Biologické chování
a vybrané molekulární charakteristiky epiteliálních buněk propagovaných in vitro
z normální a nádorové tkáně mléčné žlázy žen
Disertační práce
MUDr. Luboslava Krásná Ústav molekulární genetiky AV ČR Onkologická klinika VFN a l.LF UK Praha
Školitel: MUDr. Pavel Veselý, CSc.
Ústav molekulární genetiky AV ČR Praha 2006
Chtěla bych poděkovat svému školiteli a všem svým spolupracovníkům z Laboratoře buněčné biologie AV ČR a z Onkologické kliniky VFN za spolupráci. Zvláštní poděkování patří RNDr. Evě Matouškové, CSc., která svou biologickou intuicí stála u zrodu této práce, její průběh velmi pozorně sledovala a směrovala.
I. Obsah
I. Obsah 3 II. Seznam použitých zkratek 5
III. Úvod 7 IV. Literární přehled 9
1. Kultivace epiteliálních buněk z normální i nádorové tkáně mléčné žlázy žen 9
2. Zakládání buněčných linií 10 3. Identifikace epiteliálních buněk v in vitro kultuře 11
4. Identifikace maligních buněk v in vitro kultuře 11 5. Využití kultur к testování chemorezistence in vitro 13
V. Cíl práce 16 Dílčí cíle 16 VI. Materiál a použité experimentální metody 17
1. Kultivační roztoky 17 2. Biologický materiál 17 3. 3T3 feeder-layer kultivační metoda 18
4. Fázově-kontrastní mikroskopie, časosběrná mikroskopie, fluorescenční mikroskopie 19
5. Stanovení in vitro růstových vlastností kultur a buněk 20 5.1 Plating Efficiency Test (PET) - schopnost buněk tvořit kolonie 20
5.2 Korigovaný počet generací v pasáži a generační čas 20
6. Imunocytochemická barvení 21 6.1 Přímé fluorescenční značení aktinových vláken 21
6.2 Fluorescenční biotin-streptavidin-rhodamin systém detekce antigenů 21 6.3 Nefluorescenční biotin-streptavidin-peroxidázový systém detekce antigenů 22
7. Fluorescenční in situ hybridizace 22 8. Test tumorigenicity in vivo 23 9. Testování chemorezistence buněk in vitro 23
9.1 Klonální test chemorezistence in vitro 23 9.2 MTT test chemorezistence in vitro 25
VII. Výsledky 28 1. Klonální růst jednotlivých epiteliálních buněk z prsního karcinomu 28
2. Kultivace buněk z normální mléčné žlázy, dočasné převládnutí luminálních buněk 28
3. Kultivace buněk z benigních a maligních nádorů mléčné žlázy 29
3.1 Úspěšnost v zakládání kultur 29 3.2 Růstové vlastnosti kultur 30 3.3 Imunocytochemická identifikace luminálních buněk v kulturách 34
3.4 Morfologie buněk a charakter kolonií v primokulturách 35 3.5 Změna morfologie buněk a charakteru kultur při pasážování 39
3.6 Tumorigenicita kultur in vivo 42 4. Kultivace buněk z podkožních metastáz 43
5. Potvrzení přítomnosti maligních buněk v in vitro kulturách 44 5.1 Exprese pomocných markerů malignity v kulturách založených z benigních a maligních
tumorů (TC a Surg vzorky) 44 5.2 Exprese pomocných markerů malignity v kulturách z podkožních metastáz (Meta vzorky)
45
5.3 Chromozomální aberace detekované pomocí FISH 46
5.4 Exprese cyklinů regulujících přechod z G1 do S fáze buněčného cyklu 47
6. In vitro chemorezistence kultur 49 6.1 Klonální test chemorezistence 49 6.2 MTT test chemorezistence in vitro 53 6.2.1. Porovnání in vitro rezistence kultur ve vztahu к velikosti původního vzorku 53
6.2.2. Porovnání in vitro rezistence kultur ve vztahu к histopatologickému stupni malignity
původního nádoru 55 6.2.3. Výsledné křivky závislosti přežívající frakce buněk na koncentraci testované látky .... 57
6.2.4. In vitro efektivita testovaných látek 58
VIII. Diskuse 59 1. Efektivita kultivační metody 59
2. Princip kultivační metody 61 3. Morfologie kultivovaných buněk a charakter kultur 62
4. Známky malignity v kulturách založených z nádorové tkáně a metastáz 64
5. Test chemorezistence in vitro 66
IX. Závěr 67 X. Summary 70 XI. Použitá literatura 72
XII. Seznam vlastních publikací 80
PŘÍLOHY - 4 publikované práce
II. Seznam použitých zkratek
a-SMA ATP
ВО, Вв, EO, Ев, SO, SO
ВРЕ BSS
CCD kamera cDDP
CS Doxo EDTA EGF EMA ESA ER FCS
feeder-layer FISH
FNA 5-FU Gem grade I-III H-MEM HMFG-2
K5, K7, K8, K14, K18, K19
LOH Ipc
LWD optika Mafo
MCDB170 Meta MIDx MTT
NADPH-NT reduktáza NP40
PBS
a-smooth muscle actin adenosintrifosfát
křivky závislosti přežívání metabolicky aktivních buněk (SF) na koncentraci testované látky
bovinní pituitární extrakt balanced salt solution
charge-coupled device camera cis-platina
calf serum, bovinní sérum doxorubicin
kyselina ethylendiamintetraoctová epidermální růstový faktor
Epithelial Membrane Antigen , alternativní označení episialín, MUC1
Epithelial Specific Antigen, alternativní označení: EGP40, Ber EP4, EpCAM estrogen receptor
fetal calf serum, fetální bovinní sérum živný porost tvořený letálnč ozářenými 3T3 buňkami
fluorescenční in situ hybridizace fine needle aspiration
5-fluorouracil gemcitabin
histopatologický stupeň malignity nádorů Eaglovo minimální medium v Hanksově BSS human milk fat globule membrane antigen cytokeratiny
loss of heterozygosity large polygonal cells
long working distance optic
mafosfamid, in vitro aktivní metabolit ifosfamidu
bezsérové, chemicky plně definované kultivační médium
vzorky kožních metastáz metabolic inhibition dose 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-
diphenyltetrazolium bromid; thiazolová modř nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen - neotetrazolium reductase
nonidet P40, polyethylene glycol P-l,1,3,3- tetramethylbutylphenyl ether
phosphate-buffered saline
РЕ plating efficiency PET plating efficiency test PgR progesterone receptor ppc peak plasma concentration
Rhol23 rhodamine 123
SSC standard saline citrate buffer SDS sodium dodecyl sulfate
SF survival fraction, frakce metabolicky aktivních buněk
spc small polygonal cells
Surg surgical samples, vzorky nádorů získané z peroperačních biopsií
Tax paklitaxel TC true-cut biopsy samples, vzorky získané
perkutánní biopsií nádorů tenkou jehlou TDLU terminal ductal lobular unit
TGF p transforming growth factor TNF tumour necrosis factor
TRITC tetramethyl rhodamine isothiocyanate TRITON X-l 00 octylphenol ethylene
UMH MIDx unmeasurably high, neměřitelně vysoká hodnota MIDx
UML MIDx unmeasurably low, neměřitelně nízká hodnota MIDx
ÚZIS Ústav zdravotních informací a statistiky České republiky
Vbl vinblastin Vnrlb vinorelbin
Tato práce shrnuje vývoj a zavedení kultivačního systému pro pěstování epiteliálních buněk z normální a nádorové tkáně mléčné žlázy žen, charakterizaci buněčných populací a využití buněčných kultur pro testování chemorezistence individuálních nádorů. Většina zde uvedených výsledků byla publikována ve čtyřech přiložených publikacích - u dvou jsem první autorkou, u dvou spoluautorkou.
III. Úvod
Karcinom mléčné žlázy je nejčastějším nádorovým onemocněním žen. Jeho incidence i úmrtnost stoupá. V roce 2000 bylo v ČR diagnostikováno 92.4 nových případů karcinomů mléčné žlázy na 100 000 žen a na následky této nemoci zemřelo 36.8 ze 100 000 žen.
Nejvyšší výskyt nemoci přetrvává v nejvyšší sledované věkové skupině žen (317 onemocnění na 100 000 žen ve věku nad 85 let) s rostoucím podílem nižších klinických stadií. Trendem posledních let se však stává stoupající incidence karcinomu mléčné žlázy v mladších věkových skupinách. V roce 2000 bylo na 100 000 žen ve věku 25-29 let diagnostikováno 2.9 karcinomů mléčné žlázy. Až do této doby byl výskyt karcinomu mléčné žlázy v této věkové skupině ojedinělým jevem. Nádory mléčné žlázy u mladých žen mají přitom horší biologické vlastnosti a všeobecně horší prognózu (ÚZIS).
Mléčná žláza je unikátním žlázovým orgánem.
