Text práce (2.355Mb)

Univerzita Karlova v Praze

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd

Antimikrobiální peptidy při infekcích gramnegativními bakteriemi

Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Ing. Igor Šplíchal, CSc.

Garant za KBLV: PharmDr. Petr Jílek, CSc.

Hradec Králové, 2009 Bc. Petra Tocháčková

Prohlášení:

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci „Antimikrobiální peptidy při infekcích gramnegativními bakteriemi“ zpracovala samostatně a s použitím uvedené literatury.

V Hradci Králové, dne 15. 04. 2009

Podpis:

Poděkování:

Děkuji vedoucím diplomové práce Ing. Igoru Šplíchalovi a PharmDr. Petru Jílkovi, CSc. za odborné vedení a za cenné rady. Dále děkuji RNDr. Iljovi Trebichavskému, CSc. za podnětné připomínky a MUDr. Alle Šplíchalové, PhD. za technickou asistenci při získávání gnotobiotických selat a provádění pokusů.

Děkuji také všem vyučujícím fakulty, kterými jsem měla tu čest být vyučována, za jejich přístup ke studentovi a erudovanou podporu při studiu, čímž jsem získala vědomostní vhled do dané problematiky.

V neposlední řadě děkuji všem svým blízkým za neskonalou podporu při studiu.

Obsah:

1 Úvod ... 3

2 Literární přehled ... 5

2.1 Mikroorganismus versus makroorganismus ... 5

2.1.1 Normální střevní mikroflóra ... 5

2.1.2 Vliv mikroorganismů na vývoj střeva ... 6

2.2 Antimikrobiální peptidy ... 7

2.2.1 Vývoj a úloha AMPs v organismu ... 8

2.2.2 Struktura a mechanismus účinku AMPs ... 9

2.2.3 Proteolytické degradace a mikrobiální rezistence ... 12

2.2.4 Účinnost antimikrobiálních peptidů ... 15

2.2.5 Možnosti lékařského využití AMPs ... 18

2.3 Přehled AMPs ... 19

2.3.1 Hlavní představitelé AMPs produkovaných neutrofily ... 19

2.3.2 Hlavní představitelé AMPs produkovaných eozinofily ... 19

2.3.3 Hlavní monocytární a fagocytární AMPs ... 20

2.3.4 Hlavní AMPs produkované NK-buňkami a T-lymfocyty ... 20

2.3.5 Hlavní představitel AMPs produkovaný trombocyty ... 20

2.4 AMPs u prasete ... 20

2.4.1 Gnotobiologie ... 20

2.4.2 Prasečí antimikrobiální peptidy ... 22

2.4.3 Defensiny ... 23

2.5 Gramnegativní bakterie ... 27

2.5.1 Gramnegativní bakterie obecně ... 27

2.5.2 Lipopolysacharid ... 27

2.5.3 Salmonella ... 29

2.6 Popis metod ... 30

2.6.1 PCR jako výchozí metoda ... 30

2.6.2 Kvantitativní real time PCR ... 31

3 Cíl práce ... 34

4 Materiál a metody ... 35

4.1 Gnotobiotické prase ... 35

4.2 Popis rfaG- a rfaL- mutantú ... 37

4.3 Příprava a vzorků ... 37

4.4 Kvantifikace genové exprese ... 37

4.4.1 Izolace RNA ... 38

4.4.2 Stanovení koncentrace a čistoty celkové RNA ... 39

4.4.3 Syntéza cDNA - reverzní transkripce ... 39

4.4.4 Real time PCR – polymerázová řetězová rekce v reálném čase ... 40

5 Výsledky ... 43

5.1 Navržené systémy pro pBD1 a pBD2... 43

5.1.1 Návrh systému pro stanovení pBD1 ... 43

5.1.2 Návrh systému pro stanovení pBD2 ... 44

5.2 Celková RNA izolovaná z ilea ... 44

5.3 Exprese pBD1 a pBD2 normalizované k beta aktinu, cyklofilinu A a k oběma zároveň ... 45

5.3.1 Exprese pBD1 mRNA normalizovaná k mRNA beta aktinu; systém se sondou 63…….. ... 45

5.3.2 Exprese pBD1 mRNA normalizovyná k mRNA cyklofilinu A; systém se sondou 63……. ... 46

5.3.3 Exprese pBD1 mRNA normalizovaná k mRNA beta aktinu a cyklofilinu A; systém se sondou 63 ... 47

5.3.4 Exprese pBD2 mRNA normalizovaná k mRNA beta aktinu; systém se sondou 33……. ... 48

5.3.5 Exprese pBD2 mRNA normalizovaná k mRNA cyklofilinu A; systém se sondou 33…… ... 49

5.3.6 Exprese pBD2 mRNA normalizovaná k mRNA beta aktinu a cyklofilinu A; systém se sondou 63 ... 50

6 Diskuze ... 51

7 Závěr ... 58

8 Sezanm zkratek ... 59

9 Literatura ... 61

10 Přílohy ... 70

Bc. Petra Tocháčková

Antimikrobiální peptidy při infekcích gramnegativními bakteriemi Diplomová práce - abstrakt

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Farmacie

Cíl práce: Cílem práce je vypracování metodiky a stanovení možné genové aktivace antimikrobiálních peptidů (beta defensinů 1 a 2 – pBD1 a pBD2) v ileu při infekci gnotobiotických selat gramnegativními bakteriemi. Jako zástupce gramnegativních bakterií různé virulence byla zvolena Salmonela enterica serovar Typhimurium, kmen LT2 a její R mutanty (rfaG- a rfaL-).

Metody: 1) Návrh systémů pro stanovení prasečích pBD1 a pBD2 (software), 2) Purifikace celkové RNA (komerční kolony), kvantifikace (spektrofotometricky) a odhad její čistoty (poměr A280/A260), 3) Reverzní transkripce (směs náhodných n-merů a oligo d(T)m), 4) Kvantifikace cDNA (polymerázová řetězová reakce v reálném - LNA sondy) a 5) Normalizace genového přepisu pro pBD1 a pBD2 vůči beta aktinu, cyklofilinu A nebo oběma kontrolním genům zároveň.

Výsledky: Pro purifikaci celkové RNA a syntézu cDNA jsme použili metody, které snižují riziko kontaminace genomovou DNA a tím i falešně pozitivních výsledků. Navrhli jsme detekční systémy pro stanovení pBD1 a pBD2, jejichž efektivita byla okolo 100% (srovnatelná s efektivitami systémů pro kontrolní geny). Transkripce pBD1 nebyla ovlivněna absencí Salmonelly (bezmikrobní selata) nebo její virulentností. V případě pBD2 byly rozdíly v aktivaci genového přepisu statisticky významné u beta aktinu jako kontrolního genu, avšak ne v případě použítí cyklofilinu A jako kontrolního genu.

Závěry: U gnotobiotických selat infikovaných/osazených gramnegativní bakterií Salmonella enterica serotyp Typhimurium a jejích R mutantů jsme sice jednoznačně neprokázali vliv virulentnosti na expresi prasečích beta defensinů, nicméně jsme naznačili, že je tato cesta nadále otevřená hledání jiných vhodnějších mikroorganismů a jejich vakcinačních kmenů. Posílení vnitřních obranných mechanismů jedince by se mohlo stát jedním z nejjednodušších postupů, jak zabránit propuknutí masivní infekce ohrožující jedince na životě.

Využití vakcinačních kmenů stimulujících tvorbu endogenních antimikrobiálních peptidů by bylo přínosné nejen v humánní medicíně, ale také ve veterinární praxi.

Normalizací transkriptů pro pBD1 a pBD2 k různým kontrolním genům a jejich kombinaci jsme potvrdili oprávněnost používání vice kontrolních genů.

Bc. Petra Tocháčková

Antimicrobial peptides in infections with grammnegative bacteria Diploma thesis - abstract

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Pharmacy

Background: Aim of this thesis was a development of methods for detection of gene activation of antimicrobial peptides (beta defensins 1 and 2 – pBD1 and pBD2) in ileum during infection of gnotobiotic piglets with gramnegative bacteria. Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 and its R mutants (rfaG- and rfaL-) were selected as representants of gramnegative bacteria of different virulence.

Methods: 1) Suggestion of systems for detection of pBD1 and pBD2 (software), 2) Purification of total RNA (commercial columns), quantification (spectrophotometry), and estimation of its purity (ratio A280/A260), 3) Reverse transcription (mixture of random n-mers and oligo d(T)m), 4) Quantification of cDNA (real time polymerase chain reaction – LNA probes), and 5) Normalization of gene transcription for pBD1 and pBD2 against beta actin, cyclophilin A or to both together.

