V laboratořích zabývajících se analýzami půdy se nejčastěji pracuje s frakcí o velikosti částic menší než 2 mm, uváděnou pod pojmem jemnozem (Zbíral, Analýza půd I - III, Jednotné pracovní postupy). Ta se v ČR dále dělí dle Kopeckého na jíl (částice menší než 0,01 mm), prach (částice 0,01 - 0,05 mm), práškový písek (částice 0,05 - 0,1 mm) a písek (částice 0 , 1 - 2 mm). Frakce s částicemi většími než 2 mm se označuje skelet a vyhodnocuje se zvlášť při odběru vzorku jako procento skeletovitosti. Skelet se dělí na hrubý písek (2-4 mm), štěrk (4-30 mm) a kámen (více než 30 mm). Pokud je v ornici více než 20 % skeletu, začíná to působit rušivě.
3 1
Norma ISO 10381-6, Metodický pokyn ke sběru, manipulaci a uskladnění půdních vzorků k laboratornímu stanovení aerobních mikrobiálních procesů, doporučuje přesévání vzorků přes síta o velikosti ok 2 - 5 mm.
Literatura se údaji o vlivu velikostních frakcí půdy na mikrobiologické parametry příliš nezabývá. Práce Degens (1998) se zabývala porovnáním obsahu mikrobiální biomasy ve fumigovaných a nefumigovaných vzorcích půd přesetých přes síta o velikosti ok 2 a 0,5 mm.
Zjistili, že u velikostní frakce 2 mm nedošlo k žádné změně v biomase během skladování (1 a 8 týdnů). Oproti tomu 0,5 mm frakce vykázala 30% pokles v osmém týdnu ve srovnání s týdnem prvním. Možnost ovlivnění množství mikroorganismů velikostí frakcí půdy uvádí ve své práci i Krištůfek (1998). Ten zjistil, že dehydrogenázová aktivita stanovená ve frakci půdních částic menších než 0,25 mm byla o 22% vyšší v porovnání s aktivitou půdní frakce 2 mm.
2.8.2 Teplota a forma skladování
Ze standardně měřených mikrobiologických parametrů půd jsou na skladování nejcitlivější parametry dusíku. Vliv teploty na jeho jednotlivé formy během uchovávání vzorku sledovali Kalaš a Fojtíková (1979). Autoři konstatovali nutnost omezit skladování při laboratorní teplotě na minimum. Pozorované změny byly z velké části závislé i na teplotě půdy v době odběru. Tyto závěry korespondují i s výsledky práce Scharfa (1977). Podrobněji se touto problematikou zabýval Stana (1980), který ověřil, že změny vlivem sušení byly závislé nejen na podmínkách sušení, ale i na stanovišti a době odběru. Největší odchylky při sušení vzorku při 40 °C byly připsány nejvyšší mikrobiální aktivitě při této teplotě. Esala, (1995), který ve své práci sledoval vliv mražení a tání na obsah jednotlivých minerálních forem dusíku, konstatoval, že je třeba minimalizovat dobu, po kterou je vzorek vystaven teplotám na bodem mrazu.
Obecně se uvádí, že odebrané vzorky půd je nutné bezprostředně po odběru v uzavřených polyetylénových sáčcích uložit do přenosné chladničky a až do zpracování je udržovat při teplotě nejlépe 1 - 4 °C. Zpracování je třeba provést do 24 hodin od odběru, ve výjimečných případech (např. při nízké vlhkosti půdy při odběrech v zimním období apod. a při dodržení požadované teploty skladování) do 48 hodin. Dlouhodobé skladování vzorků půd v chladničce, jejich sušení a zmrazování se zpravidla projeví změnou obsahu amonného a nitrátového dusíku.
Trávník et. al se dlouhodobě zabývali zjištěním experimentálních podmínek, za kterých by bylo možné analyzovat obsah dusičnanového dusíku v usušených vzorcích půdy.
Výsledky práce dokazují, že vliv úpravy vzorků na stanovení obou forem dusíku je zcela zásadní, pro každou z nich je však odlišný. V obou případech je velmi významným faktorem činnost půdních mikroorganismů. Všechny vzorky byly odebírány v době, kdy teplota půdy nepřesáhla 4 °C a celková aktivita půdních mikroorganismů byla nízká. Podle závěrů prací citovaných v úvodu této kapitoly je pravděpodobné, že při odběru půdy o vyšší teplotě a tedy i s vyšší aktivitou mikroorganismů, by pozorované změny byly ještě významnější. Jejich práce dokazuje, že vzorek odebraný za nízké teploty půdy může být analyzován buď po dodání do laboratoře nebo po uchování v chladničce až sedm dní nebo po zmražení až po šesti
3 2
týdnech. U dusičnanového dusíku je možné vypozorovat určitý trend nárůstu stanovovaného obsahu v závislosti na délce skladování. Při sušení na vzduchu a po určitou dobu i při jiných způsobech sušení dochází k setrvání vlhkého vzorku při teplotách blízkých optimální teplotě pro činnost mikroorganismů. Výsledkem je výrazný nárůst obsahu obou stanovovaných forem dusíku. Pro amoniakální variantu platí, že čím vyšší teplota sušení, tím vyšší stanovený obsah této formy. U dusičnanového dusíku mezi nárůstem pozorovaným pro sušení na vzduchu i pro sušení při 60 °C není statisticky významný rozdíl. Velmi důležitým poznatkem je, že během sušení při 105 °C dochází k velmi rychlému překonání optima pro činnost mikroorganismů a tím k udržení hladiny výsledků statisticky shodných s analýzou po dodání vzorku do laboratoře.