Funkční a morfologický vývoj mléčné žlázy je komplexním procesem, jehož nejdůležitější část se odehrává až v dospělosti ženy. V různých obdobích života prochází mléčná žláza různými stadii diferenciace. Mléčná žláza dospělé ženy je složena z větvících se duktů ukončených alveoly. Celá tato struktura je v neustálém kontaktu s okolní pojivovou a tukovou tkání. Alveoly a dukty všech velikostí jsou vystlány epitelem, který má v alveolách a malých duktech sekreční potenciál. Tento takzvaný luminální epitel je obklopen myoepiteliálními buňkami, jejichž schopnost kontrakce pomáhá vylučování mléka z mléčné žlázy po
Obr.].: Exprese cytokeratinů ve dobu laktace. Myoepiteliální buňky přiléhají к bazální
větvicích se strukturách mléčné , . , ,v . , .
membráně, proto jsou nazývaný tez bazalnim epitelem.
jtjc y; .- Lrmr^_ &ЯЁиштАИйЯк К. 19
K14
Intenzita značení
+++ н ш
++ ИИ .1 + r-r^i
Charakteristickým rysem epiteliálních buněk, odlišujícím je od jiných buněk, je exprese cytokeratinů, tj. intermediálních filament tvořících cytoskelet buněk a podílejících se na jejich morfologii a motilitě. Profil exprimovaných keratinů je charakteristický pro jednotlivé epitely. Mléčná žláza, jak už bylo uvedeno, je tvořena dvěma hlavními kompártmenty epiteliálních buněk. Luminální, neboli sekreční buňky exprimují cytokeratiny 8, 18 a 19 (K8, K18, K19 pozitivní buňky). Naproti tomu bazální čili myoepiteliální buňky exprimují cytokeratin 14 charakteristický pro bazální buňky vícevrstevných epitelů (K14 pozitivní buňky) [1, 2, 3]. V malých duktech, hlavně v oblasti takzvané terminální duktálně- lobulární jednotky (TDLU, obr.l) jsou některé jednotlivé luminální buňky anebo shluky několika málo luminálních buněk K19 negativní [1, 4]. Předpokládá se, že TDLU v sobě skrývá proliferační kompártment, takzvané kmenové buňky, méně diferencované (proto K19 negativní), ale připravené к další proliferaci a eventuelně i к dalšímu větvení žlázové struktury v těhotenství. Analogicky s jinými lidskými nádory se přepokládalo, že maligní nádory mléčné žlázy jsou tvořeny málo diferencovanými, vysoce proliferujícími buňkami a TDLU byla považována za primární ohnisko maligních procesů. Histopatologická analýza benigních tumorů mléčné žlázy skutečně prokázala, že tyto jsou tvořeny K19 negativními buňkami [1]. Proto bylo velkým překvapením zjištění, že jak primární tumory mléčné žlázy, tak jejich metastatická ložiska jsou tvořena převážně buňkami fenotypově shodnými s diferencovanými luminálními buňkami žlázy - se silnou expresí K19 [1]. Myoepiteliální komponenta mléčné žlázy v maligních nádorech většinou zcela chybí [5, 6, 7].
Výzkum prsních karcinomů je dlouhodobě limitován tím, že není znám jasný buněčný prekurzor maligních nádorů. Zároveň neexistuje metoda pro rutinní kultivaci buněk prsních karcinomů. Předpokládá se, že úspěšný vývoj metody pro kultivaci epiteliálních luminálních (sekrečních) a myoepiteliálních (bazálních) buněk mléčné žlázy by měl být také klíčem к rutinní kultivaci nádorových buněk. Pak by mohla být řada výzkumů na buněčné i molekulární úrovni (včetně optimalizace protinádorových strategií) prováděna na tkáňových kulturách. Čím časněji je nádorové onemocnění diagnostikováno, tím větší důležitosti nabývá (z důvodu nedostatku zdrojového materiálu) výzkum a testování primárních nádorových buněk odvozených z individuálních nádorů in vitro. Využívání imortalizovaných linií, sestávajících obvykle z geneticky extrémně aberantních typů buněk, je jednostranným zjednodušením situace in vivo a spoléhání na ně může být zavádějící [8].
IV. Literární přehled
1. Kultivace epiteliálních buněk z normální i nádorové tkáně mléčné žlázy žen
První dokumentované pokusy o kultivaci epiteliálních buněk mléčné žlázy začaly už v roce 1937 [9]. První buněčná linie, pocházející z maligního nádoru mléčné žlázy byla založena až o dvacet let později, v roce 1958 [10]. Teprve za dalších téměř dvacet let, poté co v roce 1975 Rheinwald a Green dosáhli prvního výrazného úspěchu v kultivaci lidských kožních epiteliálních buněk (keratinocytů) pomocí feeder-layer techniky [11], se začaly dostavovat častější úspěchy v kultivaci epiteliálních buněk mléčné žlázy. Byly definovány růstové požadavky umožňující krátkodobou kultivaci luminálních buněk pocházejících z mléka kojících žen: feeder-layer tvořený ozářenými fibroblasty (3T3 nebo 3T6 - myší embryonální fibroblastové linie), sérum a epidermální růstový faktor (EGF) [12]. Tímto kultivačním systémem se však nepodařilo kultivovat epiteliální buňky izolované ze solidních vzorků mléčné žlázy. Martha Stampfer se spolupracovníky vyvinuli v roce 1980 komplexní MM médium obohacené kombinací několika druhů kondiciovaného média a růstových faktorů, které bez použití feeder-layer buněk umožnilo úspěšné zakládání primokultur z normálních i patologicky změněných vzorků mléčné žlázy [13]. S přibývajícími poznatky o kultivaci epiteliálních buněk Martha Stampfer dokázala postupně svoje kultivační médium nahradit bezsérovým, chemicky plně definovaným médiem MCDB170, jehož jediným nedefinovaným přídavkem zůstal bovinní pituitární extrakt (BPE) [14]. Přibližně ve stejné době vznikla další bezsérová média: CDM3 [15], DFCI [16] a další [17, 18]. Hlavní výtkou proti bohatým médiím se sérem bylo to, že podporovaly hlavně proliferaci stromálních buněk (fibroblastů) které pak přerůstaly v kultuře a tím zabraňovaly množení epiteliálních buněk.
Avšak ukázalo se, že v bezsérových médiích rostou jenom myoepiteliální (K19 negativní) buňky mléčné žlázy [4, 19]. Přitom karcinomy mléčné žlázy jsou většinou tvořeny K19 pozitivními buňkami [1]. Navíc, úspěšnost všech těchto kultivačních technik byla stále nízká, vyžadovaly velké vstupní inokulum buněk a úspěšně založené kultury se vyznačovaly krátkou in vitro viabilitou. Jediného pokroku dosáhla pokračovatelka Marthy Stampfer - Shanaz Dairkee. V médiu MCDB170 snížila koncentraci vápníku a přidala 2% FCS. Výrazně zkrátila dobu enzymatické degradace vstupního vzorku, případně na izolaci buněk z nádorové tkáně použila opakovanou aspiraci tenkou jehlou (FNA). V obou případech vycházela
z předpokládané snížené adhezivity nádorových buněk v tkáních. Touto kombinací změn sejí podařilo úspěšně založit a po několik pasáží in vitro udržet kultury epiteliálních buněk u 29/44 solidních vzorků a u 12/25 FN A vzorků [20, 21].
2. Zakládání buněčných linií
Většina in vitro založených kultur pocházejících z mléčné žlázy žen se - bez ohledu na použitou kultivační techniku - vyznačuje velmi limitovaným proliferačním potenciálem. Od vzniku první buněčné linie v roce 1958 do roku 1994 se podařilo založit jen 20-30 dostatečně charakterizovaných buněčných linií pocházejících prokazatelně z buněk karcinomů mléčné žlázy. Navíc většina z nich pocházela z metastatických zdrojových buněk izolovaných z pleurálních výpotků, podkožních metastáz, lymfatických uzlin [22, 23, 24, 25] a jen několik málo linií bylo odvozeno z primárních nádorů [19, 26, 27, 28]. Nádory, ze kterých se přece jen podařilo založit buněčnou linii, měly několik společných vlastností: byly rozsáhlé (větší než 5 cm), málo diferencované (grade III), většinou metastazovaly alespoň do regionálních lymfatických uzlin, buňky nádorů byly vysoce aneuploidní, neexprimovaly estrogenový a progesteronový receptor (ER a PgR neg), overexprimovaly c-erbB2 protein. Šlo tedy o velmi pokročilá nádorová onemocnění, obvykle s krátkou prognózou. Linie vznikaly téměř každá odlišným postupem, většinou se podařilo založit buněčnou linii jako jednu z desítek ba i stovek vzorků (Caillieau v ref. 29 vykazuje desetiprocentní úspěšnost v zakládání linií z metastáz a žádný úspěch u 300 primárních nádorů, Langlois v ref. 22 založil linii z jednoho z deseti vzorků odebraných z metastázy jediné pacientky, Meltzer v ref. 30 uspěl u dvou ze sta primárních nádorů, Amadori v ref. 27 založil linii z jediného ze 136 primárních nádorů, McCallum v ref. 31 uspěl u deseti ze 135 primárních nádorů, Gazdar v ref. 32 u osmnácti ze 177 primárních nádorů a u tří ze 12 metastáz a Wang v ref. 33 založil jednu buněčnou linii ze 6 primárních nádorů). Úspěšnost v zakládání buněčných linií pocházejících z karcinomů mléčné žlázy záleží pravděpodobně zčásti na použité metodě, ale především na vlastnostech buněk jednotlivých nádorů. Až dlouhý proces maligní transformace, spojený často se získáním schopnosti metastazovat, uděluje určité frakci geneticky heterogenní nádorové populace buněk schopnost dlouhodobé proliferace in vitro.