Results: We used a method reducing risk of contamination by genomic DNA and obtaining of false positive results for purification of total RNA. We suggested detection systems for estimation of pBD1 and pBD1 with efficiency approx. 100% (comparable with efficiencies of used housekeeping genes). The transctiption of pBD1 was not influenced by absence of Salmonella (germ-free piglets) or its virulence. The differences in activation of gene transcription of pBD2 were significant in beta actin used as housekeeping gene, but not in case of cyclophilin A.

Conclusions: An influence of virulence on expression of the porcine beta defensins in the gnotobiotic piglets infected/associated with gramnegative bacteria Salmonella enterica serovar Typhimurium was not unequivocally documented. However we pointed a possibility of this pathway to look for other more suitable microorganisms and their vaccine strains. A support of inner defense individual mechanisms would be one of the simplest attitudes how to protect against life-threatening infection. Using of vaccine strains stimulating production of endogenous antimicrobial peptides would be interesting either in medicine or in veterinary practice.

We confirmed a suitability of normalization of transcripts for pBD1 and pBD2 to different housekeeping genes and to their combinations.

1

Úvod

Objev a rozvoj používání antibiotik vedly k dramatickému obratu v léčbě infekčních onemocnění. Tyto látky mikrobiálního původu jsou schopny v nízkých koncentracích inhibovat růst jiných mikroorganismů. Antibiotika (ATB) patří mezi skupinu léčiv, která je v terapii infekčních onemocnění používána přibližně jedno století. Za tu dobu však tato strategie léčby zaznamenala nebývalý rozmach. Na počátku celosvětového užívání antibiotik stál penicilin G, který byl poprvé cíleně použit v klinické praxi ve 40. letech 20. století (MacGowan a kol., 1998).

Od té doby se začala ATB užívat nejen k cílené eliminaci infekčního agens, ale také jako součást potravy pro hospodářská zvířata, což mělo vést zejména k prevenci onemocnění a zvýšení užitkovosti. Po dobu třiceti let byla přibližně více než polovina světové produkce antibiotik spotřebována právě pro veterinární účely (Zhang a kol., 2000). Následkem nadměrného používání ATB byl nekontrolovatelný vstup antimikrobních látek do životního prostředí a výskyt reziduí těchto látek v živočišných produktech. Tím se dostávaly i do potravinového řetězce člověka. Nejvýznamnějším problémem spojeným s nesprávným a nadměrným užíváním ATB je rozvoj rezistence, který následně komplikuje léčbu velmi závažných bakteriálních infekcí. Antibiotika byla jako standardní přísada do krmných směsí v Evropě zakázaná od 1. ledna 2006.

Monitoring používání antibiotik u nás probíhá již od roku 2000. Sleduje se celková spotřeba a spotřeba v rámci jednotlivých skupin a substancí.

Dnešní výzkum ATB se zabývá hlavně vytvořením bezpečného antibiotika, s malým vlivem na vznik rezistence a s co možná největší selektivitou na původce onemocnění (MacGowan a kol., 1998). Takový typ antibiotika byl nalezen přímo uvnitř hostitelského organismu (Sang a Blecha, 2008). V buňkách hostitele se vytvářejí látky, které mají své nezastupitelné místo v obranné odpovědi na mikrobiální napadení. Tyto látky - antimikrobiální peptidy (AMPs) jsou krátké peptidické struktury, se schopností rozpoznat cizorodou buňku a zahájit proces směřující k likvidaci agens a spuštění dalších fyziologických procesů pro navrácení organismu zpět do homeostazy.

První kroky alternativní cestou ke klasickým ATB naznačil již Fleming v roce 1922 popisem antimikrobiálního účinku lysozymu. První AMPs - thioniny

byly objeveny v rostlinách roku 1972 (Fernandez de a kol., 1972). Následovaly hmyzí cecropiny a další rostlinné a bakteriální AMPs (Hultmark a kol., 1980).

Hlavním tématem předložené diplomové práce je stanovení exprese prasečích antimikrobiálních peptidů beta defensinů 1 a 2 v ileu gnotobiotického selete infikovaného gramnegativní bakterií Salmonella enterica serovar Typhimurium a jejími R mutanty (chemotypy Rd1 a Ra).

2 Literární přehled

2.1 Mikroorganismus versus makroorganismus 2.1.1 Normální střevní mikroflóra

Pasteur (†1895) pokládal mikroorganismy za nepostradatelné pro normální lidský život. Mečnikov (1910) zastával názor, že složení mikroflóry je nezbytné pro dobré fungování hostitelského organismu, a že interakce mezi hostitelem a původcem onemocnění jsou neméně důležité. Escherich (1885) tvrdil, že znalost endogenní mikroflóry je nezbytná nejen pro porozumění fyziologie trávení, ale také pro pochopení patologie a terapie mikrobiálních střevních onemocnění (Falk a kol., 1998).

Ve střevě zdravého jedince se během jeho vývoje ustanoví rovnováha osídlení jednotlivými bakteriálními kmeny bránící nežádoucímu přemnožení některého z kmenů. Osídlení v rámci střeva však není ve všech částech stejné, ale je regionalizováno na zóny, které jsou určitými druhy mikroorganismů upřednostňovány (Falk a kol., 1998). Na této regionalizaci se kromě vzájemné kompetice mikroorganismů o životní prostor podílí komponenty střevního imunitního systému hostitele (Matsumoto a kol., 1995). Mikrobiální společenství hostitele osidlující především gastrointestinální trakt (GIT) je významem své metabolické aktivity často srovnáván s metabolickou aktivitou jater. Počet bakteriálních buněk hostitele se uvádí jako 10¹³-10¹⁴ - o jeden řád více buněk než je počet vlastních buněk hostitele (v případě člověka). Toto zahrnuje 800 - 1000 druhů bakterií, z čehož převažují anaerobní a fakultativně anaerobní druhy (Wilks, 2007).

Obrázek č. 1.: Zvyšující se počty mikrobiálního osídlení v jednotlivých úsecích trávicího traktu člověka (O'Hara a Shanahan, 2006).

Složení mikrobionty je mezidruhově odlišné a specifické pro různé živočišné druhy v závislosti na délce střeva, typu zažívacího ústrojí a preferovanému složení stravy (Smith a Crabb, 1960). Mikroflóra se mění také během života jedince například v závislosti na změně potravy, prostředí, hygienických návycích apod. Dalšími faktory ovlivňující mikroflóru GITu jsou prodělaná onemocnění, léčba antibiotiky, hospitalizace a další (Le Frock a kol., 1979).

Obsazení GIT vhodnými bakteriálními kmeny zajišťuje určitou střevní vitalitu a zlepšuje schopnost střeva včasně reagovat na bakteriální agens. Tato reakce se projevuje tím, že při obsazené ekologické nice střeva vhodnými typy bakterií nedojde k přemnožení potenciálně patogenního kmene a nedochází k infekci. Na druhou stranu, pokud se infekce objeví, tak je střevo schopné na ni včas reagovat mimo jiné i pomocí antimikrobiálních peptidů (Falk a kol., 1998).

2.1.2 Vliv mikroorganismů na vývoj střeva

Mikroflóra se během života jedince vyvíjí. K ustanovení klimaxové¹ střevní mikroflóry dochází u živočichů po několika letech života od narození.

1 Klimax je finální stádium sukcese. Společenstvo, které je klimaxové, je stabilní a neměnné. Tento stav nastává u stanovišť, které byly osídleny druhy nejlépe adaptovanými na konkrétní místo.

Skladba mikrobionty ovlivňuje strukturu střevního epitelu, skladbu sousedních bakterií, komponenty střevního imunitního systému i biochemické funkce ve střevě (Midtvedt, 1986). Srovnání histologických rozdílů u bezmikrobních a mikrobiálně asociovaných selat rozpracovali ve své práci Van Kesselova skupina (Shirkey a kol., 2006).

Mikrofóra má přímý vliv na (Falk a kol., 1998) :

 Morfologii střeva

 Střevní motilitu

 Biochemické funkce ve střevě

 Modulaci komponentu slizničního imunitního systému (GALT)² - studie na mikrobiologicky definovaných (gnotobiotických) prokázala, že mikrofóra ovlivňuje rozložení GALT. Zpětně pak rozmístění GALT ovlivňuje rozložení jednotlivých druhů mikrofóry.

Látky (mj. AMPs), produkované činností GALT vytvářejí prostředí, které některé mikroorganismy znevýhodňují a dávají prostor jiným. Kolonizací určitých kmenů bakterií je pak možné stimulovat produkci žádoucích AMPs (Midtvedt, 1986).

