J. (1999). Ubiquitin-dependent degradation of TGF-beta-activated Smad2.
Nature Cell Biology 1, 472-478.
Lopezcasillas, F., Cheifetz, S., Doody, J., Andres, J.L., Lane, W.S., and Massague, J. (1991). Structure and Expression of the Membrane Proteoglycan Betaglycan, a Component of the Tgf-Beta Receptor System. Cell 67, 785-795.
Ludvikova, M., Pesta, M., Holubec, L., Jr., and Kalfert, D. (2009). [New aspects of tumor pathobiology].
Cesk Patol 45, 94-99.
Mani, S.A., Guo, W., Liao, M.J., Eaton, E.N., Ayyanan, A., Zhou, A.Y., Brooks, M., Reinhard, F., Zhang, C.C., Shipitsin, M., Campbell, L.L., Polyak, K., Brisken, C., Yang, J., and Weinberg, R.A. (2008).
The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell 133, 704-715.
Marambaud, P., Shioi, J., Serban, G., Georgakopoulos, A., Sarner, S., Nagy, V., Baki, L., Wen, P., Efthimiopoulos, S., Shao, Z., Wisniewski, T., and Robakis, N.K. (2002). A presenilin-1/gamma- secretase cleavage releases the E-cadherin intracellular domain and regulates disassembly of adherens junctions. Embo J 21, 1948-1956.
Massague, J., and Gomis, R.R. (2006). The logic of TGF beta signaling. Febs Letters 580, 2811-2820.
Massague, J., Seoane, J., and Wotton, D. (2005). Smad transcription factors. Genes & Development 19, 2783-2810.
Mohammad, K.S., Javelaud, D., Fournier, P.G., Niewolna, M., McKenna, C.R., Peng, X.H., Duong, V., Dunn, L.K., Mauviel, A., and Guise, T.A. (2010). TGF-beta-RI kinase inhibitor SD-208 reduces the development and progression of melanoma bone metastases. Cancer Res 71, 175-184.
34
Moses, H.L., Yang, E.Y., and Pietenpol, J.A. (1990). Tgf-Beta Stimulation and Inhibition of Cell- Proliferation - New Mechanistic Insights. Cell 63, 245-247.
Moses, H.L., Branum, E.L., Proper, J.A., and Robinson, R.A. (1981). Transforming Growth-Factor Production by Chemically Transformed-Cells. Cancer Research 41, 2842-2848.
Moustakas, A., and Heldin, C.H. (2007). Signaling networks guiding epithelial-mesenchymal transitions during embryogenesis and cancer progression. Cancer Science 98, 1512-1520.
Nishimura, G., Manabe, I., Tsushima, K., Fujiu, K., Oishi, Y., Imai, Y., Maemura, K., Miyagishi, M., Higashi, Y., Kondoh, H., and Nagai, R. (2006). delta EF1 mediates TGF-beta signaling in vascular smooth muscle cell differentiation. Developmental Cell 11, 93-104.
Noda, M., and Rodan, G.A. (1987). Type-Beta Transforming Growth-Factor (Tgf-Beta) Regulation of Alkaline-Phosphatase Expression and Other Phenotype-Related Messenger-Rnas in Osteoblastic Rat Osteosarcoma Cells. Journal of Cellular Physiology 133, 426-437.
Oft, M., Akhurst, R.J., and Balmain, A. (2002). Metastasis is driven by sequential elevation of H-ras and Smad2 levels. Nat Cell Biol 4, 487-494.
Ozdamar, B., Bose, R., Barrios-Rodiles, M., Wang, H.R., Zhang, Y., and Wrana, J.L. (2005). Regulation of the polarity protein Par6 by TGFbeta receptors controls epithelial cell plasticity. Science 307, 1603-1609.
Padgett, R.W., Das, P., and Krishna, S. (1998). TGF-beta signaling, Smads, and tumor suppressors.
Bioessays 20, 382-390.
Pantel, K., and Brakenhoff, R.H. (2004). Dissecting the metastatic cascade. Nat Rev Cancer 4, 448-456.
Pantel, K., Brakenhoff, R.H., and Brandt, B. (2008). Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nat Rev Cancer 8, 329-340.
Perez-Moreno, M.A., Locascio, A., Rodrigo, I., Dhondt, G., Portillo, F., Nieto, M.A., and Cano, A. (2001).
A new role for E12/E47 in the repression of E-cadherin expression and epithelial-mesenchymal transitions. J Biol Chem 276, 27424-27431.
Petritsch, C., Beug, H., Balmain, A., and Oft, M. (2000). TGF-beta inhibits p70 S6 kinase via protein phosphatase 2A to induce G(1) arrest. Genes Dev 14, 3093-3101.
Prunier, C., and Howe, P.H. (2005). Disabled-2 (Dab2) is required for transforming growth factor beta- induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). J Biol Chem 280, 17540-17548.
Qin, B.Y., Lam, S.S., Correia, J.J., and Lin, K. (2002). Smad3 allostery links TGF-beta receptor kinase activation to transcriptional control. Genes & Development 16, 1950-1963.
Raftery, L.A., and Sutherland, D.J. (1999). TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: From Mad to Smads. Developmental Biology 210, 251-268.
Raftery, L.A., Twombly, V., Wharton, K., and Gelbart, W.M. (1995). Genetic Screens to Identify Elements of the Decapentaplegic Signaling Pathway in Drosophila. Genetics 139, 241-254.
Ravanti, L., Hakkinen, L., Larjava, H., Saarialho-Kere, U., Foschi, M., Han, J.H., and Kahari, V.M. (1999).
Transforming growth factor-beta induces collagenase-3 expression by human gingival fibroblasts via p38 mitogen-activated protein kinase. Journal of Biological Chemistry 274, 37292-37300.
Roberts, A.B., and Wakefield, L.M. (2003). The two faces of transforming growth factor beta in carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8621-8623.
Roberts, A.B., Anzano, M.A., Lamb, L.C., Smith, J.M., and Sporn, M.B. (1981). New Class of Transforming Growth-Factors Potentiated by Epidermal Growth-Factor - Isolation from Non- Neoplastic Tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 78, 5339-5343.
Sabbah, M., Emami, S., Redeuilh, G., Julien, S., Prevost, G., Zimber, A., Ouelaa, R., Bracke, M., De Wever, O., and Gespach, C. (2008). Molecular signature and therapeutic perspective of the epithelial-to-mesenchymal transitions in epithelial cancers. Drug Resist Updat 11, 123-151.
Saika, S., Kono-Saika, S., Tanaka, T., Yamanaka, O., Ohnishi, Y., Sato, M., Muragaki, Y., Ooshima, A., Yoo, J., Flanders, K.C., and Roberts, A.B. (2004a). Smad3 is required for dedifferentiation of retinal pigment epithelium following retinal detachment in mice. Lab Invest 84, 1245-1258.