Nízká úspěšnost v zakládání buněčných linií pocházejících z karcinomů mléčné žlázy žen a svým způsobem uniformní charakter existujících buněčných linií vzbuzuje otázku, zda jsou imortalizované linie vhodným modelem pro výzkumné úkoly řešící otázky spojené zejména s časným vývojovým stadiem nemoci [8].
3. Identifikace epiteliálních buněk v in vitro kultuře
Kultivace epiteliálních buněk in vitro sebou přinesla řadu dalších úkolů. Prvním z nich bylo dokázat, že in vitro proliferující buňky jsou epiteliálního původu. Exprese cytokeratinů spolehlivě odlišuje epiteliální buňky mléčné žlázy od stromálních buněk, často kontaminujících kulturu. Detekcí cytokeratinů lze dobře odlišit i dva základní kompártmenty epiteliálních buněk mléčné žlázy: luminální buňky charakterizované expresí K8, K18 a K19 a myoepiteliální (bazální) buňky exprimující K5, K7 a K14 [1, 2, 3]. Někdy bývá v kulturách identifikována buněčná populace, která exprimuje kombinaci luminálních a myoepiteliálních cytokeratinů: 7, 8, 14 a 18. Tato koexprese může být indikátorem existence společné progenitorové buněčné populace, nebo může být exprese cytokeratinů v in vitro podmínkách změněná funkčním stavem buňky [34], nebo může jít o více dediferencované buňky, jaké byly nalezeny i in vivo a jsou spojovány s horší prognózou nemoci [35]. Každopádně je exprese cytokeratinů dostatečným průkazem epiteliálního původu buněk. I exprese epiteliálního membránového antigenu (EMA, ref. 36) nebo epiteliálního specifického antigenu (ESA, ref. 37) je charakteristická pro epiteliální buňky. Přesvědčivým důkazem epiteliálního původu buněk je rovněž detekce desmozomálních mezibuněčných spojů tvořených buňkami při dosažení konfluentního porostu [38].
4. Identifikace maligních buněk v in vitro kultuře
Druhým, mnohem těžším problémem je odlišení maligních a benigních buněk kultivovaných in vitro. Nádorové a normání buňky se neliší morfologickými ani tinkčními vlastnostmi, navíc jsou buňky v kultuře vytrženy z kontextu okolní tkáně. Malignita kultivovaných buněk se obvykle prokazuje schopností buněčné suspenze indukovat nádory po inokulaci do imunokompromitovaných athymických myší, čili testem tumorigenicity in vivo.
U primárních kultur i ustálených buněčných linií karcinomů mléčné žlázy je však in vivo tumorigenicita spíše výjimkou [39, 40,41]. Při identifikaci maligních buněk v kulturách je tak nutno spoléhat na expresi dalších, ne zcela jednoznačných markerů malignity.
Většina maligních nádorů je tvořena luminálními buňkami [1, 42], myoepiteliální složka nebývá v místě maligního nádoru vůbec nalezena [5, 6, 7]. Za maligní buňky in vitro byly proto považovány luminální buňky (K19 pozitivní) rostoucí v kultuře založené ze vzorku
maligního tumoru. Při in vitro kultivaci však může docházet ke změně exprese cytokeratinů [34], možná je rovněž příměs luminálních buněk z okolní nenádorové tkáně.
Další indikací malignity kultivovaných buněk může být přítomnost chromozomálních aberací. Maligní transformace a progrese buněk mléčné žlázy je mnohostupňový proces genetických změn, jejichž souslednost byla zatím definována jen přibližně. Primární maligní nádory mléčné žlázy jsou tvořeny četnými karyotypicky změněnými příbuznými i nepříbuznými klony buněk [43, 44, 45, 46], s nejčastěji alterovanými chromozomy 1, 3, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 18 a 20 [21]. Postižena může být oblast jednoho genu (LOH, amplifikace, delece, mutace), více genů, celé rameno či chromozom. Zatímco klasické cytogenetické vyšetření u nesuspenzních, adhezivně rostoucích epiteliálních kultur mléčné žlázy je obtížné, nabízí se novější molekulárně biologická metoda - fluorescenční in situ hybridizace (FISH) buněk se sondami cílenými proti rozličně velkým úsekům jednotlivých chromozomů, od jednotlivých genů až po centromerickou oblast chromozomu. Pro toto vyšetření je adhezní kultura výhodnější, navíc buňky nemusí být zachyceny v mitóze.
Absence chromozomálních aberací ale nevylučuje nádorový původ buněk. Wolman, Smith a spolupracovníci zjistili, že buňky v kulturách odvozených jak z primárních nádorů tak z metastáz karcinomů mléčné žlázy byly převážně diploidní [50]. Tyto diploidní nádorové kultury se však lišily od kultur založených ze vzorků normální mléčné žlázy svojí schopností invadovat in vitro lidskou amniotickou bazální membránu [48] a výrazně vyšší senzitivitou vůči tumour necrosis faktoru (TNF) [49]. Bylo prokázáno, že in vitro kultivace vede к selekci buněk s menším genetickým poškozením [50, 51]. Buňky s výrazně poškozeným genomem mohou být in vitro neviabilní. Jejich spoluúčast na výsledném obraze maligní nemoci in vivo je pravděpodobně závislá na funkci a metabolismu méně alterovaných okolních buněk [46].
I další z používaných markerů malignity epiteliálních buněk karcinomů mléčné žlázy kultivovaných in vitro, jako je vysoká NADPH-NT reduktázová aktivita [52], HMFG-2 exprese a zvýšená retence Rhol23 [16], exprese c-erbB2 proteinu [53], exprese c-src proteinu [54], nebo schopnost morfologické diferenciace buněk při jejich kultivaci v rekonstituované bazální membráně [38, 55-58] spíše kvalitativně charakterizují stupeň alterace buňky, který hraje roli v tumorigenezi. Nemohou však jednoznačně rozlišit příslušnost buňky к ještě benignímu či už malignímu typu.
5. Využití kultur к testování chemorezistence in vitro
Necílená, empirická léčba nádorů již pravděpodobně dosáhla hranice svého možného přínosu. Současným trendem v léčbě všech druhů nádorů se stává individualizace (tailoring), využívající originální biologické vlastnosti každého jednotlivého nádoru. Pacienti začínají mít prospěch z léčby složené z kombinace nespecificky působících chemoterapeutik a specificky cílených protilátek, působících většinou proliferační blokádu buněk se zvýšenou expresí receptorů pro růstové faktory. I klasická chemoterapie však může být podávána více cíleně. Je známo mnoho mechanismů rezistence, které nádorové buňky chrání před účinkem chemoterapeutik, jako je například aberantní exprese proteinů podílejících se na transportu či metabolizmu chemoterapeutik. Jednou z možností, jak předejít podávání toxické, ale přitom neúčinné léčby, je testování funkčnosti těchto mechanismů v buňkách nádoru [59, 60]. Test chemorezistence nádorových buněk in vitro naopak umožňuje detekci rezistence vůči konkrétní chemoterapeutické látce bez znalosti molekulárního podkladu této rezistence.
Snaha o vývoj testu chemorezistence in vitro začala krátce po zapojení chemoterapeutik do léčby nádorových onemocnění. V 70. letech se jevil slibným test klonogenity kmenových buněk nádorů [61]. Suspenze nádorových buněk byla na hodinu vystavena účinku chemoterapeutické látky a poté kultivována v měkkém agaru až do doby nárůstu buněčných kolonií, jejichž počet byl porovnán s množstvím kolonií v kontrolní misce.