2.2 Antimikrobiální peptidy

Antimikrobiální peptidy jsou malé endogenní molekuly s vysoce kladným nábojem a amfipatickou strukturou. Tvoří všudypřítomnou a důležitou složku přirozené imunity všech skupin mnohobuněčných organismů. Tato přirozená antibiotika mají širokou antimikrobiální aktivitu proti různým druhům bakterií, hub a virům. Zvýšená exprese genů pro AMPs a následná syntéza a uvolňování vlastních AMPs se v organismu realizuje skrze částečné propuknutí onemocnění.

Stav, kdy dochází ke zvýšené produkci AMPs lze záměrně vyvolat pomocí imunomodulátorů³ (Zhang a kol., 2000), živých vakcín nebo probiotik (Splichal a kol., 2005). Cílené zvýšení produkce AMPs formou probiotik a

2 GALT – Gut associated lymfoid tissue - komponent slizničního imunitního systému, který je rozprostřen v lamina propria. V hlenu gastrointestinálního traktu je větší množství lymfoidních buněk než ve zbytku celého těla (B-buněk je zde až 80%). Buňky B-lymfocytů v laminy propria produkující IgA, IgM, IgG.

3 Různé látky modulující imunitní odpověď na patogen aktivací obranných mechanismů

organismu.

živých vakcín je jednou z nejperspektivnějších cest ovlivnění hostitelských obranných mechanismů. Záměrem je vytyčení potenciálně vakcinačních kmenů, které by zvyšovaly produkci endogenních AMPs (Zilbauer a kol., 2005).

Využití AMPs jako možné alternativy klasických ATB může být limitováno současnými vysokými finančními náklady chromatografického čištění a chemické nebo rekombinantní syntézy AMPs. Alternativními cenově přijatelné strategie by mohly zahrnovat imunomodulaci, genový transfer a transgenové postupy (Hancock, 1999). Další výzkum na poli AMPs povede pravděpodobně k vývoji vhodného genového transferu a transgenových zvířat s kontrolovanou expresí daných AMPs (Zhang a kol., 2000).

2.2.1 Vývoj a úloha AMPs v organismu

AMPs jsou kódovány genově⁴ a vytvořeny podle mRNA (mediátorová kyselina ribonukleová) předlohy. Často jsou jako prekurzory dále upravovány enzymovou aktivitou na zralé formy. Geny pro AMPs mají pozitivní selekci a patří mezi jednu z nejvíce se exprimující skupinu savčích proteinů. Některé jsou konzervativní v rámci fylogenetické linie savců, některé se objevily a zase zanikly nebo byly rozšířeny genovou multiplikací v podskupinách savčích čeledí (Boman, 1998).

U savců jsou produkovány nejčastěji fagocytárními buňkami např.

neutrofily, makrofágy, dále eosinofily, T-lymfocyty, NK-buňky⁵ a epiteliálními buňkami. Nacházejí se v GIT, dýchacích a urogenitálních tkáních a to především na jejich epiteliálních površích. Tedy prakticky na celém rozhraní vnějšího a vnitřního prostředí organismu (Falk a kol., 1998).

V buňkách myeloidního původu jsou ukládány ve vakuolách a využívány k neoxidativnímu poškození mikroorganismu po pohlcení fagocytární buňkou nebo jsou uloženy v sekrečních granulích a připraveny pro následné uvolnění v čas potřeby (Agerberth a kol., 1999). Mukozní epiteliální buňky bez granulí uvolňují AMPs do svého okolí přímo (Zhang a kol., 2000).

Hlavní úloha AMPs v organismu spočívá v biochemické obraně proti potenciálnímu infekčnímu činiteli (Salzman a kol., 1994). Dalšími úlohami

4 Oproti konvenčním ATB, která syntetizovány zejména enzymatickou činností

mikroorganismů.

5 NK-buňky - přirození zabíječi.

AMPs jsou modulace T buněk, indukce chemokinů a sekvestrace volného lipopolysacharidu (LPS) v organismu, což má velký význam pro snížení rizika endotoxinového šoku při septickém stavu (Rosenfeld a Shai, 2006). AMPs se také uplatňují v procesu hojení ran (Steinstrasser a kol., 2008), při angiogenezi (Nishikawa a kol., 2008), aktivují buňky prezentující a rozpoznávající antigeny (dendritické buňky, makrofágy, lymfocyty). Některé typy AMPs jsou označovány jako alarminy, protože přivolávají a aktivují imunitní buňky specificky rozpoznávající antigeny (Eliasson a Egesten, 2008).

2.2.2 Struktura a mechanismus účinku AMPs

Všechny AMPs tvoří struktury malé velikosti (12-100 aminokyselinových zbytků), kladného náboje a amphipatické struktury, což zajišťuje jejich selektivitu na aniontovou fosfolipidovou dvojvrstvu (Boman, 1995). Podle strukturní příbuznosti je můžeme rozdělit na lineární a cyklické peptidy.

Lineární mají alfa helikální strukturu (např. u člověka LL-37, u plazů magainin, u hmyzu cecropin) nebo prodlouženou strukturu (např. indolicidin). Cyklické mají dva nebo více disulfidických můstků s beta skládaným listem např.

defensiny (Andreu a Rivas, 1998), smyčkovou strukturu nebo smíšenou např.

lidský alfa defensin.

Obrázek č. 2.: Znázornění struktur: (A) smíšená, (B) smyčková, (C,D) s beta skládaným listem, (E) alfa helikální, (F) prodloužená (Jenssen a kol.,

2006).

Hlavním mechanismem účinku je elektrostatická interakce kladně nabité molekuly AMPs s negativně nabitou fosfolipidovou buněčnou membránou a

následná permeabilizace buněčné membrány. Permeabilizace probíhá nejčastěji dvěma mechanismy. Prvním je vytvoření transmembránových pórů mechanismem uspořádání AMPs do podoby skruže (C). Druhý způsob je skrze membránové narušení a solubilizaci tzv. kobercovitým mechanismem (D), při kterém procesem flip – flop přestupuje řetězec AMPs přes vnitřní buněčnou membránu a vytváří micelární struktury v negativně nabitých membránových lipidech (Matsuzaki a kol., 1998). Dalšími méně častými mechanismy proděravění buněčné membrány je prstencovité uspořádání (B), při které se peptidy přímo zanořují do membrány. Posledním mechanismem proděravění buněčné stěny je uspořádání do agregátů (A), kdy se vytvářejí micelám podobné komplexy peptidů s lipidy bakteriální membrány. U gramnegativních bakterií (G-) se AMPs vážou na negativně nabitý LPS v místě dvoumocného kationtu hořčíku, což vede k vytvoření štěrbiny v membráně nebo neutralizují část membrány a způsobí ztrátu rovnováhy a její rozpad (Rosenfeld a Shai, 2006). Ve všech případech se tvoří na napětí závislé póry nebo kanály, ve kterých hydrofobní povrch AMPs interaguje s lipidovým jádrem membrány a prostupuje do cytoplasmy (Oren a Shai, 1998). Membránové poškození není však jediným antimikrobiálním mechanismem. AMPs může též proniknout do nitra buňky, kde ovlivní různé buněčné pochody, které vedou k zániku buňky nebo k neschopnosti jejího dělení. Cílovou strukturou je pak například DNA, RNA, proteiny, enzymy nebo jiné komponenty buňky (E-I) (Brogden, 2005;

Jenssen a kol., 2006).

Obrázek č. 3.: Mechanismy účinku AMPs (Jenssen a kol., 2006).

AMPs mohou v hostitelském organismu spouštět i odlišné procesy vedoucí k aktivaci protiinfekčních mechanismů (Vývoj a úloha AMPs v organismu). AMPs mají také výrazný lytický účinek na mikroby s malou nebo žádnou cytotoxicitou na hostitelské buňky. Specifičnost účinku AMPs na mikroorganismy je založena na rozdílu skladby buněčné membrány (případně přítomnosti buněčné stěny) eukaryotické a prokaryotické buňky.

Mikroorganismy mají vysoký obsah anionických fosfolipidů a neobsahují cholesterol (Zhang a kol., 2000).

Antimikrobiální aktivita peptidů je vázaná na prostředí, které je izotonické s prostředím v savčích tělesných tekutinách. Membránové poškození mikroorganismu, které je považováno za primární antimikrobiální mechanismus účinku, vyžaduje kationické vlastnosti AMPs pro počáteční interakci peptidu s anionickým skupinou mikrobních membránových lipidů. Dále hydrofobní

vlastnosti umožňující vazbu peptidu na hydrofobní komponenty membrány (Zhang a kol., 2000). Podrobnější mechanismus účinku viz Účinnost antimikrobiálních peptidů.

2.2.3 Proteolytické degradace a mikrobiální rezistence

Některé mikroorganismy jsou rezistentní na určitý typ AMPs, což hraje zásadní roli v jejich schopnosti kolonizovat a infikovat hostitele (Peschel, 2002).

