Jednotlivé metody měření během experimentů

3.3.1 Stanovení obsahu sušiny a maximální vodní kapacity (WHC)

Metoda pro stanovení těchto parametrů je základní metodou v analýzách půd.

Principem stanovení sušiny je zahřátí na takovou teplotu, při níž se odpaří voda. Z rozdílu hmotnosti se pak stanoví obsah sušiny v procentech.

Maximální vodní kapacita (WHC, Water Holding Capacity) je stav, kdy je půda schopna v přirozeném uložení udržet v kapilárních pórech nej větší množství vody. Vyjadřuje se v jednotkách objemu vody na gram suché zeminy. Při takovémto nasycení se vzduch nachází jen v nekapilárních pórech tedy zemina obsahuje největší množství vody hygroskopické, obalové a kapilární. Procentuální vyjádření W H C znamená kolik procent maximální W H C (100% WHC) je požadováno. Pri čipem stanovení W H C je nasycení vzorku vodou a následná nenásilná ztráta vody do ustanovení rovnovážného stavu. Z rozdílu hmotností se při znalosti obsahu sušiny W H C vypočítá. ISO 11465 (1993), ČSN ISO 11465 (1998)

Následující postup je uveden v SOILETOX-SOP-01:

• Stanovení sušiny se provádí navážením 10 g jemnozemě ve dvou opakováních od každé půdy do skleněných infúzek. Zaznamená se jejich přesná hmotnost na dvě desetinná místa. Následně se vzorky přikryjí alobalovým víčkem s otvory a nechají se sušit v sušárně po dobu 5 hodin při teplotě 105 °C. Po usušení a vychladnutí se opět zváží s přesností na dvě desetinná místa a rozdíl hodnot získaných před a po vysušení se použije při výpočtu WHC.

• Maximální vodní kapacita (WHC) se stanovuje tak, že do 250 ml infúzní lahve se posadí nálevka s filtračním papírem. Do takto připravené nálevky se naváží 20 g jemnozemě (v případě vysokoobjemových půd pouze 10 g). Od každé půdy se připravují dvě opakování. Do každé z nálevek s půdou se přilije 100 ml destilované vody a zamíchá se skleněnou tyčinkou tak, aby se vytvořila homogenní suspenze půdy s vodou. Poté se nálevky přikryjí jednotlivě alobalem tak, že je překryté hrdlo infúzní lahve. Takto přikryté se vzorky nechají při laboratorní teplotě přes noc. Spolu se vzorky se připravuje i kontrola (do prázdného filtračního papíru v nálevce se nalije stejné množství vody a postupuje se totožně). Druhý den se zváží na vahách hmotnost filtračního papíru

4 0

s nasycenou půdou (případně bez půdy u kontroly) na dvě platná desetinná místa.

Stanovení 100% W H C v ml.g"¹ se provede dle následujícího výpočtu:

WHCioo% (ml.g¹) = ( M^{v z} - M^k - Suš) / (Suš / 100 * N) kde:

M^{v z} - hmotnost filtračního papíru s nasycenou půdou M^k - hmotnost filtračního papíru v kontrole

Suš - obsah sušiny

N - navážka přirozeně vlhké půdy Výsledek je průměrem ze dvou opakování.

Pro výpočet množství vody potřebné na ovlhčení dané navážky na stanovené procento W H C užijeme následující výpočet:

ml/g přirozeně vlhké půdy pro WHC^X% = [(WHCioo% * X / 100) - (100 - Suš / Suš)] * 100

kde:

Suš - obsah sušiny ve vzorku v procentech

3.3.2 Bazálni respirace (BR)

Jedná se o metodu, která ukazuje aktuální stav společenstva mikroorganismů v půdě prostřednictvím jejich respirační aktivity a je metodou pro rutinní stanovení bazálni respirační aktivity mikroorganismů v půdě (bez přidání jakéhokoli substrátu). Zobrazuje fyziologický stav mikroorganismů, jejich energetických nároků, působení stresových faktorů, inhibičních vlivů některých faktorů apod. Tento parametr je často brán jako jeden z indikátorů půdní kvality a lze jej sledovat při hodnocení stavu ekosystémů (posouzení zemědělského managementu, rekultivací, při sledování vlivu polutantů na půdu atd.) ISO/DIS 16072 (2002).