Hlavním problémem testu byla nízká klonogenita (procento úspěšného nárůstu kolonií) většiny nádorových primokultur. To vedlo к potřebě velkého množství buněčného materiálu, velké pracnosti a malému množství dokončených testů. Test trval asi 20 dní. Výsledky úspěšně provedených testů ale vysoce korelovaly s odpovědí pacientů na léčbu [refs. 62-65 - ovariální karcinomy, 66 - malobuněčný plicní karcinom, 67 - mnohočetný myelom, 68 - melanom kůže a mnoho dalších], žádný z později vyvinutých testů nedosáhl tak vysoké korelace výsledků in vivo a in vitro. Test v původní podobě dodnes slouží к testování nových chemoterapeutických látek, nebo například к predikci rezistence vůči cis-platině u ovariálních karcinomových buněk, které patří mezi nejlépe kultivovatelné lidské nádorové buňky [65].
Další vývoj testování směřoval к zjednodušení a urychlení testu. V thymidin - inkorporačním testu je místo dlouhého čekání na nárůst kolonií měřena inhibice inkorporace
3H-thymidinu do DNA kultivované buněčné populace během několika prvních dní in vitro kultivace. Výsledek je dostupný již za šest dní [69]. Tento přístup má však i některé nevýhody. Není možné odlišit cytostatický od cytotoxického efektu léku, falešně pozitivně jsou hodnoceny buňky s delším trváním buněčného cyklu. Podobný charakter i chyby má
i takzvaný DiSC test, "The differential staining cytotoxicity assay" [70, 71]. Je založen na neschopnosti mrtvých nádorových buněk vyloučit fast green nebo fast green-nigrosin barvivo.
Tato metoda je vylepšením jednoduchého vitálního barvení buněk pomocí trypan blue [72].
I když DiSC test je rychlejší než klonogenní test, jeho hodnocení je pracné a podléhá jisté subjektivitě. Navíc se ukázalo, že korelace mezi schopností buněk vyloučit supravitální barvivo a jejich perspektivní schopností se dělit je nízká.
Dva další často používané testy měří podíl živé buněčné populace přítomné v kultuře po působení chemoterapeutické látky podle množství indikátorové látky vizualizované funkčním buněčným metabolizmem. První z nich je MTT test [73, 74] měřící aktivitu mitochondriálních enzymů. Sukcinyl dehydrogenáza viabilních buněk redukuje do média přidanou žlutou tetrazoliovou sůl MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) na tmavě modré krystalky. Optická denzita buněčné suspenze v pásmu modré barvy, jednoduše kvantifikovatelná pomocí ELISA-readru, vypovídá o množství buněk, které zůstaly metabolicky aktivní i po působení chemoterapeutické látky. Test který měřil poškození buněk chemoteraputickými látkami in situ pomocí mikrosensoru ukázal, že aktivita mitochondriálních enzymů je nejcitlivějším indikátorem akutního cytotoxického účinku chemoterapeutik [75]. Výsledky MTT testu jsou odečitatelné již za 5 dní po získání buněčné nádorové suspenze a vykazují dobrou korelaci s výsledkem klonogenního testu i s odpovědí pacientů na podanou léčbu. Nejnovější studie prokázala u pacientek s nádorem mléčné žlázy, jejichž terapie byla vedena na základě výsledku MTT testu zlepšení terapeutické odpovědi [76]. MTT test je materiálně i prakticky nenáročný.
Technicky ještě dokonalejším je druhý „metabolický" test, ATP bioluminiscenční test [77]. Je založen na měření koncentrace intracelulárního ATP měřením světla, generovaného kvantitativní aktivací luciferin-luciferázového reagentu. Hladina ATP je lineární funkcí množství živých buněk, je ovlivněna pouze cytotoxickým účinkem testovaných látek a dává výsledky korelující jak s výsledky standardního klonogenního testu [78, 79], tak s odpovědí pacientů na podávané chemoterapeutické látky [80, 81 - ovariální karcinom, 82-84 - prsní karcinom]. Je to test velmi rychlý,v současné době dostupný i komerčně. V porovnání s MTT testem je ATP test náročnější na vybavení laboratoře i cenově.
Ještě několik dalších způsobů in vitro testování chemorezistence bylo úspěšně použito i v praxi [review 85, 86]. Limitujícím faktorem provedení všech testů však zůstává většinou nedostatečné množství buněk získané po rozvolnění nádoru.
Nádory mléčné žlázy jsou nyní úspěšně diagnostikovány v ranějším stádiu. V 70-80%
záchytu karcinomu mléčné žlázy neumožní velikost biopsie provedení testu chemorezistence [87]. Předkultivace buněk pocházejících z nádorů by mohla pomoci odstranit toto omezení.
Epiteliální buňky z nádorů mléčné žlázy jsou však, jak již bylo napsáno, jedny z nejobtížněji kultivovatelných primárních nádorových buněk.
V roce 1980 využila Helen Smith do té doby nejúspěšnější systém kultivace mamárních epiteliálních buněk využívající komplexní MM médium [13] a v primokultuře pomnožené buňky nasadila na feeder-layer vytvořený lidskými fibroblasty. Srovnáním klonogenity (schopnost tvořit kolonie) mezi buňkami vystavenými účinku chemoterapeutických látek a kontrolními buňkami testovala in vitro chemorezistenci buněk kultivovaných z nádorů mléčné žlázy 63 žen. U 88% pacientek správně predikovala rezistenci a u 95% senzitivitu vůči chemoterapeutické látce [88]. Tento testovací systém byl pro buňky karcinomů mléčné žlázy použit vícekrát [27, 28, 89, 90, 91]. Jde však o pracný systém vyžadující velké množství původních nádorových buněk, složité kultivační médium (s řadou růstových faktorů a třemi druhy kondiciovaných médií), feeder-layer tvořený primárními lidskými fibroblasty. Z těchto důvodů nedošlo, přes slibnou korelaci výsledků tohoto testu s klinickými výsledky, к jeho širšímu využívání v praxi.
Objevil se i druhý přístup používající pro in vitro test chemorezistence buňky pocházející z několika málo prvních in vitro pasáží buněk izolovaných z primárních nádorů mléčné žlázy žen. Porost namnožených buněk byl použit pro test hodnotící poškození proliferační aktivity testovaných buněk porovnáním počtu buněk v kultuře před a po aplikaci chemoterapeutické látky [92, 93]. Ani tento přístup nenašel uplatnění v praxi pro nízkou úspěšnost (40%) při zakládání kultur z karcinomů mléčné žlázy.
Oba způsoby testování chemorezistence kultivovaných buněk mamárních karcinomů však prokázaly vysokou korelaci mezi in vitro výsledky a odpovědí pacientek na léčbu [88, 93], přestože bylo opakovaně prokázáno, že in vitro kultivací buněk karcinomů mléčné žlázy dochází к buněčné selekci [94, 95].
V. Cíl práce
Cílem této práce bylo vytvoření nového kultivačního modelu epiteliálních buněk izolovaných z normální a nádorové tkáně mléčné žlázy žen a jeho využití к rozšíření znalostí o specifických biologických vlastnostech kultur z individuálních nádorů, včetně jejich chemorezistence in vitro.
Dílčí cíle
1. Vývoj metodiky pro reprodukovatelnou kultivaci epiteliálních buněk z normální a nádorové tkáně mléčné žlázy žen na základě zkušeností s 3T3 feeder-layer technikou.
2. Optimalizace metody pro kultivaci epiteliálních buněk ze vzorku získávaného perkutánní biopsií nádorů tenkou jehlou, jehož objem nepřesahuje 0.01 cm3.
3. Zavedení rutinní validace epiteliálního charakteru kultivovaných buněk.
4. Porovnání charakteru epiteliálních buněčných populací získaných z normální tkáně a z různých typů nádorů mléčné žlázy.
5. Test tumorigenicity kultivovaných buněk in vivo a analýza markerů malignity v kulturách buněk z maligních nádorů na imunocytochemické a molekulární (FISH) úrovni.
6. Vývoj a zavedení metody testování chemorezistence buněk z individuálních nádorů.
7. Otestování chemorezistence maximálního počtu kultur. Analýza možného vlivu in vitro expanze buněk na výsledek testu.
VI. Materiál a použité experimentální metody
1. Kultivační roztoky
Standardní kultivační médium: Eaglovo minimální médium v Hanksově BSS (H-MEM), doplněné o penicilin 100 U/ml, streptomycin 100 mg/ml, pyruvát sodný 0.12 g/l, ЫаНСОз 1 g/l, všechny neesenciální aminokyseliny a 10% bovinního séra (ZVOS Zlín). Sérum je testováno na optimální růst buněk 3T3 (takto připravené standardní kultivační médium musí umožnit dobré přichycení a životnost ozářených 3T3 buněk nasazených v nízké hustotě (5-10 tisíc buněk na kultivační misku o průměru 60 mm).
Epiteliální kultivační médium: standardní kultivační médium obohacené o 2% FBS (Sigma), hydrokortizon 0.5 |ig/ml (Spofa), inzulin 5 |ig/ml (NOVO), cholera toxin 10"'° M (Sigma) a EGF 5 ng/ml (Sigma).