Citlivost původně vnímavých bakteriálních mutantů k AMPs se podařilo snížit i v experimentálních podmínkách in vitro (Kristian a kol., 2003). Expozice pomalu se zvyšující koncentraci AMPs může u bakterií po několika stovkách generací zapříčinit reversibilní fyziologickou adaptaci. Přesně se však neví, jak specifické tyto adaptace mohou být. Dosud také není jasné, jak ovlivňuje evoluci AMPs vývoj mikrobiální rezistence. Například Staphylococcus aureus se stává stále více rezistentní na dostupná antibiotika (Foster, 2004), ale AMPs si úspěšně zachovávají svou antimikrobiální účinnost i proti těmto typům mikroorganismů přes milióny let. To potvrzuje teorii, že AMPs a mikrobiální rezistence se v průběhu evoluce spoluvyvíjela a modulovala. Mikrobiální rezistence má také nejspíš vliv na šíři repertoáru AMPs. Některé AMPs jsou považovány za zásadní při odpovědi organismu na bakteriální infekci (Kraus a Peschel, 2006). Pro terapeutické účely je klíčové určit, zda a jak rychle mohou bakterie rozvinout odpovídající AMPs rezistenční mechanismy (Peschel a Sahl, 2006).

Jednotlivé mechanismy vzniku rezistence na AMPs a možnosti adaptace organismu na ně:

 Hydrolytická inaktivace produkcí peptidáz a proteáz (A,B) - jednoduché lineární struktury nebo alfa helixy jsou relativně citlivé k proteolýze. Řešením jak tomu zabránit je pak zavedení disulfidických můstků. Tím se peptidická struktura stává rigidnější a odolnější. Například u beta defensinů nejsou disulfidické můstky nezbytně důležité pro antimikrobiální aktivitu (Wu a kol., 2003), ale pro zvýšení stability (Peschel a Sahl, 2006). Některé z těchto obměn struktury je možno využít také u komerčně vyráběných

léčiv⁶. Množství variací je však omezené. Například pro aktivitu savčích AMPs atrahující leukocyty existuje pouze malé množství obměn, které mohou být provedeny bez ztráty aktivity (Peschel a Sahl, 2006).

 Úniková bakteriální AMPs-specifická rezistence (C) - spočívá v rozpoznání a extracelulárním vychytání nebo specifické aktivní vytlačení AMPs z bakteriální membrány (Jin a kol., 2004). Pro účinnost AMPs je nezbytná jen krátká sekvence aminokyselin.

Odstraněním nepotřebných sekvencí může dojít ke ztrátě rezistence původce onemocnění na dané AMPs. Velké množství příbuzných AMPs, lišící se pouze malou obměnou v sekvenci aminokyselin, které vznikly mutací, nebo duplikaci repetičních genů, ztěžuje mikroorganismu najít takovou strukturu, která by jednoznačně charakterizovala dané AMPs.

 Redukce afinity AMPs modifikací bakteriální stěny změnou náboje (D) - bakterie snižující záporný náboj na svém povrchu redukuje afinitu AMPs k buněčnému povrchu (Peschel, 2002). Záporně nabitá stěna bakterie obsahuje peptidoglykany, teichoové kyseliny, lipid A nebo fosfolipidy. Bakterie může přestavět tyto komponenty tak, aby byly méně přitahovány molekulami AMPs (Peschel a Sahl, 2006). Kapacita změny náboje buněčné stěny bakterie je však omezená (Weidenmaier a kol., 2004).

 Vytvoření biofilmu - antibakteriální účinnost antibiotik i antimikrobiálních peptidů může být ovlivněna také typem společenství, ve kterém daný mikroorganismus žije. Komunitní společenstva mikroorganismů vytvářejí biofilm, který je těžší narušit účinkem antimikrobních látek (Otto, 2006).

6 Na stejném principu je založeno zvýšení stability proti beta laktamázám u penicilínů, tímto mechanismem vzniká na beta laktamázy rezistentní oxacilin.

Obrázek č. 4.: Jednotlivé mechanismy vzniku rezistence na AMPs a možnosti adaptace organismu na ně (Peschel a Sahl, 2006).

Protože AMPs působí na nespecifické, strukturně rigidní komponenty, tak jsou schopny postihnout široké spektrum mikroorganismů bez rozvoje resistence (Tjabringa a kol., 2005). Rezistence vůči AMPs je v porovnání s rezistencí na ATB⁷ pozorována jen zřídka a málokdy má delšího trvání (Peschel a Sahl, 2006). Hostitelský organismus je schopen přizpůsobit se vzniklé rezistenci například úpravou struktury peptidu tak, aby byla opět účinná.

7 Tradiční ATB často inhibují specifické bakteriální enzymy podílející se na syntéze buněčné stěny, důležitých proteinů nebo DNA a obvykle působí pouze na určitou cílovou strukturu. Tyto cílové struktury mohou být změněny mutací původce onemocnění, čímž vzniká rezistence na dané ATB.

Obrázek č. 5.: Adaptace organismu na vznik rezistence (Peschel a Sahl, 2006).

2.2.4 Účinnost antimikrobiálních peptidů 2.2.4.1 Antivirová aktivita

AMPs jsou schopny ovlivnit absorpci viru, vstup viru do buňky, nebo přímo narušit virový plášť. Jsou účinné proti RNA i DNA virům (Roch a kol., 2004).

Zabránění vstupu viru do buňky se děje hlavně interakcí s virovým glukosaminglykanem – heparan sulfátem (Shieh a kol., 1992) nebo interakcí se specifickými buněčnými strukturami virových receptorů. Také se uplatňuje interakce s glykoproteidy virového obalu. Přenos virové nákazy z buňky na buňku se realizuje inhibicí zformování syncytia⁸ (Mikloska a kol., 2001). Buňka může být schopná působením AMPs změnit propustnost své membrány vůči virovému agens preventivním zvýšením kyselost v endocytárních vesikulách.

Antimikrobiální peptidy mohou stimulovat buněčné antivirové mechanismy.

8 Těsné mezibuněčné spoje

Působí i imunomodulačně stimulací chemokinů a interferonů (Andersson a kol., 2004).

Peptid Struktura / Zdroj Virus Mechanismus účinku

LL-37 Alfa-helix / lidský Herpes simplex virus (HSV)

Virová inaktivace

Defensiny Beta skládaný list / Savčí

HSV,HIV, Adenovirus

Inaktivace glykoproteinu Lactofericin Beta otočka /

lidský, prasečí

HIV,HSV, papilomavirus

Blok heparan sulfátu

Protegrin Beta skládaný list / lidský, prasečí

HIV, HSV Inhibice

integrace, inhibice glykoproteinu Tabulka č. 1.: Příklady antivirových peptidů a jejich mechanismu

účinku(Jenssen a kol., 2006).

2.2.4.2 Antibakteriální aktivita

Antibakteriální účinnost AMPs se zakládá na interakci s anionickými lipidy bakteriální stěny, hydrofobicitě a flexibilitě molekuly peptidu (Hancock a Rozek, 2002). Molekula AMPs je amfifilní s regiony o vysoké koncentraci pozitivně nabitých nábojů.

Interakce s bakteriální stěnou probíhá v několika krocích. Prvním je vytvoření elektrostatické vazby mezi kladně nabitým peptidem a negativním komponentem bakteriální stěny, kterým je fosfátová skupina lipopolysacharidů G- bakterií nebo lipoteichoová kyselina u grampozitivních (G+) bakterií. Tato interakce vede k začlenění peptidu do membrány, porušení a permeabilizaci stěny bakterie. Množství negativně nabitých okrsků v bakteriální stěně umožňuje selektivitu peptidů na bakteriální buňku. Peptidy jsou účinné i ve velmi nízké koncentraci (Brogden, 2005).

Peptid Struktura Zdroj Mechanismus

účinku

LL-37 Alfa-helix Lidský Permeabilizace stěny

Alfa/beta defensiny

Beta skládaný list Savčí Inhibice molekulární syntézy

Indolicidin Prodloužená Prasečí ^Inhibice

makromulekulární syntézy, kalmodulin interakce

Protegrin Beta skládaný list Lidský, prasečí Permeabilizace stěny

Tabulka č. 2.: Příklady antibakteriální peptidů a jejich mechanismu účinku (Jenssen a kol., 2006).

2.2.4.3 Antifungální aktivita

Mezi infekčními onemocněními se jako velký problém ukazuje terapie plísňové a houbové nákazy. Houby a plísně mají buněčné komponenty podobnější eukaryotní buňce než je tomu například u bakterií, a proto se zde nesnadno vytváří účinný ochranný mechanismus. Mnohá antibiotika jsou proti nim neúčinná. Mezi AMPs jsou však i takové, které vykazují fungicidní účinnost. Mechanismus účinku spočívá hlavně v permeabilizaci membrány a inhibici syntézy stěny (De Lucca a Walsh, 1999). Na antifungální selektivitě se podílí schopnost vazby na chitin nebo heparin (Andersson a kol., 2004).

