Studium interakce

in _i—•

LT

MASARYKOVA UNIVERZITA

P Ř Í R O D O V Ě D E C K Á F A K U L T A

ÚSTAV CHEMIE

Studium interakce polynukleotidů

s bio aktivními látkami

Diplomová práce

M a r e k V i d o

Vedoucí práce: doc. Mgr. Petr Táborský, Ph.D. Brno 2018

Bibliografický záznam

Autor:

Název práce:

Studijní program:

Studijní obor:

Vedoucí práce:

Akademický rok:

Počet stran:

Klíčová slova:

Bc. Marek Vido

Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ustav chemie

Studium interakce polynukleotidů s bioaktivními lát­

kami Chemie

Analytická chemie

doc. Mgr. Petr Táborský, Ph.D.

2017/2018 64

hmotnostní spektrometrie; elektrosprej; isochinolinové alkaloidy; D N A ; G4rvadruplex; interakce; konstanta afinity

Bibliografický záznam

Autor:

Názov práce:

Študijný program:

Študijný odbor:

Vedúci práce:

Akademický rok:

Počet strán:

Kľúčové slová:

Bc. Marek Vido

Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ustav chémie

Štúdium interakcie polynukleotidov s bioaktívnymi látkami

Chémia

Analytická chémia

doc. Mgr. Petr Táborský, Ph.D.

2017/2018 64

hmotnostná spektrometria; elektrosprej; izochinolíno- vé alkaloidy; D N A ; G-kvadruplex; interakcie; kon­

štanta afinity

Bibliographic Entry

Author

Title of Thesis:

Be. Marek Vido

Faculty of Science, Masaryk University Department of Chemistry

Study on interaction of polynucleotides to bioactive compounds

Degree Programme: Chemistry

Field of Study: Analytical Chemistry

Supervisor: doc. Mgr. Petr Táborský, Ph.D.

Academic Year: 2017/2018

Number of Pages:

Keywords:

64

mass spectrometry; electrospray; isoquinoline alka- loids; D N A ; G-quadruplex; interaction; binding con- stant

Abstrakt

Tato práce se věnuje studiu interakce nekanonické D N A s isochinolinovými alkaloi­

dy pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem. Byly sledovány a na­

lezeny vhodné podmínky pro výpočet afinitních konstant komplexů intramolekulár- ních G-kvadruplexů s alkaloidy sanguinarinem, korysaminem, koptisinem a stylopi- nem. Pro porovnání byly použity i polynukleotidy, které netvoří G-kvadruplexovú strukturu nebo tvoří duplex. Na základě získaných výsledků lze hmotnostní spektro­

metrii dále využít k prvotnímu výběru z velkého množství látek, u kterých se před­

pokládá schopnost interakce s nekanonickými formami D N A . Tyto látky mohou být potom sledovány pomocí přesnějších, ale zároveň časově náročnějších technik mole­

kulové spektrometrie.

Abstrakt

Táto práca sa venuje štúdiu interakcie nekanonickej D N A s izochinolínovými alkalo­

idmi pomocou hmotnostnej spektrometrie s ionizáciou elektrosprejom. Boli sledova­

né a nájdené vhodné podmienky pre výpočet konštánt afinity komplexov intramole- kulárnych G-kvadruplexov s alkaloidmi sanguinarínom, koryzamínom, koptizínom a stylopínom. Pre porovnanie boli použité aj polynukleotidy, ktoré netvoria G-kva­

druplexovú štruktúru alebo tvoria duplex. Na základe získaných výsledkov sa dá hmotnostná spektrometria ďalej využiť k prvotnému výberu z veľkého množstva lá­

tok, u ktorých sa predpokladá schopnosť interakcie s nekanonickými formami DNA.

Tieto látky môžu byť potom sledované pomocou presnejších, ale zároveň časovo ná­

ročnejších techník molekulovej spektrometrie.

Abstract

This thesis is dedicated to the study of the interaction between the non-canonical D N A and isoquinoline alkaloids by electrospray mass spectrometry. Conditions suit- able for the calculation of binding constants were found while testing the complexes of G-quadruplex structures with alkaloids sanguinarine, corysamine, coptisine and stylopine. Furthermore, polynucleotides, which do not form the G-quadruplex struc- ture or form duplex, were used for the sake of comparison. Based on the results, the mass spectrometry technique may be used for the screening of numerous compounds, which might be able to interact with the non-canonical DNA. Subsequently, these compounds may be investigated by applying more precise but time-consuming mo- lecular spectrometry methods.

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

ZADANÍ DIPLOMOVÉ PRACE

A k a d e m i c k ý rok: 2 0 1 8 / 2 0 1 9 Ústav: Ústav c h e m i e

Student: Bc. M a r e k V i d o P r o g r a m : C h e m i e O b o r : A n a l y t i c k á c h e m i e

Ředitel Ústavu chemie PřF M U V á m ve smyslu Studijního a zkušebního ř á d u M U určuje d i p l o m o v o u práci s n á z v e m : Název práce: S t u d i u m interakce p o l y n u k l e o t i d ů s b i o a k t i v n í m i l á t k a m i

Název práce a n g l i c k y : Study o n interaction of polynucleotides t o bioactive c o m p o u n d s O f i c i á l n í zadání:

V rámci d i p l o m o v é práce b u d e s t u d o v á n a interakce v y b r a n ý c h p o l y n u k l e o t i d ů s b i o a k t i v n í m i l á t k a m i (zejména rostlinnými alkaloidy). Interakce b u d o u z k o u m á n y z e j m é n a s v y u ž i t í m h m o t n o s t n í s p e k t r o m e t r i e .

Literatura:

R Y B Á K O V Á , Stanislava, M i c h a l RAJECKÝ, Jana U R B A N O V Á , Kristýna P Ě N Č Í K O V Á , Eva T Á B O R S K Á , R a i m u n d o G A R - G A L L O a Petr TÁBORSKÝ. Interaction of oligonucleotides with benzo[c]phenanthridine alkaloid sanguilutine. Chemical Papers, W A R S A W : Versita, 2 0 1 3 , roč. 6 7 , č. 5, s. 5 6 8 - 5 7 2 . ISSN 0 3 6 6 - 6 3 5 2 . d o i : 1 0 . 2 4 7 8 / s 1 1 6 9 6 - 0 1 3 - 0 3 4 0 - x .

Jazyk závěrečné práce:

Vedoucí práce: doc. M g r . Petr Táborský, Ph.D.

K o n z u l t a n t : M g r . O n d ř e j Peš, P h . D . D a t u m zadání práce: 1 0 . 2 . 2 0 1 7 V Brně d n e : 1 5 . 2 . 2 0 1 8 Souhlasím se zadáním ( p o d p i s , d a t u m ) :

Bc. M a r e k V i d o 7-

s t u d e n t

doc. M g r . Petr Táborský, P h . D . v e d o u c í práce

doc. M g r . M a r e k Nečas, Ph.D z á s t u p c e ř e d i t e l e Ú s t a v u c h e m i e

p r o p e d a g o g i c k é záležitosti

Poďakovanie

Na tomto mieste by som chcel poďakovať hlavne Mgr. Ondřejovi Pešovi, Ph.D. a doc. Mgr. Petrovi Táborskému, Ph.D. za profesionálny prístup pri vedení diplomovej práce, čas, ktorý mi venovali, takisto za rady a pomoc pri riešení hocijakých problé­

mov počas môjho štúdia. Veľká vďaka patrí všetkým ostatným ľuďom, ktorí mi ako­

koľvek pomohli a umožnili vypracovanie diplomovej práce, taktiež rodine i priate­

ľom za podporu.

Vyhlásenie

Vyhlasujem, že som svoju diplomovú prácu vypracoval samostatne s využitím in­

formačných zdrojov, ktoré sú v práci citované.

Brno 11. mája 2018

Marek Vido

1. Obsah

1. Obsah 9 2. Úvod 10 3. Teoretická časť 11

3.1. Nukleotidy H 3.1.1. Nekanonické štruktúry - G-kvadruplexy 12

3.2. Alkaloidy 15 3.2.1. Interakcie alkaloidov s D N A 17

3.3. Možnosti štúdia G4 a ich interakcií s alkaloidmi 18

3.4. Hmotnostná spektrometria 20 3.4.1. Spôsoby ionizácie 21 3.4.2. Hmotnostně analyzátory 23 3.4.3. Vyhodnotenie spektier 26

3.5. Ciele práce 30 4. Experimentálna časť 31

4.1. Chemikálie 31 4.2. Prístrojové vybavenie 32

4.3. Príprava roztokov 32 4.4. Interpretácia MS spektier pre vzorky polynukleotidov s alkaloidmi 33

4.5. Optimalizácia podmienok 36 4.5.1. Optimalizácia pufrov 36 4.5.2. Optimalizácia parametrov M S analýzy 37

4.6. Porovnanie konštánt afinity 46

4.6.1. Porovnanie konštánt afinity pre pufer N H⁴O A c 46

4.6.2. Porovnanie konštánt afinity pre pufer T E A A + KC1 51

4.7. Diskusia a záver 56 5. Zoznam skratiek 59 6. Literatúra 60

2. Úvod

G-kvadruplexová D N A (G4) je prítomná v mnohých fyziologických procesoch v bunke, napríklad ako súčasť promotorových regiónov alebo telomerickej DNA.

