3. MATERIÁL A METODY
4.4 Experiment 4 - Vliv skladování na citlivost mikroorganismů vůči toxickému působení kadmia
Výsledky shrnují grafy na obr. 12 - 17. U všech grafů osa x znázorňuje typ skladování (čerstvá půda, uložení 3 měsíce v lednici, mrazáku a vysušené podobě), osa y pak jednotlivé hodnoty. Pro metodu bazálni respirace jsou jednotky ug COi-C.gsuj^.hod"1, pro fumigačně-extrakční metodu ug C.gs uä_ 1, substrátem indukovaná respiraci ug COi-C.gsuš^.hod"1, anaerobní amonifikaci ug NH4.gs uš"1.den"1, potenciální amonifikaci argininu ug NH4.gs uš"1.hod"
1 a potenciální nitrifikaci ug NC"2.gSuš" hod" . Řady rozlišují variantu s Cd (žluto-hnědá) a kontrolu (hnědá). Procenta nad řadami ukazují míru aktivity půdy s Cd oproti kontrole.
Komentář k obr. 12: Z výsledků měření bazálni respirace vyplývá, že skladování ovlivňuje efekt kadmia na mikrobiální parametry půd. U orné půdy dosahuje aktivita v čerstvé půdě 26% ve srovnání s kontrolou, během skladování se naměřená aktivita zvyšuje.
Nejvyšší je při uložení půdy v lednici 63%, pro mrazák je 49% a nižší je při skladování ve vysušené podobě, tj. 37%. V případě trvalého travního porostu je aktivita mikroorganismů v čerstvé půdě 32% vůči kontrole, u ostatních typů se opět zvyšuje. Nejvyšší se objevila u vysušené půdy 51%, následuje půda z lenice 48% a nejblíže čerstvé je půda z mrazáku 43%
aktivity kontroly. U lesní půdy je opět aktivita čerstvé nejnižší 16%, ostatní jsou výrazně nad touto hodnotou. Nejvyšší je aktivita půdy z lednice 57%, následuje půda z mrazáku 46% a vysušená půda 42%.
Komentář k obr. 13: Zde jsou shrnuty výsledky fumigačně-extrakční metody. U orné půdy má nejvyšší procento aktivity vůči kontrole čerstvá půda 74%. Pak následuje půda vysušená s 67%, půda z lednice 41% a nejnižší aktivitu vykazuje půda z mrazáku. Trvalý travní porost dosahuje stejného procenta aktivity u čerstvé a vysušené půdy, tj. 83%. Ostatní varianty jsou nižší, pro půdu z lednice 78% a z mrazáku 47%. Lesní půda vykazuje aktivitu v čerstvé podobě stejnou pro kontrolu i variantu s kadmiem, při skladování v lednici aktivita naspikované půdy dokonce přesahuje o 14% kontrolu. Při skladování v mrazáku je aktivita naspikované půdy 86% a vysušené půdy 84% vůči kontrole.
Komentář k obr. 14: Obrázek shrnuje výsledky substrátem indukované respirace. U orné půdy je aktivita čerstvé formy 11%, při skladování v lednici se snižuje na 8%, v mrazáku činí 12% a vysušená podoba udává 15% hodnoty kontroly. Trvalý travní porost dosahuje u čerstvé půdy aktivity 44%, v ostatních variantách se snižuje. Pro lednici je 22%, pro mrazák 24% a pro vysušenou formu 28%. Lesní půda má opět nejvyšší aktivitu v čerstvém stavu 69%, následuje lednice 56%, mrazák 49% a nejnižší je ve vysušené podobě 37%.
Komentář k obr. 15: Zde jsou shrnuty výsledky stanovení anaerobní amonifikace. U orné půdy jsou hodnoty naměřené v kontrolách velmi nízké a ve všech případech je převyšují hodnoty z naspikované půdy. U čerstvé půdy aktivita vzorků s kadmiem dosahuje 271%
aktivity kontroly, u skladování v lednici je ještě vyšší 321%. Pro vysušenou půdu bylo naměřeno 150% a aktivita kontroly při skladování v mrazáku nebyla naměřitelná vůbec.