Peptid Struktura / Zdroj

Cílový organismus

Mechanismus účinku

PMAP-23 Alfa-helix /

prasečí

Candidosa albicans

Permeabilizace stěny

Defensiny Beta skládaný list / Savčí

Candidosa albicans

Permeabilizace stěny, lýza buněčná

Indolicidin Prodloužená / Prasečí

Trichosporon beigelii

Permebilizace buněčné stěny

Cecropin Alfa helix / Hmyz Aspergillus fumigatus

Váže

ergosterol/cholesterol

Tabulka č. 3.: Příklady antifungálních peptidů a jejich mechanismu účinku (Jenssen a kol., 2006)

2.2.4.4 Antiparazitální aktivita

Také parazitární nákazy jsou jedním z velmi diskutovaných celosvětových problémů. Týkají se zejména zemí třetího světa. Ročně si vybírají milionové oběti na životech. I zde je pak potenciální možnost směrování této léčby směrem k antimikrobiálním peptidům. Mechanismus antiparazitárního účinku AMPs je obdobný jako u výše jmenovaných. Jedná se

hlavně o interakci s epitelem parazita. Takto působí například defensiny na Trypanosoma brucei a Leishmania major (Davis a Kedzierski, 2005). Na druhou stranu se zde vyskytují i zcela odlišné a ne úplně objasněné mechanismy účinku (Roch a kol., 2004).

2.2.5 Možnosti lékařského využití AMPs

Využitím produkce antimikrobiálních peptidů ve střevě by bylo možné předcházet velkému problému, který sebou nesou alimentární nákazy.

Průjmová onemocnění jsou velmi častou příčinou smrti hlavně v rozvojových zemích a velice nepříjemným onemocněním vůbec. Lze tak bojovat vůči nitrobuněčným parazitům jako jsou Salmonella nebo Mycobacterium (Araneo a kol., 1996) a dalším původcům hlavních bakteriálních infekčních onemocnění člověka. Stimulací vhodných AMPs je možné předejít rozvoji infekce a zamezit tak fatálnosti onemocnění. Na využití těchto látek také čeká veterinární medicína, která touto vhodnou náhradou antibiotik dosáhne zvýšení užitkovosti zvířat trpících různými onemocněními (Sang a Blecha, 2008).

Antimikrobiální peptidy se zdají být perspektivním řešením pro budoucí léčbu infekčních onemocnění a to nejen samostatně, ale také v kombinaci se stávajícími antibiotiky, kde by se využil jejich aditivní a synergizující efekt. Dále v léčbě virových onemocnění jako je HIV (Mikloska a kol., 2001) pro snížení rezistence na stávající léčbu. Ohnisko výzkumu v oblasti AMPs se soustředí také na vyjádření vztahu struktury k mechanismu účinku a na možnosti syntézy potenciálně účinného AMP (Jenssen a kol., 2006).

Dá se očekávat, že vývoj antibiotik půjde třemi hlavními směry. První je obměna existujících antibiotik. Dalším směrem, kterým může být zaměření účinku ATB na neproteinové struktury jako je například cytoplazmatická membrána. Zde se nabízí možnost kombinace membránu poškozujícího AMPs s antibiotikem, které má vysokou afinitu na některou specifickou neproteinovou strukturu bakteriální stěny (např. nisin). Třetím směrem je využívání

„chytřejších“ antibiotik s mnohostrannou antimikrobiální aktivitou a tímto způsobem zabránit rozvoji rezistence. V dnešní době se navíc spektrum účinku klasických antibiotik stále více přesouvá na léčbu nádorových onemocnění (Peschel a Sahl, 2006).

Množství adaptačních strategií vyskytujících se u AMPs dává tušit velkému potenciálu lékařského využití. Vizí je, kontrola daleko většího množství

patogenních kmenů bez vytváření selekčního tlaku, jak tomu je u konvenčních ATB. Na druhé straně jsou velké dávky, které by byly nutné k ovlivnění původce onemocnění, potenciálně nebezpečné pro rozvoj většího množství nežádoucích účinků než je tomu u dnešních ATB. Nežádoucí účinky rozmanitých typů AMPs můžeme dnes však pouze odhadovat, protože všechny AMPs v organismu jsou uvolňovány z buněk pouze lokálně a ve velmi malém množství na to, aby způsobily celkovou reakci. Z experimentálních pokusů omezeného množství zkoušených AMPs ukázalo porušení střevní homeostazy, které může vést až k Crohnově nemoci a ulcerosní kolitidě (Peschel a Sahl, 2006).

2.3 Přehled AMPs

2.3.1 Hlavní představitelé AMPs produkovaných neutrofily⁹

AMPs jsou v neutrofilech uskladněné v granulích nebo jsou uloženy volně v cytoplazmě (Sima a kol., 2003).

 Baktericidní permebilitu zvyšující proteiny

 Kalprotektiny

 Katelicidiny

 Defensiny - viz 2.4.3.1

 Laktoferrin a laktoferricin

 Lysozym / muramidasa

 Fosfolipáza A2

 Serprocidiny a elastáza

2.3.2 Hlavní představitelé AMPs produkovaných eozinofily¹⁰

Cytotoxickou aktivitu eozinofilů zajišťují granula s obsahem kationtových AMPs. Mezi zástupce těchto AMPs patří (Sima a kol., 2003):

 Neurotoxin

 Protein-1

9 Neutrofily jsou krátce žijící buňky imunity kolující v krvi. Mají schopnost penetrovat do

zánětlivých tkání, kde uvolňují různé působky a pozitivně zvyšují regulaci receptorů dalších efektorů.

10 Eosinofily jsou schopné migrace do tkání, kde uvolňují cytokíny, mediátory zánětu a kationické proteiny. Mají schopnost pohlcovat bakterie i houby a působit cytotoxicky na eukaryotní parazity.

2.3.3 Hlavní monocytární a fagocytární¹¹ AMPs

Mezi AMPs nacházející se v těchto buňkách patří hlavně kalprotektin.

Kalprotektin je silně exprimován zánětlivou tkání a je tudíž cenný ukazatel zánětlivé reakce například v plicní tkáni (Splichal a kol., 2002).

2.3.4 Hlavní AMPs produkované NK-buňkami a T-lymfocyty

Tyto vysoce aktivní buňky imunitního systému obsahují například:

 Performin

 Saposiny (Leippe, 1995)

 Granulysin (Zhai a Saier, 2000).

2.3.5 Hlavní představitel AMPs produkovaný trombocyty

Zde se nachází tzv. platelet mikrobicidní peptid – PMP sekretovaný při aktivaci destiček trombinem (Sima a kol., 2003).

2.4 AMPs u prasete 2.4.1 Gnotobiologie

Zdravý jedinec placentálního savce je až do porodu sterilní. K prvnímu takovému kontaktu a k iniciační inokulaci GITu dochází již během porodu při průchodu porodními cestami. Pokud prostředí není pro daný mikroorganismus z hlediska životního prostředí limitující¹², pak převládají mikroorganismy s vysokou množivostí (Matsumoto a kol., 1998).

Prvenství myšlenky vytvoření aseptického prostředí pro chov zvířat je přisuzováno L. Pasterovi (†1895), který byl sám přesvědčen o nemožnosti života bez mikrobů. Teoreticky rozpracoval techniku získávání organismů prostých mikrobů. Krátce po jeho smrti Nuttal a Thierfelder (1896-1897) prokázali odchovem bezmikrobního morčete, že je možný život makroorganismu bez mikrobů.

Chováním živočichů (nebo rostlin) v mikrobiologicky definovaných podmínkách se nazývá gnotobiologie z řeckého slova gnosis (znalost) a bios (život) (Gustafsson, 1959). Podstatná je schopnost kontrolovat složení životního prostředí, ve kterém živočich vyrůstá a žije. Jako gnotobiotické se

11 Monocyty a mokrofágy reprezentují první linii obrany při setkání s patogenem.

12 Limitujícími podmínkami se rozumí zejména požadavky na teplotu, živiny a přítomnost antimikrobiálních látek, které mohou být produkovány v daném prostředí jiným přítomným bakteriálním kmenem.

označují zvířata nebo rostliny, které jsou bezmikrobní nebo jsou asociované (mono-, di-, tri-, až polyasociované) definovanými mikroorganismy. Protiváhou gnotobiotických organismů jsou organismy konvenční s neznámou/nedefinovanou mikroflórou.