Testovací médium: Epiteliální kultivační médium bez pH-indikátorové barvy (fenolová červeň)
Zmražovací médium: 3 ml epiteliáního kultivačního média, 5 ml bovinního séra (CS), 2 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) - po smíchání epiteliálního kultivačního média a bovinního séra byl po kapkách, za neustálého míchání směsi, přidáván DMSO, konečná směs byla před použitím vychlazena v lednici.
Trypsin: 0.25% roztok Trypsinu (DIFCO) v PBS
EDTA: 0.02% kyselina ethylendiamintetraoctová v PBS.
Trypsin/EDTA: Trypsin : EDTA v poměru 1 : 3
2. Biologický materiál
Vzorky normální mléčné žlázy byly získány z redukční mamoplastiky (Klinika plastické chirurgie 3.LF UK Praha nebo Nemocnice Na Bulovce). Část vzorku byla použita к histopatologickému vyšetření к vyloučení patologických změn. Část vzorku určená к in vitro kultivaci měla objem v rozmezí 1-3 cm3.
Vzorky nádorů, benigních i maligních, byly získány z peroperačních biopsií (označovány jako Surg vzorky) (1.Chirurgická klinika VFN a l.LF UK Praha). Část vzorku určená к in vitro kultivaci měla objem přibližně 1 cm3.
Část vzorků nádorů mléčné žlázy byla získána perkutánní biopsií mléčné žlázy - váleček o šířce lmm a délce 9 mm odebraný tenkou jehlou pod ultrazvukovou kontrolou (označovány jako TC vzorky) (Radiodiagnostická klinika V FN a l.LF UK Praha). Objem takto získaného vzorku byl přibližně 0.01 cm3.
Vzorky kožních metastáz pacientek s karcinomem mléčné žlázy byly získány chirurgickou extirpací (označovány jako Meta vzorky). Část vzorku vyhrazena к in vitro kultivaci měla velikost 1-3 cm3.
Vzorek tkáně určený к in vitro kultivaci byl okamžitě po odběru sterilně odddělen, vložen do připravené zkumavky se sterilním epiteliálním kultivačním médiem a do zpracování (obvykle 6 hodin, nejpozději do 48 hodin po náběru) skladován v teplotě 0-4 °C.
3. 3T3 feeder-layer kultivační metoda
Vzorky mléčné žlázy a metastáz byly malými chirurgickými nůžkami sterilně rozstříhány na co nejmenší kousky (menší než 1 mm3), část tkáně při stříhání obvykle získala až kašovitou konzistenci. Celá masa pak byla za třepání při 37°C inkubována 3-12 hodin (v závislosti na velikosti a tuhosti vzorku) v 0.5 až 4 ml 0.05% kolagenázy A (Boehringer- Manneim GmbH), poté homogenizována opakovaným resuspendováním skleněnou pipetou.
Výsledná suspenze byla Юх naředěna epiteliálním kultivačním médiem a centrifugo vána 10 min při 200g. Sediment byl resuspendován v epiteliálním kultivačním médiu a nasazen na připravený feeder-layer v kultivační lahvičce.
Feeder-layer, vrstva sloužící jako nedělící se, ale mechanicky a metabolicky aktivní podklad pro epiteliální buňky mléčné žlázy, byl vytvořen nasazením letálně ozářených (100 Gy, Gammacel 220, buňky ozařované v suspenzi) buněk myší fibroblastové linie NIH 3T3 (dále pouze 3T3) v koncentraci 25 000 buněk na cm2 kultivačního povrchu ve standardním kultivačním médiu. Po 2-5 hodinách buňky tvořily rovnoměrnou síť pevně přisedlou к povrchu kultivační misky (obr. 2) a mohly být použity к nasazení epiteliálních buněk.
Epiteliální buňky obvykle potřebovaly к přichycení 24 hodin. Rostoucí kolonie vytěsňovaly buňky feeder-layeru do stran (obr. 3). Feeder-layer byl dostatečně metabolicky aktivní po dobu asi 10 dnů. Postupně docházelo к rozpadu letálně ozářených buněk. Protože adhezivita fibroblastových buněk je mnohem menší než adheziviza epiteliálních buněk, mohl být feeder-layer odstraněn trypsinem; po 1-2 minutovém působení trypsinu došlo к selektivnímu uvolnění 3T3 buněk a do kultivační lahvičky byla přidána nová suspenze
ozářených 3T3 buněk. Feeder-layer byl o b v y k l e j e š t ě před d o s a ž e n í m k o n f l u e n t n í h o porostu epiteliálních buněk 1-2 x v y m ě n ě n .
Obr. 2.: 1'eeder-íaver, živný porost tvořený letálně Obr. 3.: Rostoucí kolonie epiteliálních buněk ozářenými 3T3 buňkami. vytěsňuji méně adhesivni 373 buňky do stran.
Při pasážování konfluentních epiteliálních buněk byly zbylé b u ň k y feeder-layeru odstraněny p o m o c í krátké inkubace s trypsinem. Epiteliální buňky byly poté sklizeny p o m o c í směsi t r y p s i n - E D T A , ve které byly 10 minut inkubovány při 37°C. O p t i m á l n í násada čerstvě sklizených či r o z m r a ž e n ý c h epiteliálních buněk na připravený feeder-layer při pasážování byla 4-8 tisíc buněk na cm2 kultivačního povrchu.
Sklizené epiteliální buňky kterékoliv pasáže m o h l y být z m r a ž e n y . Suspenze epiteliálních buněk byla smíchána v poměru 1:1 s v y c h l a z e n ý m z m r a ž o v a c í m m é d i e m do
6
výsledné koncentrace 10 buněk/ml a rozdělena do 1 ml z m r a ž o v a c í c h a m p u l í ( N U N C ) . Ty byly postupně schlazeny pomocí zmražovací krabičky s i z o p r o p a n o l e m ( f r e e z i n g container, Nalgene) na - 7 0HC a uloženy do tekutého dusíku. Při z p ě t n é m r o z m r a ž o v á n í buněk byla a m p u l k a p o n o ř e n í m do teplé vody ohřátá na 37HC, j e j í obsah byl r e s u s p e n d o v á n v dalších 9 ml epiteliálního kultivačního média a nasazen na připravený feeder-layer na kultivační lahvičce. Po přichycení epiteliálních buněk к feeder-layeru (za 2 4 - 4 8 hod) bylo m é d i u m z lahvičky opatrně odsáto a nahrazeno čerstvým epiteliálním kultivačním m é d i e m . Kryoprezervace buněk pozorovatelně neovlivnila růstové a m o r f o l o g i c k é charakteristiky buněk.
4. Fázově-kontrastní mikroskopie, časosběrná mikroskopie, fluorescenční mikroskopie
Pro přímé pozorování vitálních buněk byl použit inverzní m i k r o s k o p Nikon Diaphot 300 s L W D fázově-kontrastní optikou. Pro časosběrnou mikroskopii byl m i k r o s k o p vybaven
CCD kamerou Cohu a monitorem Sony Trinitron připojenými к sběrači snímku Matrox instalovaném v osobním počítači Cyrix 166 MHz. Optimální teplota 37°C byla pro studium buněk jištěna dvojí tepelnou regulací. Celý mikroskop byl umístěn v izolovaném boxu se stabilním gradientem teploty. Pro buněčné kultury v kultivačních lahvičkách byl použit vyhřívaný stolek a pro kultivační misky speciální komůrka, která zabraňovala odpařování média. Pro sběr fotografií kultury ve volitelných intervalech byl použit program dr.exe, pro prohlížení záznamu a hodnocení pohybu buněk program dp.exe, oba vyvinuty v Laboratoři buněčné biologie ÚMG AV ČR Ing. Danielem Zichou, CSc. [96].
Imunocytochemické barvení bylo hodnoceno v inverzním mikroskopu Nikon Diaphot 300 s využitím fázově kontrastní optiky ke srovnání pozitivity buněk a jejich morfologie.
К hodnocení fluorescenčního barvení byl použit fluorescenční mikroskop Olympus BX41, též umožňující korelaci fluorescenčního a fázově kontrastního obrazu.
5. Stanovení in vitro růstových vlastností kultur a buněk
5.1 Plating Efficiency Test (PET) - schopnost buněk tvořit kolonie
Na kultivační misku o průměru 60 mm s ozářenými 3T3 buňkami bylo nasazeno 103"104 epiteliálních buněk testované kultury. Po 1-2 týdnech kultivace byly buňky fixovány a předbarveny roztokem May-Griinwald (10 min) a dobarveny roztokem Giemsa-Romanowski (20 min). Poté byl vyhodnocen počet kolonií. Výsledkem byla takzvaná plating efficiency (РЕ), procento buněk schopných tvořit kolonie.
