VÝZKUMNÉ CENTRUM PRO CHEMII ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGII

P Ř Í R O D O V Ě D E C K Á F A K U L T A

VÝZKUMNÉ CENTRUM PRO CHEMII ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGII

V A L I D A C E A O P T I M A L I Z A C E P O S T U P U O D B Ě R U , T R A N S P O R T U A Ú P R A V Y V Z O R K Ů P Ů D P R O

M I K R O B I Á L N Í A N A L Ý Z Y

Bc. Michala Nešporová

Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce:

RNDr. Jakub Hofman, Ph.D

Konzultantka:

RNDr. Jitka Cernohlávková

v

Brno, Česká republika, 2008

OBSAH

OBSAH 2 ABSTRAKT 4 ABSTRACT 5 1. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE 6

2. TEORETICKÁ ČÁST 7

2.1 P Ů D N Í M I K R O O R G A N I S M Y A JEJICH V Ý Z N A M 7

2.2 K O L O B Ě H U H L Í K U 8 2.3 K O L O B Ě H DUSÍKU 1 0 2.4 V Y U Ž I T E L N O S T M I K R O B I Á L N Í C H P A R A M E T R Ů V EKOLOGII, M O N I T O R I N G U A E K O T O X I K O L O G I I 1 2

2.5 V A R I A B I L I T A M I K R O B I Á L N Í C H P A R A M E T R Ů PŮD 13

2.5.1 Časová variabilita 14 2.5.1.1 Studie Wardle (1998) 14 2.5.2 Prostorová variabilita 17

2.6 F A K T O R Y OVLIVŇUJÍCÍ PŮDNÍ M I K R O O R G A N I S M Y 18

2.6.1 Obsah uhlíku a dusíku a dalších živin v půdě 19

2.6.2 l liv rostlin 21 2.6.3 Sezónní výkyvy 22 2.6.4 pH půdy 23 2.6.5 Vlhkost 24 2.6.6 Teplota 25 2.6.7 Struktura a textura půdy 25

2.6.8 Těžké kovy a pesticidy 26

2.7 P O S T U P Y ODBĚRŮ, Ú P R A V Y , M A N I P U L A C E A S K L A D O V Á N Í PŮDNÍCH VZORKŮ PRO M I K R O B I Á L N Í

A N A L Ý Z Y 2 7

2.7.1 Plán odběru vzorků 27 2.7.2 Odběr vzorků 29 2.7.3 Homogenizace, úprava a skladování vzorků 30

2.7.4 Příprava vzorků k analýze 31

2.8 V L I V N A K L Á D Á N Í S P Ů D N Í M V Z O R K E M N A PŮDNÍ M I K R O O R G A N I S M Y 3 1

2.8.1 Zrnitostní frakce 31 2.8.2 Teplota a forma skladování 32

2.8.3 Čas od odběru do analýzy 33

3. MATERIÁL A METODY 35

3.1 POUŽITÉ PŮDY 3 5 3.2 D E S I G N P R O V Á D Ě N Ý C H E X P E R I M E N T Ů 3 6

3.2.1 Experiment 1 - vliv skladování a času na parametry cyklu uhlíku 36 3.2.2 Experiment 2 - vliv zrnitostní frakce na parametry cyklu uhlíku 37 3.2.3 Experiment 3 - analýza zdrojů variability jednotlivých metod 38 3.2.4 Experiment 4 - vliv skladování na citlivost mikroorganismů vůči toxickému působení kadmia...39

3.3 J E D N O T L I V É M E T O D Y M Ě Ř E N Í B Ě H E M EXPERIMENTŮ 4 0

3.3.1 Stanovení obsahu sušiny a maximální vodní kapacity (WHC) 40

3.3.2 Bazálni respirace (BR) 41 3.3.3 Substrátem indukovaná respirace (SIR) 42

3.3.4 Chloroform fumigačně - extrakční metoda (FE, C^bi0) 43

3.3.5 Potenciální amonifikace argininu (PAMO) 45 3.3.6 Potenciální nitrifikace (PAO, SNA) 46 3.3.7 Anaerobní amonifikace (AMO) 47

3.4 STATISTICKÁ A N A L Ý Z A V Ý S L E D K Ů 4 8

2

4. VÝSLEDKY 49

4.1 E X P E R I M E N T 1 - V L I V S K L A D O V Á N Í A Č A S U N A P A R A M E T R Y C Y K L U U H L Í K U 4 9 4.2 E X P E R I M E N T 2 - V L I V ZRNITOSTNÍ F R A K C E N A P A R A M E T R Y C Y K L U U H L Í K U 5 2 4.3 E X P E R I M E N T 3 - A N A L Ý Z A ZDROJŮ V A R I A B L I T Y JEDNOTLIVÝCH M E T O D 53 4.4 E X P E R I M E N T 4 - V L I V S K L A D O V Á N Í N A CITLIVOST M I K R O O R G A N I S M Ů VŮČI T O X I C K É M U PŮSOBENÍ

K A D M I A 54

5. DISKUSE 56

5.1 E X P E R I M E N T 1 - V L I V S K L A D O V Á N Í A Č A S U N A P A R A M E T R Y C Y K L U U H L Í K U 56 5.2 E X P E R I M E N T 2 - V L I V ZRNITOSTNÍ F R A K C E N A P A R A M E T R Y C Y K L U U H L Í K U 58 5.3 E X P E R I M E N T 3 - A N A L Ý Z A ZDROJŮ V A R I A B L I T Y JEDNOTLIVÝCH M E T O D 5 9 5.4 E X P E R I M E N T 4 - V L I V S K L A D O V Á N Í N A CITLIVOST M I K R O O R G A N I S M Ů VŮČI T O X I C K É M U PŮSOBENÍ

K A D M I A 6 0

6. ZÁVĚRY 62 7. LITERATURA 64 8. PŘÍLOHY 77

3

ABSTRAKT

Mikrobiální parametry půd jsou velmi významnou složkou biomonitoringu v terestrických ekosystémech. Umožňují indikovat probíhající negativní procesy v půdě včetně toxického působení půdních kontaminantů. Z mnoha studií je známo, že mikrobiální parametry v reálných půdách vykazují značnou časovou a prostorovou variabilitu. K té se navíc přidává různou měrou vliv manipulace s odebraným vzorkem půdy a variabilita daných mikrobiálních metod. Je překvapující, že ačkoli existují určitá doporučení pro skladování a manipulaci s půdou pro účely mikrobiálních analýz, systematický průzkum těchto vlivů na jednotlivé parametry a zejména na jejich následnou citlivost v testech toxicity ještě nebyl

proveden.

Cílem této práce bylo vyhodnotit vliv skladování a úpravy půdních vzorků na vybrané mikrobiální parametry tří půd - orná, trvalý travní porost a lesní půda. Hodnocené parametry zahrnovaly bazálni respiraci - BR, substrátem indukovanou respiraci - SIR, mikrobiální biomasu - Cbi⁰, amonifikaci - A M O , potenciální amonifikaci - P A M O a krátkodobou potenciální nitrifikaci - PAO. Proběhlo srovnání nej frekventovanějších forem skladování (tj.

v lednici při teplotě 4 °C ' v mrazáku při teplotě -18 °C a ve vysušené podobě za laboratorní teploty 22 °C) a zhodnocení vlivu délky skladování (jeden až šest měsíců). Pro správné vyhodnocení bylo také nutné zjistit vlastní variabilitu používaných metod. Dalším úkolem bylo určit vliv velikostní frakce půdy (1, 2, 4 mm) na mikrobiální parametry uhlíku (BR, SIR, Cbio)- Ve finále se pak tato práce zabývá vlivem skladování na citlivost mikroorganismů v testech toxicity s kadmiem.

Ze získaných výsledků porovnání různých typů skladování vyplynulo, že skladování může parametry uhlíku jak stimulovat, tak inhibovat. Celkově byly hodnoty parametrů uhlíku nejvíce podobné čerstvé půdě při skladování v lednici (4 °C). Rozdíl v hodnotách mikrobiálních parametrů cyklu uhlíku pro velikostní frakce orné a lesní půdy se téměř nevyskytuje. Efekt se objevil pouze u trvalého travního porostu, kdy frakce 4 mm vykazuje u metod B R a SIR nej nižší hodnoty. Variabilita metod byla sledovaná v další fázi experimentů několikerým opakováním metody na stejném vzorku během krátké doby. Výsledky se liší pro stanovení jednotlivých prvků. Pro parametry uhlíku se pohybuje maximálně do 15%. Pro parametry dusíku je vyšší, u PAO je do 16%, A M O do 30%, P A M O do 40% - u lesní půdy až

100%. Z vyhodnocení vlivu skladování na citlivost v testu toxicity kadmia na mikroorganismy vyplývá, že u B R dochází ve všech typech skladování ke snížení citlivosti mikroorganismů vůči kadmiu. Ostatní metody vykazují spíše nárůst citlivosti. Pro mikrobiální biomasu (Cbi⁰) byla citlivost nejvíce zvýšená skladováním v mrazáku a u substrátem indukované respirace také skladováním v lednici. Pro parametry dusíku je skladováním citlivost také zvýšena, ale různou mírou. Efekt se zde liší podle charakteru půdy a metody skladování.