Před každým měřením byl stanoven obsah sušiny a W H C (water holding capacity). Ve všech experimentech kromě č. 4 byla půda navážena po 10 g jemnozemě do skleněných infúzních lahví o objemu 250 ml. Pro účely experimentů č. 1 a 2 byla použita 3 opakování od každé půdy. Obsah všech infúzních lahví byl ovlhčen na 60% WHC, uzavřen pryžovými zátkami s kovovými vršky, aby se předešlo úniku plynu a vše bylo uloženo v termostatu nastaveném na 22 °C. Po 24 (případně 72 pokud do měření zasáhl víkend) hodinách uložení byl změřen obsah CO2 v lahvích pomocí plynového chromatografu. Před vlastním měřením musel být přístroj nakalibrován. To se provádělo minimálně pěti (u experimentu č. 3 se jednalo o nejméně 8) nástřiky vzduchu z místnosti a stejným počtem nástřiků směsi 1,11%

C0²/Argon odebrané přes septum přímo z redukčního ventilu příslušné bomby. Objem všech nástřiků, tedy vzorků i kalibrace, byl 1 ml. Po měření bylo nutno vzorky důkladně vyvětrat a následně opět neprodyšně uzavřít a uložit v termostatu. Tento postup se opakoval několik dní až do doby, kdy se hodnoty bazálni respirace ustálily. Tímto způsobem nedošlo k předinkubaci v pravém slova smyslu, jako je uvedena v SOILETOX-SOP-05, protože jsme chtěli prostřednictvím měření od počátku inkubace zaznamenat vývoj bazálni respirace v období předinkubace.

4 1

Scénář experimentu č. 3 požadoval větší počet opakování, tedy 5. Proběhla týdenní předinkubace při ovlhčení na 40% W H C s odvětráváním každý druhý den, poté došlo k důkladnému vyvetraní vzorků, zvýšení W H C na 60% a opětnému uzavření na 24 hodin. Po uplynutí této doby byl změřen obsah C 0² v lahvích stejným způsobem jako v předchozích experimentech.

U experimentu č. 4 byla situace jiná. Zde bylo nutno pracovat včetně předinkubace. Ta ale probíhala s celkovým množstvím půdy určeným pro dané testy. Postup je popsán v kapitole 10.2.4. Pro měření bazálni respirace bylo odebráno z velkých lahví předinkubované půdy po 10 g do 250 ml infúzních lahví ve 3 opakováních pro každou z variant. Půda již byla ovlhčena na požadovaných 60% WHC, takže se pouze infúzní lahve těsně uzavřeli a uložily do termostatu o teplotě 22 °C. Po 24 hodinách byl změřen obsah C 0² v lahvích stejným způsobem jako v experimentech č. 1, 2 a 3.

Během měření byl plynový chromatograf nastaven na tlak mobilní fáze 0,3 kp/cm² a žhavící proud 20 mA. Výpočet kumulativního obsahu C 0²- C byl proveden podle vzorce:

COz-Cíug.gsuš."¹) = (Vz - In) / Kal * 0,0111 * 150 * 1,824 * 0,2729 * 1000 / Suš kde:

Vz - velikost píku vzorku (cm)

In - průměrná velikost píku pro vzduch v místnosti (cm) Kal - průměrná velikost píku pro kalibrační směs (cm) Suš - množství sušiny ve vzorku (g)

1,824 - hustota C 0² při 101,325 kPa a 22 °C (g/l) 0,2729 - hmotnostní zlomek C v C 0²

Výsledek se počítá jako průměr z celkového množství opakování.