5.2 Korigovaný počet generací v pasáži a generační čas
Počet generací epiteliálních buněk rostoucích v kultuře nemůže být, pro jejich nízkou PE, počítán přímo z množství nasazených a sklizených buněk. Množství sklizených buněk je děleno jenom množstvím nasazených buněk schopných tvořit kolonie (jejioh množství se odvodí z paralelně vykonaného testu PET), aby se zjistilo, kolik buněk (x) vzniklo z jedné původní buňky. Pužitím vzorce x=2n"1se pak zjistí počet generací (n). К zjištění průměrného generačního času se pak čas mezi nasazením a sklizením buněk dělí počtem generací.
6. Imunocytochemická barvení
6.1 Přímé fluorescenční značení aktinových vláken
Buňky byly nasazeny v standardní hustotě na krycí mikroskopická sklíčka položená na dno kultivační misky o průměru 35 mm s připravenou vrstvou feeder-layeru. Po dosažení subkonfluentní hustoty byl porost na skle dvakrát opláchnut PBS, 5 minut fixován 4%
formaldehydem (Sigma-Aldrich) a opláchnut PBS 3 x 5 minut. Na flexibilní samotěsnící fólii (Parafilm M, Sigma-Aldrich) byla nanesená 20 ц1 kapička phalloidinu značeného rhodaminem (phalloidin-TRITC, Sigma-Aldrich) a na ní, nafixovanými buňkami dolů, položeno krycí sklo. Po 15-minutové inkubaci ve tmě při pokojové teplotě bylo krycí sklíčko opláchnuto 3 x 5 minut PBS. Krycí sklíčko bylo pomocí kapky montovacího média Gelvatol (věnovala Dr. Barbara Safiejko-Mrocka, UO, Oklahoma) přichyceno к podložnímu sklu a po zaschnutí ve tmě při pokojové teplotě mohlo být uchováváno v lednici po dobu cca 6 měsíců a kdykoliv pozorováno ve fluorescenčním mikroskopu.
6.2 Fluorescenční biotin-streptavidin-rhodamin systém detekce antigenú
Buňky byly nasazeny, kultivovány a fixovány stejným způsobem jako při značení aktinových vláken. Na parafilm bylo naneseno 20 jíl primární protilátky a sklíčko s porostem bylo inkubováno 30 minut při pokojové teplotě, nebo přes noc v lednici ve vlhké komůrce a opláchnuto 3 x 5 minut v PBS. К vizualizaci specificky navázaných primárních protilátek byl použit streptavidin-TRITC reagující se sekundární biotinylovanou protilátkou (Univerzální detekční systém, Immunotech). Montování preparátu probíhalo stejně jako při značení aktinových vláken.
Jako primární protilátky byly použity monoklonální protilátky: C-35 pro K7, C-51 pro K8, DA-17 pro К18, BA-17 pro К19, BP 53-12 pro p53 oncoprotein (všechny tyto protilátky z Exbio), LL001 pro K14 (protilátku věnovala P. Purkis) [34], GP1.4 pro EMA, VU-1D9 pro ESA, 1 A4 p ro a-SMA (Sigma-Aldrich), a 3 B5 pro с -erbB2 protein (Immunotech). Králičí polyklonální protilátka (Boehringer Ingelheim Bioproducts) byla použita pro značení src onkoproteinu.
6.3 Nefluorescenční biotin-streptavidin-peroxidázový systém detekce antigenů
Subkonfluentní buněčná kultura byla opláchnuta dvakrát krátce PBS a fixována vychlazenou směsí methanol-aceton (1:1, -20°C) 5 minut. Takto fixovaná kultura byla použita pro imunocytochemické barvení okamžitě, nebo mohla být na dobu 3-4 měsíců uchovávána v -70°C a použita к imunocytochemickému barvení po rozmražení a usušení. Pro značení protilátkou EMA a ESA byla kultura po oplachu PBS fixována 4% formaldehydem při pokojové teplotě a opláchnuta PBS 3 x 5 minut. Takto fixované kultury mohly být skladovány asi 10 dní v PBS ve 4°C. Primární protilátka byla nanesena přímo na fixované buňky a inkubována 30 min při pokojové teplotě. К vizualizaci specificky navázaných protilátek byl použit biotin-streptavidin-peroxidáza univerzální detekční systém (Immunotech). Antigen byl vizualizován pomocí diaminobenzidínu (DAB, Sigma-Aldrich).
Byla použita stejná sada primárních protilátek jako při fluorescenčním značení.
7. Fluorescenční in situ hybridizace
Epiteliální buňky byly nasazeny v standardní hustotě na podložní mikroskopická skla, která byla umístěna na dno kultivační misky o průměru 90 mm s předem připravenou vrstvou ozářených 3T3 buněk. Po dosažení subkonfluentního porostu epiteliálních buněk byla kultivační miska 2x opláchnuta PBS, buňky na skle byly 10 min inkubovány v hypotonickém roztoku 0.075 M KC1, 10 min fixovány směsí methanol:ledová kyselina octová (3:1) a důkladně opláchnuty v PBS. Takto nafixovaná sklíčka bylo možno 3 měsíce uchovávat v 70%
ethanolu při teplotě 0-4°C.
Před hybridizací byl fixovaný porost na skle postupně inkubován 15 min v 96%
etanolu, 10 minut v hypotonickém roztoku (0.075 M KC1), 10 minut ve fixačním roztoku methanol:ledová kyselina octová (3:1) a 5 minut v 2 x SSC při teplotě 37 °C. Poté následovala dehydratace vzorku postupným ponořením skla do 70%, 80% a 96% etanolu, vždy na 1-2 minuty. Na čisté krycí sklíčko byla nanesena sonda (3-5 |il), sklíčko překlopeno na sklo se vzorkem a okraje krycího sklíčka byly přichyceny chemoprénovým lepidlem. Při zahřátí na 37°C po dobu 5 minut lepidlo zaschlo. Dalších 5 minut při teplotě 75°C probíhala kodenaturace vzorku a sondy. Hybridizace probíhala přes noc ve vlhké komůrce při 37°C.
Ráno bylo krycí sklíčko odstraněno a podložní sklo se vzorkem bylo promyto 2 min v roztoku 0.4 x SSC v 0.3% NP-40 (nebo TRITON X-100) při teplotě 72°C. Poté byl vzorek ponořen na 30 vteřin do roztoku 2 x SSC v 0.1% NP-40 pokojové teploty. Příprava preparátu byla
ukončena oschnutím ve vertikální poloze a přiložením krycího sklíčka s kapkou montovacího média Vectashield obsahujícího DAPI (4',6'-diamidino-2-phenytindole hydrochloride, Vector laboratories). Po 10 minutovém schnutí ve tmě byly okraje krycího sklíčka к podložnímu sklíčku přichyceny pomocí laku na nehty. Preparát bylo možné hodnotit hned, skladování preparátu bylo možné po dobu asi 2 měsíců v temnu v teplotě 4 °C. Intenzita signálů však s dobou skladování mírně klesala.
Preparáty byly hodnoceny ve fluorescenčním mikroskopu Olympus BX41, pro zpracování a uchování obrazu byl používán program LUCIA (Laboratory Imaging, Praha).
Použitá byla sonda pro с -erbB2 g en kombinovaná s pericentromerickou sondou pro chromozom 17 a pericentromerické sondy pro chromozomy 1,3,7,8,11 (Vysis).
8. Test tumorigenicity in vivo
Tumorigenicita kultur byla testována subkutánní aplikací 1-10 miliónů buněk do podkoží Nu/nu myší, kmen CD1. Myši byly monitorovány po dobu 3 měsíců po aplikaci.
9. Testování chemorezistence buněk in vitro
9.1 Klonální test chemorezistence in vitro
V kultivačních destičkách obsahujících 6 x 4 kultivačních jamek o průměru 16 mm, byl 24 hodin před nasazením testovaných buněk připraven feeder-layer. Po této době byla přidána buněčná suspenze epiteliálních buněk v koncentracích 100, 300, 1000 a 3000 buněk na jamku (každý řádek jedna koncentrace). Následující den byla přidána testovaná látka v 5 různých koncentracích (každý sloupec jedna koncentrace) а к jednomu sloupci bylo přidané čisté kultivační médium sloužící jako kontrola (obr.4).
Obr.4.: Schéma původního uspořádáni klonálního testu chemorezistence. Jedna 24-jamková kultivační destička stačila к otestováni jedné látky v pěti různých koncentracích při čtyřech různých hustotách nasazeni testované buněčné suspenze. Jako příklad je uvedena destička testující 5-fluorouracil
Později byla testována jen jedna koncentrace nasazených epiteliálních buněk: 500, 1000 nebo 1200 buněk na jamku, někdy ve dvou paralelních pokusech. Následující den pak byly aplikovány čtyři testované látky, každá v 5 koncentracích (každý sloupec jedna koncentrace), jeden sloupec sloužil jako kontrola (obr.5).