Trvalý travní porost udává u čerstvé půdy 132% aktivity vůči kontrole, u skladovaných variant je aktivita nižší 65% pro lednici, 67% pro vysušenou půdu a 69% pro mrazák. Lesní půda ve všech případech vykazuje vyšší aktivitu v kontrole než v naspikované půdě. Nejvyšší
54
je u čerstvé půdy 78%, následuje skladování ve vysušené podobě 75%, v lednici 53% a nejnižší je hodnota při skladování v mrazáku 45%.
Komentář k obr. 16: Obrázek shrnuje výsledky získané měřením potenciální amonifikace argininu. U orné půdy v čerstvé formě aktivita vůči kontrole tvoří 90%, v lednici je nižší 36%, ve vysušené podobě je o 11% vyšší než aktivita v kontrole a v mrazáku není měřitelná vůbec. Trvalý travní porost udává u čerstvé půdy 42% aktivity, ostatní jsou nižší. V lednici 36%, ve vysušené podobě 30% a v mrazáku opět nebyla aktivita stanovitelná.
Lesní půda vykazuje v čerstvé variantě aktivitu výrazně vyšší než je kontrola o 65%, ostatní jsou opět nižší. Vysušená půda udává 76%, z lednice 63% a v mrazáku i v tomto případě
nebyla hodnota stanovitelná.
Komentář k obr. 17: Na tomto místě jsou uvedeny výsledky měření potenciální nitrifikace. Orná půda v čerstvém stavu udává hodnotu naspikované půdy 96% aktivity kontroly, při skladování se však tento parametr výrazně snižuje. Při uložení v lednici je aktivita pouhé 2%, u mrazáku a vysušené je v naspikované půdě shodně nulová oproti kontrole. Trvalý travní porost vykazuje obdobný trend jako orná půda. V případě čerstvé formy aktivita tvoří 96%, ale v lednici pouze 4%, v mrazáku 1% a ve vysušené půdě je opět nulová. Lesní půda v tomto testu měřena nebyla, protože její hodnoty vychází velmi nízké, jak bylo zjištěno při zjišťování variability metod.
55
5. DISKUSE
Z dosažených výsledků celkově bez ohledu na frakce a způsob skladování vyplývá, že aktivita lesní půdy je ve všech metodách nej vyšší, následována trvalým travním porostem a nej nižších hodnot dosahuje orná půda. Tento jev byl popsán řadou studií (Gupta and Germida,
1988; Drury et al., 1991; Lynch and Panting, 1980; Reid and Goss, 1980) jako pozitivní vztah mikrobiální biomasy s půdní strukturou a stabilitou agregátů. Vlastně to znamená, že v neoraných systémech je výrazně vyšší obsah mikrobiální biomasy než v oraných, kde se při každém orání poruší struktura mikrobiálního společenstva. V praxi dochází k tomu, že v málo orané půdě se vyskytuje mnohem větší zastoupení houbové složky mikrobiální biomasy (Hendrix et al., 1986; Holland and Coleman, 1987).
5.1 Experiment 1 - Vliv skladování a času na parametry cyklu uhlíku
V literatuře se uvádí, že odebrané vzorky půdy pro měření mikrobiálních parametrů by měly být analyzovány v co nejkratší době. Při nutnosti delšího přechovávání pak skladovány v lednici při teplotě 4 °C. Norma OECD (1995) uvádí, že pokud existuje nutnost skladování vzorků, mělo by být provedeno tak, aby vzorky skladované do 3 měsíců byly uloženy v 4 °C a vzorky skladované déle do 1 roku v -20 °C. Norma ISO 10381-6 doporučuje skladování v lednici při teplotě 1 - 4 °C.
Zatím však neexistují žádná obecně přijatá pravidla, kterými by se laboratoře mohly řídit. Samotný odběr představuje zásah do struktury a funkčnosti mikrobiálního systému.