Vliv doby skladování v suchém stavu byl opět pro obě formy dusíku odlišný. Pro dusičnanový dusík nebyla zaznamenána žádná změna ani po 25 týdnech skladování. U amoniakálního dusíku nebyly pozorovány statisticky významné změny do šesti týdnů skladování. Po 25 týdnech pak byl zaznamenán značný nárůst obsahů zmíněné formy. Tento vysoký nárůst není závislý na způsobu sušení vzorku, ale souvisí pravděpodobně s oxidačním rozkladem organické hmoty půdy.
2.8.3 Čas od odběru do analýzy
V době mezi odběrem a analýzou dochází k významným změnám obsahu jednotlivých forem dusíku. Tyto parametry jsou závislé na více faktorech a jsou zvláště významné pro dusík obsažený v amoniakální formě. Vliv odběru, úpravy a skladování půdních vzorků na obsah jednotlivých forem dusíku byl diskutován již v celé řadě publikací. Specifický problém tohoto prvku spočívá v dynamické rovnováze mezi dusičnanovou a amoniakální formou a rovnováze mezi dusíkem v organických sloučeninách (včetně těch, které jsou součástí mikrobiální biomasy půdy) a oběma anorganickými formami.
Nej významnějším faktorem, který ovlivňuje sledované změny je biologická aktivita půdy. Ta je závislá především na provzdušnění půdy, její teplotě a vlhkosti. Všechny tyto parametry se
zpravidla při odběru, transportu, úpravě a skladování vzorku významně mění a tím může docházet ke stanovení obsahů jednotlivých forem dusíku různě odlišných od těch skutečných v místě a čase odběru.
V případě stanovení mikrobiální biomasy, je všeobecně uznáváno, že nejlepším přístupem je skladovat vzorky ve vlhkém stavu při nízkých teplotách nejčastěji při 4 °C, méně jasná už je otázka délky skladování. Ve většině metodik se uvádí, že vzorky půdy byly před
vlastní analýzou skladovány při teplotě 4 °C, ale chybí údaj, jak dlouho byly skladovány.
Změny mikrobiální biomasy v průběhu skladování popsali Elhottová et. al. (1997). Ve svých pokusech zjistili signifikantní změny v celkové mikrobiální biomase během prvních dnů skladování, zatímco zhruba po dvou měsících se mikrobiální biomasa ustálila na konstantní hladině. Pokles celkové mikrobiální biomasy byl provázen nárůstem biomasy bakteriální. To znamená, že podíl bakteriální biomasy se v celkové biomase zvyšoval a pokles celkové biomasy byl způsoben snížením biomasy mikromycetů. Pokles biomasy mikromycetů je snadno vysvětlitelný tím, že během mechanického porušení půdního vzorku dojde k potrhání a následnému odumření houbových vláken. Nárůst bakteriální biomasy byl provázen akumulací zásobních látek v bakteriálních buňkách, která předchází tvorbě klidových stádií.
To je ukazatelem, že bakterie se v prvních měsících přizpůsobovaly novým, pro ně
3 3
nepříznivým podmínkám prostředí. Je pravděpodobné, že společenstvo mikromycetů reagovalo podobně jako společenstvo bakterií na změnu vnějších podmínek prostředí tvorbou klidových stádií a spor. Bohužel nemají výsledky, které by to potvrzovaly. Jejich další výsledky Santrůčková (1988), také ukazují, že rozsah a kvalita změn biomasy na počátku skladování závisí i na teplotě půdy v době odběru.
Z výsledků vyplývá, že v počátečních týdnech skladování půdy při 4 °C se mikrobiální biomasa mění. Navrhují, aby vzorky půdy odebrané pro stanovení celkové mikrobiální biomasy pro účely průzkumu půd byly po odběru přesáty a dále uchovávány ve vlhkém stavu v polyetylenových sáčcích nejméně po dobu 2 měsíců.
Při okamžitém zpracování se předpokládá, že změny v půdě vyvolané odběrem a následnou nutnou úpravou vzorků ještě příliš nestačily ovlivnit měřený parametr. Po uložení při teplotě kolem 4 °C se předpokládá, že efekt odběru a manipulace se vzorky mezitím odezní. Nelze jednoznačně říci, který z obou postupů je vhodnější. Uložení půdy poskytuje více času a možností pro následné analýzy, neboť při uložení na několik týdnů nebo i déle již nehraje roli, zda se všechny analýzy provedou najednou nebo během několika dnů. Na druhou stranu je zřejmé, že s dobou uložení se vzorky stále více vzdalují původnímu stavu v době odběru. I při nízkých teplotách uložení dochází k biologickým a jiným změnám ve vzorcích.
Simek (1998) uvádí srovnání aktivity denitrifikačních enzymů ve 4 různých půdách, resp.
v půdě hnojené různými dávkami hnojiv. K nej většímu snížení aktivity došlo v prvním týdnu po odběru vzorků. Určitá část aktivity se ale uchovala i ve vysušených a před měřením ovlhčených vzorcích. Cooke (1990) uvedl výsledky měření aktivity denitrifikačních enzymů ve vzorcích zmražených a následně přes noc rozmražených. Tato manipulace se vzorky vedla ke snížení aktivity a to navíc různě u různých vzorků. U vysušených a také u zmražených vzorků je problematické jejich dovlhčení (rozmražení) před měřením. Většinou se půda nechává adaptovat až několik dnů, aby se obnovila její biologická aktivita. Není však k dispozici dostatek informací o tom, jak tuto fázi přípravy vzorků optimálně provést.
3 4