Stabilizácia G4 v roztoku prebieha v prítomnosti iónov (K⁺, Na⁺, N H^{4 +}) a rôznych nízkomolekulárnych ligandov. Zatiaľ čo katióny koordinujú kyslíky jednotlivých kvartetov G4 štruktúry, Ugandy môžu všeobecne reagovať s G4 niekoľkými spôsob­

mi s rôznou mierou afinity. Pri nájdení vhodného Ugandu je možné ovplyvniť celý rad fyziologických procesov, vrátane nádorového bujnenia, do ktorého sú nekano­

nické štruktúry D N A hojne zapojené.[l]

Medzi liečivá s výrazným terapeutickým účinkom patria rastlinné alkaloidy, ktoré tvoria takmer polovicu všetkých doposiaľ známych látok s farmakologickou alebo biologickou aktivitou. V súčasnosti je známych viac než 12000 látok, ktoré sa zara­

ďujú medzi alkaloidy. Veľa z nich sa používa ako liečivá, stimulanty alebo jedy (napr. najznámejší kofeín, nikotín, morfín či kokaín).[2] Niektoré izochinolínové al­

kaloidy vykazujú vysokú mieru interakcie s celým radom foriem D N A . Interakcie je možné sledovať pomocou molekulovej alebo luminiscenčnej spektrometrie, cirkulár- neho dichroizmu, rovnovážnej dialýzy alebo hmotnostnej spektrometrie s ionizáciou elektrosprejom (ESI MS). Štúdium interakcie alkaloidov s D N A pomocou ESI MS umožňuje prevádzať základnú charakteristiku interakcie. Dá sa tak určiť stechiomet- ria sledovaného komplexu a tiež afinita alebo selektivita veľkej skupiny ligandov s rôznymi typmi DNA. Avšak na druhú stranu je potrebné si uvedomiť, že sledovanie tejto interakcie pomocou MS prebieha prednostne v plynnej fáze pri iných než natív­

nych podmienkach.

Cieľom diplomovej práce je overiť existenciu vhodných podmienok pre výber a porovnanie ligandov, ktoré môžu vykazovať afinitu ku G4, pomocou ESI MS. Tak­

to navrhnuté Ugandy je potom vhodné študovať ďalej v roztoku za natívnych pod­

mienok presnejšími, no časovo náročnejšími technikami.

3. Teoretická časť 3.1. Nukleotidy

Nukleové kyseliny sú biologické makromolekuly, ktoré sú zodpovedné za prenos a uchovanie genetickej informácie bunky všetkých žijúcich organizmov. Existujú dva typy kyselín: deoxyribonukleové, t. j . D N A a ribonukleové, t. j . RNA. Základ­

nou monomérnou jednotkou nukleových kyselín sú nukleotidy, ktoré sú zložené z fosfátového zvyšku kyseliny fosforečnej, zo sacharidovej zložky - pentózy a z dusíkatej bázy.

Nukleotidy, ktoré tvoria DNA, obsahujú ako cukrovú zložku 2'-deoxy-D-ribózu, za­

tiaľ čo R N A obsahuje D-ribózu. Jednotlivé nukleotidy sú spojené fosfodiesterovými kovalentnými väzbami, kde fosfátový zvyšok prepája 5'-hydroxylovú skupinu ribózy jedného nukleotidu s 3'-hydroxylom ribózy ďalšieho nukleotidu. Jednoduchá sek-

vencia z troch nukleotidov je zobrazená na obr. 1.

Obr. 1: Ukážka štruktúry časti polynukleotidu so sekvenciou 5'-ACT-3', ktorý j e spo­

jený vodíkovými mostíkmi s komplementárnym vláknom 3'-TGA-5'.

Existuje päť hlavných báz, ktoré sa vyskytujú v nukleových kyselinách. Dve sú deri­

váty purínu: adenín (A) a guanín (G); a tri sú deriváty pyrimidínu: cytozín (C), ty- mín (T) - v D N A , uracil (U) - v RNA. Poradie kovalentne pospájaných báz určuje primárnu štruktúru, t. j . sekvenciu, vlákna nukleovej kyseliny. Podľa definície sa za­

pisuje pomocou skratiek báz jednotlivých nukleotidov v smere 5' —> 3' (napr. 5'- GTG-GATGG-3'). Funkčné skupiny báz umožňujú tvorbu vodíkových mostíkov a pomocou nich vytvárajú rôzne sekundárne štruktúry. D N A sa najčastejšie vyskytu­

je vo forme typickej dvoj závitnice, ktorá je zložená z dvoch vlákien nukleotidov s navzájom komplementárnymi bázami (AT, GC).[3-5]

Okrem bežnej a najčastejšej sekundárnej štruktúry, antiparalelnej pravotočivej dvoj- závitnice (tzv. 5-DNA), môže D N A vytvárať aj mnohé ďalšie konformácie: napr. Z- D N A (ľavotočivá dvoj závi tni ca), A-DNA; trojito a štvorito zapletené štruktúry (tzv.

triplexy a tetraplexy) a rôzne krížové či posunuté štruktúry, ktoré sa vytvoria na­

miesto bežnej dvojzávitnice (tzv. duplexu). Tieto nezvyčajné štruktúry z troch či šty­

roch vlákien sa často vytvárajú počas iniciovania alebo regulácie dôležitých procesov metabolizmu D N A . Tetraplexy sa tvoria vďaka schopnosti guanínových báz vytvárať tetramerické štruktúry a nazývajú sa aj G4 D N A alebo G-kvadruplexy.[5, 6]

3.1.1. Nekanonické štruktúry - G-kvadruplexy

G4 štruktúra sa môže tvoriť rovnako in vitro ako aj in vivo na úsekoch D N A , ktoré opakovane obsahujú v sekvencii viac guanínov po sebe (napr. C G G G C G G G C G C G - AGGGAGGGT). Štyri guaníny sa navzájom spoja pomocou cyklických Hoogstee- nových vodíkových mostíkov do štvorcovej štruktúry zobrazenej na obr. 2, ktorá sa nazýva G-kvartet. Takéto planárne tetramérne štruktúry sa môžu na seba naskladať a vytvoriť viacvrstvovú G4 štruktúru. Na obr. 2 je G4 tvorený tromi vrstvami. Počet poschodí danej štruktúry závisí od počtu guanínov, ktoré nasledujú po sebe v primárnej sekvencii D N A vlákien tvoriacich G4.

G4 vykazujú vysoký stupeň polymorfizmu. Môžu byť tvorené intramolekulárne v rámci jedného vlákna DNA, ktoré obsahuje aspoň štyri úseky s viacerými guanínmi po sebe, alebo môžu byť tvorené intermolekulárne z dvoch a viacerých vlákien D N A bohatých na guanín. Ak je G4 tvorený z dvoch vlákien (bimolekulárne), musí obsahovať aspoň dva úseky s viacerými guanínmi po sebe, ak je G4 vytvorený zo štyroch vlákien (tetramolekulárne), stačí aj jeden taký úsek v sekvencii. Jednotlivé

vlákna, ktoré tvoria G4, môžu byť navzájom nasmerované paralelne alebo antipa- ralelne, ako je ukázané na obr. 3.[7-9] Okrem toho sa nemusí kvartet, ktorý tvorí poschodie kvadruplexu, skladať vždy výlučne zo štyroch guanínov. Existujú aj kvar­

tety s adenínom či cytozínom. Ďalej môžeme klasifikovať kvadruplexy aj podľa kon- formácie, akú zaujímajú guanínové zvyšky v kvartete. Pričom každý guanín môže byť v polohe syn alebo anti.[9]

Obr. 2: Ukážka tetraméru zo štyroch guanínov, t. j . G-kvartetu (vľavo); tri na sebe naskladané tetraméry vytvárajú celkovú G4 štruktúru (vpravo).

Takisto úseky D N A medzi guanínmi môžu vytvárať viaceré rozmanité kombinácie tvarov či slučiek, ktoré spájajú guanínové úseky. Tri základné typy slučiek sú zobra­

zené na obr. 3. Medzi dvomi vedľajšími paralelnými vláknami vzniká tzv. vrtuľová (z anglického propeller) slučka, ktorá prepája vrch a spodok útvaru G4. V prípade priľahlých antiparalelných vlákien vzniká tzv. postranná (z anglického lateral) sluč­

ka, ktorá lemuje pomyselnú hranu G4. V prípade bimolekulárneho G4 môžu byť prí­

tomné akurát dve postranné slučky, ktoré smerujú buď rovnakým smerom (tzv. hla­

va-hlava usporiadanie) alebo navzájom opačným smerom (tzv. hlava-päta usporiada­

nie). Naopak protiľahlé antiparalelné vlákna sa spájajú tzv. diagonálnou slučkou, ktorá prechádza ponad stred guanínového kvartetu. [8, 10] Tvorbu G4 štruktúry pod­

porujú monovalentné ióny (napr. Na⁺, K⁺) , ktoré sa dokážu vmedzeriť do stredu tet­

raméru, ako je naznačené na obr. 2 a zvýšiť stabilitu G4.[7, 11] Prítomnosť iónov

a ďalšie podmienky majú vplyv na vytvorenú štruktúru G4, ktorá závisí na sekundár­

nych silách vodíkových mostíkov, ale tiež na silách báz skladajúcich sa na seba v poschodiach a na hydrofóbnych efektoch. [9, 12]

a n t i p a r a l e l n é

Obr. 3: Ukážka troch druhov slučiek, ktoré spájajú paralelné alebo antiparalelné vlákna G4.