3.3.3 Substrátem indukovaná respirace (SIR)

Jedná se o instrumentální metodu pro rutinní stanovení respirační aktivity mikroorganismů v půdě po přidání lehce využitelného substrátu - tzv. substrátem indukované (neboli potencionální) respirace. Po přídavku glukózy se sleduje krátkodobá (6 hodin) odpověď respirace jako produkce C 0² na plynovém chromatografu. Původním záměrem této metody bylo stanovení mikrobiální biomasy na základě empirické korelace mezi SIR a biomasou zjištěnou jinými metodami. V tomto případě je však údaj o mikrobiální biomase poplatný jejímu fyziologickému stavu, její kvalitě. Pro odhad biomasy jako kvantitativního parametru je však vhodnější F E metoda, která je nezávislá na fyziologickém stavu společenstva. SIR metoda tedy zůstává využitelná zejména pro stanovení potenciální respirace (PR) půdních mikroorganismů. Výhodou tohoto parametru oproti bazálni respiraci je to, že ukazuje maximální možnou, substrátem nelimitovanou respirační aktivitu

mikroorganismů. Ta je výsledkem fyziologického stavu mikroorganismů, jejich energetických nároků, působení stresových faktorů, inhibičních vlivů některých faktorů apod. I tento parametr lze brát jako jeden z indikátorů půdní kvality a sledovat jej při hodnocení stavu ekosystémů: při posouzení zemědělského managementu, rekultivací, při sledování vlivu polutantů na půdu atd. ISO 14240-1 (1997).

4 2

Vlastní postup při měření tohoto parametru byl pro účely této diplomové práce lehce modifikován oproti SOILETOX-SOP-04. Hlavní odlišnost spočívala v předinkubaci. Pro experimenty č. 1 a 2 bylo předinkubaci období měření bazálni respirace. SIR se totiž měřila ve stejných infúzních lahvích (tedy 3 opakování od každé půdy) po stabilizaci bazálni respirace. Tyto vzorky již byly ovlhčeny na 60% WHC, další postup tedy představoval změnu vlhkosti na 80% spolu s přídavkem snadno využitelného substrátu - glukózy tak, aby na 1 g suché půdy připadlo 5 mg glukózy-C. Následovalo důkladné uzavření a uložení do termostatu o teplotě 22 °C. Měření bylo provedeno vždy přesně po 1, 2, 3, 4, 5 a 6 hodinách od přidání substrátu na plynovém chromatografu stejným způsobem jako v kapitole 10.3.1.

Pro experiment č. 3 probíhala předinkubace stejně jako v případě měření BR, tedy 5 opakování, 1 týden při ovlhčení na 40% WHC a teplotě 22 °C a odvětrávání každý druhý den.

Další postup byl shodný s předchozími experimenty, tedy ovlhčení na 80% WHC, dodání substrátu a měření po 1, 2, 3, 4, 5 a 6 hodinách.

V průběhu experimentu č. 4 byla půda již předinkubována a ovlhčena na 60% WHC, pro potřeby této metody se navážka 10 g ve 250 ml infúzních lahvích (3 opakování od každé varianty) doplnila na vlhkost 80% W H C s dodatkem glukózy a další postup byl stejný jako v předchozích experimentech.

Měření probíhalo na stejném přístroji a za stejných podmínek jako u měření bazálni respirace. Výpočet kumulativního obsahu C 0²- C pak byl proveden podle následujícího vzorce:

COz-Cíug.gsuš."¹) = (Vz - In) / Kal * 0,0111 * 150 * 1,824 * 0,2729 * 1000 / Suš kde:

Vz - velikost píku vzorku (cm)

In - průměrná velikost píku pro vzduch v místnosti (cm) Kal - průměrná velikost píku pro kalibrační směs (cm) Suš - množství sušiny ve vzorku (g)

1,824 - hustota C 0² při 101,325 kPa a 22 °C (g/l) 0,2729 - hmotnostní zlomek C v C 0²

Tím byl získán narůstající obsah C 0²- C pro 6 hodin po odpovídajícím množství opakování.