Klíčová slova: skladování půdy, mikrobiální biomasa, půdní mikroorganismy, velikostní frakce půdy, toxicita Cd

4

ABSTRACT

Soil microbial parameters are very important part of monitoring in terrestric ecosystems. They make possible to indicate negative processes in the soil including toxic influence of soil contaminants. Microbial parameters in real soils show a big temporal and spatial variability, which is known from a lot of studies. The other source of variability can be also manipulation with samples and variability of used methods. It is surprising, although we have some references to storage and manipulation with soil for microbial analyses, nobody made a systematic research of these influences to parameters of biomass and their susceptibility in toxicity tests.

The aim of this work was to determine the influence of storage on select microbial parameters of soil (basal respiration - BR, substrate induced respiration - SIR, content of extractable carbon in microbial cells - Q,io, ammonification - P A M O , potential ammonification - P A M O and short-term potential nitrification - PAO). We compared the way of storage (in frige at 4 °C, in freezer at -18 °C and in dry condition at 22 °C) and time of storage (from one to six month). In the next step we determine the variability of all methods, which were used. The next part was aimed to determine the influence of size-fraction (1, 2, 4 mm) on microbial carbon parameters (BR, SIR, Cbi⁰). And the final part of this work was about influence of storage to toxicity tests of cadmium to microorganisms.

The results of the comparison of different ways of storage show that values of carbon parameters from frige is the closest to the values measure in the fresh soil. The difference between values of carbon microbial parameters doesn't occure in arable and forest soil. Effect exists only in the pasture soil that is the least value for size fraction 4 mm at B R and SIR methods. Variability of the methods is different for assessment each element. For carbon parameters it move most to 15%. For nitrogen parameters is the variability bigger than for carbon parameters. For P A O variability is about 16%, for A M O it is about 30% and for P A M O variability is about 40% - for forest soil it is up to 100%. We find in evaluation of influence of storage to susceptibility in toxicity test with cadmium to soil microorganisms that by B R method susceptibility of microorganisms decline. And susceptibility increases by other methods.

Key words: soil storage, microbial biomass, soil microorganisms, soil size-fractions, toxicity of cadmium

5

1. CÍLE

Společenstvo mikroorganismů v půdě je klíčové pro udržení úrodnosti půdy, cyklů živin a prvků. Slouží jako varovací systém účinku polutantů a hraje důležitou roli při jejich degradaci. V současné době existuje celá řada metod, které umožňují půdní mikrobiální společenstva hodnotit. Na druhou stranu půdní mikroorganismy a půda jako celek představují velmi heterogenní systém. S tím souvisí i problémy spojené s realizací monitoringu či laboratorních experimentů, kdy dochází ke zkreslování výsledků vlivem odběru, přechovávání, úprav vzorků půdy, ale také případnou variabilitou metod.

Cílem této diplomové práce bylo zjistit variabilitu ve výsledcích měření vybraných mikrobiologických parametrů půd (bazálni respirace, substrátem indukovaná respirace, mikrobiální biomasa, amonifikace, potenciální amonifikace a krátkodobá potenciální nitrifikace) v závislosti na různém způsobu a čase skladování. Tedy jestli existuje vztah mezi formou (tj. v lednici, v mrazáku a ve vysušeném stavu za laboratorní teploty) a délkou skladování (jeden až šest měsíců). Dále bylo cílem zjistit, zda jsou srovnatelné výsledky u určitých velikostních frakcí půdy (1, 2 a 4 mm). Po objasnění vlivu výše jmenovaných zásahů na dané parametry bylo cílem taktéž zjistit, jak tyto faktory ovlivňují relativní citlivost mikroorganismů vůči působení toxikantů. Součástí práce bylo také vyhodnocení variability jednotlivých parametrů, tedy podíl variability metody (a operátora) a analytické koncovky,

protože ty mohou být zodpovědné za další část celkové variability parametru.

Během realizace práce jsem se podílela i na měření mikrobiálních parametrů pro monitoring půd z oblastí Košetice a cementárna Mokrá a tyto výsledky byly využity v odborných zprávách těchto projektů.

6

2. TEORETICKÁ ČÁST

2.1 Půdní mikroorganismy a jejich význam

Půdu lze definovat jako samostatný přírodní útvar vzniklý z povrchových zvětralin zemské kůry a z organických zbytků za působení půdotvorných faktorů. Je životním prostředím půdních organismů, stanovištěm planě rostoucí vegetace, slouží k pěstování kulturních rostlin. Reguluje koloběh látek, může fungovat jako úložiště, ale i zdroj látek potenciálně rizikových. Jedná se o dynamický, stále se vyvíjející živý systém. Přežití a prosperita všech suchozemských biologických společenstev, přirozených i umělých, závisí na této tenké vrchní vrstvě Země. Půda je proto bezesporu nej cennějším přírodním bohatstvím.

Půdní mikrobiální biomasa může být definována jako organismy žijící v půdě, které jsou obvykle menší než cca 10 [xm (Schloter et al., 2003). Obsahuje mnoho druhů bakterií, hub a zároveň také větší půdní organismy jako jsou kvasinky, řasy nebo prvoci. Každý druh má však svoji specifickou roli, takže se doplňují a dohromady fungují jako jeden celek (Brooks et al., 1985). Největší pozornost je věnována houbám a bakteriím. Tyto dvě skupiny mikroorganismů jsou nej důležitější s ohledem na tok energie a přenos živin v terestrických ekosystémech. Mikrobiální biomasa se skládá z klidových i metabolický aktivních organismů.

Nicméně v současné době se rozšíření biomasy odhaduje, buď přímými nebo nepřímými (biochemickými) technikami, které nebyly řádně validovány a kontrolovány pro oddělování těchto složek (Schloter et al., 2003).

Mikrobiální biomasa v půdě je živou součástí půdní organické hmoty. Ačkoli tvoří méně než 5% této hmoty, zastává minimálně 3 funkce extrémně důležité pro rostlinnou produkci v ekosystému:

1. labilní zdroj uhlíku (C), dusíku (N), fosforu (P) a síry (S) 2. tvoří okamžitou zásobu těchto látek

3. účastní se transformace živin a degradace pesticidů.

Kromě toho některé formy mikroorganismů žijí v symbiotickém vztahu s kořeny rostlin, působí jako biologické prostředky proti rostlinným patogenům, přispívají k tvorbě půdních agregátů a podílejí se na samotném utváření půdy (Dalal, 1998).

Mikroorganismy z různých systematických kategorií v půdě degradují organický materiál. Zkoumání celkových metabolických procesů v půdě podává informace týkající se půdní populace v její celistvosti, ale neinformuje o jednotlivých populacích. Výpočty hodnot mikrobiální biomasy mohou být základem pro srovnání velikostí různých populací, ale rozdíly mezi žijícími - metabolický aktivními, žijícími - neaktivními a odumřelou biomasou zůstávají nejisté. Kromě toho kvůli vlivu velikosti organismů na jejich metabolickou rychlost, nejsou jasné ani vztahy mezi totální biomasou a intenzitou metabolismu. Proto byly vyvinuty metody, které přesně určují příspěvky bakterií a hub k celkové aktivitě půdy (Anderson and Domsch, 1973).

Bohužel měření mikrobiální biomasy nám neřekne nic konkrétního bez rozlišení různorodosti mikrobiálního společenstva. Spolu se vzestupem molekulárně genetických nástrojů v mikrobiální ekologii se potvrdilo, že známe pouze velmi malou část rozmanitosti světa mikroorganismů. Většina tohoto fascinujícího bohatství, jak se zdá, je ukryta v obrovském množství dosud neidentifikovaných bakterií. Nové přímé metody, nezávislé na

7

kultivaci, založené na genotypu (Amann et al., 1995) a fenotypu (Zelles and Bai, 1994) mikrobů, umožňují hlouběji porozumět složení jejich komunit. Například použitím rDNA přístupu, který rozlišuje bakteriální společenstva analýzou 16S rDNA izolované z environmentálních vzorků. Téměř výhradně se zviditelní nové sekvence, které s dobře prostudovanými bakteriemi v kultivovaných sbírkách souvisí pouze do určité míry (Amann et al., 1995). Často se vyskytující, mnohdy dosud nekultivované bakterie se zviditelní mikroskopicky, použitím fluorescenčně značené rRNA-nasměrované oligonukleotidové sondy. Na základě molekulárních studií se usuzuje, že 1 g půdy se skládá zvíce než 10⁹ bakterií patřících do přibližně 10 tisíc různých druhů (Ovreas and Torsvik, 1998). Tato obrovská rozmanitost často komplikuje uchopení struktury mikrobiálního společenstva jako ukazatele půdní kvality.

Existuje několik studií, které mohou ukázat jasný efekt změn v zemědělském hospodaření nebo kontaminace míst na celkovou strukturu mikrobiálního společenstva.