Pokud dojde k vyhodnocení požadovaných parametrů ihned po odběru, předpokládá se, že změny vyvolané odběrem ještě nestačily sledovaný parametr ovlivnit. Naopak při dlouhodobějším skladování se předpokládá, že dané změny již odezněly. Ovšem v tomto případě se naskýtá otázka, do jaké míry ještě skladovaná půda odpovídá reálnému prostředí.
Z našich výsledků vyplývá, že v případě bazálni respirace (BR) během skladování v lednici (4 °C) a v mrazáku (-18 °C) opravdu dochází k výkyvům (obr. 1). Při porovnání hodnot naměřených vždy v prvním dnu předinkubace je kolísání velmi zřetelné. Oproti tomu při porovnání hodnot ze dne čtvrtého se již rozdíly mezi jednotlivými časy zmenšují.
V absolutních hodnotách dochází mezi čerstvou půdou a půdou skladovanou 32 měsíců ke značnému poklesu aktivity v prvním dni předinkubace. U čtvrtého dne není takový efekt patrný. To je pravděpodobně způsobeno skutečností, že vlivem skladování se půda vyčerpává.
Mikroorganismy odumírají, případně přechází do dormantního stádia (Wardle, 1992) a po opětovném ovlhčení začnou růst s různou intenzitou v různých časech skladování, ale po určité době (v našem případě čtyři dny) se aktivita opět ustálí. V celkovém pohledu má vždy vyšší hodnoty varianta skladovaná v mrazáku. V tomto prostředí pravděpodobně mikroorganismy vlivem nízké teploty rychleji odumírají, takto uvolněné živiny a snadno rozložitelný uhlík dokáže rychle využít přežívající část společenstva ke stimulaci svého metabolismu (Soulides and Allison, 1961; Skogland et al., 1988; Schimel and Clein, 1996).
Ve čtvrtém dnu se zdá biomasa všech časů skladování jako vyrovnaná a nejblíže k čerstvé půdě se jeví skladování v lednici. Z tohoto pohledu lze tedy pro parametr BR doporučit skladování v lednici.
56
Stanovení mikrobiální biomasy Cbi0 vzorku z lednice a mrazáku fumigačně-extrakční metodou (FE) se také pohybuje v určitých výkyvech (obr. 2). Tyto výkyvy jsou však pravdepodobne způsobeny variabilitou metody (viz kapitola 5.3), protože nepřesahují 7%
hodnoty. Z toho vyplývá, že parametry měřené touto metodou jsou v průběhu skladování vyrovnané. Takový výsledek je v souladu s pracemi Winter et. al (1994) a Stenberg et al.
(1998), které vyvozují, že v čase skladování od 1 do 18 měsíců jsou měřené parametry přibližně stejné. Zde jsou však v celkovém pohledu hodnoty pro skladování vyšší pro variantu z lednice, což jen potvrzuje teorii zmíněnou výše u metody BR. Během měření metodou B R a SIR dochází k předinkubaci, kdy mají mikroorganismy čas adaptovat se na nové podmínky a v případě mrazáku důsledně využít vyšší hladinu potravy. Kdežto u metody FE k předinkubaci nedochází, měření probíhá ihned po ovlhčení a mikroorganismy nestihnou zareagovat tak efektivně jako u B R nebo SIR. Navíc mikrobiální biomasa má větší setrvačnost a předinkubace nebude fungovat pro stabilizaci její hodnoty jako u mikrobiální aktivity. Stejně jako u metody B R i zde se jeví hodnoty půd skladových v lednici jako nej bližší k půdě čerstvé.