Výpočet potenciální respirační rychlosti (PR) byl následující: provedení lineární regrese závislosti kumulativního obsahu kumulativního obsahu C 0²- C na čase v programu

STATISTICA for Windows, modul Multiple regession k odvození parametru B, což je

„slope" regresní přímky a současně i PR v ug kumulativního obsahu COi-C.gsuj^.h"¹. V případě, že byl „intercept" statisticky nevýznamný, byla provedena regrese s nastavením

„intercept" roven nule. „Standard error of B " označoval S.D. pro hodnotu potenciální respirační rychlosti.

3.3.4 Chloroform fumigačně- extrakční metoda (FE, C

^bio

)

Jedná se o instrumentální metodu pro rutinní stanovení kvantity biomasy půdních mikroorganismů jako obsah extrahovatelného uhlíku imobilizovaného v mikrobiálních

43

buňkách - Cbi⁰. Během fumigace půdy po dobu 22 hodin jsou mikrobiální buňky lyžovány a mikrobiální organický materiál se uvolní po extrakci 0,5M K²S 0⁴. Neživý organický materiál není fumigací ovlivněn. Obsah organického uhlíku se stanoví ve fumigovaných i nefumigovaných vzorcích a z rozdílu se určí obsah uhlíku v mikrobiální biomase. Uhlík se stanoví v přítomnosti silné kyseliny oxidací doprovázenou redukcí C r^{4 +} na Cr^{3 +}. Množství zbylého dichromanu je titrováno Mohrovou solí. Jde v podstatě o chemické stanovení a proto se jedná o parametr výhradně kvantitativní, nezávislý na fyziologickém stavu mikrobiální populace. Také tento parametr pak lze brát jako jeden z indikátorů půdní kvality a sledovat jej během hodnocení stavu ekosystémů: při posouzení zemědělského managementu, rekultivací, při sledování vlivu polutantů na půdu atd. ISO 14240-2 (1997).

Postup při měření touto metodou se plně shodoval SOILETOX-SOP-03. Od každé varianty bylo naváženo 6 opakování po lOg (kromě experimentu č. 3, kde se jich používalo 10) do skleněných infúzních lahví. Všechny vzorky byly ovlhčeny na 60% W H C (kromě experimentu č. 4, kde už vzorky požadovanou vlhkost měli z předchozí manipulace).

Polovina vzorků, tedy 3 (resp. 5), byla vložena do exsikátoru spolu s 3krát asi 60 ml chloroformu. Následovalo odsátí vzduchu z exsikátoru olejovou vývevou tak, že chloroform přibližně 2 minuty vřel. Poté byl exsikátor umístěn v temnu při laboratorní teplotě po dobu 22 hodin.

Ke zbytku vzorků bylo přidáno 40 ml 0,5M K2SO4, infúzní lahve uzavřeny zátkami a nechány 30 minut třepat při 180 rpm a amplitudě 10. Po uplynutí této doby byl obsah lahví filtrován po dobu 30 minut přes papír FILTRAK 391, následně filtráty uzavřeny zátkami a uloženy v lednici při teplotě 4 °C do druhého dne. Stejnému postupu byla vystavena spolu se vzorky i kontrola, kterou představovalo 50 ml 0,5M K 2 S O 4 (pro experimenty č. 1, 2 a 4 ve 2 opakováních a pro č. 3 v 5 opakováních).

Další den po 22 hodinách uložení v temnu byl exsikátor otevřen, chloroform odstraněn, následně opět uzavřen a 12krát opakovaně evakuován tak, že po odsátí zůstal vždycky 12 minut stát. Poté se opakovalo totéž, co s nefumigovanými vzorky (včetně další kontroly), tedy 30 minut třepání se 40 ml 0,5M K²S 0⁴ a 30 minut filtrace přes F I L T R A K 391.