(Ovreas and Torsvik, 1998) porovnávali vliv střídání plodin (střídavé obhospodařování) a humusového hospodářství na mikrobiální rozmanitost a strukturu společenstva. Našli větší diverzitu v půdách, které byly pod vlivem humusového hospodářství. (Smit et al., 2001) se zajímali o sezónní změny v půdním společenstvu bakterií na pšeničném poli. Parametry mikrobiální diverzity jsou často používány pro určování půdní kvality zejména kvůli sledování znečištění. (Muller et al., 2001) se například zajímali o dlouhodobé efekty dlouhodobé expozice rtuti na půdní mikrobiální společenstvo. Podle gradientu znečištění, bylo prokázáno, že bakteriální diverzita byla v kontaminovaných půdách snížena, zatímco změny v biomase hub se nevyskytly.

Nej dostupnější jsou informace o efektech pesticidů na mikroby a jejich degradace bakteriemi a houbami. (El Fantroussi et al., 1999) se podařilo ukázat, že mikrobiální diverzita byla během aplikace močovinových herbicidů snížena. (Ibekwe et al., 2001) odhalil zřejmý dopad fumigantů na půdní mikrobiální společenstva. Podobné výsledky byly získány i pro ostatní pesticidy (triadimefon) skupinou (Yang et al., 2000).

2.2 Koloběh uhlíku

Uhlík je základním prvkem biosféry, nepostradatelnou součástí všech organických látek. Znalost jeho cykluje důležitou součástí studia dopadu klimatických změn na přírodní vegetaci a následné zpětné odezvy. V současné době se vyskytuje velké množství různých modelů tohoto procesu, jak na globální úrovni, tak i na úrovni lokálních ekosystémů. Základní uspořádání těchto modelů je víceméně stejné. Skládají se ze tří složek (atmosféra, živá a mrtvá organická hmota) a tří proudů (produkce organické hmoty, rozklad odpadu a dekompozice mrtvé organické hmoty). Modely cyklu uhlíku se od sebe navzájem liší svojí komplexností a detaily parametrů (oddělování součástí a šíření toků) (Golubyatnikov and Svirezhev, 2008).

Cyklus uhlíku popisuje pohyb všech jeho forem mezi atmosférou, oceány, biosférou a v neposlední řadě i geosférou {schéma 1). Tento mechanismus obsahuje několik rezervoárů a procesů, díky nimž uhlík mezi zmíněnými rezervoáry putuje. Globální cyklus uhlíku, jeden z hlavních biogeochemických cyklů, může být rozdělen na geologickou a

8

biologickou složku. Geologický uhlíkový cyklus operuje v časovém rozmezí milionů let, zatímco cyklus biologický působí na úrovni dnů až tisíců let.

Schéma 1: Zásoby uhlíku na Zemi a roční výměna oxidu uhličitého mezi zásobníky (vyjádřeno jako hmotnost uhlíku obsaženého v oxidu uhličitém v miliardách tun) (dle J.

Koudelkové a P. Prokopa, VSB-TU, Ostrava)

Geologický cyklus postihuje proces od vzniku uhličitanů z uhlíkatých kyselin, přes jejich úpravu zemského povrchu (oceánské dno, sopečná činnost, vznik horských útvarů) až po zvetrávaní a následný rozklad zpět na CO2. Zvetrávaní a sopečná činnost regulovaly koncentrace atmosferického CO2 během stovek milionů let až do doby, kdy člověk svojí činností obsah tohoto plynu v atmosféře dramaticky zvýšil.

Biologický cyklus uhlíku představuje jeho pohyb mezi pevninou, oceánem a atmosférou prostřednictvím procesů fotosyntézy a respirace. Prakticky veškerý mnohobuněčný život na zemi závisí na produkci sacharidů ze slunečního světla a CO2 (fotosyntéza) a metabolickém rozkladu (respirace) těchto cukrů k produkci energie potřebné pro pohyb, růst a reprodukci.

Rostliny odebírají CO2 z atmosféry během fotosyntézy a vrací jej zpět díky respiraci skrze následující chemické reakce:

respirace:

C⁶H i²0⁶ (organická hmota) + 6 0² " ^ 6 C 0² + 6 H²0 + energie fotosyntéza:

energie (sluneční záření) + 6 C 0² + H²0 ~ ^ C⁶H i 2 0⁶ + 6O2

Díky fotosyntéze využívají zelené rostliny sluneční energii k převedení atmosférického CO2 do sacharidů. Rostliny a zvířata využívají tyto sacharidy (a ostatní produkty od nich odvozené) v procesu nazvaném respirace. Ta uvolňuje energii obsaženou v cukrech pro využití v metabolismu, takže dochází ke změně sacharidového „paliva" zpět na C O 2, který se následně vrací do atmosféry. Množství uhlíku kolující ročně biologickým cyklem je asi tisíckrát větší než množství, které projde zajeden rok cyklem geologickým.

9

Hlavní výměna uhlíku s atmosférou na zemi vyplývá právě z fotosyntézy a respirace.

Během denní doby v růstové sezóně, listy absorbují sluneční světlo a zachytávají z atmosféry CO2. Ve stejném časovém úseku rostliny, zvířata a půdní mikroorganismy konzumují uhlík i v organické hmotě a vrací do atmosféry C 0². V noci se fotosyntéza zastaví, protože slunce nedodává pro reakce hnací energii, nicméně respirace pokračuje. Tento druh nerovnováhy mezi zmíněnými procesy se odráží v sezónních změnách v atmosférických koncentracích CO2. Během zimy na severní polokouli se fotosyntéza zastavuje (mnoho rostlin ztratí listy), ale respirace funguje dál. Tyto podmínky vedou na severní polokouli k vzestupu koncentrace atmosférického CO2 během zimy. S počátkem jara se však fotosyntéza spustí znovu a C 0² v atmosféře se sníží.

Cyklus C zahrnuje oxidaci energeticky bohatých organických molekul na C 0² a redukci CO2 zpět na organický uhlík. Podobně jako hoření paliv uvnitř spalovacích motorů opatří sílu pro pohyb, oxidace organického uhlíku buňkami zabezpečuje udržení života. Běžné oxidační procesy (např. glykolýza) přímo syntetizují ATP prostřednictvím fosforylace substrátu nebo vyrábí redukční ekvivalenty, které jsou se syntézou ATP spojeny nepřímo oxidatívni fosforylací. Na druhou stranu, redukce CO2 je používána některými organismy k fixování uhlíku do biomolekul.

Mezi různými rezervoáry cykluje uhlík v obrovském množství. Například rostliny a mikroorganismy fixují ročně okolo 10^{1 7} g CO2 a respirací následně vypouští přibližně stejné množství. Hlavními zásobárnami uhlíku jsou organická hmota v buňkách živých organismů, její degradační produkty, anorganický uhlík v horninové podobě (CaCCh) a plyny

v atmosféře. C 0², CO a N H⁴ produkují i spotřebovávají mikroorganismy.

Mikrobiální parametry uhlíku představují citlivý indikátor změn kvality půdy a jsou sledovány při hodnocení vlivu polutantů na tento systém. V laboratoři půdní ekotoxikologie centra Recetox se běžně stanovují následující parametry:

• bazálni respirace (BR) - udává představu o aktuálním (bez přídavku substrátu) stavu půdy. Konkrétně ukazuje na fyziologický stav mikrobiálních společenstev v půdě prostřednictvím jejich respirační aktivity.

• substrátem indukovaná respirace (SIR) - ukazuje respirační aktivitu mikroorganismů po přídavku snadno využitelného substrátu (glukóza), udává maximální možnou, substrátem nelimitovanou respirační aktivitu

• mikrobiální biomasa (Cbi⁰) - fumigačně-extrakční metodou se stanovuje obsah extrahovatelného uhlíku imobilizovaného v mikrobiálních buňkách, tato hodnota se uvádí jako kvantita biomasy

Všechny zmíněné parametry jsou zakotveny v ISO normách. Pro bazálni respiraci je to ISO /DIS 16072 (2002), pro substrátem indukovanou respiraci ISO 14240-1 (1997), a v případě stanovení mikrobiální biomasy se jedná o normu ISO14240-2 (1997).

2.3 Koloběh dusíku

Dusík je důležitou mikrobiální, rostlinnou i živočišnou živinou (esenciální makrobiotický prvek, nezbytná součást aminokyselin, bílkovin, ribonukleouvých kyselin a dalších látek). V půdě a prostředí prodělává mnoho přeměn.

10

Přeměny dusíku a transformace jeho forem souvisí zejména s metabolismem organismů, zmenší části jde o fyzikální a chemické procesy. Jeho cyklus v terestrickém ekosystému je tvořen většinou několika základními procesy {schéma 2). Plynný N2 je prostřednictvím fixace molekulární formy redukován na amoniak (NH³, resp. N H^{4 +}) . Fixace probíhá i v atmosféře účinkem elektrických výbojů a působením slunečního záření. Naprostá většina však připadá na mikrobiální proces, katalyzovaný enzymem nitrogenázou. Amoniakální dusík je v různých sloučeninách zabudován do biomasy. Po jejím odumření je amoniak z organických vazeb uvolněn. Může být znovu využit jako živina, vázán v půdě, volatilizován do atmosféry nebo nitrifikací převeden na nitrátovou formu (NO2"). Nitrátový dusík může být také využit jako živina nebo denitrifikací převeden na plynný oxid dusný (N²0) a molekulární dusík (N²).