Obrázek č. 6.: Rozdíly mezi konvenčními, bezmikrobními a asociovanými organismy (Šplíchal, 2009).

Kombinace genetických manipulací modelového organismu a gnotobiologie poskytuje nové informace o tom, jak mikroorganismy ovlivňují normální vývoj, organizaci, udržování slizničního imunitního systému a funkci epiteliálních buněk organismu. Experimentálně se studuje vztah mikroorganismu s hostitelem v bezmikrobním prostředí. Vyhodnocuje se efekt přidaného mikroorganismu nebo definované skupiny mikroorganismů k hostiteli. Ukazuje se, že hranici mezi patogenními a nepatogenními organismy může tvořit jejich rozdílná schopnost působit na funkci a diferenciaci buněčné stěny¹³ (Finlay a Cossart, 1997).

Gnotobiologie může dále přispět k novému pohledu na etiologii infekčních onemocnění, akutních a chronických zánětlivých pochodů a pravděpodobně také v objasnění tumorogeneze (Falk a kol., 1998). V bezmikrobních organismech lze střevo kolonizovat téměř jakoukoliv nově příchozí bakterií, včetně nepatogenních a probiotických a vyhodnocovat jejich rizika a benefity.

13 Tím je myšleno, že patogenní mikroorganismy mají schopnost a tendenci buněčnou stěnou hostitele procházet a nepatogenní mikroorganismy jí nepronikají, ale spíše modulují její funkce a produkci působků.

konvenční bezmikrobní asociovaný

gnotobiotický organismus

Pro účel této práce bude blíže popsáno miniaturní prase domácí (Sus scrofa domestica) jako model pro studium v mikrobiologicky definovaných podmínkách. Prasečí model je vhodný pro studium mnoha lidských chorob jako je diabetes, koronární aterosklerosa, atopická dermatitida a další díky podobnosti vnitřních struktur s lidskými (Rothkotter a kol., 2002; Vodicka a kol., 2005). Na prasečím modelu je dobře rozpoznatelné jak se AMPs podílejí na průběhu těchto onemocnění. Lze zde zkoumat podmínky vedoucí ke zvýšené expresi genů pro jednotlivé AMPs. Výhodné je také znemožnění pasivní imunizace plodu přestupem imunoglobulinů matky do plodu díky epiteliochoriálnímu typu placentace (Sterzl a Silverstein, 1967). Bezmikrobní prasata mají díky absenci mikroflóry ve střevě nižší utilizaci potravy a nezralý GALT, což se projevuje nezralými T lymfocyty ve střevních klcích. Také dlouho chybí buňky tvořící IgG a IgA v lamina propria (Mandel a kol., 1995; Sang a Blecha, 2008; Sima a kol., 2003).

2.4.2 Prasečí antimikrobiální peptidy

Prvním AMP izolovaným z prasete byl v roce 1989 cecropin s označením P1 a nachází se v horní části tenkého střeva (Lee a kol., 1989).

Další ho záhy následovaly. Podle biologické funkce a sekvenční odlišnosti rozeznáváme dvě hlavní rodiny AMPs - katelicidiny a defensiny (Zhang a kol., 2000).

Stručný přehled základních skupin prasečích AMP:

 Kateliciny: skupina protegrinů, profeninů

 Beta defensiny viz 2.4.3.2

 NK-lysin

 Cecropin P1

 Hepcidin

 LEAP-2 - Liver expressed antimikrobial peptid 2 – játry vylučovaný antimikrobiální peptid

 PGRP - Peptidoglykan recognition proteins – peptidoglykany rozeznávající protein

(Sang a Blecha, 2008)

2.4.3 Defensiny

Jako stěžejním AMPs pro účel této práce byl vybrán prasečí beta defensin ze skupiny defensinů. Je to skupina AMPs, která je poměrně velmi dobře prostudovaná a potenciálně biomedicínsky využitelná.

2.4.3.1 Defenziny obecně

Defensiny jsou malé lysosomální kationtové peptidy. Je to rozsáhlá na cystein bohatá skupina kationtových AMPs, která se vyskytuje u obratlovců i bezobratlých, rostlinách i v houbách(Sang a kol., 2006). V současnosti jsou stále objevovány nové typy defensinů (Sang a Blecha, 2008). Jejich schopnost inaktivovat bakterie rupturou membrány hraje důležitou roli ve vnitřní obranné bariéře organismu. Vykazují účinnost na různé bakterie a houby. Defensiny také působí chemotakticky na dendrické buňky, T-lymfocyty a monocyty. Dále jsou schopné stimulovat angiogenezi, podporovat uvolnění histaminu z žírných buněk a prostaglandinu - PGD2. Mají schopnost inhibovat vazbu adenokortikotropního hormonu na jeho receptory a tím vykazují kortikostatický efekt (Zhang a kol., 2000). Podle typu párování cysteinů a vytvořených disulfidických můstků jsou rozdělené do tří kategorií na alfa, beta a gama defensiny (Lehrer, 2004). Alfa defensiny mají disulfidické můstky na C1-C6 a C3-C5, beta defensiny na C1-C5, C2-C4 a C3-C6.

Obrázek č. 7.: Disulfidické můstky savčích alfa a beta defensinů (Zhang a kol., 2000).

Gama defensiny jsou malé asi 18 aminokyselin dlouhé cyklické peptidy, která se vyskytují pouze u pár druhů opic. Mají tři disulfidické můstky (Sima a kol., 2003).

Alfa defensiny jsou bohaté na arginin a jsou vylučovány zejména Panethovými buňkami, ze kterých jsou pak uvolňovány do Lieberkühnových krypt viz obrázek č. 8. (Lievin-Le a Servin, 2006). Jejich antimikrobiální účinnost může být ve střevě ovlivněna salinitou a vodní rovnováhou.

Antimikrobiální spektrum alfa defensinů zahrnuje G+ i G- bakterie, obalené viry a houby (Sima a kol., 2003).

Obrázek č. 8.: Panethové buňky uvolňují alfa defensiny do Lieberkühnových krypt (Lievin-Le a Servin, 2006).

Beta defensiny mají strukturu, kde striktně převládá cystein (Zhao a kol, 1996). Lidský beta defensin hBD1 se uplatňuje při zánětlivých reakcích, hBD2 je několikanásobně účinnější v antimikrobiální obraně.

Gama defensiny mají silnou antibakteriální účinnost proti G+ i G- bakteriím. Jeho lidský homolog retrocyklin má potenciální schopnost prevence a zpomalení nákazy virem HIV (Sima a kol., 2003).

2.4.3.2 Prasečí beta defensiny

U prasete se nevyskytují alfa ani gama defensiny. Prasečích beta defensinů (pBD) známe v dnešní době třináct pBD a všechny mají šest cysteinových zbytků. Podle délky, genové struktury a homologie aminokyselin rozdělujeme beta defensiny do dvou skupin. První jsou 61-65 aminokyselin dlouhé a gen pro jejich expresi je kompaktní s krátkou sekvencí intronů. Jsou exprimovány hlavně v ústním a dýchacím epitelu. Druhá skupina beta

defensinů je o 3-10 aminoskupin delší a jejich gen je poměrně rozsáhlý s obsahem dlouhých intronů. Jsou exprimovány v urogenitálním traktu, respiračním a zažívacím epitelu (Zhang a kol., 2000).

Obrázek č. 9.: Organizace genů pro beta defensiny – dva krátké exony a dlouhý intron (Zhang a kol., 2000).

Mezi hlavní exprimované defensiny u prasete patří pBD1. Jejich exprese probíhá z velké části v leukocytárních buňkách jazyku, a tenkého střeva (Veldhuizen a kol., 2006). Na jejich zvýšené expresi se podílí bakteriální lipopolysacharid, tumor nekrotizující faktor - TNF alfa, interleukin-1 alfa a infekce některými typy bakterií. Jeho účinek se projevuje proti G+ i G- bakteriím i houbám (příklady citlivých kmenů jsou E.coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Candida albicans). Pro jeho účinnost je důležité vhodné pH a salinita prostředí (Zhang a kol., 2000).