Úseky bohaté na guanín, ktoré sú schopné tvoriť G4, sa hojne vyskytujú v mnohých dôležitých oblastiach D N A aj R N A sekvencií.[13-15] Jednou z nich je teloméra (u ľudí sa opakuje sekvencia TTAGGG), teda koncová oblasť chromozómu, ktorá sa skracuje pri každom delení bunky a súvisí so starnutím bunky, ale v niektorých ty­

poch buniek (napr. zárodočných, kmeňových i rakovinových) môže byť obnovená pomocou enzýmu telomerázy.[16, 17] Ďalej sa nachádzajú v oblasti, ktorá sa podieľa na výmene častí ťažkých reťazcov protilátok určujúcich typ protilátky;[18] v promó­

toroch, sekvenciách D N A , ktoré iniciujú transkripciu určitého génu;[19] ale­

bo v protoonkogénoch (napr. bcl-2, c-kit), ktoré potenciálne spôsobujú rakovinu. [20]

Či už sa jedná o genóm baktérie alebo ľudský genóm, výskyt úsekov bohatých na guanín nieje náhodný a predpokladá sa, že tvorba a stabilita G4 zohráva dôležitú ro­

lu v mnohých biologických procesoch alebo ich regulácii, nevynímajúc replikáciu DNA, transkripciu a transláciu. Porozumenie správaniu G4 v interakcii s inými lát­

kami môže pomôcť k tomu, aby sa stabilizácia či destabilizácia štruktúry G4 dala cielene využiť na liečebné alebo iné účely. [13-15]

3.2. Alkaloidy

Alkaloidy sú bázické zlúčeniny dusíka (väčšinou heterocyklické), ktoré sa vyskytujú hlavne v rastlinnej ríši. Avšak nevylučuje sa aj iný pôvod, dnes sa niektoré alkaloidy vyrábajú častejšie synteticky ako extrakciou z rastlín. Ako alkaloidy sa zväčša neoz­

načujú aminokyseliny, peptidy, proteiny, nukleotidy, nukleové kyseliny, amínosa- charidy a antibiotiká. Naopak sa medzi alkaloidy zahŕňajú aj niektoré neutrálne zlú­

čeniny biogeneticky príbuzné bázickým alkaloidom.[21, 22] Alkaloidy sa môžu deliť podľa rôznych hľadísk, napr. podľa typu štruktúrneho prekurzoru (resp. podľa che­

mickej štruktúry), podľa biosyntetického pôvodu, podľa účinkov alebo rastlinného pôvodu. [3, 22]

Jednou z najväčších skupín alkaloidov sú látky, ktorých základ tvorí izochinolín.

V tejto práci boli použité protoberberínové (PBA) a kvartérne ben- zo[c]fenantridínové alkaloidy (KBA), ktoré sú zobrazené na obr. 4. P B A a K B A sú podskupinami benzylizochinolínových alkaloidov, ktoré štruktúrne vychádzajú z izochinolínu (čo je tiež naznačené na obr. 4).[2, 3, 22] Najčastejšie sa vyskytujúcim P B A je berberín, ďalej sa medzi P B A radia napr. koptizín (KP), koryzamín (KR) a stylopín (ST), palmatín atď. Existuje množstvo ďalších podobných látok, pričom sa líšia rôznymi substituentami, ktoré sa viažu na základnú tetracyklickú kostru. Tiež sa môžu líšiť počtom substituentov (tetra- / penta- / hexasubstituované) alebo prí­

tomnosťou kladne nabitého dusíku, t.j. môžu byť vo forme kvartérnych solí (napr.

KP) alebo bez náboja (napr. ST).[23-26] Taktiež rôzne K B A sa líšia množstvom a polohou substituentov. Najznámejšie a komerčne najdostupnejšie alkaloidy zo sku­

piny K B A sú sanguinarín (SA) a chelerytrín (CHE), ktoré boli objavené už v 19.

storočí. Ďalej medzi ne patrí napr. chelirubín, makarpin a chelilutín.[23, 27]

P B A aj K B A sa vyskytujú v širokej palete rastlinných druhov, ktoré patria do čeľadí makovité (Papaveraceae), zemedymovité (Fumariaceae), rutovité (Rutaceae) a iné.

Naj hojnejšími zdrojmi K B A sú rastliny Krvavček kanadský (Sanguinaria canaden­

sis), Lastovičník väčší (Chelidonium majus), Dicranostigma lactucoides, Macleaya cordata, a ďalšie druhy ako Bocconia a Zanthoxylum.[28-30] Množstvá a typy alka­

loidov v rastlinách sa líšia na základe viacerých faktorov. Závisia na klíme, prostredí, vegetačnom období a zložení pôdy, pričom výskyt konkrétneho alkaloidu môže byť obmedzený na určitú časť rastliny alebo rôzny v jednotlivých orgánoch. [25] Naprí-

klad Lastovičník väčší (Chelidonium majus) obsahuje SA a C H E v koreňoch, zatiaľ čo vo vonkajších orgánoch hromadí chelidonín, berberín a KP.[2] Stylophorum la- siocarpum je pôvodom čínska rastlina, ktorá obsahuje dominantne ST a KP, v menších množstvá zase SA, C H E a aj menej častý K R , chelilutín, makarpin a iné.[23] Soušek et al. určili v ôsmich druhoch rastlín Fumaria rozličné alkaloidy vrátane K P aST.[31]

benzylizochinolín Ci ôHbN koptizín (KP) C19H14NO4CI

chelerytrín (CHE) C²i H^{1 8}N 0⁴C l stylopín (ST) C i⁹H^{1 7}N 0⁴

Obr. 4: Štruktúrne vzorce používaných alkaloidov a základu ich kostry - benzylizo- chinolínu (resp. izochinolínu).

PBA a K B A vykazujú široké spektrum rozličných biologických a farmaceutických účinkov. SA aj ďalšie P B A majú protimikrobiálne a protizápalové účinky. SA sa tak-

tiež používal v pastách a ústnych vodách, lebo účinkuje proti povlaku a zápalu ďa- sien.[2, 29, 30] Berberín vykazuje aktivitu proti malárii a proti diabetický efekt.[25]

Okrem toho môžu niektoré P B A a K B A rôzne interagovať s duplexovou a G4 for­

mou DNA, čo je detailnejšie uvedené v nasledujúcej kapitole 3.2.1. Dôležité sú aj ich cytotoxické účinky, či už pomocou inhibície telomerázy (napr. SA) alebo apoptózou (napr. makarpin), vďaka čomu môžu zabrániť proliferácii rakovinových buniek. [23, 25]

SA aj ostatné K B A vykazujú štruktúrnu rovnováhu medzi imíniovou (nabitou) a al- kanolamínovou (nenabitou) formou, ktorá je závislá na pH. Hodnota v rovnováhe pre SA je pK = 7,4. Bolo zistené, že s D N A interaguje interkaláciou iba imíniová forma, pričom vysoká koncentrácia D N A môže spôsobiť transformáciu alkanolamínovej formy na imíniovú.[30]

3.2.1. Interakcie alkaloidov s DNA

Prítomnosť katiónov Na⁺, K⁺ pomáha aktivovať a stabilizovať štruktúru G4. Podob­

ne môže fungovať aj prítomnosť rôznych malých molekúl, ktoré tvoria s G4 nekova- lentné komplexy. Ich schopnosť interagovať s G4 sa líši podľa typu ligandu a jeho spôsobu interakcie, pričom sa môžu podobným princípom viazať aj na duplexové či iné štruktúry DNA. Molekula ligandu sa môže viazať na slučky G4; alebo dôjde k in- terakalácií, kedy je molekula vsunutá medzi dve poschodia G4; alebo sa naskladá z vonkajšej strany poschodia G4 pomocou %-% interakcií. Typy komplexovania l i - gandov sú načrtnuté na obr. 5. Ligandy môžu preferovať len určitý typ interakcie, ale tiež môžu indukovať zmenu samotnej štruktúry G4. Väčšina molekúl schopných in­

terakcie s G4 má rovnaké vlastnosti, ktoré napomáhajú nekovalentným väzbám, t.j. planárny delokalizovaný systém % elektrónov, čiastkový pozitívny náboj a pozitívne nabité substituenty.[32] Medzi také ligandy patrí aj etídium bromid a jeho deriváty, ktoré sú schopné inhibovať telomerázu tým, že uľahčujú a stabilizujú for­

movanie G4, okrem toho môžu slúžiť aj ako fluorescenčné značky. [33] G4 stabilizu­

jú ďalej napr. deriváty quinakridónu, perylénu[34] alebo antrachinónu.[35] Medzi mnohými molekulami sú potenciálnymi inhibítormi telomerázy tiež niektoré alkaloi­

dy s podobnou štruktúrou, napr. sanguinarín, berberín, palmatín, atď.[25, 32]

Chen et al. izolovali a štruktúrne popísali štyri nové kvartérne fenantroindolizidínové alkaloidy z rastliny Tylophora atrofolliculata. U týchto štyroch nových alkaloidov

a ďalších známych alkaloidov (vrátane sanguinarínu, ktorý bol použitý ako referenč­

ná zlúčenina známa viazaním na G4 s veľkou afinitou) určili pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS) relatívne väzobné afinity ich komplexov s G4. Analýzou štruktú­

ry a vypočítaných relatívnych afinít porovnali aktivitu jednotlivých alkaloidov pri vytváraní komplexov s G4. Pozitívny vplyv na afinitu má prítomnosť kvartérneho amónneho katiónu v molekulu a taktiež planarita molekuly. Ďalej mala negatívny efekt na afinitu prítomnosť metoxylovej alebo hydroxylovej skupiny navyše oproti iným skúmaným alkaloidom. Naopak pozitívne vplývala prítomnosť metoxylovej skupiny namiesto hydroxylu na rovnakej pozícii v molekule.[36]

Obr. 5: Ukážka troch typov interakcií molekúl s G4.