V těchto formách se vrací do atmosféry a cyklus se uzavírá. I když jednotlivé procesy přeměn dusíku mají často velmi odlišné nároky na faktory prostředí, mohou v půdě probíhat současně, a to vzhledem k existenci gradientů, které jsou navíc v mnoha vzájemných vazbách a vytvářejí v půdě nepřeberné množství mikroprostředí, mnohdy s velice specifickými podmínkami (Simek, 1998).

Jedním z nej významnějších procesů tvorby a přeměn je denitrifikace. Podrobný přehled v této oblasti je obsažen v práci Simek (2000). Simek zmiňuje, že právě tento proces je často při studiu cyklu dusíku opomíjen. Důvodem jsou problémy v souvislosti s metodologií. Je velmi obtížné kvantifikovat procesy, do nichž vstupují nebo z nichž vystupují plynné formy.

Podobně jako v případě uhlíku, i mikrobiologické parametry dusíku jsou citlivým indikátorem v kvalitě půdy a z jejich hodnot lze vyčíst fyziologický stav populací mikroorganismů. V souvislosti s tím se měří:

• schopnost fixace dusíku

• mineralizace dusíkatých látek:

• N - mineralizační potenciál - vypovídá o celkovém množství vyprodukovaných forem dusíku ( N H^{4 +}, NO2", NO3") na konci inkubace ISO

14238 (1997).

• amonifikace - velké množství mikroorganismů

o anaerobní amonifikace (AMO) - sledování schopnosti mikroorganismů přeměňovat organicky vázaný dusík na amonné ionty bez přídavku substrátu

o potenciální amonifikace argininu (PAMO) - sledování schopnosti mikroorganismů měnit organicky vázaný dusík na amonné ionty v krátkém čase za přídavku substrátu (arginin)

• nitrifikace - menší množství mikroorganismů

o potenciální nitrifikace - stanovení aktivity enzymů první fáze nitrifikace ISO/DIS 15685.

• denitrifikace

11

Schéma 2: Cyklus dusíku v půdě a prostředí (upraveno dle Klemedtsson et al, Atlas, Bartla, 1993. Cleemput, 1994)

0

2.4 Využitelnost mikrobiálních parametrů v ekologii, monitoringu a ekotoxikologii

Jak již bylo zmíněno mikroorganismy jsou velmi významnou součástí ekosystémů.

Svou úlohou v cyklech uhlíku, dusíku, ostatních živin i v proudu energie značně napomáhají jejich správnému fungování. Jsou ale také složkou, která velmi citlivě reaguje na jakýkoli

stresový faktor vyskytující se v dosahu, tato vlastnost se projevuje např. změnou velikosti společenstva nebo snížením strukturní i fyziologické diverzity. Proto analýzy velikosti, struktury či aktivity mikrobiálních společenstev obecně informují o stavu dekompozitorů.

12

Tato trofická úroveň hraje zásadní roli v dostupnosti živin pro úrovně ostatní. Její výrazné ovlivnění může vést k důležitým změnám této dostupnosti a tím k posunu celkové produkce ekosystému (Wardle, 1992).

Heterogenita strukturních a funkčních forem uvnitř mikrobiálních společenstev umožňuje také analýzu vybraných druhů, populací nebo fyziologických skupin na různé úrovni specifity ekologických funkcí (např. nitrifikace, enzymatické aktivity, kinetika mineralizace vybraných substrátů) (Baath, 1989). Informace o stavu, aktivitě nebo rovnováze těchto aktivit vedou k posouzení mechanismů vlivu studovaného stresoru a důsledků vyvolaných změn pro cykly jednotlivých živin, případně pro jednotlivé (ekologicky významné) metabolické procesy. Změny stavu a aktivity mikrobiálních společenstev, zejména citlivých specializovaných skupin mikroorganismů, byly ověřeny jako citlivé indikátory stresového vlivu kontaminace půdy (Killham, 1985). Při správné kombinaci hodnocených parametrů a odpovídajícím experimentálním designu je možné hodnotit vliv stresových faktorů v prostředí z retrospektivního i z predikčního hlediska.

Mikrobiální ekotoxikologie reálného prostředí umožňuje provádět modelové experimenty a získávat informace o míře resistence mikrobiálních společenstev vůči existující nebo potenciálně možné kontaminaci. Tyto analýzy lze zaměřit na již dříve kontaminované prostředí nebo na prostředí nekontaminované, kde je předmětem zájmu potenciálně možná reakce mikroflóry na testovaný typ kontaminace (Doelman, 1986).

V současné době mikrobiální ekotoxikologie a ekologie představují rozvíjející se vědní obory s uceleným systémem verifikovaných základních metod (Powlson, 1994). Při určitém zjednodušení lze vymezit dva základní myšlenkové i metodické přístupy:

1. výzkum zaměřený na mikrobiální procesy v reálných ekosystémech či v celistvých vzorcích prostředí nebo

2. studie pracující s mikroorganismy izolovanými z prostředí a následně zkoumanými z hlediska genetické, taxonomické nebo fyziologické diversity (Garland a Mills, 1994).

Oba přístupy implikují širokou škálu pokusných plánů, avšak interpretační úroveň dosažených výsledků je značně rozdílná. Systémové sjednocení těchto postupů je hlavní prioritou současného vývoje.

2.5 Variabilita mikrobiálních parametrů půd

Z časového hlediska lze půdní vlastnosti dělit na relativně stabilní a dynamické. Za relativně stabilní lze označit půdní profil, zrnitostní složení, složení jílových minerálů, atd. Ke změnám těchto vlastností dochází v průběhu staletí, pokud nejsou jejich radikální změny způsobeny přírodní katastrofou nebo vlivem zásahů člověka (Bedrna, 1989).

Vlastnosti měnící se v průběhu dne, sezóny, popřípadě roku jsou označovány jako dynamické. K nim patří zejména obsah vody, teplota, obsah solí v půdním roztoku a v neposlední řadě i množství, aktivity a druhy mikroorganismů. Změny mohou být způsobeny jednak vlivy vnějšího prostředí (atmosféra, geosféra, hydrosféra a biosféra), j ednak vnitropůdními činiteli (mikroorganismy, solemi v půdním roztoku, poutači schopností

půdních částic atd.). Dynamické změny půdních vlastností mají zpravidla cyklický charakter.

13

Význam sledování a hodnocení dynamických vlastností půd je nesporný jak z hlediska praktické využitelnosti (hnojení, agrotechnika, výnosy), tak z důvodů dalšího teoretického poznaní v oblasti pedologie, vlivu člověka na pedosféru, zejména však pro hodnocení ekologické stability půdního prostředí, jako hlavního transformátoru energie v krajině.

2.5.1 Časová variabilita

Půdní mikrobiální biomasa je základní součástí subsystému rozkladačů, který reguluje cykly živin, tok energie a celkovou produktivitu ekosystému. Nejedná se o statické těleso, za které je občas považována, a její dynamika je pravděpodobně extrémně důležitá pro hodnocení stupně uvolňování labilních živin a jejich dostupnosti ostatním komponentám ekosystému. Časovou variabilitou daných skupin organismů bývá nejčastěji označováno měření jejich nedostatku stability (Bengtsson, 1994; Pimm, 1991; Tilman, 1996). Pokud jsou mikroorganismy rezistentnější k výkyvům vede to k menší fluktuaci v odpovědi na

změny environmentálni ch podmínek a faktory, které zvyšují stabilitu půdní mikrobiální biomasy, tak napomáhají zvýšení záchytu živin v půdě (Wardle and Nicholson, 1996).

Existuje několik základních poznatků o zákonitostech časové variability a míře jejich ovlivnitelnosti určitými faktory (Bauhus and Barthel, 1995; Diazravina et al., 1995). Několik studií se zabývalo měřením mikrobiální biomasy vzorků půd v různých časových intervalech (Kinsbursky and Steinberger, 1989), (Luizao et al., 1992), (Maxwell and Coleman, 1995) a mnoho z nich se pokusilo interpretovat trendy pozorované ve vztahu k externím environmentálním faktorům (Garcia and Rice, 1994), (Joergensen et al., 1994), (Vangestel et al., 1992). Ale zatím se nikdo nepokusil zjistit, jestli hlavní modely fungují napříč různými studiemi ve vztahu k těmto trendům.

Velmi podstatnou studií v oblasti této problematiky je Wardle (1998b). Tento autor shrnul údaje z několika publikovaných studií, v nichž byla prezentována časová data pro půdní mikrobiální biomasu (C a N), aby určil jestli by časová variabilita (a tím i nestálost) mohla být statisticky spojena s externími faktory, včetně typu využití krajiny a vlastností makroklimatu a půdy. Při předchozím zpracování dat podobného typu mohl Wardle (1992) odhadovat pouze kvantitativní aspekty těchto jevů. Definitivním cílem novějšího výzkumu bylo stanovení, které faktory mají shodnou roli při podporování nestability mikrobiální biomasy a interpretace výsledku vzhledem k době možného vlivu na mikrobiální cyklus a tím i funkci ekosystému.