Defensin pBD2, který je exprimován zejména v ledvinách, tenkém střevu a játrech je z 60% podobný lidskému beta defensinu – hBD1 (Veldhuizen a kol., 2006; Veldhuizen a kol., 2008a). Všechny rozdíly v primární struktuře těchto defensinů se nacházejí na povrchu molekuly, což vede ke změně lokálního náboje a vzniku hydrofilnějšího konce helixu a více hydrofobní smyčky. Příprava syntetického peptidu, redukované formy přírodního peptidu, se realizuje bez disulfidických vazeb. Tato redukce nemá vliv na spektrum

bakteriálního účinku (Hoover a kol., 2001). Při experimentálním podání synteticky připraveného pBD2 do organismů infikovanými různými typy mikroorganismů se vyskytla dobrá reakce na tuto léčbu hlavně u Listeria monocystogenes, Erysipelothrix rhusiopathiae a Salmonella typhimurium. U dalších mikroorganismů jako jsou Clostridium perfringens, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Yersinia enterocolitida¹⁴ se žádoucí baktericidní efekt dostavil až po zvýšení koncentrace. Mechanismus antibakteriálního účinku byl blíže studován u Salmonella typhimurium, kde byla pozorována formace vakuol, vchlipování cytoplazmatické membrány a následný únik cytoplazmy a lýza bakteriální stěny. Výsledkem byl „duchu“ podobný obal bakterie. Tento výsledný efekt byl porovnatelný s lidským hBD1 a proto se dá předpokládat, že pBD2 hraje významnou roli v antimikrobiální ochraně u prasete (Veldhuizen a kol., 2006; Veldhuizen a kol., 2008a). Antimikrobní aktivita tohoto defensinu se zdá být velice významná a perspektivní pro další využití. Studuje se pozitivní vliv obecně na diareu, enterokolitidy a jiné střevní onemocnění. Stimulací pBD2 ve střevě například dietním opatřením může zvýšit střevní odolnost, redukovat střevní infekce a zamezit nutnosti používání antibiotik (Veldhuizen a kol., 2006; Veldhuizen a kol., 2008a).

Zvýšení exprese defensinů v zažívacím traktu je studováno jako možnost zrychlení a zkvalitnění brzké odpovědí organismu na bakteriální infekci (Zilbauer a kol., 2005). Na druhou stranu však toto uměle vyvolané zvýšení koncentrace defensinů ve střevě může mít závažné nežádoucí účinky jako je porušení střevní homeostaze, které může vést až k Crohnově nemoci a ulcerosní kolitidě (Peschel a Sahl, 2006).

Hledají se nadále cesty, jak efektivně zvýšit obranyschopnost jedince vůči infekčnímu onemocnění. Jednou z možností je vývoj potenciálních vakcinačních kmenů, které by po vakcinaci vyvolaly zvýšení exprese antimikrobiálně účinných látek (např. defensinů). K realizaci takového výzkumu přispívají i práce na gnotobiotických zvířatech, která vykazují nižší „pozadí“

způsobené konvenční mikroflórou a jsou osídlena probiotickým nebo potenciálně vakcinačním kmenem (Šplíchal a kol., 2005) .

14 Bakterie, které se běžně nacházejí ve střevě prasete a mohou být příčinou různých

bakteriálních onemocnění, které pak mohou mít za následek snížení užitkovosti zvířete.

2.5 Gramnegativní bakterie 2.5.1 Gramnegativní bakterie obecně

Buněčnou stěnu gramnegativních bakterií tvoří vnější a vnitřní membrána oddělené periplasmatickým prostorem. Následkem toho se G- bakterie barví podle Grama růžově na rozdíl od G+ bakterií, které se barví modrofialově.

Obrázek č. 10.: Schéma gramnegativní bakterie: 1 - kapsula, 2 - vnější membrána, 3 - periplazmatický prostor, 4 - vnitřní membrána, 5-9 - komponenty

v cytoplazmě (Anonym 1, 2009).

2.5.2 Lipopolysacharid

Salmonella enterica má jakožto gramnegativní bakterie vnější membránu tvořenou LPS a poriny. Molekula LPS je složena z vnějšího řetězce tj. O-antigenu, vnější dřeňové části, vnitřní dřeňové části a koncového lipidu A, který je zodpovědný za biologickou aktivitu (Caroff a Karibian, 2003). Lipid A je složený z acylovaných mono a bisfosforilovaných disacharidovaných koster, které slouží jako hydrofóbní kotva většiny vnějších membrán gramnegativních bakterií (Raetz a Whitfield, 2002).

Obrázek č. 11.: Struktura LPS (Caroff a Karibian, 2003).

Rozeznáváme dvě formy LPS: hladký (S – smooth) a hrubý (R - rough) (Jiao a kol., 1989; Wiggins a kol., 2007). S-forma obsahuje O-polysacharidový řetězec, který je tvořen opakujícími se oligosacharidovými jednotkami, dřeňový oligosacharid a lipid A. R-forma postrádá O-specifický řetězec. Obě formy jsou díky lipidu A biologicky aktivní (Freudenberg a kol., 2008). S-forma vždy obsahuje příměs R-formy. R-formu jsme však schopni připravit v čistém stavu a v různě nekompletní podobě řetězce. Existuje 5 tříd těchto nekompletních LPS označených Ra, Rb, Rc, Rd a Re podle snižující se kompletnosti dřeňových oligosacharidů (Caroff a Karibian, 2003).

Rozpoznávání LPS buňkami imunitního systému je zprostředkováno receptorovým komplexem. Signalizace probíhá prostřednictvím Toll-like receptoru 4 (TLR4), na které se podílí LPS-binding protein (LBP). Buněčný receptor CD14 se účastní rozpoznání subjednotek (Miller a kol., 2005a). R- forma aktivuje TLR4 i v nepřítomnosti CD14, S-forma je závislá na rozpoznání buňkami s receptorem CD14 (Huber a kol., 2006; Miller a kol., 2005b).

2.5.3 Salmonella

Pro účel této práce byla jako modelový organismus vybrána Salmonella enterica serovar Typhimurium. Tato gramnegativní bakterie je původcem mnoha vážných gastrointestinálních onemocnění s celosvětovou závažností.

Je vysoce variabilní co do druhu hostitele, tak do způsobu projevu.

Salmonelová nákaza může proběhnout od symptomatických forem, přes různé projevy gastroenteritid, až po závažné tyfoidní formy (Amieva, 2005). Pokud je hostitelský organismus navíc oslaben malnutricí, přídatným onemocněním nebo různými stavy spojenými s imunodeficitem, pak se tyto nákazy často stávají fatálními. V některých afrických rozvojových zemích provází systémová infekce serovarem Typhimurium infekci HIV. Na vyřešení problému salmonelových infekcí čeká také veterinární medicína, protože hospodářská zvířata mohou být rezervoárem infekce.

Obrázek č. 12.: Průběh salmonelové nákazy (Anonym 2, 2009).

Salmonella spp. je blízce příbuzná mikroorganismům běžné střevní mikroflóry jako je Escherichia. To jí dává schopnost kolonizovat GIT savců, ale i ptáků, plazů a hmyzu. Čítají až na 2000 různých serovarů (Chan a kol., 2003).

Podle analýzy DNA rozeznáváme dva hlavní druhy S.enterica, ke které náleží drtivá většina patogenních kmenů a S.bongori. Dále se dělí na osm poddruhů.

Vysoká patogenicita je u Salmonell dána specifickým mechanismem invaze do buněk hostitele. Je schopna prostupu střevním epitelem a poté intracelulárního parazitizmu v makrofázích (Rychlik a Barrow, 2005).

Obrázek č. 13.: Salmonella enterica (Anonym 3, 2007)

Salmonella enterica serotyp Typhimurium způsobuje u lidí a prasat gastroenteritidu. K septickému stavu dochází zřídka v případě imunodeficitních stavů – např. HIV infekce, malé děti, senioři (Amieva, 2005).

2.6 Popis metod

2.6.1 PCR jako výchozí metoda

PCR je zkratka anglického výrazu pro polymerázovou řetězovou reakci.

Je to biochemická a biologická metoda užívaná pro exponenciální amplifikaci fragmentu DNA enzymatickou replikací in vitro bez využití živých organismů¹⁵. Tuto metodu poprvé použil v roce 1983 Kary Mullins, který také za práci na PCR obdržel Nobelovu cenu za chemii.

PCR amplifikuje specifickou genovou sekvenci jako např. gen nebo jeho část. Běžně používané metody amplifikují fragmenty velké 10kb (kilo base pairs), některé až 40kb dlouhé. (Cheng a kol., 1994). PCR probíhá zpravidla

15 K replikaci a amplifikaci žádaných fragmentu DNA se využívají také živé mikroorganismy jako je E.coli nebo kvasinky.

v malých reakčních zkumavkách o objemu 0,2-0,5 ml. Celý objem reakční směsi (okolo 15-100 μl) se vkládá do termálního cykléru. Tento přístroj zahřívá reakční směs a umožňuje reakci, která se následně cyklicky opakuje 20 – 35 krát. (Pavlov a kol., 2004).

Obrázek č. 14.: Schéma průběhu PCR (Anonym 4, 2009).

2.6.2 Kvantitativní real time PCR

Variací tradiční PCR je kvantitativní real time PCR. Tato technika je používaná pro exponenciální amplifikaci krátké DNA (obvykle 100 – 600 bází).