Dalším krokem, už společným pro fumigované i nefumigované vzorky bylo spalování chromsírovou směsí. Do erlenmayerových baněk bylo napipetováno přesně 2 ml 0,0667M K²Cr²07 a z dávkovače odměřeno 5 ml H3PO4 a 10 ml H2SO4. Vzniklá směs byla ještě doplněna o 8 ml vzorku (případně kontroly), zamíchána a spalována v sušárně s otevřenou ventilací při teplotě 125 °C po dobu 45 minut. Ihned po spálení bylo do všech vzorků přidáno 5 ml destilované vody a vzorky ponechány vychladnout na laboratorní teplotu. Po vychladnutí byly do každého vzorku přidány 2 - 3 kapky indikátoru (0,5g difenylamidu + 20 ml H²0 +

100 ml H²S 0⁴) , zamícháno a ihned titrováno Mohrovou solí - 0,1M (NH⁴)²Fe(S04)2.6 H²0 . Indikovaný přechod byl z modré do zelené. Faktor titrace byl určen z poměru 8,004 (teoretická spotřeba Mohrovy soli) ku skutečné spotřebě při titraci standardu (směs 2 ml 0,0667M K²C r²0⁷, 22 ml H²0 a 5 ml H²S 0⁴) .

Uhlík ve fumigovaných (F) i nefumigovaných (NF) vzorcích se vypočte podle vzorce:

CF(NF) (ug-gsuš."¹) = f * ( K - Vz) * 0,1 * 1/6 * 3/2 * 12,011 * 40/8 * 1000 / suš.

4 4

neboli:

CF(NF) (ug.gsuš."¹) = f * ( K - Vz) * 1501,375 / suš.

kde:

K - průměrný objem Mohrovy soli spotřebovaný na titraci kontroly (F resp. NF) Vz - objem Mohrovy soli spotřebovaný na titraci vzorku

Průměr ze tří opakování C N F přímo udává C^{e x}. Uhlík imobilizovaný v biomase - E^c -získáme randomizací odečtu C N F od C F hodnot (průměr s S.D.). Cbi⁰ lze pak spočítat jako:

C^{b i 0} = 2,64 * E^c

3.3.5 Potenciální amonijikace argininu (PAMO)

Amonné ionty jsou z půdy extrahovány roztokem chloridu draselného a dále stanoveny kolorimetricky v mikrodestičce. Metoda je založena na Berthelotově reakci amonných iontů s chlornanem a salicylanem, která dává v alkalickém prostředí modré zbarvení. Intenzita zbarvení je měřena fotometrický při 660 nm.

Do polystyrénových zkumavek bylo naváženo po 2 g půdy ve 4 opakováních od každé varianty (4 pro variantu s argininem + 4 pro kontrolu = 8 opakování pro každou půdu) a ovlhčeno na 60% WHC. Do poloviny zkumavek bylo přidáno 0,5 ml roztoku L-argininu (100mg/50ml), následovalo protřepání a uložení v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Druhá polovina vzorků byla doplněna 0,5 ml destilované vody, protřepána a uložena v mrazáku při teplotě -18 °C také na 3 hodiny. Po uplynutí daného času došlo k přidání 10 ml I M KC1, promíchání na vortexu a ponechání na třepačkách při 150 rpm a amplitudě 10 po dobu 45 min. Následovala centrifugace vzorků 5 min. při 2000 rpm.

Samotné stanovení amoniových iontů proběhlo na mikrodestičce postupem stanoveným v SOILETOX-SOP-lla. Nejprve bylo do každé potřebné jamky napipetováno multikanálovnou pipetou 175 ul reakčního roztoku salicylanu sodného, poté přidáno 35 ul extraktů půdy (z každé zkumavky do 3 jamek), promícháno a necháno 15 minut reagovat. Po uplynutí této doby bylo do všech jamek přidáno 30 ul alkalického roztoku chlornanu sodného a 40 ul 1M chloridu sodného (extrakční roztok). Po promíchání bylo ponecháno reagovat při laboratorní teplotě po dobu 60 minut. Po hodině byla změřena absorbance při vlnové délce 660 nm.