Doxo
cDDP
Tax
VbI
Obr.5: Schéma zjednodušeného uspořádáni klonulmho testu chemorezistence. Jednu 24-jamková kultivační destička sloužila к otestování čtyř látek v pěti různých koncentracích při jediné testované hustotě nasazení buněčné suspenze.
Po 72 hodinách působení bylo médium s testovanou látkou i médium v kontrolních miskách nahrazeno epiteliálním kultivačním médiem. Po týdnu kultivace byly kultivační destičky 15 min fixovány a předbarveny May-Griinwald roztokem a dobarveny Giemsa- Romanovski roztokem (5-15 minut). Poměr počtu kolonií, které vyrostly v misce s testovanou látkou a počtu kolonií v kontrolní misce udával procento buněk, které byly schopné zvolenou koncentraci testované látky přežít.
Do testu byly zařazeny nukleosidové analogy 5-fluorouracil (5-FU) a gemcitabin (Gem), antracyklin doxorubicin (Doxo), alkylační látka cis-platina (cDDP), taxan paklitaxel (Tax) a semi-syntetický vinka alkaloid vinblastin (Vbl). Testované koncentrace in vitro (tab.l) byly odvozeny od ppc. Ppc, peak plasma concentration, je maximální dosahovaná koncentrace testované látky v séru pacientek, pokud je tato látka součástí léčebného režimu [83, 90, 97, 98]. Nejdříve byl testován širší rozsah koncentrací všech látek, později byl rozsah testovaných koncentrací zúžen do rozmezí, ve kterém nejčastěji docházelo к inhibici proliferace buněk schopných tvořit kolonie (tab. 1).
testovaná látka obchodní název a výrobce ppc [Hg/ml|
testované koncentrace A
[násobek ppc]
testované koncentrace В
[násobek ppc]
5-fluorouracil (5-FU) Fluoro-uracil, Roche 30 1; 0.5; 0.33; 0.1; 0.033 0.2; 0.16; 0.08; 0.04; 0.02 gemcitabin (Gem) Gemzar, Lilly France S.A. 30 1; 0.5; 0.33; 0.1; 0.033 0.066; 0.05; 0.033; 0.02; 0.006 doxorubicin (Doxo) Doxolem, Medicom International Ltd. 0.5 1; 0.5; 0.2; 0.1; 0.05 0.08; 0.06; 0.04; 0.02; 0.008
cisplatina (cDDP) Platidiam, Lachema 5 1; 0.5; 0.2; 0.1; 0.05 0.1; 0.08; 0.05; 0.02; 0.01 paklitaxel (Tax) Taxol, Bristol Myers-Squibb 10 1.2; 0.6; 0.24; 0.12; 0.06 0.1; 0.075; 0.05; 0.025; 0.01 vinblastin (Vbl) Vinblastin, Gedeon Richter Ltd. 1 1; 0.5; 0.2; 0.1; 0.05 0.1; 0.075; 0.05; 0.025; 0.01 Tab. I.: Látky testované v klonálním testu chemorezistence. Po předběžném otestováni každého léku v rozmezí koncentraci A, byl rozsah testovaných koncentrací zúžen (koncentrace B).
9.2 MTT test chemorezistence in vitro
Suspenze epiteliálních buněk, v koncentraci 5.105 buněk/ml testovacího média byla za průběžného promíchávání nasazena do 96-jamkové mikrodestičky (8 řádků a 12 sloupců) pro tkáňové kultury s rovným dnem, 80 jíl suspenze do jedné jamky. Všechny periferní jamky byly ponechány prázdné, a později doplněny jen bezbuněčným médiem (z těchto krajních jamek se nejvíce v inkubátoru odpařuje kultivační médium a dochází v nich tak ke změně koncentrace testované látky). Testovaná část kultivační destičky tedy měla 6 řádků a 10 sloupců.
Druhý den, po adhezi buněk na dno jamek, byly к jednotlivým jamkám přidány vybrané chemoterapeutické látky v určitých koncentracích. Do testu byly zařazeny:
antracyklin doxorubicin (Doxo), semi-syntetický vinka alkaloid vinorelbin (Vnrlb), taxan paklitaxel (Tax), nukleosidový analog gemcitabin (Gem) a alkylační látky mafosfamid (Mafo, in vitro aktivní metabolit ifosfamidu) a cis-platina (cDDP). Testované koncentrace látek (tab. 2) také vycházely z ppc. Po předběžném otestování každé látky v rozmezí 0.01 x ppc až 1000 x ppc, bylo vybráno 8 koncentrací, v rozmezí kterých docházelo nejčastěji к úplné metabolické inhibici testovaných kultur. Každá testovaná látka tvořila jeden řádek, v něm kromě 8 různých koncentrací zůstaly ještě 2 jamky, kam nebyla přidána testovaná látka a tyto jamky sloužily jako negativní kontrola udávající normální metabolickou aktivitu buněk (obr.6). Kultivační mikrodestička byla dále inkubována ve standardních podmínkách (37°C, 3.5% C02) 72 hodin.
testovaná látka obchodní název a výrobce ppc ÍHg/ml|
testované koncentrace [ násobek ppc]
cisplatina (cDDP) Platidiam, Lachema 5 0.5; 1; 5; 10; 15; 20
doxorubicin (Doxo) Doxolem, Medicom International Ltd. 0.5
0.5; 1;5; 10; 20; 30; 40; 50 gemcitabin (Gem) Gemzar, Lilly France S.A. 30
0.5; 1;5; 10; 20; 30; 40; 50 mafosfamid (Maf) Mafosfamide-L-Lysine, ASTA Medica AG 1
0.5; 1;5; 10; 20; 30; 40; 50 vinorelbin (Vnrlb) Navelbine, Pierre Fabre Oncologie 2
0.5; 1;5; 10; 20; 30; 40; 50
paklitaxel (Tax) Taxol, Bristol Myers-Squibb 10 0.05; 0.1; 0.5; 1; 5; 10; 15; 20 Tab. 2.: Látky testované v MTT testu chemorezistence.
cDDP Doxo Gem
Maf
Vnrlb
Tax
w testovací médium (bez buněk a bez testovaných látek)
® testovací médium s nejvyšší koncentrací testované látky (bez buněk)
# testovací médium s buňkami (bez testované látky)
# • • • • $ > 0 0 testovací médium s buňkami a testovanou látkou ve stoupající koncentraci Obr. 6: Schéma uspořádáni MTT testu chemorezistence in vitro. Jedna 96-jamková kultivační destička sloužila к otestováni šesti látek v osmi různých koncentracích.
Po 72 hodinové inkubaci byl do všech jamek přidán na 6 hodin 0.5 mg/ml roztok MTT v PBS. Mitochondriální dehydrogenázy živých buněk konvertují tuto žlutou látku na nerozpustné modré krystalky formazanu. Syntéza krystalků byla nejdříve po 6 hodinách
zhodnocena vizuálně, aby se předešlo falešně pozitivním či falešně negativním výsledkům (bakteriální kontaminace kultury se projevuje vysokou metabolickou aktivitou; naproti tomu, neúmyslné vynechání jedné jamky při dávkování buněčné suspenze by mohlo působit falešným dojmem, že došlo к úplné metabolické inhibici). Poté byla do všech jamek přidána lyzační směs (10% SDS, pH 5.3) a po celonoční inkubaci v 37 °C, která stačila к dokonalé solubilizaci krystalků, byla změřena optická densita jamek na ELISA-readru ve vlnové délce 590 nm proti pozadí 630 nm.
Naměřené hodnoty byly zpracovány v programu Excel a byly korigovány s hodnotou optické denzity testovacího média a původním vizuálním odečtem. Podíl optické denzity testované a kontrolní jamky udával procento metabolicky aktivních buněk, survival fraction (SF). Naměřené hodnoty (8 koncentrací pro každou látku) umožnily vytvořit pomocí programu Excel regresní křivku založenou na funkci udávající závislost procenta metabolicky aktivních buněk (SF) na koncentraci látky (c). Byly použity tyto funkce:
exponenciální funkce SF = a/.exp(a2.c);
exponenciela s aditivní konstantou SF = а/ + (100-ai) . exp(ci2. сj;
logistika 1 SF = а/ + (100-ai) . exp (a 2 . c);
logistika 2 SF = (100+ J00*exp(a,)) / (1 + exp(a, + a2. c));
Z regresní křivky bylo možné odečíst koncentraci látky potřebnou pro metabolickou inhibici jakéhokoliv procenta buněk. Pro srovnání rezistence kultur byly odečteny hodnoty MID 10, MID25, МГО50, МШ75 a MID90, čili koncentrace látky potřebné к metabolické inhibici
10, 25, 50, 75 a 90% buněk testované kultury. V případě, že žádná z testovaných koncentrací nedokázala inhibovat například 90% buněk testované kultury a regresní funkce, založená na všech naměřených hodnotách pro danou kulturu vykazovala pro inhibici 90% buněk nekonečně velkou koncentraci látky, byla hodnota MID90 pro danou kulturu označena jako neměřitelně vysoká (UMH, immeasurably high). Taková hodnota pak nebyla brána v úvahu při výpočtu mediánu MID90 pro určitou skupinu kultur.