3.3. Možnosti štúdia G4 a ich interakcií s alkaloidmi

Formovanie G4ivadruplexov, ich vlastnosti, štruktúra a interakcie s malými moleku­

lami sa dajú študovať kombinovaním viacerých analytických metód. Každá z týchto metód poskytuje rôzne informácie, má svoje typické výhody i nevýhody. Metódy sa často navzájom dopĺňajú a používajú súčasne, aby poskytli celkový presný obraz o G4 a jeho správaní v prostredí s inými molekulami.[27, 37]

Obrovská rozmanitosť štruktúry G4 sa dá potvrdiť aj študovať pomocou nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR), rôntgénovej krystalografie, cirkulárneho dichroizmu (CD), Ramanovej spektroskopie, povrchovej plazmonovej rezonancie a ďalších tech-

nik. Napr. CD poskytuje charakteristický pozitívny pás pri 260 nm a negatívny pás pri 240 nm pre štvorvláknovú paralelnú štruktúru, zatiaľ čo antiparalelný G4 má po­

zitívny pás pri 295 nm a negatívny pri 260 nm. CD je rýchla a vyžaduje menej vzor­

ky, ale detailnejší i precíznejší pohľad na G4 poskytuje NMR.[9]

Jednou z techník, ktorá umožňuje štúdium nekovalentných komplexov, je aj hmot- nostná spektrometria s použitím ionizácie elektrosprejom (ESI MS). ESI M S dokáže jednoducho určiť stechiometriu komplexu pomocou jeho presnej hmotnosti, ktorú meria. Výhody MS oproti ostatným metódam sú hlavne rýchlosť, citlivosť, jednodu­

chosť, schopnosť pracovať so zmesami a veľmi malá spotreba vzorky. Obzvlášť N M R vyžaduje oveľa viac vzorky, ale takisto môže byť komplikovanejšia príprava vzorky, napr. aj v rôntgénovej krystalografii. Problémom ESI zase môže byť prevod komplexu z roztoku do plynnej fázy, ktorý môže čiastočne závisieť na podmienkach, pričom prechod môže byť komplikovanejší a je dôležité rozpoznať či rozlíšiť stav vytvorených komplexov v roztoku a v plynnej fáze. [11, 38, 39] Pre štúdium polynuk- leotidov pomocou ESI-MS sa používa negatívny mód, keďže fosfodiesterová chrbti­

ca nukleových kyselín ľahko dosahuje v roztoku záporný náboj. Pre tvorbu G4 je za­

se potrebná prítomnosť katiónov N l V " , N a⁺ alebo K⁺, ale zároveň kvôli tvorbe aduk- tov a nízkej prchavosti je použitie sodných a draselných solí pre ESI-MS problema­

tické. Výhodne sa preto používa roztok G4 v pufri NH⁴OAc, ktorý pri koncentrá­

ciách okolo lOOmmolľ¹ udržiava dostatočnú iónovú silu a tiež poskytuje katión NH4⁺.[11, 40] Tiež je možné použiť roztok KC1 pri veľmi nízkych koncentráciách do 1 mmol ľ¹ (kvôli nekompatibilitě s MS) spolu s prídavkom vyššej koncentrácie pufru (okolo 100 mmol ľ¹), ktorý dostatočne zabezpečí potrebnú iónovú silu, ale zároveň obsahuje objemné katióny, ktoré sa nedostanú do G4 štruktúry, napr. Marchand a Gabelica použili octan trimetylamónny.[12] Pre zlepšenie signálu ESI-MS spektier sa často používa prídavok metanolu, ktorý znižuje povrchové napätie kvapiek vzni­

kajúcich pri procese ESI. [11, 40]

Výsledky MS môže potvrdiť a obsiahlejšie rozšíriť už spomínaná spektroskopia CD, ktorou sa dá sledovať rôzna zmena teploty topenia štruktúry D N A pri naviazaní od­

lišných ligandov.[27, 32] Posun teploty topenia môže byť pozorovaný aj pomocou U V a fluorescenčnej spektroskopie, a tiež fluorescenčnou titráciou. Na analýzu G4 komplexov s viacerými alkaloidmi z rastliny Tylophora atrofolliculata použili ESI- MS napr. Chen et al., ktorí dané alkaloidy porovnali pomocou ich relatívnych väzob-

ných afinít ku G4 vypočítaných z MS spektier. Okrem M S použili aj C D spektrosko- piu, pomocou ktorej potvrdili tvorbu G4 (pozitivny pás 290 nm) aj jeho interakcie so skúmanými alkaloidmi (pribudol pozitívny pás 430 nm, zvýšila sa intenzita pásu 290 nm). Ďalej túto interakciu potvrdili pomocou fluorescenčnej spektrometrie. Pri 530 nm dochádza k zhášaniu fluorescencie komplexu G4 s tiazolovou oranžou, keď alkaloid interaguje s G4 a vymení v komplexe tiazolovú oranž, ktorá sama neflores- kuje.[36] Koeppel et al. zase na základe merania tzv. FRET (Fôrsterov rezonančný prenos energie) predpokladajú interkaláciu alebo planárne interakcie aromatických kruhov ligandu a guanínov z vonkajšej strany G4.[33] Komplexnejšiu informáciu môže rovnako poskytnúť M S iónovej mobility, ktorá môže pomôcť rozlíšiť rôzne ió­

ny s rovnakou hodnotou m/z.[ll]

3.4. Hmotnostná spektrometria

Hmotnostná spektrometria (MS) je analytická technika, ktorá rozdeľuje ióny v plynnom stave podľa pomeru ich hmotnosti a náboja (tzv. hodnota m/z). Vo vý­

stupnom spektre sú na osy y vyjadrené relatívne početnosti iónov, ktoré zodpovedajú jednotlivým nameraným hodnotám m/z zobrazeným na ose x.[38, 41, 42]

Vstup vzorky

t

zdroj Hmotnostný

analyzátor Detektor

i I" • s

Výhod n ocova cie

3

zariadenie Obr. 6: Bloková schéma hmotnostného spektrometra.

Inštrumentácia M S sa môže skladať z mnohých rozmanitých techník, ale základný princíp zostáva rovnaký. Je schematicky znázornený na obr. 6. MS môže byť spojená s ďalšími analytickými metódami (napr. kvapalinová i plynová chromatografia, kapi­

lárna elektroforéza), čo je jedna z jej výhod, ale môže byť využívaná aj ako samo­

statná metóda. Podľa účelu existujú mnohé variácie rozhraní techník, ale v zásade sa spojenie uskutočňuje buď off-line, keď je vzorka najprv zozbieraná a až následne analyzovaná v M S ; alebo prebieha plynulo on-line, keď vzorka zjednej techniky vstupuje priamo do M S , kde ďalej prebieha analýza.[43] Vstup do MS preto musí byť prispôsobený danej aplikácii. M S analýza začína vstupom vzorky do ionizačného

zdroja, kde je daná látka prevedená na ióny, ktoré sú ďalej vedené pomocou magne­

tického alebo elektrického poľa do hmotnostného analyzátora alebo sústavy viace­

rých analyzátorov. Rozdelené ióny aj s prípadnými fragmentárni iónov vychádzajúce z analyzátora sú nakoniec detegované detektorom. Signál sa po prevedení z detektora zobrazí v počítači ako spektrum. V niektorých technikách môžu konštrukčné prvky M S splývať, prípadne môžu byť skombinované. M S taktiež vyžaduje pre správne fungovanie vákuovú techniku, ktorá zabezpečuje potrebné úrovne vákua.[38, 41, 42]

3.4.1. Spôsoby ionizácie

Rozmanité ionizačné zdroje sa dajú rozdeliť podľa množstva energie, ktorá je prene­

sená pri ionizácii. U tvrdých techník spôsobuje prebytok energie časté fragmentácie.