Kalibrace se prováděla ředěním základního roztoku o koncentraci 100 ug NH^{4 +}-N/ml na výsledný objem 300 ul roztokem I M KC1, který byl použit pro extrakci, tak, aby kalibrační řada obsahovala koncentrace 8, 6, 4, 2, 1 a 0,5 ug NH^{4 +}-N/ml. Další postup byl stejný jako u stanovení v extraktech půdy - 175 ul reakčního roztoku + 35 ul kalibračního roztoku - 15 minut reagovat 30 ul chlornanu sodného + 40 ul chloridu sodného 60 minut reagovat -měření absorbance.

Kalibrační přímka byla sestrojena z absorbancí kalibračních roztoků, od nichž byly odečteny hodnoty absorbance kontroly ( I M KC1). Od hodnot absorbance vzorků byla odečtena absorbance kontroly a z kalibrační rovnice vypočítáno množství amonných iontů

-4 5

ug N H⁴ -N/ml v jamce. Množství amonného dusíku - N H⁴ - N v ug/g sušiny se vypočítá podle rovnice:

NH^{4 +}-N (ug/g sušiny) = ug NH^{4 +}-N/ml * V) / (suš * g/100) kde:

ug NH^{4 +}-N/ml - určí se z kalibrační rovnice

V - objem extrakčního roztoku ve zkumavce (lOml) suš. - obsah sušiny % v půdě

g - navážka půdy (2g)

3.3.6 Potenciální nitrifikace (PAO, SNA)

Organicky vázaný dusík v půdě je působením mikroorganismů nitrifikace přeměňován na amoniak (amonifikace), který je dále oxidován na dusitany a dusičnany (1. a 2. fáze nitrifikace). Aktivitu nitrifikačních enzymů (1. fáze nitrifikace) můžeme stanovit metodou označovanou jako krátkodobá potenciální nitrifikace (SNA - short-term nitrification essay).

Ta je založena na stanovení produkce dusitanových iontů v půdě obohacené přídavkem amonného substrátu během krátké doby inkubace, kdy nedochází ke změnám ve velikosti mikrobiální populace. Vzorky půdy jsou inkubovány v půdní suspenzi za neustálého třepání při laboratorní teplotě. Suspenze obsahuje saturující množství substrátu (síran amonný) a chlorečnan sodný, který působí jako inhibitor 2. fáze nitrifikace - oxidace nitritů na nitráty.

Předpokládá se lineární nárůst koncentrace N 0²" iontů v čase. V hodinových intervalech (do doby 6 hodin) se odebírají vzorky suspenze, ve kterých se stavoví množství dusitanových iontů ISO/DIS 15685.

Postup při měření se shodoval se SOILETOX-SOP-13. Do skleněných infúzek o objemu 250 ml bylo naváženo 20 g půdy ve 4 opakováních od každé varianty a ovlhčeno na 60 % WHC destilovanou vodou. Ke každému vzorku bylo přidáno 80 ml inkubačního roztoku, promícháno a infúzky byly vloženy na horizontální přepačku při amplitudě 150.

V časových intervalech 0 (před začátkem třepání), 2, 3, 4, 5 a 6 hodin byly odebrány z každého vzorku 2 ml suspenze a napipetovány do 15 ml zkumavek spolu s 2 ml 2 M KC1. Po promíchání byly zkumavky ihned centrifugovány 5 min při amplitudě 2000 rpm.

Stanovení dusitanových iontů proběhlo až na konci inkubace v mikrodestičce. Do jamek bylo napipetováno multikanálovou mikropipetou 210 ul roztoku pufru, přidáno 60 ul vzorku a 30 ul roztoku činidla sulfanilamidu. Z každého extraktu byly napipetovány 3 opakování.