Porovnání vlivu skladování v lednici a mrazáku prostřednictvím metody substrátem indukované respirace (SIR) ukazuje na první pohled jistý efekt (obr. 2). V tomto případě se však nejedná o variabilitu metody, protože rozdíly mezi hodnotami jsou vyšší než 23% (viz kapitola 5.3). U obou způsobů skladování dochází v osmém týdnu k nárůstu aktivity, v dalších časech měření pak k postupnému poklesu. Tato metoda měří pouze aktivní části mikrobiálního společenstva rozkládající substrát glukózu (Pesaro et. al, 2003). Časový průběh skladování v obou formách se navzájem kopíruje, ale stejně jako u B R i zde jsou celkově vyšší hodnoty pro půdy skladované v mrazáku, důvod je patrně stejný jako u BR. Jedinou půdou, která kopíruje vliv zmíněných dvou typů skladování přibližně, je lesní půda. Důvodem bude pravděpodobně problematické ovlhčování a tím i obohacování o glukózu. Tato půda totiž na základě fyzikálních podmínek velmi pomalu vstřebává vodu a lze předpokládat, že se glukóza nemusela rozložit po povrchu rovnoměrně.
Skladování suché půdy shrnují obr. 3 - 6 . Časový vývoj skladované půdy od počátku skladování je patrný na obr. 5 - 6 . Při posuzování bazálni respirace (BR) u vysušené půdy je brán v potaz první a osmý den předinkubace. Podobně jako u variant z mrazáku a lednice, i zde dochází k výrazným změnám v čase při sledování prvního dne a tyto změny se znatelně zmenšují při sledování dne pozdějšího, v tomto případě osmého. Bylo potvrzeno, že aktivní složka biomasy je vysušením půdy zabita, zatímco dormantní není dotčena (Bottner, 1985).
Nicméně Wardle and Parkinson (1990c) uvádí, že část aktivní složky může během dlouhého sušení vstoupit do dormantní fáze. Tyto závěry potvrzují i grafy na obr. 7, kde je patrný velký nárůst aktivity při měření prvního dne předinkubace, narozdíl ode dne osmého, kdy se hodnoty víceméně nemění. Pro první den předinkubace nastává u všech měřených půd v době mezi 1. a 3. měsícem skladování velký nárůst. Ten může být způsoben právě vymřením maximálního množství mikroorganismů, které špatně snáší nedostatek vlhkosti a následným zužitkováním jejich zbytků ostatními částmi mikrobiálního systému. Po této době mohou postupně začít odumírat rezistentnější druhy, takže mezi 3. a 6. měsícem je u prvního dne předinkubace sice pokles, ale zbylé dormantní organismy se po ovlhčení transformují do aktivní formy, takže po osmi dnech dochází celkově k nárůstu aktivity oproti předchozím časům skladování.
57
Fumigačně-extrakční metoda (FE) u vysušené půdy vykazuje v prvních dnech (do 1 měsíce) stálé hodnoty. Výkyvy nastávají až po delší době, která je různá pro různé půdy.
Nejprve reaguje lesní půda, poté trvalý travní porost a jako poslední půda orná. Toto zjištění souhlasí s výsledky pracemi Wardle (1998b) a Pimm (1991), kteří zjistili, že narušenější typy ekosystémů (orná půda) mají velmi efektivní vnitřní opravné mechanismy, takže se nedají vyvést z rovnováhy tak rychle jako ekosystémy obvykle stálé (trvalý travní porost, lesní půda). Zmíněné kolísání pravděpodobně způsobuje postupné vymírání méně rezistentních druhů mikroorganismů a ustalování nové rovnováhy systému.
Substrátem indukovaná respirace (SIR) vysušené půdy ukazuje výkyvy u všech půd téměř od začátku skladování. Jak již bylo zmíněno, tato metoda stanovuje pouze mikroorganismy schopné rozkládat glukózu, takže její výsledky popisují stav výhradně těchto druhů. Výkyvy opět mohou znamenat hledání rovnováhy mikrobiálního systému.