Naopak u mäkších techník nemusí dochádzať k rozpadu ani pri veľkých molekulách či komplexoch. Techniky sa tiež líšia podľa vlastností analyzovaných látok. Typic­

kou tvrdou technikou používanou pre prchavé, tepelne stabilné a zväčšia menšie mo­

lekuly je elektrónová ionizácia. Ďalej sa pre látky v plynnom stave používajú mäk­

šie techniky, napr. chemická ionizácia alebo ionizácia bombardovaním rýchlymi atómami. Pre anorganickú analýzu sú vhodné zdroje využívané aj v optickej spek­

troskopii, napr. indukčné viazaná plazma a žiarivý výboj, ktoré atomizujú a následne ionizujú analyt. Pre neprchavé pevné vzorky sa používajú rôznorodé de- sorpčné techniky, napr. desorpcia poľom, laserová desorpcia alebo plazmová de- sorpcia. V prípade analytov prítomných v roztoku sa používa rozprašovanie kvapiek, v ktorých molekuly podstúpia ionizáciu za atmosférického tlaku (chemickú, foto- ionizáciu alebo už sú v podobe iónov). Pre prevedenie iónov do potrebného väčšieho vákua sa vtedy používa systém viacstupňového pumpovanie. [38, 41, 42] Veľké roz­

šírenie použitia M S pre analýzu biologických makromolekul priniesol vývoj dvoch nových mäkkých ionizačných techník, ionizácia laserovou desorpciou za účasti matrice (MALDI)[44, 45] a ionizácia elektrosprejom (ESI)[46], za ktoré boli v roku 2002 ocenení Nobelovou cenou K. Tanaka a J. B. Fenn.[47]

3.4.1.1. Ionizácia elektrosprejom (ESI)

Ionizácia elektrosprejom prebieha za atmosférického tlaku priamo z roztoku, ktorý obsahuje analyt v iónovej forme. Preto je veľmi vhodná pre kombinovanie s kvapalinovou chromatografiou alebo kapilárnou elektroforézou. Pre ESI je typická tvorba viacnásobne nabitých iónov, čo umožňuje jej použitie pre analýzu molekúl

s obrovskou hmotnosťou aj pomocou analyzátorov, ktoré majú menší rozsah. Bežná je aj tvorba aduktov s Na⁺, K⁺ alebo NH4⁺, ktoré bývajú prítomné vo vzduchu alebo v rozpúšťadle. Dôležitou vlastnosťou ESI je závislosť signálu na koncentrácii a nie na množstve vstupujúcej vzorky, čo umožňuje jej nízke spotreby.[38, 42]

zdroj vysokého napätia

Obr. 7: Schéma ionizácie kladných iónov elektrosprejom.

Schematicky znázornený princíp ESI je na obr. 7. Kapilára, ktorou preteká roztok analytu, je umiestnená niekoľko mm až cm pred vstup do hmotnostného spektromet­

ra. Bežne používané prietoky sú približne 1-10 ul min"¹ a rozmery ústia kapiláry sa pohybujú väčšinou v um. Na kapiláru je aplikované silné elektrické napätie, ktoré spôsobí potenciálový rozdiel medzi jej špičkou a vstupom do M S , zvyčajne okolo 3 až 6 kV. Polarita privedeného elektrického napätia je určená podľa typu analyzo­

vaných iónov, napr. polynukleotidy bývajú analyzované v negatívnom móde, lebo ich ióny v roztoku majú záporný náboj.[38, 48] Pri analýze kladných iónov je na špičke kapiláry kladné napätie, ktoré spôsobí, že kladné ióny sa hromadia na povrchu kvapaliny a vytvárajú kvapku, zatiaľ čo záporné ióny sú naopak pri stenách. Pri pre­

konaní určitého napätia sa z kvapky na špičke vytvorí tzv. Taylorov kužeľ, ktorý pravidelne uvoľňuje dané množstvo kvapaliny vo forme kvapiek. Vyletujúce kvapky, ktoré obsahujú analyzované ióny, sú priťahované vstupom do M S , ktorý je opačne nabitý ako letiace kvapky. Počas letu sa z kvapiek odparuje rozpúšťadlo a zmenšujú sa, dokým nedosiahnu polomer, ktorý zodpovedá Rayleighovmu limitu stability:

q = 8n(e^oYR³)^1/2; (1)

kde q je veľkosť náboja, so je dielektrická konštanta vákua, y je povrchové napätie a R je polomer kvapky. Ak je polomer kvapky nižší ako v predchádzajúcej rovnici, dôjde ku Coulombickému štiepeniu. To znamená, že odpudzujúce sily iónov, ktoré sú rovnako nabité, prekonajú povrchové napätie kvapaliny, čím sa kvapka rozdelí na menšie kvapky. Tento proces sa viackrát opakuje. Konečný prechod iónov do plyn­

ného skupenstva môže prebiehať podľa dvoch teórií. Prvá hovorí, že kvapka sa delí, dokým v nej neostane iba jeden väčší ión, ktorý sa uvoľní po odparení všetkého roz­

púšťadla. Podľa druhej, sa menšie ióny začnú postupne uvoľňovať z povrchu kvapky, keď dosiahne veľmi malú veľkosť a zostáva v nej už len málo ió­

nov. [48-50]

V prípade menších rozmerov kapiláry (vnútorný priemer v jednotkách um) sa často používa i označenie nanosprej alebo nanoESI. Prietoky sa používajú v nl min"¹. Men­

šie ústie kapiláry sprejuje menšie počiatočné kvapky, čo vedie k zlepšeniu citlivosti analýzy a väčšej robustnosti, ak sú prítomné anorganické soli.[51] Prvýkrát ukázali výhody nanospreju Mann a Wilm v roku 1994.[52] ESI sa môže ďalej modifikovať podľa požadovanej aplikácie. Sprej ovanie môže prebiehať z čipu aj z rôzne uprave­

ných kapilár, ktoré môžu byť zo skla, kovu či iného materiálu. [53] Takisto existujú ambientné techniky využívajúce ESI, keď sú vzorky analyzované priamo za bežných podmienok. Kapilára môže byť umiestnená viacerými geometrickými spôsobmi voči vstupu do MS a taktiež sa využívajú prvky na zlepšenie sprejovania, napr. prídavné prúdy plynu (napr. dusík) či kvapaliny, ktoré uľahčujú a usmerňujú sprej ovanie. Tie­

to prvky takisto umožňujú kompatibilitu s mnohonásobne väčšími prietokmi eluen- tu.[42, 54]

3.4.2. Hmotnostně analyzátory

Všetky analyzátory využívajú k rozdeleniu iónov elektrické a/alebo magnetické pole.

Magnetický sektor a kvadrupól (Q) prepúšťajú podľa nastavenia po danej dráhe vždy len ióny o určitej hodnote m/z, pričom zmenou podmienok sa postupne preske- nuje celé spektrum. Principiálne najjednoduchší analyzátor doby letu (TOF) zase naraz deteguje všetky ióny podľa času dopadu. Medzi záchytové analyzátory patria iónové pasce (kvadrupólové a lineárne), orbitrap a iónový rezonančný cyklotron s fourierovou transformáciou, ktoré najprv uväznia všetky ióny a následne ich pre­

púšťajú alebo priamo detegujú zmenou nastavenia. Analyzátory sa väčšinou používa-

jú zapojene v sústavách namiesto samostatného použitia, aby sa zvýšili možnosti analýzy a zlepšili parametre prístroja. Pričom kvadrupól (prípadne i hexapól) slúži často ako vodiaci prvok či kolízna cela. Zapojenie viacerých analyzátorov umožňuje taktiež opakovanú separáciu po fragmentáciách iónov, teda tandemovú analýzu v priestore. V záchytových analyzátoroch môže prebiehať aj viacnásobná tandemová analýza v čase. [38, 42]

3.4.2.1. Q-TOF

Q-TOF je hybridný analyzátor, ktorý je zložený z kvadrupólového hmotnostného analyzátora a následne ortogonálně zapojeného analyzátora doby letu. Okrem týchto dvoch hlavných častí prístroja môžu byť súčasťou aj ďalšie prvky iónovej optiky (napr. kolízna cela). Q-TOF dokáže pracovať v jednoduchom aj tandemovom mó­

de. [55]

Kvadrupól sa skladá zo štyroch tyčí, ktoré majú okrúhly alebo hyperbolický tvar a všetky sú navzájom paralelné. Dvojice protiľahlých tyčí sú pripojené na opačné pó­

ly jednosmerného a striedavého elektrického napätia. Ióny letiace pozdĺž tyčí sú ovplyvňované meniacim sa elektrickým poľom, ktoré vytvára ich oscilujúce trajekto­

rie. K detektoru pokračujú iba ióny, ktorých pomer m/z zodpovedá určitým hodnotám napätí, čo sa dá vypočítať pomocou Mathieuových rovníc. Ostatné ióny sa zachytia na tyčiach alebo odletia mimo analyzátor. Princíp kvadrupólu zobrazuje obr. 8. Zme­

nou nastavenia napätí na tyčiach sa dá postupne detegovať celé spektrum iónov. Na­

stavené parametre taktiež určujú, aké rozpätie hodnôt m/z bude predstavovať stabilné trajektorie iónov, ktoré preletia analyzátorom.[38, 42]

prejdené ióny k detektoru

Obr. 8: Schéma konštrukcie a princípu kvadrupólu.