Roztoky se nechaly 15 minut reagovat a poté došlo ke změření absorbance při 540 nm.

Kalibrační řada byla napipetována ze zásobního roztoku o koncentraci 2 ug N 0²" /ml tak, aby výsledná koncentrace roztoků odpovídala 1,6; 1,2; 0,8; 0,4; 0,2 a 0,1 ug N 0²" /ml.

Ředění se provedlo roztokem I M KC1. Další postup byl stejný jako pro stanovení půdních extraktů.

Kalibrační přímka byla sestrojena z hodnot absorbancí kalibračních roztoků, od nichž se odečetly absorbance kontroly ( I M KC1). Od hodnot absorbance vzorků byla odečtena absorbance kontroly a z kalibrační rovnice vypočítáno množství dusitanových iontů v ug

4 6

NO2" /ml. Množství dusitanového dusíku vN0²" -N ug/g sušiny bylo vypočteno podle rovnice:

N0²" -N (ug/g sušiny) = (ug N0²"-N/ml * V) / (suš * g/100) kde:

ug N0²"-N/ml - určí se z kalibrační rovnice

V - objem extrakčního roztoku v infúzce (80 ml) suš - obsah sušiny % v půdě

g - navážka půdy (20 g)

Získáme tak narůstající obsah NO2" - N (ug/g sušiny) pro 6 hodin po čtyřech opakováních.

Potenciální nitrifikace je vyjádřená jako produkce N 0²" - N za hodinu vztažená na množství sušiny v půdě

Výpočet potenciální nitrifikace (SNA) byl proveden lineární regresí závislosti kumulativního obsahu N 0²" - N (ug/g sušiny) na čase v programu STATISTICA for WINDOWS, modul Multiple regression , došlo k odvození parametru B, což je „slope"

regresní přímky a současně i SNA v ug N 0²" -N.gsoí."^"¹. „Standard error of B " představoval S.D. pro SNA.

3.3.7 Anaerobní amonifikace (AMO)

Organicky vázaný dusík v půdě je působením mikroorganismů přeměňován na amoniak, který je dále oxidován na dusitany a dusičnany. Za anaerobních podmínek (převrstvení vzorků půdy vodou) nedochází k oxidaci a hromadí se uvolněné amonné ionty.

Z rozdílu jejich množství na počátku a na konci inkubační doby (7 dní) je možné určit amonifikační aktivitu mikroorganismů.

Postup při měření byl proveden v souladu se SOILETOX-SOP-12a. Na počátku bylo naváženo 10 g od každé půdy v 8 opakováních, vše ovlhčeno na 60% WHC. Polovina vzorků (4 od každé půdy) byla zalita 40 ml destilované vody, promíchána, neprodyšně uzavřena a umístěna v termostatu při teplotě 37 - 40 °C bez provětrávání po dobu 7 dní. U zbývajících vzorků proběhlo stanovení amonných iontů obdobně jako u metody P A M O , tedy dle SOILETOX-SOP-lla.

Po týdenní inkubaci za anaerobních podmínek bylo k zatopeným vzorkům přidáno 40 ml 2 M KC1 a stanoveno množství amonných iontů také dle postupu popsaném u metody P A M O a v SOILETOX-SOP-1 la.

Konečný výpočet se provádí z rozdílu amonných iontů na konci a počátku inkubace, který se vztáhne na množství sušiny ve vzorku a počet dní inkubace:

NH^{4 +}-N (ug/g^suš / den) = (ug NH^{4 +}-N / g^{s u š} 7. den) - (ug NH^{4 +}-N / g^{s u š} 0. den) / 7 kde:

suš - obsah sušiny % v půdě g - navážka půdy (10 g)

47

Pro určení průměru a směrodatné odchylky byla provedena randomizace rozdílů průměrných hodnot každého ze čtyř opakování navážky půdy.

In document VÝZKUMNÉ CENTRUM PRO CHEMII ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGII (Stránka 40-48)