2.5.1.1 Studie Wardle (1998)

Wardle (1998) vybral 58 studií, pro které byly hodnoty Cbi⁰ nebo Nbi⁰ určeny opakovaně na stejné lokalitě. Přednostně vybral studie se čtyřmi nebo více opakovanými měřeními v čase, které obsahovaly více nebo všechny sezóny během roku (příloha 1). Použitý index časové variability byl koeficient variance (CV - směrodatná odchylka/průměr mikrobiální biomasy C nebo N během trvání studie). Každý čas vzorkování reprezentoval hodnotu nezávislých dat. Tento přístup je jedním z nej populárnějších ukazatelů časové variability (Pimm, 1991) a bylo již úspěšně použito pro vyčíslení časové variability rostlinné biomasy

14

(Tilman, 1996). Přístup je nezávislý na velikosti vzorku, takže nedojde ke zkreslení různými studiemi obsahujícími odlišné počty vzorkovacích případů.

Důležité v této sumarizační studii bylo, že rozdílné studie používaly různé metodologie případně různé varianty metodologií. Hodnoty Cbi⁰ použité v analýzách byly v 52% případů získány použitím fumigačně-inkubační metody (FI), ve 33% použitím fumigačně-extrakční metody (FE), ve 12% použitím metody substrátem indukované respirace (SIR) a ve 2%

použitím přímé mikroskopie. Pro Nbi⁰ byla ve 40% použita FI a v 60% F E metoda. Na metody nebyl brán zřetel, pokud rozdíly v C V pro jednotlivé z nich (FE, FI, SIR, mikroskopie) bly nevýzamné (ANO V A).

Pro hodnocení vlivů různých faktorů na variabilitu mikrobiálních parametrů byly z každé studie získány též údaje o pH půdy, organickém C, celkovém N a obsahu jílu. Pro každou studii byly také určeny zeměpisná šířka, průměrné celkové roční srážky a průměrné roční teploty (Wardle, 1992). K určení, které z těchto faktorů (nebo kombinací faktorů) byly důležité pro regulaci C V (a tím i časové variability) mikrobiální biomasy C a N , byly použity korelační analýza, částečná korelační analýza a postupná multiple regression.

Z předchozího průzkumu literatury Wardle (1998b) vyvodil, že trendy jsou často protichůdné. Různé studie podávají zprávu o maximálních hodnotách Q,i⁰ a Nbi⁰ v různých sezónách a informují jak o pozitivních tak i negativních efektech ve vztahu s půdní vlhkostí a rostlinnou produktivitou. Asi polovina studií z mírných ekosystémů, které bral Wardle v úvahu, ukazovala maximální mikrobiální biomasu na jaře nebo v létě, a několik z nich ukazovalo významný pokles v zimě. Tato skutečnost potvrzuje, že rozdíly v teplotě mezi létem a zimou mohou být velmi důležité pro časovou variabilitu mikrobiální biomasy.

Další viditelné ovlivnění časové variability bylo dynamikou vlhkosti. Mikrobiální biomasa často ukazuje pozitivní vztahy s půdní vlhkostí (Santrůčková, 1992), (Kandeler and Bohm, 1996) a jindy naopak negativní, což je pravděpodobně výsledkem zvýšené kompetice o živiny s rostlinami (Raghubanshi, 1991). Růst kořenů rostlin měl vliv na navození jak stimulačních (Bristow and Jarvis, 1991), tak i inhibičních efektů (Garcia and Rice, 1994). To odráží dvojí efekt rostlin na půdní mikroorganismy, na jedné straně jejich stimulaci díky přídavku uhlíku a na straně druhé jejich potlačení díky kompetici o zdroje (Vanveen et al., 1989). V obdělávaných systémech se také ukazuje jako důležitý faktor pro kolísání mikrobiální biomasy střídání plodin a další aspekty spojené se zemědělskou praxí (Franzleubbers et al., 1994).

Přes všechny objasněné vazby a faktory pravděpodobně způsobující fluktuace a variabilitu mikrobiální biomasy, v téměř čtvrtině studií nebylo možno prokázat důvody pozorované časové změny v mikrobiální biomase (Wardle, 1998).

Populace nebo biomasy organismů vystavené významnému množství zásahů, mohou být méně rezistentní k externím odchylkám než ty v méně narušených podmínkách, a proto by mohly být považovány za méně stabilní (Wardle, 1998b),(Pimm, 1991). Takže by se dalo očekávat, že mikrobiální biomasa vykáže menší časovou variabilitu v systému, v němž je podstatně méně „nesouladu". Po kvantitativní analýze dat z mnoha studií {příloha 1) Wardle (1998) došel k názoru, že to v tomto případě neplatí. I když trvalejší a méně narušené typy ekosystému (lesní a trvalý travní porost) měly vyšší hodnoty mikrobiální biomasy než nejvíce

15

narušený typ (orná půda), časová variabilita všech tří typů je pozoruhodně vyrovnaná (Wardle, 1998a). To znamená, že časová variabilita mikrobiálni biomasy je nezávislá na velkých rozdílech ve vegetaci a typu využití půdy a také naznačuje slabou vazbu mezi nadzemní a podzemní stabilitou.

U C V pro oranou a neoranou půdu v několika studiích nebyly zjištěny výrazné efekty zásahů na časovou variabilitu. Navzdory očividným destabilizačním efektům orby (Hendrix et al., 1986) se zdá, že stabilita mikrobiální biomasy je do značné míry nedotčená. Podobný jev se vyskytoval ve studiích zaměřených na efekty po vykácení tropických lesů (Srivastava and Singh, 1989), (Luizao et al., 1992), (Basu and Behera, 1993): žádné zvětšení časové variability po vykácení. Jakékoli nepříznivé efekty narušení půdy mají vliv na její biologické vlastnosti, to ale podle poznatků citované studie Wardle (1998) zřejmě neplatí u destabilizace mikrobiální biomasy. Větší ztráta živin z narušeného ekosystému pravděpodobně neodpovídá zvýšené fluktuaci mikrobiální biomasy vycházející z větší časové variability.

Není jasné, proč je stabilita mikrobiální biomasy tak málo citlivá k široké škále narušení. Jedna možnost souvisí s tím, že půdní mikroflóra je regulována procesy na úrovni mikroskopického světa a že rozdíly v mechanismech narušení mezi ekosystémovými typy mohou být menší v mikroskopické sféře než ve sféře krajinné. Další možností je, že časovou variabilitu mohou významněji ovlivňovat jiné, dosud neznámé faktory (Wardle,

1998).

Korelační studie provedené na různých studiích z přílohy 1 odhalily, že s hodnotami C V pro Cbio jsou někdy významně spojeny určité půdní chemické faktory a zeměpisná šířka.

Zejména se jednalo o významné spojení:

• hodnot CV s pH a zeměpisnou šířkou v orných ekosystémech

• hodnot C V s hodnotami organického C, pH a zeměpisné šířky v trvalých travních porostech

• hodnot CV s koncentrací celkového půdního N v lesích.

Je zřejmé, že regulace časové variability je odlišná mezi třemi typy ekosystémů a především C V v lesním ekosystému byl spojen s rozdílnými faktory než u zbylých dvou typů.

Důležitost půdního N jako regulátoru v lesích může být spojena s existencí N jako rozhodujícího činitele mikrobiální biomasy v lesích významněji než v ostatních ekosystémech (Wardle, 1992).

Právem bychom mohli očekávat, že zeměpisná šířka slouží jako kontrola variability Cbio- S rostoucí zeměpisnou šířkou, rostou i rozdíly mezi letními a zimními teplotami a ve studenějších oblastech zimní zmrazení výrazně redukuje mikrobiální biomasu (Cochran et al., 1989). Naopak během jarního tání dochází k rapidnímu mikrobiálnímu růstu (Deluca and Keeney, 1994). Role celkového organického C při redukci časové variability není příliš jasná:

• Organický C je důležitý pro kontrolu velikosti mikrobiální biomasy. V současné době jsou Cbio a její C V spojovány s organickým C, ale ne s ostatními formami.

To znamená, že organický C zvyšuje Cbi⁰ a redukuje jeho časovou variabilitu, ale pravděpodobně ne skrze stejné mechanismy.

• Zvýšení organického C zvyšuje stabilitu mikrobiální biomasy, potvrzuje teoretickou předpověď, že mikrobiální potrava založená na odumřelé organické hmotě je stabilnější než jiná. Současný výzkum ukazuje, že rostoucí

16

množství zdrojů organického C, které pochází z odumřelé organické hmoty, má stabilizační efekty na půdní mikrobiální biomasu. Stabilizační efekty odumřelé hmoty byly již dokázány ve vodním prostředí. Dále se také jako významný faktor při stabilizačních efektech na časovou variabilitu ukazuje pH, přesný mechanismus však není znám.