Ortogonálny TOF má základný princíp rovnaký ako obyčajný lineárny TOF. Oba fungujú ako letová trubica, v ktorej sú ióny rozdelené podľa času, ktorý potrebujú na prechod danou dráhou. Na začiatku trubice sú všetky ióny urýchlené elektrickým po­

ľom, ktoré im dodá rovnakú kinetickú energiu. Potom pokračujú oblasťou, kde na ne

nepôsobí ďalšia energia. Ťažšie ióny budú pokračovať nižšou rýchlosťou ako ľahšie ióny, čím sa rozdelia podľa hmotnosti. Teoreticky by mohli byť analyzované ióny s neobmedzenou hmotnosťou a rozlíšenie by malo závisieť iba od dĺžky trubice, ale príliš dlhá trubica by spôsobila zrážky aj disperziu iónov. Taktiež v praxi ióny nezačínajú a nekončia let v rovnakej polohe, ani v rovnakom čase, ani nemajú rovna­

kú počiatočnú kinetickú energiu. Rozlíšenie iónov sa teda dá zlepšiť viacerými spô­

sobmi, ktoré sa môžu súčasne kombinovať. Okrem ortogonálneho prívodu zaostre­

ných iónov (napr. kolmé spojenie TOFu s kvadrupólom) sa používajú reflektron a oneskorená extrakcia (len pre lineárny TOF). Reflektron funguje ako iónové zrkad­

lo, ktoré koriguje rozptyl počiatočných kinetických energií iónov s rovnakým pome­

rom m/z. Skladá sa zo série kruhových elektród, ktoré sú umiestnené na konci trubice oproti zdroju iónov. Elektrické pole reflektronu pôsobí proti letiacim iónom a otočí ich dráhu naspäť do trubice. Ióny s vyššou rýchlosťou a kinetickou energiou prenik­

nú hlbšie do reflektronu, pričom v ňom strávia viac času ako rovnaké ióny s menšou energiou a tak sa vyrovná celkový čas letu iónov s rovnakým m/z. Keďže ióny vyle­

tia naspäť do trubice, detektor býva umiestnený vedľa iónového vstupu podľa uhlu, v akom je naklonený reflektron. [38, 42]

reflektron

iónový zdroj smer

pohyb

iónov , ^f

i i

u r y c h l o v a č Obr. 9: Schéma hybridného analyzátora Q-TOF.

Oneskorená extrakcia urýchľuje ióny, ktoré sa po vstupe do trubice krátky čas roz­

deľujú podľa ich počiatočnej kinetickej energie v oblasti trubice, kde im nieje dodá­

vaná energia. Ión, ktorý mal pôvodne vyššiu energiu, sa bude pri oneskorenom

urýchlení nachádzať ďalej od elektródy ako ión, ktorý mal na začiatku menšiu ener­

giu. Preto na rozdiel od spojitej extrakcie, ktorá by prebehla hneď, keď sa ióny do­

stanú na začiatok trubice, dostane pôvodne pomalší ión pri neskoršej extrakcii viac energie, vďaka čomu sa vyrovná čas, ktorý oba ióny strávia v trubici. Oneskorená ex­

trakcia sa používa iba pre lineárny TOF v spojení s pulznými zdrojmi (napr. M A L - DI). Naopak pri spojení s ionizačnými technikami, ktoré súvislé produkujú prúd ió­

nov (napr. ESI), sa výhodne využíva ortogonálny prívod iónov, kde sú ióny urých­

lené krátkym pulzom vyprodukovaným pomocou elektródy, ktorá je umiestnená kolmo ku smeru ich pohybu pri vstupe do trubice. V tomto smere majú minimálne rozlíšenie rýchlostí a tiež polôh, ak sa použije zaostrený lúč iónov.[38, 42] Obr. 9 zobrazuje vyššie popísaný Q-TOF s ortogonálnym prívodom a reflektronom.

3.4.3. Vyhodnotenie spektier

3.4.3.1. Určenie náboja a hmotnosti viacnásobne nabitých iónov

M S spektrum je závislosť relatívnej početnosti alebo intenzity iónov na hodnote m/z.

Pri dostatočnom rozlíšení sa dajú tzv. píky v spektre ľahko priradiť jednotlivým ná­

bojovým stavom tej istej veľkej molekuly, ktorá vďaka izotopovému rozdeleniu prv­

kov vytvára tzv. obálku, teda niekoľko píkov s pravidelnou medzerou, ako je vidieť v detaile obr. 10.

Obr. 10: Spektrum roztoku vzorky polynukleotidu s izotopovou obálkou priblíženého piku s nábojovým stavom 5-.

Keďže izotopy sa líšia vždy o jednu hmotnostnú jednotku, veľkosť medzery medzi dvomi píkmi závisí od náboja, napr. pre ióny s nábojom ± 5 sa budú hodnoty píkov meniť o Am/z = 0,2. Podľa použitého módu MS analýzy vieme, či je náboj kladný alebo záporný. Presná hmotnosť sa vypočíta vynásobením nameranej hodnoty m/z nábojom. Pri použití mäkkej techniky majú v spektre svoje piky nielen veľké mak­

romolekuly, ale aj nekovalentné komplexy, ktoré sa dajú presne identifikovať podľa známej hmotnosti.[40] Zo spektra sa dá preto určiť aj stochiometria daných komple­

xov, príklad je na obr. 11.

r

y ^{" 6 í}

^-

y ^(k:

LQ97

j 5-

4S-210

/ -

1L37.M3D

L

6

" í

-

2598 p

(k:

LQ97

j 5-

4S-210

[M]

_ ĽJ, [M + L]

J 1134.3153

. .... L t . . IL . 1 .^{t L}.

i>

1327

i]

4229

[M + L]

"

1382.4-144

[M + 2L

1437.6337

1592

D526íSA_Yi8_LB0220_d:-MS.;.5-3.5min ŕŕ 90 BD

[M]

"

[M + L]

"

1659.3265

L [M + 2L]

ML ĺ ^{, 7}","^{s 2}

• •:: •

5

-

1200 130 3 1400 1500 1600 17CŮ frfZ

Obr. 11: Spektrá roztoku vzorky samotného polynukleotidu (hore) a rovnakého roz­

toku po pridaní alkaloidu (dole), ktorý vytvára komplexy s daným polynukleotidom.

V hornej časti obr. 11 je spektrum roztoku vzorky polynukleotidu a dole je spektrum toho istého polynukleotidu po pridaní alkaloidu do roztoku vzorky. Hore dokážeme identifikovať piky troch nábojových stavov, ktoré patria danému polynukleotidu.

Dolné spektrum rovnako obsahuje piky samotného polynukleotidu (označeného ako M), ale zároveň pribudnú pre každý nábojový stav piky komplexov polynukleotidu s alkaloidom (označeným ako L). Ich hodnoty m/z sú kumulatívne, teda rozdiel me­

dzi m/z piku [M] (samotný Polynukleotid) a píkom [M+L] (komplex polynukleotidu a alkaloidu v pomere 1:1) je rovnaký ako rozdiel medzi m/z piku [M+L] (komplex polynukleotidu a alkaloidu v pomere 1:1) a píkom [M+2L] (komplex polynukleotidu a alkaloidu v pomere 1:2). Rovnako by to platilo v prípade vyšších pomerov. Daný rozdiel m/z sa po vynásobení nábojom rovná presnej hmotnosti pridaného alkaloidu.

Druhý spôsob, ako určiť či overiť nábojový stav, ktorý je potrebný pre priradenie pi­

ku s hodnotou m/z skúmanej látke alebo komplexu, je pomocou nasledujúceho výpo­

čtu. Pre výpočet stačí poznať približné hodnoty m/z dvoch nasledujúcich nábojových stavov (napr. 6- a 5- ako je ukázané na obr. 10) a dá sa použiť aj pri veľmi nízkom rozlíšení, ktoré dnešné MS prístroje ľahko prekonávajú.[38, 42] Náboj jedného piku sa vypočíta pomocou rovnice:

= ±m^H-m²/z² (m²/z²-mjz^)

kde zi je náboj iónu s vyššou hodnotou m/z a m; je jeho hmotnosť; m2/z2 zase prislú­

cha iónu s nižšou hodnotou m/z; m^H je hmotnosť protónu. Rovnica (2) je odvodená upravením rovníc (3) a (4) o dvoch neznámych (zi a Z2)'

z²=z¹ + l (3)

z²( m²/ z² + m^H) = z¹{m¹/z¹ ± m^H) = M (4) Rovnica (3) je odvodená z predpokladu, že hodnoty píkov, ktoré sú použité vo výpo­

čte, patria dvom nasledujúcim nábojovým stavom líšiacim sa o 1. Rovnica (4) je zase odvodená z úvahy, že hmotnosť nabitej molekuly m je navýšená alebo znížená o hmotnosť všetkých protónov m#, ktoré by sa pridali alebo odtrhli od nenabitej mole­

kuly o hmotnosti M:

m (M+z-mn)

— = - ~ ^{z HJ} => z • (m/z ± m^H) = M (5)

3.4.3.2. Výpočet konštánt pre porovnanie afinity alkaloidov v inter­

akcii s polynukleotidmi

Aj keď ióny prechádzajú z roztoku do plynného stavu, v ktorom sú analyzované, za určitých podmienok môžu byť namerané píky v M S spektre použité k porovnaniu väzobnej afinity malých molekúl alebo katiónov ku G4 štruktúram polynukletidov.