Vzájemné porovnání jednotlivých typů skladování uvádí Obr. 7 - 8. Na Obr. 7 je bazálni respirace (BR). Hodnoty jsou vybrány ze dvou časových rozmezí, první jsou 3 - 4 měsíce a v druhém případě 6 - 8 měsíců. Ve všech sledovaných časech i půdách jsou hodnoty seřazeny stejným způsobem. Nejvyšších hodnot dosahuje skladování ve vysušené podobě, pak následuje varianta z mrazáku a poslední je uložení v lednici. Velmi vysoké hodnoty B R u trvalého travního porostu a lesní půdy jsou v souladu se zjištěním ve studiích Clarholm and Rosswall (1980) a Lund and Goksoyr (1980), že následkem ovlhčení může mikrobiální biomasa výrazně narůst během několika hodin. Výsledky měření fumigačně-extrakční (FE) metodou udává obr. 8. V tomto případě je nejnižší hodnota mikrobiální biomasy při skladování ve vysušené podobě. Tento fakt je v souladu s výše zmíněnou teorií, že při F E metodě dochází k ovlhčení těsně před analýzou, tím biomasa nestihne narůst a měří se pouze aktuální stav. Ze zbylých způsobů skladování je většinou nižší hodnota ze skladování v mrazáku. Důvod je podobný jako u vysušené půdy, že během skladování za velmi nízké teploty řada mikroorganismů odumře a měří se aktuální stav bez jakékoli inkubace. Výsledky substrátem indukované respirace shrnuje obr. 8. Nejnižší aktivity dosahuje půda skladovaná v mrazáku, pravděpodobně důsledkem vymření mikroorganismů schopných spotřebovávat glukózu. Aktivita u zbylých dvou typů uložení je víceméně na stejné úrovni.
Z důvodů uvedených v předchozích odstavcích, zejména se zřetelem na časový průběh skladování, se jeví uložení v lednici jako nejvíce podobné hodnotám čerstvé půdy a tudíž jako nejlepší způsob skladování.
5.2 Experiment 2 - Vliv zrnitostní frakce na parametry cyklu uhlíku
V literatuře se nevyskytuje mnoho informací o vlivu velikostních frakcí půdy na mikrobiologické parametry. Norma ISO 10381-6 obsahuje pouze doporučení o používání frakce velikosti 2 mm pro tyto testy. Základním dělítkem skeletu od jemnozemě je právě rozměr 2 mm, který byl zvolen proto, že je horní hranicí kapilárního pohybu vody. Do porovnání s obvyklou velikostí byly pro účely této práce přibrány ještě frakce 1 mm a 4 mm, kde je ještě obsažen hrubý písek, ale už ne štěrk.
Z našich výsledků vyplývá, že nej výraznější vliv frakcí se objevuje u trvalého travního porostu. Ostatní druhy půdy nevykazují téměř žádný vliv velikosti frakce.
58
V případě orné půdy jsou hodnoty bazálni respirace (BR) pro prvních sedm dní předinkubace shodné pro všechny tři frakce. Určité odlišení nastává až v osmém dnu, kdy je nej vyšší hodnota pro frakci 1 mm. Lesní půda taktéž vykazuje hodnoty pro sedm naměřených časů srovnatelné uvnitř jednoho měření, ale zde se liší výsledky pro den sedmý a nej vyšší hodnoty dosahuje frakce 4 mm. Nej variabilnější pro tento parametr se jeví trvalý travní porost, kde srovnatelných hodnot půda dosahuje pouze první den měření. V ostatních dnech je vždy nejvyšší aktivita u frakce 1 mm, naopak nejnižší u frakce 4 mm. Tento fakt může být v souladu s daty publikovanými v práci Wardle (1992), kde je uveden vliv struktury a textury půdy na mikrobiální parametry. Vzhledem k tomu, že tato půda obsahuje až 66%
písku, je pravděpodobné, že čím větší velikostní frakce, tím větší zastoupení neživé složky v analyzované hmotnosti. A tedy menší obsah mikroorganismů, tím i menší mikrobiální aktivita.
Metoda F E neukazuje žádnou variabilitu ani v jedné z testovaných půd.
Metodou SIR bylo zjištěno, že na výsledky u lesní půdy nemá velikost frakce žádný vliv. Naopak u orné půdy i trvalého travního porostu se efekt vyskytl. Orná půda vykazuje nejnižší aktivitu ve frakci 4 mm, vyšší ve 2 mm a hodnota podobná oběma předchozím vychází u frakce 1 mm. U trvalého travního porostu je opět variabilita nej větší, stejně jako u B R nejvyšších hodnot dosahuje aktivita u frakce 1 mm, naopak nejnižší se jeví frakce 4 mm.