Je také možné, že některé faktory regulující velikost a aktivitu mikrobiální biomasy a napomáhající k zachování živin v půdě, nemají žádnou funkci v řízení časové variability.

Půdní C/N poměry, které vypovídají o kvalitě zdrojů v půdě a pomáhají regulovat mikrobiální biomasu a určité půdní procesy, nevykazují žádné vztahy s časovou variabilitou. Kromě toho, ačkoli jílové částice zjevně chrání mikroorganismy proti predáci a tak redukují koloběh mikrobiální biomasy na mikroskopické úrovni (Insam et al., 1991), není zatím nic známo o stabilizačních efektech zvýšeného obsahu jílu. Dále jak velikost mikrobiální biomasy tak poměr Cbio/C neukazují s časovou variabilitou žádný vztah, který by vedl k myšlence, že vysoký obsah mikrobiální biomasy nebo její přírůstek vede ke zvýšení stability systému.

I když Wardle identifikoval 3 faktory, které ovlivňují časovou, významný podíl na celkové globální variabilitě C V pro mikrobiální biomasu zatím stále není popsán. Tento fakt může být částečně způsoben tím, že lokality, z nichž každá studie pochází, mají své vlastní kontrolní faktory. Jedná se například o časovou variabilitu typu srážek (zejména mezi sezónami). Tento poslední faktor nejspíše hraje důležitou roli dynamiky vlhkosti v regulaci mikrobiální biomasy (Bottner, 1985; Sparling et al., 1986).

Třebaže Wardle dokázal identifikovat regulátory časové variability Q,i⁰, všechny pokusy zjistit totéž pro Nbi⁰ byly neúspěšné. Toto téma by bylo možné případně zpracovat jen částečně, protože velká část studií uvažujících časovou variabilitu Nbi⁰ byla provedena pro lesní půdy, zatímco většina těch pro Cbi⁰ se týká trvalých travních porostů a půdy orné. Zdá se, že zjištěné mechanismy ovlivňování časové variability biomasy C nelze spolehlivě aplikovat na lesní půdy na rozdíl od ostatních ekosystémů. Bohužel, existuje jen málo studií zabývajících se zpracováním oddělených analýz pro každý typ ekosystému k postižení časové variability biomasy N .

2.5.2 Prostorová variabilita

V dnešní době je zcela zřejmé, že odběru vzorků půd (stejně jako celé další manipulaci s nimi) je třeba věnovat větší pozornost než vlastní analytické koncovce. Zároveň by ale vzorkování mělo být plně podřízeno účelu, který je očekáván, a to výběrem lokalit, počtem odběrových míst (případně dílčích vzorků) počínaje a hloubkou, dobou odběru a následnou úpravou konče.

Společnou komplikující skutečností všech snah o získání, co nej reprezentativnějšího půdního vzorku (při zanedbání časových podmínek) je prostorová heterogenita půdního prostředí. Třebaže je značná a známá již z dřívějška, v nedávné minulosti se o ní příliš nehovořilo. Znamenalo by to totiž určité zpochybnění výsledků komplexního průzkumu půd a tím i bonitačních prací. Plošná heterogenita různých parametrů byla zjištěna a dokázána řadou autorů (Rodeghiero and Cescatti, 2008; Wei et al., 2008; Liu et al., 2008; Berg and Bengtsson, 2007; Saldana and Ibanez, 2007; Ozgoz et al., 2007; Machado et al., 2007; Cho,

17

2007). Na domácí scéně se tímto tématem zabýval např. Damaška (1986). V posledně jmenované studii autoři zjistili, že k získání průměrného vzorku by bylo zapotřebí řádově

stovek vpichů na hektar, přičemž relativně nejméně proměnlivá se jevila půdní reakce (pH půdy) a největší kolísání zaznamenali u hodnot přístupného fosforu a draslíku. Tento závěr potvrzuje i zjištění studie Kolář et. al (1982), kde se rozdíly výsledků z totožných míst v časové řadě lišily buď analytickou chybou nebo odpovídaly vývoji sledovaného faktoru na pozemku, ale mezi místy odběru byly již zaznamenány rozdíly řádově v desítkách i více procent.

Z dosavadních výsledků vyplývá celkem jasně, že odběr průměrného či reprezentativního vzorku z větších ploch (řádově desítky ha) není příliš vhodný. V praxi to znamená, že například u hnojení dochází díky rozdílnému obsahu živin na různých místech k přehnojování určitých částí a nedostatečnému ošetření jiných.

Půdní mikrobiální biomasa vykazuje velmi variabilní výsledky v oblasti času i prostoru svého výskytu. S tím souvisí poznatky spojené s půdní respirací. Faktorů ovlivňujících prostorovou variabilitu produkce CO2 je několik:

• topografie (Hanson et al., 1993; Rayment and Jarvis, 2000)

• hustota nebo biomasa kořenů (Fang et al., 1998; Janssens et al., 1998; Stoyan et al., 2000; Rodeghiero and Cescatti, 2006)

• kvantit a kvalita půdní organické hmoty (Rayment and Jarvis, 2000; Scott- Denton et al., 2003; Epron et al., 2004)

• mikrobiální biomasa (Xu and Qi, 2001; Scott-Denton et al., 2003)

• charakteristiky vegetace (Law et al., 2001)

• vzdálenost od stromů a množství napadaných listů (Fang et al., 1998; Stoyan et al., 2000; Law et al., 2001).

Prostorová variabilita se často projevuje již v měřítku centimetrů. Odráží velikost půdních částic, rozdíly v rozmístění půdní fauny, množství obsažených kořenů a zbytky rozkládající se organické hmoty. Variabilitu mikrobiální biomasy sledoval Tessier et al.

(1998). Výsledky potvrdily, že koeficient extrahovatelnosti půdy ( K^{E C}) má určitou souvislost s hloubkou. V této práci se autoři zajímali o horizontální a vertikální prostorovou variabilitu biomasy, K^{E C} a jejich vztah s půdními vlastnostmi. Z výsledků jejich studie vyplývá, že jak rozpustný tak i celkový uhlík s hloubkou klesají.

2.6 Faktory ovlivňující půdní mikroorganismy

Variabilitu jakožto kolísání mikrobiálních parametrů v čase a prostoru můžeme rozdělit na několik částí:

• Variabilitu a trendy způsobené různými faktory v prostředí (v půdě). Tyto většinou dokážeme popsat a vysvětlit na základě vztahů a vazeb již prokázaných v různých studiích.

• Variabilitu, která je s danými parametry pevně spojená a nevíme, co ji způsobuje.

• Variabilitu, která vzniká až po odběru vzorku díky rozdílné manipulaci a úpravám se vzorky a která je spojená s analytickou metodou.

18

V případě prvním, je v literatuře půdní mikrobiologie velké množství informací, které popisují faktory, které mohou mít vliv na výsledky mikrobiálních parametrů. Přestože se tato diplomová práce zaměřuje na poslední část variability, obsahují následující kapitoly

informace o faktorech ovlivňujících půdní mikroorganismy.

2.6.1 Obsah uhlíku a dusíku a dalších živin v půdě

Většina půdních systémů je limitována živinami. Mikrobiální biomasa tedy obvykle zásadně souvisí s podílem organické hmoty v půdě. Přídavek zdrojů snadno hydrolyzovatelného uhlíku se u mnoha půd projevuje rapidním mikrobiálním růstem a aktivitou (Anderson and Domsch, 1985). Jiné, složitější formy uhlíku, jaké se vyskytují například ve stéblech, jsou obvykle využívány výrazně pomaleji, z toho vyplývá zpožděná odpověď mikrobiální biomasy (Wardle, 1992). Závislost mikrobiální biomasy na půdním uhlíku se odráží i v jejím poklesu, který je patrný během skladování půdy, pravděpodobně jako následek vyčerpání substrátu. Ačkoli mikrobiální biomasa projevuje také silný vztah

s hladinou dusíku v půdě, její odezvy na přidání dusíku se zdají být velmi variabilní (Wardle, 1992).

Wardle (1992) přehodnotil 25 souborů dat z 22 předtím publikovaných studií, aby mohl odhadnout relativní důležitost substrátového (obvykle půdního) uhlíku a dusíku pro limitování velikosti mikrobiální biomasy v různých ekosystémech. Také se pokusil stanovit síly vztahů, které jsou mezi uhlíkem a dusíkem mikrobiální biomasy a uhlíkem a dusíkem obsaženými v substrátu. Vybrané studie obsahovaly nejméně šest nezávislých měření mikrobiální biomasy a hodnot půdního uhlíku a dusíku. Ve většině těchto dat byly uhlík a dusík z mikrobiální biomasy ve velmi pozitivním vztahu se substrátovými. Data biomasy organických vzorků (rašelinný a lesní humusový materiál) publikovaná Sparling and West (1988) měla vzájemný vztah pouze s hladinami substrátového uhlíku a tři studie ukázaly přímé pozitivní vztahy mezi mikrobiální biomasou uhlíku a substrátovým dusíkem, ale ne substrátovým uhlíkem, byly to Martens (1987) (organické půdy), Vandewerf and Verstraete (1987) (orné půdy) a Beare et al.