Pre dané porovnanie interakcií rôznych ligandov s polynukleotidmi môžeme stanoviť tzv. konštanty afinity. Konštanty afinity sa dajú počítať z intenzít[56, 57] alebo z plôch píkov,[40] pričom výpočet sa principiálne nelíši. Taktiež sa dá relatívna afi­

nita ligandov porovnať vypočítaním pomeru relatívnych intenzít iónov všetkých komplexov ku sume intenzít iónov komplexov spolu s iónmi voľných G4.[37] Rov­

nako môže byť použitý pomer, kde namiesto relatívny intenzít vystupujú sumy plôch

MS píkov.[36] Ak by proces ESI prebiehal jednoducho, teda by M S signál kvantita­

tívne zodpovedal koncentráciám v skúmanom roztoku, konstanty afinity by zodpo­

vedali rovnovážnym asociačným konstantám študovaných nekovalentných komple­

xov v roztoku. Keďže prechod do plynnej fázy je komplikovaný a môže sa líšiť pre samotné molekuly a komplexy, takéto prirovnanie konštánt afinity rovnovážnym konštantám je diskutabilné, ale dá sa použiť pre zjednodušenie popisu sledovaných interakcií. Avšak existujú aj ďalšie zložitejšie prístupy, ktoré riešia vzťah medzi in­

tenzitami v MS spektre a koncentráciami v skúmanom roztoku.[58]

Nasleduje ukážka výpočtu konštánt afinity pre komplexy polynukleotidu s alkaloidom v pomere 1:1 (Kj) a 1:2 (K²), ktorý bol použitý v tejto práci pre charak­

terizáciu interakcií daných komplexov. Rovnako by sa konštanta počítala i v prípade, že by sa tvoril iba komplex 1:1, a podobným princípom by sa počítali konštanty aj pre komplexy s vyšším pomerom alkaloidu:

[1:1] . _

K L ~ [DNAHALKV ^{( 6)}

= [1:2] .

2 [1:1]-[ALKV ^K '

kde K^x sú konštanty afinity a [DNA], [1:1], [1:2] sú rovnovážne koncentrácie samo­

statného polynukleotidu a jeho komplexov s alkaloidom v pomere 1:1 a 1:2 v analyzovanom roztoku. Počiatočné rovnovážne koncentrácie polynukleotidu a alkaloidu sú známe a vo väčšine experimentov boli pre zjednodušenie rovnaké:

c⁰ = [DNA]⁰ = [ALK]⁰; (8)

kde co sú počiatočné koncentrácie. Ostatné rovnovážne koncentrácie potrebné pre výpočet konštanty sa vypočítajú pomocou vzorcov:

M = ^co • a Jr T, v ^{k d e x} = ^{D N A}> ^{1 : V}> ^{1 : 2}; (⁹)

{'DNA+h-.l+h-.l)

[i4L/ř] = c⁰- [ l : l ] - 2 - [ l : 2 ] ; (10) kde I^x sú intenzity píkov, ktoré zodpovedajú koncentráciám [x] samostatného poly­

nukleotidu (x=DNA) a jednotlivých komplexov polynukleotidu s alkaloidom v pomere 1:1 (x=l:l) alebo 1:2 (x=l:2). Dôležitým predpokladom pre uvedené vý-

počty je, že relatívne intenzity, ktoré zodpovedajú píkom komplexov a samostatných polynukleotidov, sú proporčně rovnaké ako ich relatívne koncentrácie [DNA], [1:1]

a [1:2] v analyzovanom roztoku:

[DNA] [1:1]

/ _1:1

[1:2]' / _1:2

(H) kde I^x sú intenzity (alebo sumy plôch) M S píkov, ktoré zodpovedajú koncentráciám [x] samostatného polynukleotidu (x=DNA) a jednotlivých komplexov polynukleoti- du s alkaloidom v pomere 1:1 (x=l:l) alebo 1:2 (x=l:2).[40, 56]

3.5. Ciele práce

Cieľom tejto práce bolo vybrať vhodné podmienky pre štúdium interakcie intramole- kulárnych G-kvadruplexov s vybranými ligandmi, alkaloidmi sanguinarínom, kopti- zínom, koryzamínom a stylopínom, pomocou hmotnostnej spektrometrie. Podmienky zahŕňajú prítomnosť rôznych iónov (NH4⁺, K⁺) pri stabilizácii G4rvadruplexových komplexov a optimalizáciu MS parametrov, iónového zdroja a iónovej optiky.

4. Experimentálna časť 4.1. Chemikálie

• Alkaloidy, Biochemický ústav, Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česko:

• Sanguinarín chlorid (SA), C20H14NO4CI

• Koptizín chlorid (KP), C19H14NO4CI

• Koryzamín chlorid (KR), C²o H i⁶N 0⁴C l

• Stylopín (ST), C19H17NO4

• Amoniak, NH3, 25% roztok vo vode, Fluka, Nemecko

• Chlorid draselný, K C l , 99,0%, Sigma-Aldrich, Nemecko

• Izopropanol, (CH³)²CHOH, > 99,9 %, Sigma-Aldrich, Nemecko

• Kyselina octová, C H 3 C O O H , > 99,7 %, Sigma-Aldrich, Nemecko

• Metanol, C H³C H²O H , > 99,9 %, Honeywell, Nemecko

• Octan trietylamónny (TEAA), ( C H³C H²)³N H O C O C H³, -1,0 mol ľ¹ roztok vo vode, Sigma-Aldrich, Nemecko

• Polynukleotidy, H P L C čistota, Thermo Fisher Scientific, USA:

• G G l , sekvencia: 5'-CGG G C G G G C G C G A G G G A G GGT-3'

• chair 1, sekvencia: 5'-GGT T G G TGT GGT TGG-3'

• T20, sekvencia: 5-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3'

• DS26, sekvencia: 5'-CAA T C G G A T C G A A T T C G A TCC G A T TG-3'

4.2. Prístrojové vybavenie

Hmotnostný spektrometer micrOTOF-Q II (Bruker Daltonik GmbH, Nemecko) Pre vstreknutie vzoriek do ESI zdroja bola používaná injekčná striekačka napojená na pumpu, ktorá udržiavala pravidelný prietok nastavený na 220 ul hod"¹. Ak nie je uvedené inak priamo pri spektre, všetky spektrá boli zaznamenané v negatívnom móde v celkovo rozsahu m/z 50 až 10000 s frekvenciou 1 Hz a ďalšie parametre M S analýzy boli: napätie ESI kapiláry 3500 V ; napätie na vstupe do M S 500 V ; tlak ne- bulizačného plynu 2,5 Bar; prietok sušiaceho plynu 5 1 min"¹; teplota v zdroji približ­

ne 100 °C.

Prístroj bol kalibrovaný na začiatku každého meracieho dňa pomocou 10 mmol ľ¹ roztoku mravčanu sodného v 50% izopropanole tak, aby výsledná chyba nebola väč­

šia ako 2 ppm. Konečné použité spektrá sú priemerné spektrá z minimálne 60 spek­

tier, ktoré boli nahrávané aspoň za jednu minútu, pričom celkové nahrávanie spektier prebiehalo dlhší čas a vždy až po ustálení signálu. Pre vyhodnotenie a úpravu spek­

tier bol používaný sofrvér DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltonik GmbH, Nemecko).

4.3. Príprava roztokov

Zásobné roztoky

Polynukleotidy boli doručené v pevnej suchej forme. Zásobné roztoky polynukleoti- dov boli pripravené pridaním odpovedajúceho objemu vody tak, aby roztoky mali presnú koncentráciu (chairl a T20 boli 400 u.mol ľ¹, DS26 bol 300 u.mol ľ¹, GG1 bol 200 u.mol ľ¹). Roztoky boli skladované v chladničke.

Alkaloidy, ktoré boli extrahované v pevnej forme na Biochemickom ústave (Lékař­

ská fakulta Masarykovej univerzity), boli po navážení rozpustené v presnom objeme vody (použité pre SA, K P , KR) alebo metanolu (použité pre ST) tak, aby ich roztoky mali presnú koncentráciu (SA a K R boli 200 u.mol ľ¹, K P bol 300 u.mol ľ¹, ST bol 315 u.mol ľ¹). Roztoky boli skladované v chladničke.

Vzorky v pufri NH4OAC

Všetky roztoky vzoriek boli pripravené zriedením zásobných roztokov polynukleoti- dov a alkaloidov, ktoré boli skladované v chladničke, na ekvimolárnu koncentráciu,

t. j . koncentrácia polynukleotidu aj alkaloidu v roztoku vzorky bola 5 u.mol ľ . Do roztokov bol pridaný pripravený pufer NH4OAC o koncentrácii 300 mmol ľ¹ tak, aby jeho koncentrácia v roztokoch bola 100 mmol ľ¹; a tiež metanol tak, aby jeho kon­

centrácia v roztokoch bola 20 % (v/v).

Vzorky v pufri TEAA s KC1

Všetky roztoky vzoriek boli pripravené zriedením zásobných roztokov polynukleoti- dov a alkaloidov, ktoré boli skladované v chladničke, na ekvimolárnu koncentráciu, t. j . koncentrácia polynukleotidu aj alkaloidu v roztoku vzorky bola 5 u.mol ľ¹. Do roztokov bol pridaný roztok T E A A tak, aby jeho koncentrácia v roztokoch bola 20 mmol ľ¹; a tiež pripravený roztok KC1 o koncentrácii 10 mmol ľ¹ tak, aby jeho koncentrácia v roztokoch bola 0,2 mmol ľ¹; a nakoniec izopropanol tak, aby jeho koncentrácia v roztokoch bola 20 % (v/v).