Což potvrzuje výše uvedenou teorii o souvislosti velikosti částic a obsahu mikroorganismů.
5.3 Experiment 3 - Analýza zdrojů variablity jednotlivých metod
K vyhodnocení vlivu skladování na mikrobiologické parametry půdy bylo nutno vyhodnotit i samotné metody, resp. jejich variabilitu v rámci jednotlivých měření.
Z průběžných výsledků totiž nebylo zřejmé, zda se zjištěné trendy týkají opravdu vlivu skladování nebo jsou způsobeny jistým systematickým posunem v metodě. Půda je velmi heterogenní systém, proto určitá variabilita uvnitř metody musí nastat vždy. Podle dosažených výsledků jsou mnohem přesnější metody stanovení uhlíku ve srovnání s metodami stanovení dusíku.
Metody pro stanovení uhlíku vykazují variabilitu maximálně okolo 20% (BR do 20%, FE do 7% a SIR do 23%), naopak u stanovení dusíku je výrazně vyšší (AMO do 50%, P A M O do 50% - u lesní půdy až 100%, PAO do 15%).
Během vyhodnocování metody B R a SIR se odebírá vzorek plynu rozptýlený v uzavřené lahvi, je tedy velmi pravděpodobné, že složení v odebrané části do velké míry odpovídá složení v celém objemu. Na druhou stranu však jistý problém představuje samotný plynový chromatograf s mechanickým zapisovačem. Výsledná koncentrace nelze podle velikosti píků stanovit zcela přesně, protože je nutno odečítat délky píků ručně podle pravítka a není tudíž vyloučeno jisté zkreslení při subjektivním hodnocení. U metody SIR také může dojít k určité variabilitě díky přídavku substrátu glukózy, která se vždy nemusí dostat ke všem částicím půdy ve stejném množství. Např. lesní půda vstřebává vodu daleko pomaleji než půda orná, tudíž mohou některé části vzorku zůstat ovlhčené málo, jiné hodně.
5 9
U metody F E je variabilita nejnižší. I v tomto případě je možné předpokládat, že analyzovaná část vzorku má do velké míry stejné složení jako zbytek, protože z filtrátu se odebírá poměrně velké množství (8 ml). Jistým zdrojem variability u této metody však je samotné finální vyhodnocení prostřednictvím titrace, kdy dochází k barevné změně z modré do zelené barvy s ne příliš ostrým přechodem. Jde opět o subjektivní vyhodnocení a závisí na každém pracovníku a světelných podmínkách, jak je barva vnímána. Nelze tedy s jistotou tvrdit, že titrační objem pro všechny vzorky je odečten ve stejné fázi barevného přechodu.
Metody stanovení dusíku se jeví jako výrazně variabilnější. Je možné, že svůj vliv na to má i velmi malé množství vzorku odebírané pro samotné stanovení. Vzhledem k faktu, že vyhodnocování probíhá v mikrodestičce jsou postupně během realizace měření odebírány menší a menší vzorky, s nimiž se dále pracuje, a výsledné množství vzorku použité pro jednotlivá vyhodnocení se pohybuje v řádech ul (u metod stanovení uhlíku jsou to ml).
V kterémkoli z kroků tedy může dojít k odebrání části, která nebyla dost důkladně promíchána, případně vlivem usedání sedimentu po třepání nemá stejné složení ve všech částech roztoku. Nejnižší variabilitu vykazuje metoda PAO (15%), zde ale může dojít k falešnému zkreslení výsledků při závěrečném výpočtu, kdy se bere průměr ze 16 čísel, ve skutečnosti se ale nejedná o tento počet vzorků, nýbrž o pouhé 4 vzorky a následné 4 odběry z každého z nich.
V I S O 14240-2 jsou v příloze C údaje z ringtestu, kdy 11 laboratoří hodnotilo stejný vzorek a C V byl od 11 do 23%.