(1990) (rostlinný humus). To, že část substrátového organického uhlíku je vlastně imobilizována v mikrobiální biomase, lze vyjádřit poměrem CWCorg- V naprosté většině případů tento koeficient pozitivně souvisí se substrátovým dusíkem, což ukazuje, že v mnoha půdních systémech dusík spíše než uhlík ovlivňuje imobilizaci organického uhlíku do půdní mikrobiální biomasy. Avšak významný podíl půdního organického uhlíku je v mnoha půdách pro biomasu relativně nedosažitelný. Biomasa je pak více ovlivňována formami dostupného organického uhlíku než absolutním celkovým množstvím. Pro mnoho souborů dat byl poměr CWCorg negativně spojen s organickým uhlíkem, což dokazovalo, že omezení mikrobiálního uhlíku snižuje míru dostupnosti uhlíku. Vztahy mezi mikrobiální biomasou a půdním organickým uhlíkem byly předtím demonstrovány jako nej silnější v půdách s méně než 2,5% organického uhlíku (Anderson, 1989}.

Dusík z biomasy a poměr dusíku a celkového substrátového dusíku se jeví jako typicky ovlivněný substrátovým uhlíkem a dusíkem přibližně stejně, avšak toto tvrzení je založeno na menším množství studií (Wardle, 1992). Poměr C/N v mikrobiálních buňkách je podle studií spojen se substrátovým C/N jak pozitivně tak negativně. Toto naznačuje, že přinejmenším v některých půdních systémech snížení množství organické hmoty může podporovat buď výhodnější příjem uhlíku nebo výhodnější příjem dusíku (Wardle, 1992). Přehodnocení

19

dat prezentovaných v práci Beare et al. (1990) ukazuje, že mikrobiální biomasa v humusu je silně pozitivně spojena s obsahem dusíku v humusu a negativně spojena a obsahem uhlíku.

Beare et al. (1991) následně demonstrovali, že složení humusu bylo závislé na počátečním stavu mikrobiální biomasy. Je možné předpokládat, že poměr humusového složení je pravděpodobně spojen s obsahem biomasy rostlinného humusu (Flanagan and Vancleve, 1983), které je střídavě ovlivňováno obsahem dostupného dusíku. Proto tedy měření mikrobiální biomasy v humusu může přímo předpovídat poměr složení humusu více než jeho chemické složení.

Vztahy mezi Q,i⁰ a Nbi⁰ objasňují studie, které zkoumaly efekty přídavků rostlinných reziduí na mikrobiální biomasu (Holland and Coleman, 1987; Ocio et al., 1991a). Tyto přídavky obvykle způsobí velký nárůst mikrobiální biomasy, který může trvat značnou dobu.

Relativní nárůst mikrobiální biomasy může v takové situaci být podstatně větší než relativní nárůst půdního organického uhlíku a dusíku způsobený přídavkem. Závislosti Nbi⁰ na rozkladu slámy se rozumí jen málo, avšak pravděpodobně existují dvě skupiny mikroorganismů:

• jedni limitovaní uhlíkem (zužitkují snadno dostupný uhlík a pak zemřou)

• limitovaní dusíkem (využijí méně dostupný uhlík ve slámě a dusík v odumřelé mikrobiální biomase).

Pozitivní efekt dusíku pro růst mikrobiální biomasy při rozkladu rostlinných reziduí byl dokumentován ve studii Holland and Coleman (1987). Naopak nepatrné nebo jen dočasné efekty byly popsány v jiných studiích (Sparling and Williams, 1986; Ocio et al., 1991b; Ocio et al., 1991a). Ocio & Brooks (1991) dokázali, že nárůst Nbi⁰ během rozkladu slámy byl podstatně větší než by odpovídalo imobilizaci půdního minerálního dusíku. Tím naznačili, že mikrobiální dusík musel pocházet z rozkládané slámy.

Na doplněk minerálního dusíku reaguje mikrobiální biomasa různě. Velké množství studií informuje o velmi malých efektech (např. (Carter, 1986a; McGill et al., 1986; Sparling and Williams, 1986; Vandewerf and Verstraete, 1987; Paustian et al., 1990) a pouze část studií dokazuje výraznou stimulaci (např. (Schnurer et al., 1985; Jenkinson, 1990; Tesařová, 1990). Několik studií se ale také zmiňuje o úbytku mikrobiální biomasy po přídavku minerálního dusíku (Soderstrom et al., 1983; Nohrstedt et al., 1989) doprovázeném snížením mikrobiální aktivity (Foster et al., 1980; Ohtonen and Markkola, 1991). Ve studii Verhaegen et al. (1988) je doloženo, že negativní účinky se mohou zmírnit současným přidáním amonných iontů a inhibitorů nitrifikace.

Díky zjištění, že mikrobiální biomasa pravděpodobně není výrazně spojena s půdním minerálním dusíkem, Wardle (1992) předpokládá, že prostorové a časové kolísání obsahu minerálního dusíku nepatří k hlavním faktorům regulace velikosti mikrobiální biomasy.

Přídavek uhlíku a dusíku současně buď organickým přihnojováním nebo prostřednictvím zbytků rostlin podstatným způsobem vede ke stimulaci mikrobiální biomasy a tedy k nadměrnému přírůstku způsobenému právě přidáním minerálních hnojiv (Marumoto, 1984;

Bolton et al., 1985; Schnurer et al., 1985; Insam et al., 1989; Jenkinson, 1990; Perucci, 1990).

Jsou tu nepochybně dva platné důvody:

1) Hnojiva a zbytky rostlin dodávají obojí uhlík i dusík, uspokojují tak součásti biomasy limitované jak uhlíkem tak dusíkem (Cochran et al., 1988)

2 0

2) Pomalé uvolňování živin udržuje mikrobiální biomasu po delší časové období a snižuje unikání dusíku pryč z půdního systému.

Důležitost organické hmoty pro zvýšení množství půdních mikroorganismů potvrzuje i hloubkové rozšíření mikrobiální biomasy. Několik studií porovnávalo mikrobiální biomasu mezi tradičně oranými a neoranými pozemky v zemědělských systémech, většina z nich zjistila, že mikrobiální biomasa na pozemcích s minimální orbou (a přímo zasetých plodinami) je vyšší na povrchu, kde zůstávají zbytky rostlin, zatímco u oraných pozemků je s větší rovnoměrností rozptýlena do spodní části půdního profilu (Lynch and Panting, 1980;

Carter and Rennie, 1984; Carter, 1991; Doran, 1987; Saffigna et al., 1989; Haines and Uren, 1990; Dalal et al., 1991). Také podíl organického uhlíku imobilizovaného v mikrobiální biomase je v neoraných systémech větší (Saffigna et al., 1989; Carter, 1991) To znamená, že mikrobiální bimasa může být vhodným časným indikátorem změn v kvalitě organické hmoty, způsobených orbou (Powlson and Jenkinson, 1981).

V současné době jsou relativně dobře popsány vztahy mezi mikrobiální biomasou organickou hmotou, uhlíkem i dusíkem. Problém ale nastává v souvislosti s ostatními živinami. Existuje mnoho studií hledajících odpovědi mikrobiální biomasy na umělá hnojiva s přídavkem zároveň fosforu i dusíku, bohužel ale jejich jednotlivé účinky nemohou být rozpoznány. Hladina fosforu se jeví jako limitní pro mikrobiální biomasu v některých ekosystémech, ale ne vjiných (Scheu, 1990). Na fosforová hnojiva byly zaznamenány jak stimulační (Biederbeck et al., 1984), tak neutrální odpovědi (Tate et al., 1991). Některé studie udávají, že sezónní variace extrahovatelného půdního fosforu a uhlíku z biomasy korelují buď významně pozitivně (Sparling et al., 1985) nebo nekorelují vůbec (Brookes et al., 1984;

Sarathchandra et al., 1984; Azam et al., 1986). O vliv ostatních živin na mikrobiální biomasu se zajímalo jen velmi málo studií. Data od Lawrence and Germida (1988) ukazují významně pozitivní vztahy mezi uhlíkem mikrobiální biomasy a sírou i draslíkem. Při hnojení sírou bylo ukázáno skupinou Gupta et al. (1988), že dochází ke snížení množství mikrobiální biomasy pravděpodobně v důsledku úpravy pH.