4.4. Interpretácia MS spektier pre vzorky polynukle- otidov s alkaloidmi

Na obr. 12 sú priblížené piky M S spektier, na ktorých je vysvetlený spôsob vyhodno­

tenia spektier. Pre interpretáciu a ďalšie vyhodnotenie boli vždy použité všetky rele­

vantné piky, ktoré boli v rovnakom nábojovom stave vybranom na základe najväčšej intenzity daných píkov (na obr. 12 je to 5-). Podľa všetkých nastavení MS analýzy sa môže u rôznych polynukleotidov jednať o rôzne nábojové stavy, ktoré sú pri daných nastaveniach preferované. Zmenou nastavení by sa dal zmeniť nábojový stav, ktorý by poskytoval piky s najvyššími intenzitami, ale pomery a sledované zmeny zostáva­

li vždy približne rovnaké bez ohľadu na intenzitu píkov ostatných nábojových sta­

vov. Pri úplnom priblížení vytvára každý pík izotopovú obálku, ako je vidieť aj v detaile B na obr. 12. Pretože piky tvoriace obálku sa líšia iba v izotopovom zastú­

pení prvkov a nie tým, ktoré molekuly či ióny tvoria komplexy patriace daným pí- kom, bude vždy celá izotopová obálka označená podľa monoizotopickej hmotnosti, ako by bola len jeden pík danej molekuly alebo komplexu. Napr. monoizotopická hodnota m/z pre molekulu GG1 v nábojovom stave 5- je približne M([GG1 - 5H⁺]⁵") = 1325,23; ale na obr. 12 v detaile B je rovnako označený najvyšší pík z obálky, ktorý má trochu inú hodnotu m/z, tedaM([GGl - 5H⁺]⁵") = 1325,86. Ak bude na polynukleotid naviazaný určitý počet iónov ako je vidieť na obr. 12, hodnota

m/z sa zväčší o hmotnosť daných iónov, napr. z M([GG1 - 5H⁺]⁵") = 1325,86 na M([GG1 + N H^{4 +} - 6H⁺]⁵") = 1329,26. Rovnako sa dá určiť hodnota, akú bude mať komplex polynukleotidu s alkaloidom, keďže bude zvýšená o hmotnosť daných alka­

loidov, čo je ukázané v detaile A obr. 12. Všetky tieto teoreticky vypočítané hodnoty, podľa ktorých sa dajú identifikovať používané polynukleotidy a ich komplexy s alka­

loidmi i iónmi, sú uvedené v tab. 1 a 2.

GGl+SA vz5 1 8 0 2 2 0 . d : -MS. 0 . 5 - 1 . 5 m i n #29-90

sanquinarin

— 66.2219

[ G G 1 + N H^{4 +}- 6 H⁺]⁵'

sanguinarin

— 66.2157

[ G G 1 + S A + N H^{4 +}- 7 H⁺]⁵'

i

3 A 1395.4842

66.2201 SA

66.2169

[ G G 1 + 2 S A + N H4 +- 8 H+]5'

1461 6!)99

i 1464.9085

1 3 8 0 1 4 0 0 1 4 2 0 1 4 4 0 1 4 6 0 rrVz

N H^{4 +}

3.4023 N H^{4 +} 3.4063

B

[ G G 1 + N H^{4 +} - 6 H⁺]⁵ [ G G 1 - 5 H T

1325.8600

1329.2623 I

N H^{4 +} 3.4072

[ G G 1 + 2 N H^{4 +} - 7 H⁺]⁵"

[ G G 1 + 3 N H4 + - 8 H+]5

1332.6686 | 1336,0758

1 3 2 4 1 3 2 6 1 3 2 8 1 3 3 0 1 3 3 2 1 3 3 4 1 3 3 6 1 3 3 8 rrVz

Obr. 12: Rôzne priblížené spektrum namerané pre roztok GG1 so SA, ktoré zobrazu­

je, ako boli priradené M S píky v nábojovom stave 5- jednotlivým iónom obsahujú­

cim v komplexe naviazaný sanguinarín (A) a katión M V " (B).

Pre výpočty a vyhodnocovanie spektier boli vždy používané piky s najvyššou inten­

zitou, ktoré zodpovedajú hmotnostiam makromolekul s takým izotopovým zastúpe­

ním prvkov, ktoré má najvyššiu pravdepodobnosť výskytu. U makromolekul nemu­

sia piky s najvyššou intenzitou zodpovedať monoizotopickým píkom, ktoré sú tiež uvedené v tab. 1 a 2. Taktiež je dôležité poznamenať, že piky s rovnakým nábojom, ale rôznym počtom katiónov v komplexe, sa musia líšiť počtom vodíkových atómov, ktoré boli odtrhnuté z molekuly polynukleotidu a tak dodávajú molekule konečný náboj. Keďže počet vodíkových atómov sa dá z náboja ľahko dopočítať a nie je tak dôležitý ako ostatné katióny v komplexe, bude v ďalších častiach tejto práce pre zjednodušenie uvádzaný napr. takýto skrátený popis piku [GG1+2NH⁴⁺]⁵", namiesto celého presného popisu [GG1+2NH4⁺-7H⁺]⁵". Takisto v tab. 2 sú uvedené hodnoty o aké sa zmení hodnota m/z pre ión komplexu s pridaným katiónom alebo alkaloidom už aj po započítaní zmeny počtu vodíkových atómov (ST nemá náboj na dusíku ako ostatné použité alkaloidy, preto nemení počet H⁺).

Tab. 1: Teoreticky vypočítané hodnoty m/z pre monoizotopické MS piky samotných polynukleotidov s rôznymi nábojovými stavmi.

názov / skratka polynukleotidu

nábojový stav názov / skratka

polynukleotidu 0 6- 5- 4- 3-

GG1 6631,13 1104,19 1325,23 1656,78 2209,38 chairl 4723,79 786,30 943,76 1179,95 1573,60 T20 6018,97 1002,16 1202,79 1503,74 2005,32 DS26 7966,36 1326,73 1592,27 1990,59 2654,45

Tab. 2: Teoreticky vypočítané hodnoty m/z, o ktoré sa zvýši hodnota MS píkov sa­

motných polynukleotidov s rôznymi nábojovými stavmi, ak na polynukleotid budú v komplexe naviazané rôzne ióny a alkaloidy.

naviazané alkaloidy

nábojový stav naviazané ióny

nábojový stav naviazané

alkaloidy 0 6- 5- 4-

naviazané

ióny 0 6- 5- 4-

SA-H⁺ 331,08 55,18 66,22 82,77 N H^{4 +}- H⁺ 17,03 2,84 3,41 4,26 KP-H⁺ 319,08 53,18 63,82 79,77 K⁺- H⁺ 21,99 3,67 4,40 5,50 K R - H⁺ 333,10 55,52 66,62 83,28 Na⁺-H⁺ 37,96 6,33 7,59 9,49

ST 323,12 53,85 64,62 80,78

Obr. 12 v detaile B zobrazuje ako sa dajú priradiť piky komplexov GG1 s rôznym počtom NH4⁺. Medzi píkmi v nábojom stave 5- sú pravidelné rozdiely, ktoré sa rov­

najú približne hodnote m/z = 3,41, ktorá podľa tab. 2 zodpovedá tomu, že k samotnej molekule GG1 je naviazaný ďalší katión NlV". Preto hodnota piku [GG1+3NH^{4 +}]⁵"

je približne m/z = 1325,86 + 3-3,41 = 1336,08; čo je zobrazené v detaile B obr. 12.

Ak by sa naviazal na molekulu GG1 katión Na⁺, rozstup píkov by bola hodnota m/z = 7,59; ako je vidieť aj v tab. 2 v stĺpci pre nábojový stav 5-. Pri interakcii sangu- inarínu s GG1 sa zase hodnoty m/z MS píkov zvýšia približne o m/z = 66,22, čo je zobrazené v časti A obr. 12 a táto hodnota je tiež vidieť v tab. 2.

4.5. Optimalizácia podmienok

4.5.1. Optimalizácia pufrov

Konečné koncentrácie pufrov, ktoré boli používané pre prípravu roztokov vzoriek (uvedené v kap. 4.3.), boli vybrané na základe rešerše literatúry a pomocou vlastnej optimalizácie tak, aby M S spektrá poskytovali dostatočné intenzity píkov sledova­

ných iónov a obsahovali čo najmenej interferujúcich píkov. Pre rôzne kombinácie roztokov polynukletidov s pridanými alkaloidmi pravdepodobne existujú aj lepšie podmienky, ale všetky majú širšie rozmedzie koncentrácii pufrov, ktoré sa dajú pou­

žiť. Vybrané koncentrácie boli dostatočné pre všetky používané roztoky samotných polynukleotidov i roztoky polynukleotidov s alkaloidmi.

Prídavok metanolu a izopropanolu bol zvolený kvôli zvýšeniu signálu, ktoré nemá vplyv na pomery intenzít píkov. Obe látky znižujú povrchové napätie v kvapkách, ktoré sú sprejované do M S , čím podporujú proces ESI.[11, 40] Ideálny prídavok me­

tanolu bol 15 až 25 %, pričom pri vyšších koncentráciách dochádzalo k zhoršeniu signálu a nižšie množstvo zase nemalo takmer žiadny efekt. Pre roztoky s K⁺ bol pô­

vodne používaný metanol nahradený izopropanolom, ktorý mal oveľa lepší pozitívny efekt na intenzitu signálu.

Aby sa v roztoku vytvorili prípadné G4 štruktúry, je potrebný malý prídavok NH4⁺ alebo K⁺ iónov. Pre roztoky s NFÍ4⁺je potrebné pre výrazný signál používať približne 50 mmol ľ¹ roztok NH4OAC, pričom boli odskúšané aj koncentrácie 100, 150 a 200 mmol ľ¹, ktoré poskytovali obdobný signál bez výrazných zmien. Nastaviť op­

timálne podmienky pre roztoky s K⁺ bolo komplikovanejšie, lebo roztok KC1 sa kvô-