Pro reakci je nezbytná dvojce primerů, z nichž každá má okolo 20-ti nukleotidů, které jsou komplementární k rozpoznávací sekvenci na každé ze dvou řetězů dvouvláknové DNA. Tyto primery jsou prodlužovány činností DNA polymerázy, takže kopie je tvořena z předlohové sekvence. Po vytvoření kopie může být stejný primer použit opakovaně pro vytvoření kopie vstupní DNA i kopie vytvořené v předešlém cyklu syntézy. To vede k logaritmické amplifikaci.

Obrázek č. 15.: Logaritmická amplifikace (Anonym 5, 2009).

Pro detekci se většinou používají flourescenční barviva nebo modifikované DNA oligonukleotidové próby, které fluoreskují pouze po hybridizaci s komplementární DNA. Při reakci je průběžně zaznamenávána fluorescence, která je přímo úměrná množství DNA. Stanovení množství DNA je odvozeno po srovnání s křivkou PCR standardních roztoky v různých zředění známého množství DNA (Nailis a kol., 2006).

Obrázek č. 16.: Real time PCR využívající flourescenci nesoucí sondu - červená značka představuje zhášecí reagencii, po jejímž odstranění se projeví

flourescence fluorochromu např. TaqMan sonda (Anonym 6, 2009).

Předností metody real time PCR je to, že ve srovnání s „end point“

metodami umožňuje určit množství výchozí DNA, která byla použita jako templát pro následnou amplifikaci. V kombinaci s reverzní transkripcí (qRT- PCR), kdy je nejdříve přepsána mRNA do cDNA, je potom možné určit množství původně přítomné mRNA jako měřítka aktivace genového přepisu (Bustin a Mueller, 2005; Nolan a kol., 2006).

V naší konkrétní qRT-PCR jsme pracovali s LNA sondami. Jsou to hydrolyzační sondy, výrazně zkrácené (8-9 nukleotidů) ve srovnání se sondami TaqMan (25-30 nukleotidů).

Obrázek č. 17.: LNA monomer (Anonym 7, 2009) .

Software pro výběr sond a návrh primerů je volně přístupný na webových stránkách firmy Roche Diagnostic (Manheim, SRN) www.universalprobelibrary.com. Jsou zde uvedené jednotlivé živočišné druhy, včetně primátů a člověka, u nichž je možné rozlišení oblastí exonů a intronů a navržení sond tak, aby překrývaly nukleotidové sekvence dvou sousedních exonů. To eliminuje možnou amplifikaci templát kontaminující genomové DNA (gDNA). V případě jiných druhů, např. prasete je možné polohu exonů a intronů pokud ji známe zadat manuálně.

3 Cíl práce

Cílem práce je studium genové aktivace antimikrobiálních peptidů při infekci gramnegativními bakteriemi v ileu gnotobiotických selat. Jako zástupce gramnegativních bakterií různé virulence byla zvolena Salmonela enterica serovar Typhimurium, kmen LT2 a její R mutanty (rfaG- a rfaL-). Jako AMPs byly zvoleny prasečí beta defensiny 1 a 2 (pBD1 a pBD2), které patří k nejlépe prostudovaným AMPs.

Dílčí cíle:

 Zvládnutí metodik pro samostatné vypracování diplomové práce.

 Stanovení počtu CFU (kolonie tvořící jednotky) Salmonell v tenkém střevě 1 týdenních gnotobiotických selat 24 hodin po infekci.

 Návrh systémů s hydrolyzačními LNA sondami pro stanovení genové aktivace (mRNA) pBD1 a pBD2.

 Genová aktivace (mRNA) pBD1 a pBD2 v ileu gnotobiotických selat infikovaných Salmonellou enterica serotyp Typhimurium, kmen LT2 a jejími R mutanty.

 Zhodnocení genové aktivace (mRNA) pBD1 a pBD2 v ileu gnotobiotických selat infikovaných Salmonellou enterica serotyp Typhimurium a jejími R mutanty s ohledem na normalizaci k beta aktinu a cyklofilinu A jako kontrolním genům.

 Vyvození závěrů.

4 Materiál a metody

Pracovali jsme se čtyřmi skupinami gnotobiotických selat po čtyřech selatech. Jedna skupina byla bezmikrovní selata. Bakteriální osídlení/infekci u dalších třech skupin jsme provedli v 1 týdnu stáří u třech skupin gramnegativní bakterií Salmonella enterica serotyp Typhimurium, kmen LT2 a jejími R mutanty (rfaG- a rfaL-). Následně jsme zjišťovali vliv těchto mutantů na expresi pBD1 a pBD2 metodou qRT-PCR.

4.1 Gnotobiotické prase

Plod prasete se vyvíjí za fyziologických podmínek ve sterilním prostředí dělohy. Prasnice je chována v konvenčních podmínkách (běžné podmínky chovu hospodářských zvířat). K prevenci avitaminóz selat jsou jí aplikovány 4 týdny před porodem vitamin A a D. Porod proběhne u miniprasete v 112. - 114.

dnu březosti. Prasnice rodí běžně 6-8 selat.

K zabránění kontaminace průchodem porodními cestami se provádí hysterektomie. Při operaci se vyjme celá děloha a proloží se do sterilního prostoru izolátoru roztokem 5% chloraminu¹⁶, který je v prokladači. V izolátoru se selata vybaví z dělohy, zbaví vdechnuté amniové tekutiny, provede se masáž, očistí se a přemístí do odchovného izolátoru. Poté dostanou injekčně železo vázané na dextran a vitamin K. Ihned po ošetření selat se provádí stěr vzorků. Zajišťují se stěry ze stěn, selat a biologické vzorky jako jsou výkaly, zbytky tkání a moči. Krmení se provádí sterilním mlékem. Za předpokladu vytvoření sterilních podmínek a při krmení sterilní dietou je můžeme takto chovat i několik let ve sterilním izolátoru.

16 Likvidace chloraminu se provádí přidáním síranem sodným pro vyvázání chloru a vypuštěním do čističky odpadních vod.

Obrázek č. 18.: Nahoře - práce v izolátoru, dole – krmení selat (Šplíchal, 2009).

Obrázek č. 19.: Schéma izolátoru (Šplíchal, 2009).

Po jednom týdnu byla bezmikrobní selata infikována gramnegativní bakterií Salmonella enterica serotyp Typhimurium, kmen LT2 a jejími R mutanty (rfaG- a rfaL-). Po 24 hodinách došlo k usmrcení selat v anestézii a k odběru vzorků pro bakteriální kultivaci pro stanovení počtu CFU a terminálního ilea pro stanovení mRNA.

4.2 Popis rfaG- a rfaL- mutantú

Bezmikrobní selata byla infikována gramnegativní bakterií Salmonella enterica serotyp Typhimurium, kmen LT2 a jejími R mutanty (rfaG- a rfaL-) chemotypy Rd1 a Ra. U mutantů byla provedena inaktivace genů rekombinací lineární DNA, která je na svých koncích homologní se sekvencí DNA. Ta má být z genomu bakterie odstraněna (Datsenko a Wanner, 2000). Pomocí speciálních primerů a plazmidu pKD4 obsahujícího gen pro rezistenci na kanamycin byl do genomu bakterie vnesen gen pro rezistenci na antibiotikum.

To umožnilo selekci bakterií na půdách obohacených tímto antibiotikem.

Vzniklý lineární produkt, obsahující na svých koncích sekvence ohraničující cílový gen, je přenesen elektroporací do kmene obsahujícího plazmid pKD46. Z genomu byl odstraněn gen s rezistencí na kanamycin pomocí termosenzitivního plazmidu pCP20. Příprava rfaG- a rfaL- mutantu Salmonella enterica serovar Typhimurium byla provedena ve spolupráci s Doc. Ivanem Rychlíkem a Ing. Danielou Karasovou z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně.

4.3 Příprava a vzorků

Po 24 hodinách po infikaci selat jsme odebrali vzorky terminálního ilea cca 30 mg. Vzorky byly po odběru uchovány v RNAlateru (Qiagen, Hilden, SRN), tím proběhne částečné odvodnění tkáně bez degradace RNA. Do izolace vzorku se takto uložená tkáň uchovává při teplotě -20°C.

4.4 Kvantifikace genové exprese

Kvantifikace genové exprese z izolovaného vzorku se provádí ve třech hlavních krocích zahrnujících izolaci RNA, reverzní transkripci a PCR amplifikaci. Základními pravidly při práci se vzorky je používání vybavení nekontaminované nukleázami, používání rukavic pro zabránění znehodnocení vzorků a standardizovat podmínky zpracování, tj. stejný způsob izolace, množství chemikálií, teplota, apod.