2.6.2 Vliv rostlin

Rostlinný pokryv má obvykle podstatný stimulační efekt na půdní mikrobiální biomasu. To je způsobeno plynulým zásobováním půdy kolem kořenových systémů snadno dostupnými formami uhlíku a dusíku spíše než impulsy, jaké jsou způsobeny přídavkem reziduí (Wardle, 1992). Důkaz o mikrobiálním příjmu živin podpořeným kořenovým systémem byl opakovaně podán studiemi se značeným izotopem ^{1 4}C (Bottner et al., 1984;

Schnurer and Rosswall, 1987). Množství mikrobiální biomasy se obvykle zvyšuje pouze okolo rychle rostoucích částí kořenů a naopak k výraznému snížení v mikrobiálních populacích dochází s rostoucím stářím kořenů a ve větších vzdálenostech od nich. Postupný vzestup mikrobiální biomasy v kořenové zóně rostlin byl pozorován v řadě studií (Lynch and Panting, 1980; Tesařová, 1990; Martens, 1990). Tento fakt signalizuje, že podstatná část substrátů uvolněných z rhizosféry je mikroflórou snadno využitelná (Bottner et al., 1984). Ve většině studií se objevuje, že mikrobiální biomasa vykazuje silné pozitivní korelace s rostlinnou (a zejména s kořenovou) biomasou (Roder et al., 1988; Srivastava and Singh, 1991) a systémy orné půdy ležící ladem obvykle mají mnohem nižší mikrobiální biomasu

21

nebo hladiny Cbi⁰/C⁰rg než odpovídající oseté systémy (Biederbeck et al., 1984; Bottner et al., 1984; Carter, 1986b; Carter et al., 1999).

Výše zmíněné závěry nejsou univerzální a bylo pozorováno, že někdy mohou kořeny snižovat množství uhlíku a dusíku v mikrobiální biomase, pravděpodobně skrze vzájemnou konkurenci (Okano et al., 1991). Raghubanshi (1991) objevil významné negativní vztahy mezi čistou biomasou kořenů a mikrobiální biomasou v suchých tropických lesích a Vanveen et al. (1989) uvádí, že rostoucí rostliny mohou stimulovat nebo inhibovat mikrobiální biomasu v závislosti na situaci, která panuje v rhizosféře. Jde o opačné situace - stimulace rhizosféry a imobilizace živin. Přídavky živin mohou zvýšit sledované efekty stimulace rhizosféry (Breland and Bakken, 1991).

Na čerstvě odkrytém povrchu je vývoj rostlinného pokryvu obvykle doprovázen současným vzrůstem organické hmoty a tudíž i mikrobiální biomasou. Studie o sukcesi rostlin obvykle demonstrují predpovední modely výstavby spojené s mikrobiální biomasou (Insam and Haselwandter, 1989; Scheu, 1990). Ta během fáze rychlé výstavby v rostlinné sukcesi je téměř jistě spojena s limitací uhlíku i dusíku (Scheu, 1990). Scheu (1990) ve své studii poukazuje na důležitost limitace fosforem v pozdější fázi sukcese. Půdní mikrobiální biomasa je donucena k rychlému poklesu následkem odstranění ornice stejným způsobem jako během těžby (Ross et al., 1984; Visser et al., 1983). Výstavba mikrobiální biomasy ve zbytcích zeminy se normálně shoduje s výstavbou rostlin a půdní organické hmoty. Z toho důvodu je mikrobiální biomasa často navrhována jako index půdní přestavby (Ross et al., 1982, 1990).

Rozdílný růst rostlinného pokryvu na podobných typech půd často podporují výrazně rozdílné hladiny mikrobiální biomasy (Roder et al., 1988). To odráží jak množství, tak i kvalitu organické hmoty vrácené zpět do půdy. Mikrobiální biomasa a poměr Cbi⁰/C^{o r g} se zdají být vyšší během střídání plodin než u monokultur (Anderson and Domsch, 1986; Insam et al., 1989), ve kterých se pravděpodobně odráží větší různorodost lokalit zásobených širším okruhem druhů reziduí. Plochy pod kulturními plodinami shodně obsahují nižší hladiny mikrobiální biomasy než příslušné lučiny a pastviny (Lynch and Panting, 1980; Carter, 1991;

Drury et al., 1991) a méně biomasy než přiléhající plochy s obsahem přírodní vegetace, např.

lesy (Ayanaba et al., 1976; Srivastava and Singh, 1989; Srivastava and Singh, 1991). Zatímco v případě srovnání lučiny - obhospodařovávané půdy byly jako hlavní závěr často uváděny strukturní rozdíly, porovnání mezi přírodními lesy a řízenými zemědělskými systémy odvozenými od vykácených lesů zahrnuje jako hlavní řídící faktory množství a kvalitu organické hmoty. Změny v dynamice kořenů po vykácení jsou pravděpodobně důležitým faktorem ve snižování hodnot půdní mikrobiální biomasy (Baath, 1980).

2.6.3 Sezónní výkyvy

Odpověď mikrobiální biomasy na sezónní změny způsobuje fluktuace mikroorganismů, které mohou střídavě ovlivňovat dostupnost živin a nakonec i výživu rostlin (Singh et al., 1989). Sezónnost může ovlivňovat mikrobiální biomasu přímo, vyvoláním mikrobiální odpovědi na půdní vlhkost a teplotu, nebo nepřímo, ovlivňováním produktivity rostlin. Proto je k dispozici sezónní model organické hmoty (Lynch and Panting,

1982; Bristow and Jarvis, 1991). Vliv sezónnosti na mikrobiální biomasu pro 20 dřívějších studií z oblasti ekosystému, zpracovaný Wardle (1992) je shrnut v příloze 1. Obecně se zdá,

22

že odpověď mikrobiální biomasy na sezónní změny (jak ukazuje index maximum biomasy/minimum biomasy) je vyšší v subpolárním prostředí, tj. pobřeží Antarktidy a vnitrozemí Aljašky, pravděpodobně v důsledku značného mikrobiálního růstu během jarního tání. Nejasné modely se objevily pro ekosystémy mírného pásma, mikrobiální biomasa ukazující čtyři samostatné sezónní odezvy. Jde o pozitivní odezvu na vzestup půdní vlhkosti, negativní odezvu na vzestup vlhkosti, pozitivní odezvu na teplotu a pozitivní odezvu na produkci rostlinných kořenů. Je tedy zřejmé, že souhra sezónních faktorů a jejich poměrná důležitost mohou určit odpověď mikrobiální biomasy na sezónní změny. Zatímco žádná studie neodhaluje mikrobiální biomasu dosahující zimního maxima, hodnoty zimní biomasy jsou často velmi málo rozdílné od těch z ostatních období roku. Teplejší oblasti s modely jasných sezónních srážek ukazují odezvy na půdní vlhkost, které jsou buď pozitivní (Izrael,

Kinsbursky and Steinberger, 1989) nebo negativní (Uttar Predesh, Indie: Singh et al., 1989;

Srivastava et al., 1989; Raghubanshi, 1991).

V příloze 1 nejsou dostupná žádná data ke stanovení hodnot pro lesní půdy mírného pásma, i když v různých jehličnatých lesích bylo pozorováno, že houbová biomasa vrcholí na jaře a na podzim (Soderstrom, 1979; Baath and Soderstrom, 1982; Hunt and Fogel, 1983). Předpokládá se, že biomasa hub může být spojena s předchozími spíše než se současnými podmínkami půdní vlhkosti (Baath and Soderstrom, 1982; Schnurer et al., 1986).

Simulačními modely (Jenkinson & Ladd, 1981; Paul & Voroney, 1984) byl potvrzen předpoklad, že fluktuace mikrobiální biomasy je prudší v teplém klimatu. Avšak zdá se, že výkyvy mikrobiální biomasy , které podstatně ovlivňují její fluktuace, jsou řízeny sezónními změnami. Fluktuace může být extrémně prudká za velmi kolísavých podmínek, zejména tam, kde je pravidelně zabíjena velká část mikrobiální biomasy. Fluktuace mikrobiální biomasy v ekosystémech s extrémními sezónními změnami podnebí může tedy být podstatně vyšší než bylo mnohdy zhodnoceno.

2.6.4 pHpůdy

Mikrobiální biomasa je často spojena s půdním pH. Její nízké hodnoty jsou obvykle zaznamenány v místech s nízkým pH (Jenkinson et al., 1979). Výstavba mikrobiální biomasy následující po přídavku ^{1 4}C značeného rostlinného materiálu v kyselých půdách může být opožděná (Cerri and Jenkinson, 1981). Wardle (1992) provedl statistické přehodnocení dat z 27 publikovaných studií. Analýzy ukázaly, že uhlík a dusík z mikrobiální biomasy byly s pH spojeny neutrálně asi v polovině těchto dat a pozitivně ve většině zbývajících.

Další analýza byla vykonána v práci Wardle (1992) na 22 studiích. Z výsledků této práce vyplývá, že ve většině studií bylo

• ve vlivu na celkovou mikrobiální biomasu pH podstatně méně důležité než organický uhlík a dusík

• ve vlivu na obsah C^{o r g} pH stejně důležitý faktor jako půdní uhlík a dusík Ačkoli tedy mnoho studií nepovažuje pH za důležitý faktor pro ovlivnění půdní mikrobiální biomasy, existují podmínky, kdy je jeho role přinejmenším stejně tak důležitá jako role půdního uhlíku a dusíku na ovlivnění poměru půdního C^{o r}g a N^{o r}g

Důležitost hodnoty pH v navyšování mikrobiální biomasy je ukázána studiemi zahrnujícími přídavek vápna do půd s nízkým pH (Adams and Adams, 1983; Carter, 1986a).

23