Pro určení, zda rozdíly v in vitro rezistenci TC, Surg a Meta skupiny kultur jsou statisticky významné, byla pomocí párového Studentova t-testu, s koeficientem alfa rovným 0.05 srovnána průměrná hodnota MID90 mezi skupinami.
VII. Výsledky
7. Klonální růst jednotlivých epiteliálních buněk z prsního karcinomu
Publikováno ve Folia Biologica (Praha) 44: 67-71, 1998 (spoluautorka, Pavlíková)
V této práci bylo dosaženo prvního úspěchu v kultivaci epiteliálních buněk z primárního duktálního prsního karcinomu pomocí 3T3 feeder-layer techniky. Ze vzorku peroperační biopsie vyrostly 2 rozsáhlé kolonie ze dvou individuálních buněk náhodně přežívajících ve stresových pomínkách. Celkový životní čas kultury byl více než 30 generačních cyklů, z nich 21 v první pasáži. Celkem bylo dosaženo 4 pasáží. Potvrdilo se, že kultivační technika využívající mezenchymo-epiteliálních interakcí a metabolické aktivity ozářených fibroblastů pro růst epiteliálních buněk je schopna podpořit klonální růst mamárních buněk.
2. Kultivace buněk z normální mléčné žlázy, dočasné převládnutí luminálních buněk
Publikováno v Breast Cancer Res Treat 60: 241-249, 2000 (spoluautorka)
Vzorky normální mléčné žlázy velikosti 0.15 cm3 byly disociovány různými způsoby a kultivovány na 3T3 feeder-layeru. Výsledný způsob a doba rozvolňování tkáně (0.05%
kolagenázou ve 37°C přes noc, nebo 0.2% kolagenázou ve 37°C 2 hod) se ukázaly být nejdůležitějšími faktory pro získání kolonií čistě luminálních buněk (K19 pozitivních) v první pasáži. Časné pasážování subkonfluentní kultury a hustota nasazení (optimální
i 9
3.10 buněk/cm kultivační plochy) ve druhé a dalších pasážích byla důležitá pro převahu luminálních buněk ve 2.- 4. pasáži. V 5. pasáži již byla pozorována převaha myoepiteliálních buněk. Buňky luminálního fenotypu tvořily v první pasáži asi 30% buněčné populace, ve 4. pasáži již přibližně 90% buněčné populace. Celkem bylo u této kultury dosaženo 7 pasáží a 46 zdvojení buněčné populace. Schopnost tvořit kolonie (PE) v primokultuře byla 0.2%.
V dalších pasážích PE vzrostla na 10-12%, ale znovu prudce poklesla ke konci kultivace.
Výsledek je důležitý ze dvou důvodů - ukázal, že luminální buňky jsou schopny intenzívní proliferace in vitro, jaká dosud nebyla dosažena; a že rovnováha mezi myoepiteliálními a luminálními buňkami je ovlivnitelná vnějšími podmínkami. Pro
karcinomy mléčné žlázy je charakteristická porucha této rovnováhy, projevující se absencí myoepiteliální složky [5, 6, 7], porušení této rovnováhy je jeden z možných mechanizmů spouštějící proces maligní transformace buněk mléčné žlázy [8].
3. Kultivace buněk z benigních a maligních nádoru mléčné žlázy
Části 3.1 až 5.2 publikovány v Breast Cancer Res Treat 71: 219-235, 2002 (první autorka)
г
3.1 Úspěšnost v zakládání kultur
Bylo získáno 45 TC vzorků (true cut biopsy, perkutánní biopsie tenkou jehlou, objem
o i
kolem 0.01 cm ) a 80 Surg vzorků (peroperační biopsie, objem kolem 1 cm ) z benigních a maligních tumorů mléčné žlázy žen. Tři TC vzorky a 8 Surg vzorků bylo poškozeno nesprávnou manipulací, zejména v počátcích této práce (při optimalizaci techniky), anebo byly zničeny plísňovou nebo kvasinkovou kontaminací při izolaci, transportu či počátečních fázích zpracování vzorku.
Ze zbylých 42 TC vzorků (tab. 3):
-14 vzorků v první pasáži neobsahovalo žádné epiteliální buňky a kultura přerostla fibroblasty nebo v ní nerostly vůbec žádné buňky;
-z 15 vzorků se podařilo založit primokulturu (první pasáž) epiteliálních buněk, tyto buňky však nebyly schopny proliferovat tak, aby bylo možno kulturu dále in vitro pasážovat;
-13 vzorků dalo vzniknout epiteliálním kulturám, které bylo možno dále in vitro pasážovat;
Ze zbylých 72 Surg vzorků (tab. 3):
-3 vzorky v první in vitro pasáží neobsahovaly žádné epiteliální buňky a kultura přerostla fibroblasty nebo v ní nerostly vůbec žádné buňky;
-z 16 vzorků se podařilo založit primokulturu epiteliálních buněk, buňky však nebyly schopny proliferovat tak, aby bylo možné kulturu dále in vitro pasážovat;
-53 vzorků dalo vzniknout epiteliálním kulturám, které bylo možno dále in vitro pasážovat;
celkově 0 pasáží 1 pasáž 2 a v i c e pasážf
T C 42 1 4 ( 3 3 % ) 1 5 ( 3 6 % ) 1 3 ( 3 1 % )
T C 3 bng + 39 mlg 1 bng + 13 mlg 1 bng + 14 mlg 1 bng + 12 mlg
S u r g 72 3 ( 4 % ) 1 6 ( 2 2 % ) 53 ( 7 4 % )
S u r g
11 bng + 61 mlg 1 bng + 2 mlg 1 bng + 15 mlg 9 bng + 44 mlg
Tah. 3.: Úspěšnost při zakládání kultur. 0 pasáži - v kultuře nerostly epiteliální buňky, / pasáž - epiteliální buňky rostly pouze v primokultuře. 2 a více pasáži - epiteliální buňky bylo možno dále pasážovat
Zejména u ТС vzorků, které po rozvolnění obsahovali 104-105 buněk, je to velký úspěch.
Dosud nebyl publikován úspěšný pokus o kultivaci buněk získaných tímto způsobem.
Nepasážovatelné primokultury byly obvykle tvořeny několika koloniemi buněk, které morfologicky působily dojmem homogenně luminálních buněk. To bylo imunocytochemicky potvrzeno v 11 ze 14 testovaných primokultur. Až v poslední době se podařilo K19 homogenně pozitivní kulturu BT101 pocházející z maligního tumoru mléčné žlázy pomocí krátkodobé selektivní disociace tumoru, časného pasážování a přidání 2% FCS do kultivačního epiteliálního média (podmínky vyvinuté pro maximální expanzi luminálních buněk normální mléčné žlázy) udržet v kultuře po dobu šesti pasáží.
Delší dobu pasážované kultury obvykle jevily známky zpomalení in vitro proliferace kolem desáté pasáže. Většina proliferujících buněčných kultur byla uchována zmražením v tekutém dusíku.
3.2 Růstové vlastnosti kultur
Šest benigních a sedm maligních vzorků kultivovaných in vitro bylo vybráno к detailní charakterizaci růstových vlastností kultur. Detailní histopatologická charakterizace těchto vybraných vzorkuje v tab. 4, jejich růstové parametry v tab. 5.
РЕ, procento buněk schopných založit kolonii (šestý sloupec tab. 5) bylo v primárních kulturách velmi nízké, 0.07-0.125% u benigních vzorků a 0.01-0.1% u maligních vzorků.
S rostoucím počtem in vitro pasáží hodnota PE vzrostla až na 16%, s blížícím se koncem životaschopnosti kultury opět klesala.
Všechny testované kultury vykazovaly limitovaný proliferační potenciál (druhý sloupec tab. 5) in vitro. U čtyř benigních a jedné maligní kultury došlo к zastavení proliferace epiteliálních buněk in vitro, což u tří benigních kultur vedlo к přerůstání kultury fíbroblasty.
U ostatních kultur se limitovaný růstový potenciál projevil postupným snižováním PE.
Průměrná životnost benigních kultur byla 47 dní, maximální 65 dní. Průměrná životnost maligních kultur byla 63 dní, maximální 112 dní. Zejména u maligních kultur mohla být tato hodnota trochu vyšší, kultury byly většinou zmraženy před vyčerpáním proliferačního potenciálu.
Celkový počet generačních cyklů se nedal vypočítat přímo z počtu nasazených a sklizených buněk, výpočet musel být v každé pasáži korigován na množství klonogenních buněk (viz materiál a metody). Kumulací počtu generací určité kultury v každé in vitro pasáži
